高度减毒的痘病毒株、其生产方法及其作为副免疫诱导物或用于生产载体疫苗的用途的制作方法

专利名称：：高度减毒的痘病毒株、其生产方法及其作为副免疫诱导物或用于生产载体疫苗的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及高度减毒的动物痘病毒、由其制备的副免疫(paramimity)诱导物和基于高度减毒的动物痘病毒林的载体疫苗。由于高度减毒的方法，本发明的高度减毒动物痘病毒不具有毒力和致免疫特性。本发明的另一方面涉及生产这种高度减毒动物痘病毒林的方法及其作为用于诱导副免疫(即激活动物和人的非特异性(副特异性)免疫系统)的副免疫诱导物，或者作为免疫哺乳动物或人的载体疫苗的用途。本发明的高度减毒动物痘病毒还适用于预防和治疗多因素(常为慢性)疾病。本发明优选的实施方案涉及痘病毒科所有属的高度减毒动物痘病毒林，所述林系已经从感染动物分离出来并且通过一系列传代高度减毒。本发明的动物痘病毒林具有优良的副免疫特性，毒力和免疫特性已经由于本发明的高度减毒方法而丧失。哺乳动物的内源性免疫系统可以分为抗原特异性和抗原非特异性(副特异性)部分。免疫系统的抗原特异性部分包括如抗体或特异性免疫细胞。抗原特异性机制负责建立特异性免疫，而抗原非特异性负责建立副免疫。抗原非特异性免疫系统(或"先天免疫系统")的副特异活性包括非选择性细胞和可溶性保护成分如补体溶菌酶系统和调节性细胞因子级联，以及细胞保护成分如粒细胞、小噬细胞和巨噬细胞、天然杀伤细胞、非抗原条件化(non-antigen-conditioned)T'淋巴细胞、树突细胞等。副免疫性指非特异性防御系统调节良好并发挥最佳功能的状态，它赋予生物针对大量不同病原、抗原和其它有害物(noxae)的迅iliL生的、限时的、增强的保护。在与有害物(即内源性或外源性有害物质)接触后可立即在相关生物中检测到副特异性活性，在转化的内源细胞中则为约2至6小时后，而抗原特异性免疫系统的作用只有在5至8天(细胞特异性免疫)或者甚至几周(抗体)之后才出现。由此获得了额外的时间来建立针对不能通过副免疫活性中和的抗原的特异性防御反应。因此，副特异性防御4吏得生物有可能在面对一系列外源物质、传染性病原体、毒素和转化的内源细胞后立即(即不损失时间)产生防御(AntonMayr,"Paramunisierung:EmpMeoderWissenschaft",Biol.Med.，edition26(6):256-261,1997)。因此，副特异性免疫防御是生理过程，可以定义为对包含有害物质的环境的"主要屏障"。这种形式的防御不仅对低等生物是不可替代的，对^达的和高JL^达的生命形式也尤其是这样。因此，这种生物防御系统中的原发性先天缺陷可能导致危及生命的情形。其实例是人"切东综合征(ChediakSteinbrinck-Higashisyndrome)，，，其特征是粒细胞缺陷和天然杀伤细胞(NK细胞)机能障碍，并且在大多数情况下导致患者在十岁前死亡。副免疫状况的特征为吞谨作用速率提高、自发性细胞介导的细胞毒性(NK细胞)功能提高以及其它非抗原特异性淋巴网状细胞的活性提高。同时释放特定的细胞因子，其对细胞成分以及彼此之间具有刺激和/或抑制效应(例如通过阻遏物机制)，即具有最佳的调节效应。这种紧密相连的逐步式副免疫应答生物系统及其多种受体、效应物和靶细胞以及信号传导分子信使(细胞因子)还与激素和神经系统彻底连接，在一些情况下甚至与血管和代谢系统连接。因此，它是每个生物从出生开始就天生存在的防御网络的交流、互相作用和调节的重要组分。因此，自然界从一开始就为所有生物提供了适当的保护。在种系发生过程中，最初M出的只是副特异性，即非特异性防御系统。只有在进化的后期才逐步发展出特异性免疫系统。副免疫医学上由所谓副免疫诱导物通过副免疫作用(paramunization)诱导。医学副免疫作用通过激活免疫系统副特异性部分的细胞成分和与其相关的细胞因子形成来实现，目的在于消除机能障碍、迅速提高个体的病原体和抗原非特异性保护(最佳生物调节)、消除由于应激或其它方式(例如药物上的)造成的免疫抑制或免疫缺陷、修复缺陷和/或发挥免疫、激素和神经系统之间调节器的作用(AntonMayr,"Paramunisierung:EmpirieoderWissenschaft，，,Biol.Med.，edition26(6):256-261，1997)。这意味着某些非特异性内源防御过程可以被提高、补充或抑制，取决于副免疫作用和应答性，比如患者的防御状态。副免疫诱导物本身是蛋白质，即它既不与抗体相当，也不于化学品、抗生素、维生素或激素相当。相反，它像催化剂一样通过逐步机制活化副特异性免疫系统，以便后者充分动员细胞和体液防举P机制。副免疫i秀导物在这种情况下对免疫防御既有调节效应也有修复效应。关于副免疫诱导物的作用模式，已知它们被吞噬细胞(受体细胞)摄入，所述细胞由此活化并释放介体，如细胞因子，其继而动员效应细胞。欧洲专利EP0669133Bl中描述了副免疫i秀导物，其基于两种或更多来自具有副免疫性的不同动物痘病毒林的常规减毒动物痘病毒组分的组合。这些副免疫诱导物所基于的动物痘病毒林已经用常规方式减毒，即处于病毒的毒力(尤其是免疫特性)已经减弱但是没有完全丧失的减弱状态下。本发明第一次提出了完全消除简单减毒的动物痘病毒林的毒力和免疫原性的新方法。这在下文中称为"高度减毒"法。本发明基于以下病毒首次显示了痘病毒的这种高度减毒正痘病毒骆駝痘病毒(Orthopoxviruscameli)和缺肢畸形病毒(Orthopoxvirusmuris)、野兔痘病毒粘液瘤病毒(Leporipoxvirusmyxomatosis)、禽痘病毒鸡痘病毒(Avipoxvirusgallinae)和金丝雀痘病毒(Avipoxvirusserinis)以及富'J痘病毒腺掩病毒(Parapoxvirusovis)。本发明的示例性实施方案涉及正痘病毒W"駝痘病毒林h-M27和野兔痘病毒林粘液瘤病毒林h-M2的高度减毒。迄今为止尚未实施或描述这些痘病毒林的减毒或高度减毒。其它优选的实施方案还涉及其他正痘病毒林，以及副痘病毒林和禽痘病毒林(见下文)。简单的常规减毒已经显示用于正痘病毒(0W/w/7ov:v/ms)属(在痘苗病毒ankaraMVA的情形下)，A.Mayr,H.Stickl，H.K.Mtiller，K.DannerandH.Singer,1978:"DerPockenimpfstammMVA"，Zbl.Bakt.Hyg.，I.Abt.Orgi.B167，375fi3卯；Mazr,A.