专利名称：：一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统和其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及化学领域，尤其涉及生物化学药物领域，特别是一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统和其应用。
背景技术：
：当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体损伤；同时发展为慢性感染，导致严重疾病。柯萨奇病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，青壮年发病较高，可导致约50。/。的人类急性及慢性心肌炎和25。/。扩张性心肌病的发生，是一常见、多发的心血管系统疾病。目前尚无有效的预防或治疗疫苗。CVB3属于肠道病毒，通过呼吸道、胃肠道入侵机体后，由于机体粘膜免疫(如肠道SlgA)不能在感染早期及时清除病毒，使病毒迅速扩散入血、进而侵犯心脏，导致病毒性心肌炎；CVB3的持续性感染还可能导致扩展性心肌病的发生，致死率极高，危害严重。对于以上经粘膜感染病原体，如能诱导粘膜局部(鼻咽、胃肠道)的特异性粘膜免疫应答，特别是SlgA的分泌，则可能在感染初期有效中和病毒，避免病毒入血而后感染全身器官，从而阻止严重疾病如病毒性心肌炎的发生。因此急需可诱导粘膜SlgA分泌的粘膜疫苗的研制。已知常规疫苗如灭活、减毒疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗等等经常规途径免疫(肌肉注射、皮下)等通常不能诱导特异性粘膜免疫。无论疫苗的形式，通常耙抗原需要经粘膜部位接种，才能被粘膜APC摄取提呈，激活粘膜免疫系统，诱导粘膜免疫。已知粘膜接种抗原的瓶颈在于粘膜局部纤毛的频繁物理摆动可迅速清除外来抗原；粘膜局部存在大量酸性溶液，富含水解酶、DNA酶等，可迅速降解外来抗原。因此粘膜部位接种抗原由于被迅速清除和降解，不能在粘膜局部有效停留，使不足以被APC提呈，不能诱导有效的粘膜免疫应答。即使诱导，其应答程度非常低下。针对以上抗粘膜感染病原体粘膜疫苗的重要性，以及发展粘膜免疫的主要技术难点，我们认为研制粘膜疫苗的关键在于以下三点1)必须发展安全和有效的粘膜递送系统，来递送靶抗原疫苗(特别是DNA疫苗)。该系统应当满足安全无毒性、缓释性、亲粘膜性、通用性。2)必须添加粘膜佐剂，有效增强粘膜免疫的诱导。3)必须发展有效的粘膜免疫方法，如免疫途径、免疫程序、免疫剂量、间隔时间，使能够有效地诱导粘膜免疫。对于柯萨奇病毒性心肌炎这种特殊的由CVB3粘膜感染导致的疾病，目前尚无有效的预防和治疗疫苗问世。有报道编码CVB3结构蛋白的DNA疫苗经肌肉免疫可诱导lgG和特异性CTL，具有一定的免疫保护能力。我们前期的研究表明DNA疫苗经肌肉注射免疫不能诱导特异性粘膜免疫，因此不能有效预防病毒性心肌炎发生。其机制是裸露DNA在粘膜局部被DNA酶等很快降解，无法在粘膜局部进入细胞进行有效表达，不能表达一定量的抗原，则不能诱导粘膜免疫应答。因此我们的目的是如何通过运用粘膜递送体系，来递送DNA疫苗，进行粘膜免疫，从而诱导粘膜SlgA。本发明的柯萨奇病毒性心肌炎粘膜疫苗的核心疫苗是编码CVB3主要结构抗原VP1(852bp)的DNA疫苗/基因疫苗(pcDNA3.1-VP1)。因此如何应用我们研制的通用粘膜递送系统，有效递送该DNA疫苗，是研制病毒性心肌炎疫苗的关键。欲解决的关键问题如下1)利用上述的通用粘膜递送系统，有效递送DNA疫苗。2)利用上述的粘膜佐剂的应用，以及上述粘膜免疫方法的应用，摸索一种最佳组合，有效诱导CVB3特异性SlgA和lgG，预防病毒性心肌炎发生。
发明内容本发明的目的在于提供一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统要解决现有技术中粘膜部位接种抗原时，抗原不能在粘膜局部有效停留、不足以被APC提呈、不能诱导有效的粘膜免疫应答的技术问题。本发明一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，含有靶抗原纳米颗粒和粘膜佐剂纳米颗粒两个组份，所述的靶抗原纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与靶抗原编码质粒DNA组成，所述的粘膜佐剂纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与粘膜佐剂编码质粒DNA组成。