专利名称：：预防与治疗肺癌细胞侵袭转移的反义寡核苷酸的结构及用途的制作方法预防与治疗肺癌细胞侵袭转移的反义寡核苷酸的结构及用途本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种针对uPA基因的反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)的序列结构及其成为治疗肺癌等恶性肿瘤细胞侵袭转移的新型药物。恶性肿瘤细胞的侵润转移是一个多因素参与的复杂过程，但启动这一过程的首要条件和必需步骤是肿瘤细胞穿越基底膜侵入周围基质，因此如能在此阶段控制肿瘤细胞侵润，就有可能阻止或抑制肿瘤转移。资料显示，肿瘤侵入周围基质与肿瘤细胞分泌基质降解酶溶解基质引起肿瘤周围组织"再塑"(remodeling)密切相关。丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶等是目前认为较为重要的三类基质降解酶。其中与多种类型恶性肿瘤侵润转移相关的一种丝氨酸蛋白酶一尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinaseplasminogenactivator,uPA)近来皮员为弓I人关注。1976年Astedt和Holmberg即发现癌细胞可产生及释放uPA，近来Gershtein等发现在检测的所有乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌患者肿瘤组织中uPA表达均明显升高；Zhang等证实uPA在肝癌组织中高表达；其他作者也相继报道了uPA在胃癌、结肠癌、食道癌、前列腺癌、胸腺癌、膀胱癌、头颈部鳞癌等肿瘤中高表达，并发现uPA活性高低与部分肿瘤(如非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌等)大小、分化状态、转移能力及患者临床分期、生存周期长短等明显相关，可作为判断肿瘤恶性程度和患者预后状况的重要指标；实验研究亦发现转染uPA基因可促进肿瘤转移，而应用uPA抑制剂或抗uPA抗体可阻止或抑制肿瘤细胞侵润转移。上述这些涵盖基础与临床，涉及正反两方面的研究资料均说明uPA高表达在肿瘤细胞侵润转移中发挥着重要作用。因此，以uPA为靶点降低其表达水平就有可能成为抑制肿瘤侵袭转移的一种手段(HanB，etal.O"cW2005;14(1):105-112.DanoK，etal./.rA/wnft好画oW.2005;93(4):676-681.DuffyMJ,.C"/ri^固Z)饥2004;10(1):39-49).反义寡核苷酸(ASODN)在导入细胞后能与靶基因mRNA结合形成DNA-RAN杂合体，封闭或抑制耙基因复制或表达，从而减少其"下游"产物一蛋白或酶的表达水平。目前ASODN在恶性肿瘤、病毒感染性疾病(肝炎，流感等)、某些遗传性疾病及其它基因表达异常所致疾病的实验治疗中已取得较理想疗效，且与传统治疗药物相比彰显出作用时间长、作用特异性强、毒副作用小等优点，自1998年8月美国FDA批准首个抗病毒反义药物进入床应用以来，国外已有一批反义药物进入临床II一III期试验或临床试用(JoensenH，AfedL2000,32(1):31-33.MorrisMJ，etal.C7//IGwice/"/es.2002，8(3):679-683.CoreyDR.Telomeraseinhibition,oligonucleotides,andclinicaltrials.Ozic。ge/ie2002,21(4):631-637)。人uPAmRNA为2304bp(NM-002658)，利用生物信息学软件可模拟uPAmRNA二级结构，作为设计ASODN的重要依据。但由于uPAmRNA在细胞内的状态难以预测，因此所设计的ASODN能否接近uPAmRNA并与之杂交以封闭或减少uPA表达尚有待体内外实验做进一步筛选与评价。本发明的目的在于寻找能特异高效抑制肺癌细胞侵润转移的新型反义药物，即对yPAmRNA表达有较好抑制效应的ASODN及能改善其生物活性的化学修饰衍生物。本发明的主要内容是，根据GeneBank中人yPAmRNA序列，参考计算机预测的二级结构，采用计算机辅助设计了25条ASODN(见表1)，并进行硫代修饰。经MicroPureII反向纯化柱(SolidPhaseSciences)纯化备用。以侵袭小室(Boyden小室)对设计的ASODN进行体外抗人肺癌A549细胞侵袭能力筛选与评价。结果证明有4条ASODN，即uPA85、uPA604、uPA969、uPA1227在浓度为1.0nmol/L及2.0nmol/L时对人肺癌A549细胞体外侵袭具有抑制作用，提示它们可用于肺癌细胞侵袭转移的预防与治疗。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>根据本发明，针对uPAmRNA翻译起始区(uPA85)及翻译区(uPA604、uPA969、uPA1227)的ASODN能特异性抑制uPA基因表达，有可能成为治疗肺癌等恶性肿瘤侵袭转移的新型生物工程药物。