，1999:"GeschlichtlichertFberblickuberdieMensche叩ocken(Variola),dieEradikationvonVariolaunddenattenuiertenPockenstammMVA"，Berl.Mtinchen.TierSrytlWschr.112，32215328;用于禽痘病泰Avipoxvirus)属HP1和KP1，A.Mayr，F.Hartwig，andI.Bazr，1965:"EntwicklungeinesImpfstoffesgegendieKanarienpockenaufderBasiseinesattenuiertenKanarienpockenkulturvirus",Zbl.Vet.Med.B12,41-49;A.MayrandK.Malicki,1996:"AttenuierungvonvirulentemHtihnerpockenvirusinZellkulturenundEigenschaftendesattenuiertenVirus",Zbl.Vet.Med.B.13,1-13;用于副痘病毒(Parapoxvirus)属ORF-1701,A.MayrandM.Biittner,19卯"Ecthzma(ORF)virus":In:Z.DinterandB.Morein(eds.):Virusinfectionsofvertebrates,vol.3;Virusinfectionsofruminants,ElsevierSciencePublishers,B.V.Amsterdam。下文更详细地解释了通过本发明方法高度减毒的一些动物痘病毒林骆駝痘病毒骆駝痘病毒是危险的骆駝病毒性疾病的病原体，其具有周期性的全身性病程，并且其特征为皮瘆，优选头、颈和咽喉区域的皮肤和翁膜以及四肢和腹股沟区域出现的皮渗(Munz,E.,1999:"Poxandpox画likediseasesincamels",Proc.1stInt.CamelConf.1，43-46)。如果有足够大的敏感种群，则所述疾病以2至3年的周期出现。骆駝科(Ow^//^^)的两个属(羊驼(lama)和骆駝)优先被骆駝痘病毒感染(Mayr,A.AndCzernyC.P"19卯"Camelpoxvirus",In:DinterZ.andMoreinB.(eds.):"Virusinfectionsofvertebrates",vol.3:PublishersB.V.Amsterdam)-骆乾属包含单峰雜(CVi附e/Mst/ra附M"r/Ms)和双峰雜(Ca膨/"s1/erws6fl"nVmws)。单峰雜和双峰駝主要出现在所谓"旧大陆"(沙漠，北非、阿拉伯、蒙古的大草原)国家，而羊驼的优选栖息地为南美。骆鸟它痘病毒(OW/w/7oxv/rascfl/we//)与天花病毒(人天花(痘症)的病原体)的关系特别密切。骆駝痘病毒对人无致病性。与所有经典痘病毒类似，骆駝痘病毒是砖形的并且具有特征性表面蛋白，其负责病毒或其组分的免疫和副免疫特性。取决于属和林系，平均大小为纵向280nm,横向约180腿(Otterbein，C.K.,1994:"Ph纽o-undgenotypischeUntersuchungenzweierKamelpoxvirus-IsolatevorundnachAttenuierungdurchZellkulturpassagen",Vet.Med.Diss.Munich)。骆駝痘病毒的基因组由线性双链DNA组成。两个DNA链在基因组末端共价结合在一起，使得病毒DNA形成连续的多核苷酸链。粘液瘤病毒粘液瘤病毒是粘液瘤的病原体，粘液瘤是在野兔和家兔中周期性发生展的传染性全身性病毒疾病，其特征是在头和全身出现广泛的(在一些情况下是出血性的)皮下水肿，不同于任何其它传染病，其优先在肛门区域、外阴和tube出现。在原来没有这种疾病的国家引入粘液瘤会导致迅速且致命的H在病毒变成地方性之后，该疾病的特征发生变化，直至感染在临床上不明显(MayrA.:MedizinischeMikrobiologie，Infektions-undSeuchenlehre，7thedition,Enke-Verlag,Stuttgart,2002)。该疾病在专有地占据新大陆的棉尾兔(5>/W/^"s)属的美洲棉尾兔中间传播。这种野兔形成了该疾病仅有的天然库。在它们中间这种感染表现出温和的形式。相反，对于也在澳洲归化的欧洲Orj;cto/Ms属家兔和野兔，若引入该病原体，则该疾病几乎是100%致死的。粘液瘤病毒(Z^70/^/70XV/n^属)的天然宿主范围非常有限。一般而言，该病毒仅在美洲棉尾兔以及欧洲家兔和野兔中复制。然而，在欧洲野生兔身上也已经观察到了少量感染。转移到其它动物物种和人的尝试结果为阴性。禽痘病毒由禽痘病毒(尤其鸡痘病毒和金丝雀痘病毒)引起的传染以相似的方式A艮。鸡痘来源于亚洲，已经有几千年的了解。它们分布在4Ht界，并且抗性非常高。传播通过i^v皮肤伤口进行。叮咬昆虫可能也参与传播。该疾病的潜伏时间为4至14天。有两种形式，划分为所谓的皮肤形式和粘膜形式。皮肤形式的特征是在头、鸡冠、颈和足上有水泡或结痂的结节。粘膜形式在舌上、味、喉、气管和眼的粘膜上有浅黄白色沉积物。金丝雀痘病毒感染的潜伏时间为3至16天。疾病爆发之后，大多数家畜在仅仅几小时之内死亡。感染的鸟类在角的部位和喙的角上显示结节。发生大规模的呼吸障碍，气道中病毒引起的干酪状沉积物使鸟类迅速窒命已经通过在鸡胚成纤维细胞培养物中连续传代得到了禽痘病毒的减毒林，并且已经用于接种鸡。研究最多并且最易得到的林系是抹系HP-l(A.MayrandK.Malicki,1966:"AttenuierungvonvirulentemHtihnerpockenvirusinZellkulturenundEigenschaftendesattenuiertenVirus",Zbl.Veg.Med.B13，1-13)。在鸡胚成纤维细胞中传代200次以上产生了减毒病毒，但其仍然能够复制，并且在静脉内或气雾剂给药时对鸡仍然保持致病性。传代400次以上的病毒认为没有致病性，并且认为是用于哺乳动物的高效并且极端安全的载体。有可能实现免疫而无需完成病毒的生产性复制。发明目的迄今为止已经通过常规减毒弱化的动物痘病毒林导致副免疫特性提高，并且病毒及其组分的毒力和免疫特性降低。然而，常规减毒中，动物痘病毒林并未丧失全部毒力和免疫特性。免M应仍然存在于具有简单减毒动物痘病毒林的哺乳动物中。推测这与简单减毒的稳定性过低相关，或者是在简单减毒的动物痘病毒情况下减毒程度过低。因此，本发明是基于提供动物痘病毒林的目的，所述动物痘病毒林是稳定的，显示出高度减毒，并且其中以使其完全失去毒力和免疫特性、从而可用作无害的副免疫诱导物和载体疫苗的方式修饰所述痘病毒。根据本发明，这个目的可以通过附带的权利要求书的主题来实现。已经惊奇地发现，简单减毒的动物痘病毒林通过在选定的允许细胞培养物中用连续噬斑终末稀释(plaqueterminaldilution)传代的额外减毒步骤来修饰，使其完全丧失毒力和免疫能力，而不损害其复制能力。本发明的动物痘病毒g进一步限制了其宿主范围。另外，病毒基因组中由高度减毒引起的缺失使得可以引入外源抗原。由高度减毒引起的免疫性蛋白丧失使其他的副免疫蛋白活化，它们以显著方式提高这些林系的副免疫活性。这样，得到了高活性且无害的副免疫诱导物，甚至在短期频繁重复给药时也不会引起任何变态反应或其它免疫原性副作用。因此，根据本发明方法高度减毒的动物痘病毒林非常适合作为副免疫诱导物或用于制备载体疫苗。