进一步的，所用的脱乙酰壳多糖的分子量在380000420000之间，脱乙酰度为75%-85%。进一步的，所述的靶抗原是粘膜感染病原体的优势抗原，进一步的，所述的靶抗原是CVB3结构蛋白VP1。进一步的，所述的CVB3结构蛋白来源于CVB3Nancy株，所述的CVB3结构蛋白的基因长度为852bp。进二步的，所述的粘膜佐剂是淋巴细胞趋化因子。进一步的，所述的靶抗原编码质粒DNA是以pcDNA3.1或pVAX载体，在所述的pcDNA3.1或pVAX载体插入编码靶抗原的基因。进一步的，所述的粘膜佐剂编码质粒DNA是以pcDNA3.1或pVAX载体，在所述的pcDNA3.1或pVAX载体插入编码粘膜佐剂的基因。本发明的目的还在于提供一种制备上述含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统的方法，所述的方法包括以下步骤-(1)选择靶抗原，构建质粒靶抗原编码质粒；(2)以脱乙酰壳多糖与-耙抗原编码质粒DNA以共聚沉淀方法制备脱乙酰壳多糖靶抗原纳米颗粒；(3)以趋化因子lymphotactin为粘膜佐剂，构建佐剂编码质粒；(4)以脱乙酰壳多糖与佐剂编码质粒DNA以共聚沉淀方法制备脱乙酰壳多糖-Ltn佐剂纳米颗粒；(5)脱乙酰壳多糖-靶抗原纳米颗粒与脱乙酰壳多糖-Ltn佐剂纳米颗粒共同组成权利要求1所述的粘膜递送系统。进一步的，所述的脱乙酰壳多糖靶抗原纳米颗粒通过如下方法制备，将0.010.04%浓度、PH5.5—5.8的脱乙酰壳多糖溶液，与50~400|ig/ml编码靶抗原的质粒DNA溶液在50—60。C下，以13000—17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳多糖溶液中，所述的脱乙酰壳多糖的分子量在380000420000之间，脱乙酰度75%85%，所述的质粒DNA由pcDNA3.1或pVAX载体构建，所述的质粒DNA溶解在5mM25mM的Na2S04中，通过共聚交联作用，获得的脱乙酰壳多糖-耙抗原纳米颗粒为球形，直径在50200nm之间。进一步的，所述的脱乙酰壳多糖-Ltn佐剂纳米颗粒通过如下方法制备，将0.010.04%浓度、PH5.5—5.8的脱乙酰壳多糖溶液，与50400|ig/ml编码Ltn的质粒DNA溶液在50—6CTC下，以13000—17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳多糖溶液中，所述的脱乙酰壳多糖的分子量在380000420000之间，脱乙酰度75%85%，所述的质粒DNA由pcDNA3.1或pVAX载体构建，所述的质粒DNA溶解在5mM25mM的Na2S04中，通过共聚交联作用，获得的脱乙酰壳多糖-Ltn佐剂纳米颗粒为球形，直径在50200nm之间。本发明还提供了另一种制备含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统的方法，该方法可有效增强经粘膜途径接种上述含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其中，1)首先粘膜部位接种粘膜佐剂纳米颗粒；2)24小时后，在同一部位接种合适剂量的靶抗原纳米颗粒；3)间隔两周，重复1)+2)的组合免疫；4)经3_4次1)+2)的组合免疫，靶抗原DNA总量在150200lag之间。进一步的，本发明所述的免疫方法是以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。本发明还提供了一种根据上述含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统制备的粘膜疫苗，可用于防治柯萨奇病毒性心肌炎，所述的这种粘膜疫苗含有两个组份，其中一个组份是以脱乙酰壳多糖与编码CVB3结构蛋白VP1的质粒DNA通过共聚交联形成的脱乙酰壳多糖-VP1纳米颗粒，另一个组份是以脱乙酰壳多糖与编码淋巴细胞趋化因子的质粒共凝聚形成的脱乙酰壳多糖-LTN纳米颗粒。进一步的，所述的靶抗原是CVB3结构蛋白VP1。进'步的，所述的CVB3结构蛋白来源于CVB3Nancy株，所述的CVB3结构蛋白的基因长度为852bp。进一步的，所述的脱乙酰壳多糖分子量在380000420000之间，脱乙酰度75%85%。迸7步的，所述的与编码CVB3结构蛋白VP1的质粒DNA中以pcDNA3.1载体，在所述的pcDNA3.1载体插入编码CVB3结构蛋白VP1。进一步的，所述的编码淋巴细胞趋化因子的质粒是以pcDNA3.1或pVAX载体，在所述的pcDNA3.1或pVAX载体插入编码淋巴细胞趋化因子。