根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度、及组织靶向性等，本发明包含了uPA85、uPA604、uPA969、uPA1227的各种化学修饰，例如硫代修饰、半乳糖直接修饰、亲脂性分子或PH敏靶向脂质体修饰等。根据本发明，发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的试剂。根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其它反义寡核苷酸及其衍生物。根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适量的剂量给药。根据本发明，本发明的实施对严重危害人类健康的肺癌等恶性肿瘤侵袭转移的预防与治疗具有重要的社会和经济效益。结合附表说明本发明的具体实施方法表1:25条反义寡核苷酸序列及性质表2:4条ASODN对人肺癌A549细胞体外侵袭能力的抑制效应表3:4条有效ASODN序列、作用靶点及靶基因局部结构实施例1.ASODN的设计与合成根据GeneBank中uPAmRNA全长序列，参考计算机预测的二级结构，采用计算机辅助设计了25条硫代ASODN(见表l),采用DNA自动合成仪合成并在合成时进行硫代修饰。合成完毕后，浓氨水55'C切割并脱保护15小时后，经MicroPureII反向纯化柱(SolidPhaseSciences)纯化，紫外定量后，真空干燥，-20汇保存备用。2.ASODN的细胞转染人肺癌A549细胞以含10。/。小牛血清的DMEM培养基培养，适时更换培养液及传代，逐渐降低培养液中小牛血清浓度直至无血清培养。以无血清、无抗生素含Lipofectin的细胞培养液进行硫代ASODN细胞转染，具体步骤参见Lipofectin使用说明书，每条ASODN浓度分别为0.5nmol/L、1.0nmol/L、2.0pmol/L,同一浓度ASODN设3组，未转染ASODN的A549细胞为对照组(C),转染与未转染ASODN的A549细胞培养后，分别用于细胞侵袭能力测定。3.A549细胞侵袭能力测定分别将2xl05个转染及未转染ASODN的A549细胞悬浮于铺有Matrigel50吗的侵袭小室(Boyden小室)的上室中，下室加有趋化剂Fibronectin10pg，在37°(7孵箱培养10h后，以棉签擦尽膜上室面细胞及基质胶，甲醛固定，HE染色，光镜下将多聚碳膜分成9等格，取其平均值，每组设2个样本，重复3次。4.结果a.在设计的25条靶向uPAmRNA的ASODN中，uPA85、uPA604、uPA969、uPA1227在浓度为1.0pmol/L和2.0pmol/L时能显著抑制A549细胞侵袭能力(表2)。表2.4条ASODN体外对AS49细胞侵袭能力的抑制效应_ASODN代号_ASODN浓度Qimol/L)_0(C)_9^__^_179.86±34.47138皿26.94'81.86土16.53"192.29±22.17174.14±31.28114,14土25.00"79.00±17.77"159.86±22.25101.29±20.89**68.71土12.91"_183.71±27.24144.43土32.68"95,86±24.94*'Note:，P<0.05，"P<0.01vsC.uPA85UPA604uPA969UPA1227b.4条能抑制A549细胞侵袭能力的ASODN作用靶点局部结构见表3。表3.4条有效ASODN序列、作用靶点及耙点局部结构ASODN代号作用靶点靶点局部结构ASODN序列uPA8566-85分枝环GGCTCTCATGGTGGCGAGGTuPA604585-604分枝环GCGGGGCCTCAGAGTCTTTTuPA969950-969分枝环ATGGTCTGTATAGTCCGGGAuPA12271208-1227内环GAGGGAACAGACGAGGGGTC权利要求1.一种可特异性结合人uPAmRNA的反义寡核苷酸，其序列选自1).uPA855’-GGCTCTCATGGTGGCGAGGT-3’2).uPA6045’-GCGGGGCCTCAGAGTCTTTT-3’3).uPA9695’-ATGGTCTGTATAGTCCGGGA-3’4).uPA12275’-GAGGGAACAGACGAGGGGTC-3’2.含有权利要求l中的反义寡核苷酸序列及可药用载体的药物组合物。3.权利要求1中的反义寡核苷酸用于制备抗肺癌及其它恶性肿瘤细胞侵袭转移药物的用途。全文摘要本发明是根据人尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-typeplasminogenactivator，uPA)基因结构设计、合成的反义寡核苷酸(ASODN)，可用于抑制人uPA基因表达。本发明设计了25条互补于uPAmRNA5’区、翻译区、3’区的反义寡核苷酸，首次发现互补于uPAmRNA特定区域的寡核苷酸体外对培养的人肺癌A549细胞的侵袭转移具有抑制效应。故本发明涉及到针对uPA基因的反义寡核苷酸序列、结构及其成为预防和治疗肺癌等恶性肿瘤细胞侵袭转移的新型药物。文档编号A61P35/00GK101113159SQ20061014601公开日2008年1月30日申请日期2006年11月3日优先权日2006年11月3日发明者江其生申请人:江其生