发明内容本发明涉及高度减毒的动物痘病毒林及其用作副免疫诱导物或用于生产载体疫苗的用途。高度减毒的动物痘病毒林的具体实施方案是粘液瘤病毒和骆駝痘病毒的林系。特别优选保藏号为05040602的骆駝痘病毒林h-M27和保藏号为05040601的粘液瘤病毒林h-M2。所述病毒保藏在公共卫生实验室服务(PHLS)保藏研究所、应用微生物及研究中心(CAMR)、欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，PortonDown,Salisbury,Wiltshire,UnitedKingdom。本发明的其它实施方案涉及以下病毒的高度减毒金丝雀痘病毒(Avipoxvirusserinis)，优选毒林KP1，缺肢畸形病毒(Orthopoxvirusmuris)，优选毒林Miil以及鸡痘病毒(Avipoxvirusgallinae)，优选病毒抹HP1和富'J痘病毒(Parapoxvirusovis)。在本发明发现的动物痘病毒林高度减毒中，病毒林的毒力及其免疫特性与常规减毒的动物痘病毒#4目比完全丧失。因此，本发明的高度减毒动物痘病毒不再有任何残余的毒力或免疫原性。因此，所述高度减毒的动物痘病毒特别适于用作副免疫诱导物或用来制备载体疫苗。本发明还涉及生产本发明的高度减毒痘病毒林的方法。优选的痘病毒林A^于正痘病毒属、禽痘病毒属、兔痘病毒属和副痘病毒属的病毒林。根据本发明，痘病毒林的高度减毒通过使常规减毒的病毒林在优化的选定永久细胞系(例如VERO细胞)、原代细胞培养物(例如鸡胚成纤维细胞(FHE)的细胞培养物)、孵化的鸡蛋或实验动物中进行额外的噬斑终末稀释传代(即转移并持续)来实现。已经惊奇地发现，与常规减毒的病毒林相比，通过额外的传代使得所述动物痘病毒及其组分丧失了毒力和免疫原性。在选定细胞体系或培养物中进行传代，直至获得理想的特性，即直至动物痘病毒不再具有任何毒力或免疫原性，而是显示出非特异性免疫系统(副免疫)的提高。这一般通过在优化的细胞体系比如VERO细胞传代培养物(ATCCCCL-81、WHO,美国典型培养物保藏中心)中至少传代300至500次来实现。这种优化的细胞体系提供了必要的高感染效价。表3中列出了动物痘病毒林的高度减毒所产生的其它理想的生物、遗传和免疫特性。本发明用于生产高度减毒动物痘病毒的方法一般可通过下列步骤定义(a)使动物痘病毒适应允许细胞体系(例如由10日龄鸡胚的尿嚢绒膜(CAM)组成的细胞体系)或细胞培养物(例如義羊肾细胞培养物)；(b)在多种允许细胞体系(尤其AVIVER或VERO细胞)中通过长期传代转移并持续待减毒的动物痘病毒，以使最佳感染效价成为可能；(c)在最佳细胞体系(优选VERO、AVIVER或MA细胞)中转移并持续待减毒的动物痘病毒约100至300代，例如IOO、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、l卯、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、2卯、295或300代，(c)中使用的细胞体系优选与(b)中使用的细胞体系不同；(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少卯代，例如95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、l卯、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、2卯、295、300代或更多，优选噬斑终末稀释传代。在特别优选的实施方案中，所述高度减毒的正痘病毒林是高度减毒的骆驅痘病毒(Of幼o/wxv/mscfl附e//)，特别是高度减毒的病毒林h-M27。使骆駝痘病毒高度减毒的优选方法包括下列步骤(a)在羔羊肾细胞培养物中培养分离的骆駝痘病毒约2至4代；(b)在VERO细胞传代(ATCCCCL-81、WHO,美国典型培养物保藏中心)中转移并培养所述动物痘病毒约5至10代；(c)在MA细胞中转移并培养所述动物痘病毒约114至约150代；(d)在VERO细胞中再转移并培养所述动物痘病毒约267代或更多，例如270、275、280、285、2卯、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、3卯、395、400代或更多，优选噬斑终末稀释传代。这样产生的动物痘病毒可以用于生产副免疫诱导物和载体疫苗。在制备中使用能够复制的病毒收获物。本发明的其它实施方案涉及高度减毒的野兔痘病毒林粘液瘤病毒(丄e/wn—xv/ms考A:o附fltosis),病毒林h-M2。4吏这种粘液瘤病"^林(优选病毒林h-M2)高度减毒的优选方法包括下列步骤(a)通过10天龄鸡胚的尿嚢绒膜(CAM)从患病动物进行分离，并在这个体系中持续至少2代或更多，例如3、4、5、6、7、8、9、10代或更多；(b)在VERO细胞培养物中转移并持续所分离的动物痘病毒至少120代或更多，例如125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180代或更多；(c)在AVIVER细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少24代或更多，例如25、30、35、40、45、50、55、60代或更多；(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少157至200代；(e)在MA细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少114至150代；(f)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少179代。通过P-丙内酯处理来灭活病毒收获物，以生产副免疫i秀导物。本发明还涉及药物组合物，其包含不同来源的一种或多种高度减毒痘病毒林的组合，并且适当时在其中加入了药物载体。因此，本发明另一方面涉及一种或多种本发明的高度减毒动物痘病毒林(例如组合)或高度减毒动物痘病毒林的组分用于激活哺乳动物或人副特异性免疫系统，从而用于预防和治疗的用途。在本发明的另一方面中，使用高度减毒的动物痘病毒生产载体疫苗；对于该目的使用能够复制的病毒收获物。在这种情况下，将编码外源抗原的核酸引入载体(动物痘病毒)核酸中由于高度减毒而产生的缺失之一中，以使所述外源基因可由所述栽体表达。这样得到的外源蛋白提供免疫表位，从而刺激内源特异性防御系统。定义术语传染性病原体(例如病毒、细菌、真菌)的"减毒"(减毒减弱、减轻)原则上指其毒力和免疫特性的降低。具体地，取决于减毒程度，从基因技术上讲为与缺失出现相关的分子量减少，从而其核酸缩短，从生物学上讲为与毒性和传染性相关的致病特性的降低或丧失，从免疫学上讲为免疫原活性的丧失和副特异性潜能的提高，从临床上讲为宿主范围的限制和宿主副特异性防御反应活性的提高。"高度减毒"指简单减毒但仍然有部分毒力和免疫力的病原体的进一步减弱，直至其毒力和免疫潜力完全丧失，高度减毒导致对宿主范围的极端限制。高度减毒大大增强了副免疫潜力。就其已丧失的毒力和免疫特性的复活而言，高度减毒的痘病毒比常规减毒的林系更稳定，即不可能反转。高度减毒的动物痘病毒林与常规减毒的动物痘病毒林的区别从基因技术上讲为病毒核酸分子量进一步降低，核酸中的缺失增加；从生物学上讲为完全丧失毒力和传染性，这些病毒抹同时在允许宿主体系中获得与常规减毒的毒林相比更高的最佳感染效价；从免疫学上讲为免疫原性完全丧失，从分子生物学上讲为细胞因子受体(例如干扰素和某些白介素的受体)丧失。术语"毒力"和"毒力特性"在本发明中意义相同。毒力指在确定的感染M下，致病物种的特定林系在特定宿主中引发疾病特性的程度。