脱乙酰壳多糖(chitosan，化学名为P-(1—4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)是甲壳类动物来源的天然生物多糖，是几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物，完全无毒，具有生物可容性和生物可降解性。更重要的是脱乙酰壳多糖天然带正电荷，可与带负电荷的粘膜天然静电吸附，因此具有增强粘膜黏附吸收作用；此外还具有促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被广泛用于药物赋形剂与缓释剂。以合适分子量和脱乙酰度的脱乙酰壳多糖与质粒DNA在特定的浓度、温度、pH值、振荡速度条件下，可形成大小不一的共聚复合物。本发明以特定性质的脱乙酰壳多糖制备特定溶液，与特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制备了直径在50-200nm的纳米颗粒复合物。具体选择0.02%浓度、PH5.7的脱乙酰壳多糖(分子量约400000，脱乙酰度75%85%)溶液，与40(^g/ml编码靶抗原的质粒DNA(pcDNA3.1载体构建)溶液(5mMNa2S04),在55X:下，以15000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，制备了脱乙酰壳多糖-耙抗原纳米颗粒。淋巴细胞趋化因子(lymphotactin，LTN)是C族趋化因子，由活化的CD8+T细胞(包括表皮内YST细胞)和NK细胞分泌，在维持粘膜的完整性和增强粘膜免疫中发挥重要的作用，同时对CD8+T和NK细胞具有重要的趋化作用，因此对清除病毒感染至关重要。更为重要的是，Ltn可激活粘膜及脾脏内CD4+T细胞，促使其分泌大量Thl或Th2细胞因子，有效辅助T细胞或B细胞免疫应答。因此Ltn通过激活CD4+T细胞，可同时促进固有免疫与获得性免疫的诱导，同时又由于共同粘膜免疫系统性质，促进粘膜免疫和全身免疫的诱导。Lto与蛋白质抗原联合鼻内注射后，发现SIgA分泌增加。本发明研制的含有粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖通用粘膜递送系统包括两个组分脱乙酰壳多糖一靶抗原纳米颗粒，作为粘膜疫苗；脱乙酰壳多糖-Ltn纳米颗粒，作为粘膜佐剂。粘膜疫苗与粘膜佐剂均以脱乙酰壳多糖-DNA纳米颗粒形式实现粘膜递送。本发明和己有技术相比，本发明选择LTN作为粘膜佐剂，利用其趋引T细胞到达疫苗给予粘膜部位、促进CD4+Th应答等性质，来增强特异性粘膜免疫应答的诱导。Ltn佐剂以脱乙酰壳多糖-Ltn纳米颗粒形式递送至粘膜部位，使缓释和不被降解，有效发挥粘膜佐剂作用。本发明的一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统可用于多种经粘膜感染病原体的预防或治疗性疫苗的粘膜递送。本发明的疫苗可有效诱导CVB3特异性粘膜SIgA和全身IgG的免疫。图1是pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-Ltn的构建示意图。图2是pcDNA3.1-VP1的PCR和酶切鉴定电泳图，其中，M:DNAmarker;1:pcDNA3-VPl经HindIII/BamHI双酶切；25:PCR鉴定；2:T7u/T7d引物；3:KV1/KV2引物；4:T7-1/KV2引物；5:KV1/T7-2引物。图3是pcDNA3.1-Ltn的PCR和酶切鉴定电泳图；其中，1:Marker;2:ConA活化脾细胞RT-PCR扩增LTN;3:pcDNA3.1-LTNPCR扩增LTN;4:pcDNA3.1-LTN经BamHI和Xhol双酶切；5:pcDNA3.1-LTN经BamHI单酶切；6:为pcDNA3.1经BamHI和XhoI双酶切鉴定。图4是pcDNA3.1-VP1的体外表达图。图5是pcDNA3.1-Ltn的体外表达图，其中，1:SP2/0-pcDNA3.1國LTN;2:为SP2/0陽pcDNA3.1;3:SP2/0;4:pcDNA3.1-LTN(阳性对照)。图6是chitosan-VP1和chitosan-Ltn共聚复合物的扫描电镜图示，其中，A是脱乙酰壳多糖一靶抗原纳米颗粒示意图，B为脱乙酰壳多糖-Ltn纳米颗粒的示意图；C为chitosan-VP1扫描电镜图；D为chitosan-Ltn扫描电镜图。图7是chitosan-VP1联合chitosan-LTN滴鼻免疫诱生CVB3特异性抗体血清lgG的示意图。