毒力的程度在物种的林系中可广泛变化。区分为高毒力、弱毒力和无毒力(非毒力)毒林。宿主和环境条件的变化也可能导致株系毒力的变化，但是也可能保持不便。因此，宿主的防御、宿主菌群的解剖环境和生理环境、环境温度、湿度等可以以协同或拮抗方式发生作用。每种固有致病物种在自然界中存在很多毒力不同的林系。毒力的存在或丧失可以在本领域技术人员已知的测试系统中评估，并且与各自的动物痘病毒相关。本发明的动物痘病毒对人类宿主没有任何毒力。术语"致病性"指传染性病原体或多细胞寄生物的这种能力其在侵入之后能在宿主中粘附并相同地复制，导致功能能力的局部或全面受损(机能丧失)，并且引起传染病。由于感染性疾病的发生取决于病原体和宿主，因此术语致病性涉及病原体-宿主系统，而不仅仅是涉及病原体。致病性与病原体的物种相关，与变种、林系或集落无关。这是基本的特性、能力，能够发挥作用，但不一W挥作用。对于特定的病原体-宿主系统，致病性物种不能天然变成非致病性的，因为整个物种的这种基本能力没有丧失。术语"免疫原性，，和"免疫特性"在本发明中意义相同。动物痘病毒的免疫原性指动物痘病毒诱导脊推动物(优选病毒的天然宿主)或人产生细胞特异性和/或体液免疫应答的能力，例如诱导刺激T细胞增殖和/或抗体产生。本发明的高度减毒动物痘病毒免疫原性的丧失与这种能力的丧失相关。免疫原性或其丧失可以在本领域技术人员已知的测试系统中进行研究。"载体疫苗"(重组疫苗、杂交疫苗)指由两种组分组成的疫苗微生物携带者(载体)以及已将其编码核酸引入所述载体的免疫抗原。由于其大量的核酸缺失和副免疫特性，(高度)减毒的动物痘病毒是合适且优选的微生物载体。引入的外源基因核酸由疫苗中的载体表达，引起特异性免疫应答的形成。"副免疫诱导物"(副特异性疫苗)指由减毒的、无毒力的和灭活的动物痘病毒组成、旨在用于副免疫人和动物的生物调节性产物，所述动物痘病毒根据减毒程度，现在只包含残留的免疫特性(常规减毒)或没有免疫特性(高度减毒)。它们像常规特异性疫苗那样生产并进行功能性装配，但是区别在于它们主要激活副特异性(非特异性)防御机制，而且通过其生物调节特性导致等动力学(homeodynamic)防御系统。具体实施例方式概括本发明基于这一令人惊奇的发现，即常规减毒动物痘病毒林的毒力和免疫性可以通过在允许细胞培养物、孵化的鸡蛋或实验动物中额外的噬斑终末稀释传代来降低至完全丧失。这样高度减毒的病毒林对于这些特性的潜在复活而言是稳定的。这种皿了简单、常规减毒的方法在本发明中称为"高度减毒"。这些高度减毒的动物痘病毒林明显优于常规减毒病原体。具体而言，如表3中总结的，高度减毒的动物痘病毒株与常规减毒的动物痘病毒林的区别从基因技术上讲是病毒核酸分子量的降低和核酸缺失的增加；从生物学上讲是毒力和传染性的丧失；从免疫学上讲是免疫原性的丧失，从分子生物学上讲是细胞因子受体的丧失。痘病毒科所有被检测的减毒动物痘病毒林(无论其属于哪个属)都可以被常规减毒并且随后以高稳定性进一步弱化(见表1和2)，这是一个意想不到的发现。在本发明中通过例如正痘病毒、野兔痘病毒和禽痘病毒属的代表显示了这种高度减毒，但是不应认为仅限于这些属。本发明还首次描述了粘液瘤病毒和骆駝痘病毒的高度减毒。感染性病原体为了适应环境变化(例如在细胞培养物或非天然宿主体系中生长)而进行改变的能力可以在实验上用来显著减少高度减毒所需的时间。这优选通过在一般不属于天然宿主范围的特定允许宿主体系(例如实验动物、细胞培养物、营养培养基)中长期传代来进行。痘病毒林的高度减毒通常需要约15至30年。通过下文详细描述的高度减毒方法，高度减毒的痘病毒林还丧失了其特异性免疫能力，而其副特异性活性4皮特异性增强。因此，高度减毒的痘病毒林适合作为副免疫诱导物或用来生产载体疫苗。推测副特异性的增强可归因于动物痘病毒中免疫和副免疫蛋白的共同干扰。由高度减毒引起的免疫蛋白的丧失使得其它副免疫蛋白活化，它们显著提高这些病毒林的副免疫活性。这样得到了高活性且无害的副免疫诱导物，甚至在短期频繁重复给药时也不会引起任何变态反应或其它免疫原性副作用。通常，简单、常规减毒导致毒力和传染性降低、导致宿主范围受限和病原体基因组的微小变化，同时分子量降低并在病毒基因组末端区发生缺失。另外，特异性免疫活性降低，副特异性活性提高。然而，高度减毒显著增强这些效果，使得得到的高度减毒病毒在稳定性、宿主特异性、毒力和免疫原性的丧失方面优于常规减毒的病毒(表3和4)。高度减毒的动物痘病毒在一个方面中，本发明涉及基于痘病毒科动物痘病毒林的高度减毒动物痘病毒，其特征在于所述动物痘病毒不再具有任何毒力和免疫特性，并且与常规减毒动物痘病毒^M目比，所述高度减毒动物痘病毒显示更小的病毒核酸分子量、末端区域更频繁缺失而且细胞因子受体的丟失更多。已知的减毒动物痘病毒在病毒基因组的一个或两个末端区中具有0至3个缺失。然而，多种单纯减毒的动物痘病毒林中的缺失数是不同的，从而本发明的高度减毒动物痘病毒在病毒基因组末端区中显示的缺失数比筒单减毒的动物痘病毒多1、2、3、4、5个或更多。在本发明优选的实施方案中，本发明的高度减毒动物痘病毒在末端区共显示5、6、7、8、9、IO个或更多的缺失。优选显示更频繁的缺失，优选在右侧区中至少2个缺失并在左侧区中至少2个缺失。在本发明高度减毒动物痘病毒的优选实施方案中，病毒基因組显示丟失干扰素a和Y的细胞因子受体。对于动物痘病毒而言，尤其优选额外还缺乏IL-1P和/或TH1细胞的受体。在优选的实施方案中，动物痘病毒的病毒基因组比野生型的病毒基因组小16%、17%、18%、19%,特别优选约20%。所述缺失优选位于动物痘病毒基因组的一个或两个末端区中。在优选的实施方案中，本发明的高度减毒动物痘病毒可以通过下列方法获得(a)使动物痘病毒适应允许细胞体系或细胞培养物，特别是羔羊肾细胞或CAM细胞；(b)通过在多种允许细胞体系中长期传代来转移并持续待减毒的动物痘病毒，以使最佳感染效价(如在VERO细胞中)成为可能，特别是持续约5至10代；对于粘液瘤病毒的情况，优选进行至少100次、优选至少110次、至少120次、至少130次或更多次VERO细胞传代，随后在AVIVER细胞培养物中进行至少20次、优选至少24次中间传代，并且再进行VERO细胞传代；(c)在最佳细胞体系中(例如在MA-104细胞、VERO细胞或AVIVER细胞中)转移并持续待减毒的动物痘病毒约100至300代，特别是持续200至300代；和(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少卯代，优选至少100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、2卯、300代或更多。噬斑纯化传代优选在(b)、(c)和(d)的一个或多个步骤中进行。高度减毒方法常规减毒(以及高度减毒的第一步)开始于使分离的动物痘病毒适应同源或异源的允许细胞体系，比如细胞培养物、孵化的鸡蛋或实验动物。随后通过在多种允许细胞体系中长期传代来减毒。对每个痘病毒种特异性地选择适用于每种病毒林的允许细胞体系。根据特定细胞体系中病毒的感染效价进行选择。此外，选择用于传代的细胞体系在病毒的特定种中将产生最高的感染效价。本领域技术人员能够通过现有技术中已知的方法来确定这种细胞体系(尤其是细胞系)。同时这也对应于最佳感染效价。