图8是chitosan-VP1联合chitosan-LTN滴鼻免疫诱生CVB3特异性肠道SlgA的示意图。图9是3XLD50剂量CVB3感染小鼠7天后小鼠心肌组织的HE染色图，其中，A.chi-VP1+chi-LTNi.n;B.chi-(VP1+LTN)i.n;C.chi-VP1+pcDNA3.1-LTNi.n;D.chi-VP1+pcDNA3.1i.n;E.chi-pcDNA3.1i.n。图10是3xLD50病毒感染后小鼠的体重减轻率比较图。具体实施例方式本发明采样的6-8周龄雄性BALB/c(H-2d)小鼠购自复旦大学实验动物中心，清洁级饲养。CVB3(Nancy株)由中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室杨英珍教授惠赠,也可由国家疾病控制部门获得。动物词养及操作符合国家相关规定。实施例1Hela细胞培养及CVB3病毒传代本发明的人宫颈癌细胞系Hela细胞按常规方法培养，以含10%NBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和硫酸卡那霉素的RPMI-1640培养基在37。C、6。/。C02条件下培养，隔天传代。以100iLilCVB3病毒冻存液感染约5x1C)SHela细胞，培养40hr后800/。细胞被复制病毒裂解，将液体及细胞碎片以3000rpm/min离心20min，所得上清即新鲜CVB3悬液。实施例2CVB3病毒的LD5e(半数致死量)滴定取出生48hr的BALB/c乳鼠，分为8组，每组5只小鼠，将新鲜制备的CVB3悬液以NS以IO倍递次稀释法依次稀释为10"、10'2、10—3、10—4、l(T5、l(T6、l(T7、l(T8，分别取40pl经腹腔注射8组乳鼠，逐日观察乳鼠存活情况，按病毒学常规方法计算该批次CVB3病毒的LDs。效价。距离比例=(>50%的死亡百分数一50)/(>50%的死亡百分数一<50%的死亡百分数)11)5()二>50%的死亡率稀释度的对数(Log)十距离比例本试验中同一批次内CVB3的LDso效价为10-55/1,实施例3耙抗原基因和粘膜佐剂基因质粒DNA的构建及体外表达、功能鉴定(1)(如图1所示)靶抗原质粒和粘膜佐剂编码质粒的构建以CVB3结构蛋白VP1为靶抗原为例，以趋化因子Ltn为粘膜佐剂为例，构建了以pcDNA3.1为载体(或pVAX载体)的pcDNA3.1-VPl和pcDNA3.1-Ltn质粒。其中，VP1cDNA序列根据文献(KlumpWM，etal.Wro/,1990，64(4):1573-1583);LTN的基因序列来源于NCBIGeneBank(NM-008510)具体如下agcccagcaagacctcagccatgagacttctcctcctgactttcctgggagtctgctgcctcaccccatgggttgtggaaggtgtggggactgaagtcctagaagagagtagctgtgtgaacttacaaacccagcggctgccagttcaaaaaatcaagacctatatcatctgggagggggccatgagagctgtaatttttgtcaccaaacgaggactaaaaatttgtgctgatccagaagccaaatgggtgaaagcagcgatcaagactgtggatggcagggccagtaccagaaagaacatggctgaaactgttcccacaggagcccagaggtccaccagcacagcgataaccctgactgggtaacagcctccaggacaatgtttcctcactcgttaagcagctcatctcagttccca犯cccattgcacaaatacttat加atttttaacgacattcacattcatttcaaatgttataagtaataaatatttattattg。2)自新鲜培养的CVB3中经RT-PCR获得CVB3VP1基因。设计VP1上下游引物KV1:5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTGGAAGACGCG-3';KV2:5'-CGGGATCCTTACTAAAATGCGCCCGTATTTGTC-3'。合成pcDNA3.1载体上下游引物T7-1:5'-CGATGAAGATCTCT-3';T7-2:5'-CGATGAAGATCTCT-3'。按上海华舜生物公司RNAexReagent&SystemKit提取病毒RNA，CVB3总RNA以20nlDEPCH2O溶解，-70GC保存。cDNA逆转录按上海生工生物公司2-NFirstStrandcDNASynthesisKit进行总体积20卩l，5pl病毒RNA，力日1piOligodT、6ulDEPC水，700C5min;于4。C加缓冲液4|jl、dNTP2iJl、Rnase抑制剂1|jl，37。C5min，加MMLV逆转录酶1|JI，370C60min，700C10min，得cDNA，-200C保存。特异引物PCR扩增总体积25pi'水13.3ul、10xPCR2.5yl、50mmol/LMgCI21.5(jl、2.5mmol/LdNTP0.5(jl、10pmol/|jlKV画1/KV-2引物各0.5jjI、TaqDNA聚合酶1U、cDNA模板5|jl。反应条件94°C5min，940C1min，58DC2min，720C2min，35循环，720C10min。得VP1基因。3)自ConA活化的小鼠脾细胞经RT-PCR获得LTN基因。取BALB/c小鼠脾脏，以Tris-NhUCI除红细胞，调浓度为5x106/ml，加ConA(终浓度5|jg/ml)，37°C、5%002孵箱活化12小时。收集5x106个细胞，采用上海华舜生物公司RNAexReagent&SystemKit抽提细胞总RNA，20(jlDEPC水溶解。cDNA逆转录按上海生工生物公司2-NFirstStrandcDNASynthesisKit进行cDNA-20QC保存备用。设计LTN上下游引物LTN-1:5'-5'-CGGGATCCGCCACCATGAGACTTCTCCTCCT-3';LTN-2:5'-CCGCTCGAGGGAGGCTGTTACCCAGT-3'。PCR产物即LTN基因。4)胶回收经RT-PCR所得VP1基因和Ltn基因电泳琼脂糖内RT画PCR产物以GoldenBeadsDNAGelPurificationKit纯化回收，每10mg胶力口400jjISolutionS液、20|jlGoldenBeads,65。C10min;12000rpm离心1min，去上清，力口500|jlWashSolution,12000rpm离心1min，去上清，50°C5min;以20|jl曰utionBuffer洗脱，37。C2min，12000rpm离心1min，上清含回收VP1DNA和LtnDNA。5)回收VP1DNA以Hindlll、BamHI双酶切总体积2CM，，10xK2|jl，DNA5mI，Hindlll、BamHI各1U，37。C5hr，走1.07。琼脂糖电泳，割胶经GoldenBeads回收VP1双酶切产物；同理将pcDNA3.1质粒(lnvitrogen公司)以Hindlll、BamHI双酶切，酶切产物回收、定量。回收LtnDNA以BamHI、Xhol双酶切、粗略定量。6)VP1、Ltn酶切片段与pcDNA3.1酶切载体连接按摩尔比3:1连接，总体积10iJl，h207.5pl，10x1jjI，pcDNA3.1双酶切产物1jjI，VP1或Ltn酶切产物0.5jJ,Ligase1U，16。C5hr，转化DH5a，筛阳性单克隆。7)质粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-Ltn的鉴定分别经PCR、酶切和DNA测序来鉴定。PCR鉴定以T7-1/T7-2、T7-1/KV-2以及T7-2/KV-1为正反向引物鉴定VP1插入；以T7-1/Ltn-2、T7-2/Ltn-1鉴定Ltn插入；以HindIII、BamHI双酶切pcDNA3.1-VP1，以XhoI、BamHI双酶切pcDNA3.1-LTN。由上海申友DNA测序服务中心进行DNA测序鉴定。8)pcDNA3.1-VP1的鉴定pcDNA3.1-VP1经Hindlll、BamHI双酶切可切出877bp条带；以不同引物经PCR扩增可得到884-1067bp不等条带，构建正确(如图2所示)。pcDNA3,1-LTN的鉴定pcDNA3.1-LTN质粒经BamHI、XhoI双酶切可切出369bp条带；PCR得到376bp条带，构建正确(如图3所示)。鉴定结果表明，VP1基因和Ltn基因被有效构建于真核表达载体中9)如图4所示，pcDNA3-VP1的体外表达以LipofactamineTM-2000Kit辅助转染pcDNA3-VP1质粒进Hela细胞，收集培养上清包板，ELISA法检测VP1蛋白表达加1:20鼠抗VP1、HRP-羊抗小鼠lgG，显色，测OD490nm。结果显示VP1基因在24、48、72hr均可表达。10)如图5所示，pcDNA3.1-LTN质粒经电转染SP2/0细胞后，G418筛选稳定转染株。以RT-PCR方法检测Ltn表达，结果显示pcDNA3.1-LTN可在SP2/0细胞中有效表达。实施例4粘膜佐剂LTN的趋化功能将稳转pcDNA3.1-LTNSP2/0上清以PEG20000浓縮20-25倍，加入趋化池(美国Neuroprobe);将正常脾细胞悬液(2*106/ml)加入上室中孵育4小时。