通过在这些最佳细胞体系中持续约100至300代来继续进行减毒，具体地，持续110、120、130、140、150、160、170、180、l卯、200、210、220、230、240、250、260、270、280、2卯或30(M戈。1^是特征为3至5次噬斑终末稀释传代的终末期。该材料可进一步加工用于其他用途。本文描述的所有正痘病毒、野兔痘病毒、副痘病毒和禽痘病毒代表均可以用常规方式减毒。通过在同源或异源允许宿主体系中对简单、常规减毒的病毒林继续传代来进行其后的高度减毒。宿主体系的选择进而取决于动物痘物种，并且根据上面提到的方面(感染效价)来进行选择。例如，通过在VERO细胞中持续简单减毒的正痘病毒或在鸡胚成纤维细胞(FHE)中持续简单减毒的禽痘病毒来进行高度减毒。痘病毒(例如缺肢畸形病毒、骆駝痘病毒)优选通it^VERO细胞培养物中至少60至300次传代来高度减毒，这取决于特定的病毒林(例如150或260次传代)。野兔痘病毒粘液瘤病毒林通it^MA和VERO细胞培养物中至少再传代约150至300次、优选2卯次来高度减毒。禽痘病毒鸡痘病毒林通过在FHE细胞培养物中再传代约100至150次、优选传代98次来高度减毒。副痘病毒^it过再传代100至160次、优选164次来高度减毒(表3和4)。优选使用所谓的噬斑终末稀释法进行病毒林的传代(即转移和接种)。一般而言，使用原代鸡胚成纤维细胞培养物(FHE)来高度减毒禽痘病毒属，永生化MA-104猴肾细胞(缩写MA细胞)或VERO细胞传代(ATCCCCL-81,WHO,美国典型培养物保藏中心)和许多其它细胞体系用于所有其它属，比如正痘病毒属、野兔痘病毒属和副痘病毒属。优选使用全合成培养基培养MA或VERO细胞培养物，尤其优选MEM培养基("基本必需培养基")，其包含5%至20%、优选10%的BMS(血清代用品培养基)和5%至20%、优选10%的乳白蛋白水解物。与培养基交换之后，优选使用的病毒培养基是含有5%至20%、优选10%的乳白蛋白水解物、无BMS、无胎牛血清并且无抗生素的MEM培养基。所有生产方法均优选在7.0至8.0的pH值、优选7.25的pH值下进行。优选使用效价为105至108TCID5。/ml、优选至少107'5TCID5Q/ml的病毒收获物作为制备高度减毒动物痘病毒林的起始材料。痘病毒在VERO细胞中的复制引起典型的致细胞病变效应，导致感染细胞的破坏(裂解)。使用约10MOI("感染复数")的起始接种剂量时，短暂的圆形期(roundingphase)(l至2天)之后是约3天的网状细胞结构，然后在约5天后细胞裂解。得自最后一次传代的病毒收集物可以针对其用途适当地进一步加工。例如，可以重组克隆病毒中存在的核酸来生产载体疫苗。或者可以例如通过在4匸下加入2.5%的明胶来将高度减毒的病毒收获物冻干并保存以用于其他用途，例如作为副免疫诱导物。对于医学和治疗适应症，可以检查冻干物的无害性和活性。高度减毒的正痘病毒在优选的实施方案中，可将下文以骆駝痘病毒作为实例描述的高度减毒方法用于正痘病毒正痘病毒骆駝痘病毒，h-M27在羊胚肾细胞培养物中将分离自患病动物脓疱物质的骆駝痘病毒(如病毒林M27)培养约2代。通过适当的方法，优选通过噬斑末端稀释法将这样培养的动物痘病毒转移到VERO细胞中，并且在其中持续约5代。传代至VERO细胞培养物中之后，使最后的细胞培养传代适应MA细胞(MA-104猴肾细胞)并且持续约114代。这样得到的第121次噬斑纯化的MA传代(共计284次传代)已经被证实是简单减毒的。可以在这次传代(即简单减毒)的分离物中观察到对同源宿主的毒力下降、宿主范围受到限制、感染效价提高、细胞培养物中致细胞病变效应的巨细胞减少以及特异性免疫原活性的少量降低。由于动物痘病毒在简单减毒之后仍然存在的免疫特性，简单减毒的骆駝痘病毒还适用于针对人天花的肠胃外接种或作为针对骆驼痘的疫苗(O.-R.Kaaden，A.Walz，C.P.CzernyandU.Wernery,1992:"Progressinthedevelopmentofacamelpoxvaccine",Proc.ltthInt.CamelConf"1，47-49)。骆駝痘病毒林M27可以通过在VERO细胞中持续减毒毒林来实现高度减毒。为此，有必要再进行至少另外50至150次传代，优选100次噬斑纯化的VERO传代。这样得到的高度减毒骆駝痘病毒h-M27(h=高度减毒的)已证实极为稳定。因此，生产本发明的高度减毒的骆駝痘病毒总共需要约384次细胞培养物传代。然而，在这种情况下，确切的传代数不应认为是限制的。本领域技术人员应该理解，对本文描述的方法和所用参数尤其是细胞传代数或用于高度减毒动物痘病毒林的细胞系进行的改良在本发明的范围之内。通过本发明方法得到的高度减毒骆駝痘病毒株h-M27显示出对同源宿主毒力和传染性的完全丧失，以及VERO细胞中的高感染效价(10725TCID5。/ml)。因此，其特别适于用作副免疫疫苗(副免疫诱导物)。另夕卜，基于高度减毒动物痘病毒的副免疫诱导物以能够复制的形式和灭活的形式均可使用。在灭活形式中，如下文所述用P-丙内酯来处理高度减毒的病毒(V.Fachinger，T.Schlapp,W.Strube，N.SchmeerandA.Saalmtiller，2000:"Pox-virus國inducedimmunostimulatingeffectsonporcineleukocytes",Arch.Virol.136,219-226;MayrA.，1999:"ParaspezifischenVaccinenausPockenviren(ParamunitStsinducer):"EineneueArtvonImpfstoff"，Arztezschr.Naturheilverf.40,550-557;Mayr,A.2000:"ParaspezifischeVaccine—EineneueArtvonImpfstoffenzurRegulationvonDysfunktioneninverschiedenenK6rpersystemen，，,Erfahrungshdlkunde(EHK)49，591-598)。简单减毒时，病毒基因组的长度已经由于出现缺失而明显缩短。起始病毒(野生型)基因组的长度约为193卯Obp,而减毒M27病毒林的基因组长度约为172400bp。因此，常规减毒导致DNA中核苷酸的显著丢失。用限制性酶HindIII进行限制消化显示，在分析胶中基因组的限制片段少4个(OtterbdnC.K.，1994,Vet.Med.Diss.Munich)。在这种情况下在病毒基因组的右侧端有两个缺失，左侧端有两个缺失。病毒基因组中央的保守区4呆持不变(C.Gubser,S.Hue,P.KellamandG.L.Smith,2004:"Poxvirusgenomes:aphylogeneticanalysis",J.Gen.Virol.85,105-117)。病毒基因组的长度通过高度减毒从172400bp(减毒病毒)进一步缩短至160300bp。缺失数从4升至5(基因组的左侧端区段中两个，右侧端区段中三个)，病毒基因组中央的保守区保持稳定。高度减毒进一步引起干扰素a和y的受体以及其他白介素受体的丟失，还令人惊奇地《1起造血干细胞的活化。兔痘病毒粘液瘤，粘液瘤病毒h-M2本发明的另一实施方案中，使用粘液瘤病毒林M2进行高度减毒。