滤膜甲醇固定，瑞氏姬姆萨染色，计数趋化细胞并计算趋化指数(Cl)=实验组趋化细胞数/对照组趋化细胞数。结果显示pcDNA3.1-LTN稳转SP2/0细胞上清可有效趋化脾细胞跨膜移动，Cl=2.875;而对照pcDNA3.1质粒稳转细胞上清或正常细胞上清则无趋化活性，Cl<1。(如下表所示)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例5chitosan-VP1和ehitosan-Ltn纳米颗粒的制备1)质粒DNA的大量制备依照QIAGENPlasmidMegaKit进行。2)分别制备chitosan溶液和pcDNA3.1-VPl或pcDNA3.1-Ltn溶液，方法如下首先制备0.02%、pH5.7的chitosan溶液，称取0.02gchitosan(Fluka，MW约400000，脱乙酰度75%—85%)，先以500^1~1ml1%HAc溶液将其缓慢溶解，37。C放置lhr。而后称取0.042gNaAc,以80mlH2O溶解，加入上述已彻底溶解的chitosan溶液，混匀后，以1NNaOH调节pH值至5.7等，此即0.02%、pH5.7的chitosan溶液。pcDNA3.1-VPl或pcDNA3-Ltn质粒以5mMNa2S(V溶解，DNA浓度为lmg/ml，-20()(:保存备用。3)采用共沉淀法(共凝聚法)制备chitosan-DNA纳米颗粒，方法如下在55。C水浴中，将0.02%、pH5.7的chitosan溶液逐滴滴入400ug/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡20秒，即可形成均一略带混浊的chitosan-DNA纳米颗粒。4)以扫描电镜观察新鲜制备的chitosan-VPl和chitosan-Ltn共凝聚复合物，发现新鲜制备的溶液均匀分布球型、形态均一的颗粒，直径约为50200nm(如图6所示)。实施例6靶抗原纳米颗粒chitosan-VP1联合粘膜佐剂纳米颗粒chitosan-Ltn滴鼻免疫可诱导CVB3特异性全身和粘膜抗体应答1)小鼠滴鼻免疫方法及血清、粪便收集以纳米颗粒chitosan-VPl+chitosan-Ltn为病毒性心肌炎粘膜疫苗，将6-8周BALB/c雄鼠分为chitosan-VP1+chitosan-LTN、chitosan國(VP1+LTN)、chitosan-VP1+pcDNA3.1-LTN、chitosan-VP1、及chitosan-pcDNA3.15组，每组6只小鼠。滴鼻免疫程序如下以0.75%戊巴比妥钠80~120^1经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。以含有50pg质粒DNA的chitosan-Ltn佐剂纳米颗粒溶液逐滴滴入小鼠两侧鼻腔；24小时后，以同样方法滴入含有50pg质粒DNA的chitosan-VP1纳米颗粒。隔两周免疫，共免疫4次。每隔两周经眼眶后眦静脉采血，并收集小鼠粪便，按100mg/ml溶解于5%脱脂牛奶—PBS溶液(lug/mlaprotinin、lmMPMSF)。2)CVB3特异性血清IgG和肠道SlgA的ELISA检测ELISA方法以10ug/mlCVB4VPl237249多肽、包被液(0.1MNa2CO3,pH9.6、0.1%BSA)4"C包板;以5%milk-PBS封闭;依次加1:40稀释血清及粪便原液、HRP-羊抗小鼠lgG、IgA、OPD，显色中止，测OD490nm。chitosan-VP1联合chitosan-LTN组在4周即可诱生了较高水平的特异性lgG，第6周OD值达0.92，且随时间推移IgG水平逐渐升高，抗体效价在第10周时高达6000。而单独chitosan-VP1仅在第6周开始诱生血清lgG，且OD为0.46，第10周IgG效价约为1400，明显低于前者。更为重要的是chitosan-VP1联合chitosan-LTN组更有效诱生了粘膜SlgA的分泌，第6周OD值达0.834，而单独chitosan-VP1组为0.4;当粘膜佐剂Ltn以质粒DNA形式而不是以纳米颗粒形式滴鼻免疫时，发现也可增强肠道SlgA的诱导，6周OD值为0.46，但是效果明显不及Ltn以纳米颗粒(chitosan-Ltn)形式滴鼻免疫。提示chitosan-VP1联合chitosan-LTN佐剂纳米颗粒粘膜疫苗经滴鼻免疫不仅可诱生高水平血清igG，还可增强肠道局部SlgA的产生，且粘膜佐剂Ltn的最佳滴鼻形式是制备为chitosan-Ltn纳米颗粒，可有效发挥粘膜佐剂效果，增强chitosan-VP1粘膜疫苗诱导的肠道SlgA(如图7和图8所示)。实施例7新型病毒性心肌炎粘膜疫苗chitosan-VP1联合粘膜佐剂chitosan-Ltn纳米颗粒可有效预防柯萨奇病毒性心肌炎以末次疫苗免疫后28天(4次免疫后第4周)，以致病毒性心肌炎感染剂量3xLD5o活CVB3病毒100ul经腹腔感染小鼠，7天后取小鼠左心室，制备石蜡切片。如图9心肌细胞HE染色显示未免疫小鼠和chitosan-pcDNA3.1对照组小鼠心肌细胞呈严重的灶性坏死，伴弥漫性淋巴细胞浸润，显示显著的柯萨奇病毒性心肌炎。chitosan-VPl滴鼻小鼠的心肌细胞间质偶尔见有水肿，心外膜有少量炎性浸润，病毒性心肌炎发病率约为16%;而chitosan-VPl联合粘膜佐剂chitosan-Ltn纳米颗粒滴鼻免疫组无小鼠发病，心肌几乎和正常小鼠一样，提示可100%有效预防病毒性心肌炎的发生。图10显示病毒感染后4天小鼠的体重减轻率chi-VP1+chi-LTN组体重减轻幅度最小；心肌损伤(CK值)最低；提示预防病毒性心肌炎的效果最好。证实新型病毒性心肌炎粘膜疫苗chitosan-VP1联合粘膜佐剂chitosan-Ltn纳米颗粒滴鼻免疫具有十分有效的防治病毒性心肌炎的作用。权利要求1.一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统含有靶抗原纳米颗粒组份和粘膜佐剂纳米颗粒组份，所述的靶抗原纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与靶抗原编码质粒DNA组成，所述的粘膜佐剂纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与粘膜佐剂编码质粒DNA组成。2.如权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所用的脱乙酰壳多糖的分子量在380000420000之间，脱乙酰度为75。/。-85%。3.如权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所述的靶抗原是粘膜感染病原体的优势抗原。4.如权利要求3所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所述的靶抗原是CVB3结构蛋白VP1。5.如权利要求4所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所述的CVB3结构蛋白来源于CVB3Nancy株，所述的CVB3结构蛋白的基因长度为852bp。6.如权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所述的粘膜佐剂是淋巴细胞趋化因子。7.如权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所述的靶抗原编码质粒DNA是pcDNA3.1或pVAX载体，在所述的pcDNA3,1或pVAX载体插入编码靶抗原的基因。8.如权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，其特征在于所述的粘膜佐剂编码质粒DNA是pcDNA3.1或pVAX载体，在所述的pcDNA3.1或pVAX载体插入编码粘膜佐剂的基因。9.一种制备如权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤(1)选择靶抗原，构建质粒耙抗原编码质粒；(2)以脱乙酰壳多糖与-靶抗原编码质粒DNA以共聚沉淀方法制备脱乙酰壳多糖靶抗原纳米颗粒；(3)以趋化因子lymphotactin为粘膜佐剂，构建佐剂编码质粒；(4)以脱乙酰壳多糖与佐剂编码质粒DNA以共聚沉淀方法制备脱乙酰壳多糖淋巴细胞趋化因子佐剂纳米颗粒；(5)脱乙酰壳多糖-靶抗原纳米颗粒与脱乙酰壳多糖-淋巴细胞趋化因子佐剂纳米颗粒组成权利要求1所述的粘膜递送系统。10.如权利要求9所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统的制备方法，其特征在于所述的脱乙酰壳多糖一靶抗原纳米颗粒通过如下方法制备，将0.010.04%浓度、PH5.5—5.8的脱乙酰壳多糖溶液，与50~400ng/ml编码靶抗原的质粒DNA溶液在50—6CTC下，以13000—17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳多糖溶液中，所述的脱乙酰壳多糖的分子量在38000420000之间，脱乙酰度75%85%，所述的质粒DNA由pcDNA3.1或pVAX载体构建，所述的质粒DNA溶解在5mM25mM的Na2S04中，通过共聚交联作用，获得的脱乙酰壳多糖-靶抗原纳米颗粒为球形，直径在50200nm之间。