仍然在CAM细胞中传代，1^进行几次VERO和AVIVER细胞传代，最后在VERO细胞中再进行传代。在优选的实施方案中，由高度减毒的粘液瘤病毒生产副免疫诱导物的方法包括下列步骤(a)通过10天龄鸡胚的尿嚢绒膜(CAM)从患病动物中进行分离，并且在这个体系中持续至少2代或更多，例如3、4、5、6、7、8、9、10代或更多；(b)在VERO细胞培养物中转移并持续所分离的动物痘病毒至少120代或更多，例如125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180代或更多次；(c)在AVIVER细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少24代或更多，例如25、30、35、40、45、50、55、60代或更多;(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少157至200代；(e)在MA细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少114至150代；(f)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少179代。在另一实施方案中，用于减毒的粘液瘤病毒来自患有典型粘液瘤的欧洲野兔(00^to/^ws属)的edematoussubcutis(左耳)，通过在孵化10天的鸡蛋(VALO蛋)的尿嚢绒膜(CAM)中培养来分离粘液瘤病毒，并在传代中使其在CAM中适应三次，通过HerrlichA.,MayrA.andMunzE.:"DiePocken"，2ndedition,GeorgThiemeVerlag，Stuttgart,1967的方法实现。第一个阶段使第三次CAM传代适应VERO细胞120代以上(ATCCCCL-81、WHO,美国典型培养物保藏中心)，第二个阶段通过AVIVER细胞培养物中的24次中间传代进行复制，第三个阶段再在VERO细胞中培养。为了減毒目的，共计进行了约300次传代。这些连续终末稀释传代之后，最初的毒力粘液瘤病毒-皮减毒。高度减毒的粘液瘤病毒林M2通过在VERO细胞中持续已减毒的病毒林来获得。为此，有必要在VERO细胞中再进行约250至350次传代，优选300次噬斑纯化传代。与高度减毒的骆駝痘病毒*4目似，这样得到的粘液瘤病毒林h-M2(h=高度减毒的)被证实是极其稳定的。它同样显示出对同源宿主的毒力和传染性完全丧失、高感染效价(10675CID5。/ml)，免疫原性完全丧失、副免疫活性提高、宿主范围进一步受限、基因组进一步缺失并丢失多种干扰素和白介素的受体。高度减毒的正痘病毒的特性本发明的高度减毒的动物痘病毒林特征如下1.生物稳定性提高；2.毒力和传染性丧失，甚至对2至3日龄幼鼠(肠胃外、腹膜内)也是如此；3.肠胃外和皿内给药之后特异性免疫原性丧失；4.完全限制了宿主范围；5.减毒的病毒在VERO细胞中的感染效价提高；6.强副免疫活性(能够复制并且灭活的)；7.减毒动物痘病毒的基因组长度缩短；分子量相应地降低；8.末端区中的缺失数增加；9.干扰素a和Y的受体和其它白介素的受体丢失；10.活化itjfc干细胞。与高度减毒相比，常规减毒所需细胞传代数和细胞类型汇编于表3。通常高度减毒需要在各种允许宿主体系中进行100至约300次以上的传代。完全减毒需要约15至30年的时间。表3和表4以疫苗病毒、病毒林MVA为例显示常规减毒与本发明高度减毒之间的生物学;s^因技术差异。因此，在病毒基因组的末端区(反向末端重复)中频繁出现缺失，并且分子量由于4^t较少而减少。在高度减毒动物痘病毒的情况下，约20%的原始基因组丢失(这也使其特别适于用作载体疫苗，见下文)。还发现了受体(如IL-ip和THl细胞的受体)的丢失、NK细胞活化和造血干细胞形成的提高以及细胞培养物中宿主范围的进一步限制。还存在干扰素a和Y、IL-1、2、6、12和GM-CSA、TNF的增强。最后，高度减毒的动物痘病毒林没有特异性免疫原性，但确实具有提高的非特异性免疫系统(副免疫)活性。对人或动物的毒力完全不存在。将高度减毒的副痘病毒进一步加工成副免疫诱导物由高度减毒的痘病毒林生产副免疫诱导物时，有可能通过使用浓度为0.01%-1%p-丙内酯的p-丙内酯化学处理来进行灭活。在这种情况下优选P-丙内酯浓度为0.05%。如下理想地进4亍P-丙内酯灭活在pH7.8和4匸下搅拌约1小时，随后在37C孵育约4小时并且+4匸孵育过夜。用P-丙内酯灭活导致免疫特性完全丧失，同时副特异性活性大大提高。生产副免疫诱导物时，高度减毒的病毒颗粒优选通过低转速离心(例如1000rpm)来纯化。离心之后，可以加入0.5-10%的琥珀酰化明胶(例如聚明胶肽，可得自例如Hausmann，St.Gallen，Switzerland),优选5%的琥珀酰化明胶。随后可以在适当的无菌玻璃瓶或安瓿中将得到的混合物按份(如1.5ml)冻干，并如所需用蒸馏7jc溶解。溶于蒸馏水的0.5至2ml、优选l.Oml体积的冻干物对应于于人肌内给药的疫苗剂量(还参阅MayrA.AndMayrB.:"VonderEmpiriezurWissenschaft，，，TierSrztl.Umschau，edition57:583-587，2002)。所述冻干产物可以在约+4X:至+8C或较低温度(例如-60X:)下稳定保存无限长时间。高度减毒的动物痘病毒作为副免疫诱导物的用途本发明的另一方面涉及高度减毒动物痘病毒林或高度减毒动物痘病毒林的组分单独或组合地用作副免疫诱导物的用途。实例是能够复制的或灭活的新鲜分离动物痘病毒、以及能够复制的或灭活的并来自新鲜分离的动物痘病毒的重组动物痘病毒、病毒包膜、脱离的包膜以及这些包膜的切割产物和异常(aberrant)形式、单个的天然或重组多肽或蛋白质，特别是分离的动物痘病毒中存在的或通过遗传修饰痘病毒或其部分遗传信息重组表达的膜和表面受体。因此，本发明的另一方面将同一属或另一属的多种高度减毒痘病毒林组合用作副免疫诱导物。由于其最佳副免疫性，高度减毒的动物痘病毒适用于下列人和动物的预防或治疗适应症-多因素感染因素疾病和混合感染、感染过程的慢性表现、顽固性复发感染和化学治疗抗性、细菌和病毒感染；-生物防御系统的防御薄弱和失调；-危及新生儿的感染；-某些肺瘤疾病的辅助治疗，例如防止肺瘤转移、减少化学治疗和放射疗法的副作用；-改善创伤愈合，避免外科手术之后或由损伤造成的二次感染；國素、循环、代谢、血管和神经系统之间内稳态的调节。高度减毒的动物痘病毒通过立即启动副免疫效应来促进病原体相关的无害性，由此中和应激症状、潜伏感染、发热、总体状态的降低和其它可能影响免疫的因素。因此，基于高度减毒动物痘病毒林的本发明副免疫诱导物适于诱导副特异性免疫系统和/或预防或治疗缺陷或多原因传染病。这样的疾病的实例是免疫系统功能障碍、免疫抑制、免疫缺陷疾病、激素、循环、代谢和神经系统之间内稳态的功能紊乱、危及新生儿的感染、肿瘤疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、治疗抗性感染因素疾病、混合性病毒和细菌感染、感染过程的慢性表现、多种起源的肝病、慢性皮肤病、疱瘆性疾病、慢性肝炎、流感感染、内毒素损伤、改善创伤愈合并防止二次感染。