11.如权利要求9所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统的制备方法，其特征在于所述的脱乙酰壳多糖-淋巴细胞趋化因子佐剂纳米颗粒通过如下方法制备，将0.010.04%浓度、PH5.5—5.8的脱乙酰壳多糖溶液，与50~400ng/ml编码淋巴细胞趋化因子的质粒DNA溶液在55°C下，以13000—17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳多糖溶液中，所述的脱乙酰壳多糖的分子量在380000420000之间，脱乙酰度75%85%，所述的质粒DNA由pcDNA3.1或pVAX载体构建，所述的质粒DNA溶解在5mM25mM的Na2S04中，通过共聚交联作用，获得的脱乙酰壳多糖-淋巴细胞趋化因子佐剂纳米颗粒为球形，直径在50200nm之间。12.—种制备如权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统的方法，其特征在于1)首先接种粘膜佐剂纳米颗粒；2)24小时后，在同一粘膜部位接种合适剂量的耙抗原纳米颗粒；3)间隔两周，重复1)+2)的组合免疫；4)经3—4次1)+2)的组合免疫，靶抗原DNA总量在150200(ig。13.如权利要求12所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统的制备方法，其特征在于以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。14.一种根据权利要求1所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统制备的粘膜疫苗，其特征在于所述的粘膜疫苗含有两个组份，其中一个组份是以脱乙酰壳多糖与编码CVB3结构蛋白VP1的质粒DNA通过共聚交联形成的脱乙酰壳多糖-VP1纳米颗粒，另一个组份是以脱乙酰壳多糖与编码淋巴细胞趋化因子的质粒共凝聚形成的脱乙酰壳多糖-淋巴细胞趋化因子纳米颗粒。15.如权利要求14所述的粘膜疫苗，其特征在于所述的脱乙酰壳多糖分子量在38000420000之间，脱乙酰度75%85%，所述的CVB3结构蛋白VH来源于CVB3Nancy株，所述的CVB3结构蛋白的基因长度为852bp。16.如权利要求14所述的粘膜疫苗，其特征在于所述的与编码CVB3结构蛋白VP1的质粒DNA中以pcDNA3.1或pVAX载体，在所述的pcDNA3.1或pVAX载体插入编码CVB3结构蛋白VP1。17.如权利要求14所述的粘膜疫苗，其特征在于所述的编码淋巴细胞趋化因子的质粒是pcDNA3.1或pVAX载体，在所述的pcDNA3.1或pVAX载体插入编码淋巴细胞趋化因子。18.—种如权利要求14所述的粘膜疫苗的免疫方法，其特征在于1)首先粘膜接种脱乙酰壳多糖-LTN纳米颗粒；2)24小时后，在同一部位接种脱乙酰壳多糖-VP1纳米颗粒；3)间隔两周，重复1)+2)的组合免疫；4)经3—4次1)+2)的组合免疫，VP1DNA总量在15020mug。19.如权利要求18所述的免疫方法，其特征在于以滴鼻或口服方式实施粘膜部位接种。全文摘要一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，含有靶抗原纳米颗粒和粘膜佐剂纳米颗粒两个组份，靶抗原纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与靶抗原编码质粒DNA组成，粘膜佐剂纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与粘膜佐剂编码质粒DNA组成。根据该粘膜递送系统制造的粘膜疫苗，含有两个组份，一个是以脱乙酰壳多糖与编码CVB3结构蛋白VP1的质粒DNA通过共聚交联形成的脱乙酰壳多糖-VP1纳米颗粒，另一个是以脱乙酰壳多糖与编码淋巴细胞趋化因子的质粒共凝聚形成的脱乙酰壳多糖-LTN纳米颗粒。利用上述的粘膜递送系统进行粘膜免疫，有效诱导了CVB3特异性全身IgG和肠道SIgA的分泌，有效预防柯萨奇病毒性心肌炎的发生。文档编号A61K9/00GK101204364SQ20061014757公开日2008年6月25日申请日期2006年12月20日优先权日2006年12月20日发明者艳岳,薇徐,熊思东申请人:复旦大学