本文所述高度减毒动物痘病毒林的给药可以以局部或胃肠外方式进行。副免疫诱导物的局部给药特异性刺激粘膜和皮肤中的副特异性防御机制。然而，还^_存在某种全身性效应。另一方面，胃肠外应用的副免疫作用几乎不影响皮肤和粘膜的局部防御机制。在这种情况下优选包含一种或多种本发明高度减毒动物痘病毒株并在适当时包含可药用载体的药物组合物。这样的载体或添加剂的实例是聚乙二醇、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、硬脂酸镁、羧基多亚甲基(carboxylpolymethylene)、羧甲基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。高度减毒的动物痘病毒作为载体疫苗的用途本发明的另一方面涉及高度减毒的动物痘病毒林用于生产载体疫苗的用途(综述Pastoret,P.-P.AndVanderplasschen,A.,2003)。与常规减毒的病毒糾目比，高度减毒的动物痘病毒林甚至更适于作为生产栽体疫苗的载体，因为它们通过高度减毒而完全丧失其免疫特性。由于病毒基于其感染效价传代，因此缺失位于病毒复制不必需的区域。由于与常规减毒相比，病毒基因组末端区存在的缺失甚至更大，因此高度减毒的动物痘病毒提供了插入待表达外源核酸(DNA)或外源免疫原的足够空间。外源核酸可编码提供免疫表位的肽或蛋白质。然而，本发明不限于特定的肽或蛋白质。本领域技术人员应该理解，可以根据其大小将外源基因克隆进病毒的适当缺失区中。所引入肽或蛋白质的表达可以通过控制元件如启动子以及必要时增强子元件来控制。编码肽或蛋白质的外源核酸的掺入可诱导针对该肽或蛋白质的特异性强免疫刺激特性。这是可以被利用的，例如通过将病毒核酸序列克隆进载体构建体中，所述病毒核酸序列的表达诱导被转染宿主中的免疫应答。作为载体疫苗的重组动物痘病毒的克隆在最后一次噬斑终末稀释传代之后进行。就克隆而言，可以用适当的限制核酸内切酶切割病毒核酸，并且通过标准连接方法与外源核酸序列连接。与使用其它微生物载体的常规疫苗或载体疫苗相比，本发明的载体疫苗的优点在于，它们没有变应性效应并且为经洗脱的特异性抗原提供了调节最佳的免疫系统，这有助于最佳的接种结果。本发明的载体疫苗还没有局部或全身性不良副作用。由于它们利用免疫力完全形成之前的免疫间期，因此它们尤其适用于紧急接种(例如在意外行程之前的急性感染风险的情况下)。接种结果和疫苗无害性可以通过载体动物痘病毒部分的优良副特异性活性来显著提高，这一观察结果是新的，并且使得该毒林有用于生产载体疫苗的前景。因此，基于高度减毒动物痘病毒林的载体疫苗就其活性和无害性而言优于常规载体疫苗。表格索引表l:痘病毒科的成员表2:正痘病毒的分类(正痘病毒属，OVP)表3:常规减毒和高度减毒之间的差异表4:常规减毒与高度减毒的传代数比较表5:使用副免疫诱导物进行治疗的给药方案表6:将高度减毒的粘液瘤病毒h-M2用于副免疫接种的适应症。实施例以下实施例为优选的实施方案，用于进一步解释本发明，但本发明并不旨在仅限于此。实施例1作为生产粘液瘤副免疫诱导物(h-PIND-Myxo)的起始材料，将常规减毒的粘液瘤病毒M2(3次CAM传代、277次VERO传代、24次AVIVER传代=304次传代)再进行114次MA传代和179次VERO传代(共计597次传代)，并由此高度减毒(见表4)。高度减毒兔痘病毒粘液瘤h-M2的VERO病毒收获物的效价为至少106'75CID5Q/ml。这样得到的高度减毒兔痘病毒表现为完全无毒力或免疫特性，并且按以下方式进一步加工成副免疫诱导物用0.05%P-丙内酯灭活病毒收获物(pH7.8,l小时(搅拌))，在37"C、pH7.8(必要时监测pH值，直至pH已调整为7.8)条件下搅拌4小时，孵育过夜(+4X:下静置约12小时)，随后通过低速离心(约4000g，15分钟)进行纯化。向所述灭活的病毒材料中加入聚明胶肽，使得明胶总浓度为2.5%。将这样制备的病毒材料分配到无菌的1.5ml瓶中并冻干。将冻干物保存在+4X:。使用前，将冻干物溶于lml无菌注射用水并通过深肌肉注射给药。表5列出了给药顺序和医学适应症。所述粘液瘤副免疫诱导物适于例如通过副免疫接种进行的带状疱瘆支持性治疗(方式4)。在这种情况下，所述治疗在3至4天后引起该疾病典型性脓疱的^^。在流感前期传染的情况下，使用本发明的副免疫诱导物后发现症状(发热、疲倦、头痛和四肢痛)完全消失。在有创伤损伤(例如手术后)的患者中，使用h-PIND-Myxo观察到不寻常的快速创伤愈合而没有二次感染。在口炎及牙科相关损伤的情况下，涂擦所述冻干物1至2小时之后口疮和伤口消失。实施例2常规减毒的骆駝痘病毒M27(见描述部分)通过在VERO细胞中再进行263次传代来高度减毒(共计384次传代)。将高于107°CID50/ml的病毒收获物作为生产副免疫诱导物的起始材料。为此，以与实施例l类似的方式将病毒收获物灭活、离心和冻干。给药方式和适应症也与实施例1类似。得到的病毒由于高度减毒而不显示毒力或免疫特性。实施例3常规减毒的金丝雀痘病毒(v4w》oxwnViM,KP1，第535次FHE传代)通过在FHE中再进行67次传代来高度减毒(见表4)。第602次FHE传代产物以与实施例1和2类似的方式作为生产副免疫诱导物的高度减毒金丝雀痘病毒。得到的病毒由于高度减毒而不显示毒力和免疫特性。实施例4常规减毒的鸡痘病毒(Avipoxvirusgallinum,HP1,第444次FHE传代)通过在FHE中再进行98次传代来高度减毒。在第542次FHE传代后，证实所述鸡痘病毒HP1是高度减毒的，并以与实施例1的类似方式用于生产副免疫诱导物。得到的病毒由于高度减毒而不显示毒力和免疫特性。实施例5还与前述实施例中所述方法类似地基于粘液瘤病毒(OPVmuris)和副痘病毒生产副免疫诱导物。实施例6使用高度减毒的动物痘病毒林生产载体疫苗。生产栽体疫苗时，在每个生产步骤之后监测pH值是很重要的。pH值应该约为7.8。按照实施例l所述进行用于生产载体的病毒的减毒和高度减毒。在这种情况下，可中需要实现的是针对所述特异性抗原的特异性免疫反应，即免疫力的产生。一般通过适当的限制性酶将外源基因常规地整合进本发明动物痘病毒林中由于高度减毒而产生的缺失核酸区域中。在这种情况下使用标准限制消化和克隆技术。为了分离重組病毒构建体，可以使用适当控制序列控制下的任何(选择)标记基因或选择盒，例如j3-半乳糖苷酶基因。WO00/69455中描述了由动物痘病毒林生产这种载体的方法的实例。该出版物公开内容以及其中包含的关于载体疫苗生产的教导明确地以参考方式并入本文。同样，本文引用的所有其它出版物均以参考方式并入本文。表格总结表l:<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</table>表2:正痘病毒的分类(正痘病毒属，OVP)(根据"7thReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses",2000更新)<table>complextableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>注根据这个仍然不完全的命名法，删除了以下原来包括的种OPVbubali(水牛)、OPVelephant(大象)、OPVequi(马)、OPVcuniculi(兔)表3:常规减毒及高度减毒的MVA病毒林之间的差异(MVA=修饰的Ankara痘苗病毒)原始MVA(在原代鸡胚成纤维细胞培养物中的第572次传代)和VERO-MVA(在永生化VERO细胞培养物(WHO-ATCC，CCL81)中再传代182次)<table>complextableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表4:比较各种动物痘病毒株的常规减毒和高度减毒在各种选定细胞培养物中传代数的实例<table>complextableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表5:用副免疫诱导物进行治疗的给药方案<table>complextableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表6:利用高度减毒的粘液瘤病毒h-M2(b-PIND-MYXO)的副免疫作用的适应症<table>complextableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>文献表1.Smith,G.L.,1994:Virusstrategiesforevasionofthehostresponsetoinfection.TrendsinMicrobiol.2，81-88.2.Mayr,A.,H.Stickl，H.K.Mtiller,K.D咖erandH.Singer,1978:DerPockenimpfstammMVA,Zbl.Bakt.Hyg.,Abt,Orig.B167,375-3903.Mayr，A.，1999:GeschichtlicherOberblickiiberdieMenschenpocken(Variola),dieEradikationvonVariolaunddenattenuiertenPockenstammMVA.Berl.Miinch.TierarztlWschr.112,322-328.4.Mayr，A.，F.Hartwig,andI.Bayr，1965:EntwicklungeinesImpfstoffesgegenKanarienpockenaufBasiseinesattenuiertenKanaraie叩ockenkulturvirus.Zbl.Vet.Med.B12,41-49.5.Mayr，A.andK,Malicki,1966:AttenuierungvonvirulentemHiihnerpockenvirosinZellkul加renundEigenschaftendesattenuiertenVirus.Zbl.Vet.Med.B13，1-13.6.Mayr,A.undM,Biittner,1990:Ecthyma(ORF)virus:In:Dinter,Z.andB.Morein(eds.):Virus.infectionsofvertebrates.Vol.3:Virusinfectionsofruminants.ElsevierSciencePublishersB.V.Amsterdam.Poxandpox-likediseasesincamels.Proc.lslInt.C證lConf.1,43-46.8.Mayr，A,andC.P.Czerny,1990:Camelpoxvirus.In:Dinter,Z.andB.Morein(eds.):Virusinfectionsofvertebrates.Vol.3:Virusinfectionsofruminants.ElsevierSciencePublishersB.V.Amsterdam.9.Otterbein,C,K,，1994:PhSno-undgenotypischeUntersuchungenzweierKamelpockenvirusisolatevorundnachAttenuierungdurchZellkulturpassagen.Vet.Med.Diss.Miinchen10.Kaaden,O.-R.，A.Walz,C.P.CzemyandU.Wemery，1992:Progressinthedevelopmentofacamelpoxvaccine.Proc.lthInt.C咖elConf.1，47-49.11.Gubser，C.,S.Hue,P.KellamandG丄.Smith,2004:Poxvirusgenomes:aphylogeneticanalysis.J.Gen.Virol.85，105-117.12.Fachinger，V.，T.Schlapp，W.Strube，N.SchmeerandA.Saalmiiller,2000:Pox-virus-inducedimmunostimulatingeffectsonporcineleukocytes.丄Virology74,7943-7951,13.F6rster,R.,G.Wolf,andA.Mayr，1994:Highlyattenuatedpoxvirusinducefiinctionalprimingofneutrophilsinvitro.Arch.Virol.136,219-226,14.Mayr，A.,1999:ParaspezifischenVaccinenausTieipockenviren(Paramunitatsinducer):EineneueArtvonImpfstoff.Arztezschr.Naturheilverf.40,550-557,15.Mayr,A.,2000:ParaspezifischeVaccine—EineneueArtvonImpfstoffenzurRegulationvonDysfimktioneninverschiedenenK6rpersystemen.Erfahrungsheilk加de(EHK)49,591-598.16.Mahnel，H.J，Holejsovsky,P,BartakundC.P.Czemy，1993:Kongenitale"Ektromelie"beiPelztierendurchOrthopoxvirusmuris.TierSrztl.Prax.21，469-472.17.Mahnel，H.，1985:SchutzimpfonggegenM汰usepocken.TierSrztl.Prax.13,403-407,18.Rolle,M.undA.Mayr(Hrsg.),2002:MediziniseheMikrobiologie,Infektions-undSeuchenlehre,7.Aufl.EnkeVerlagStuttgart.19.Mahnel，H.簡AttenuierungvonM汪usepockenvirus.Zbl.Vet,Med.B.30,701-710.20.Pastoret,P.-P.undVanderplasschen，A.,2003:ComparativeImmunology,Microbiology&InfectiousDiseases26(2003),343-355.权利要求1.基于痘病毒科动物痘病毒株的高度减毒的动物痘病毒，其特征在于，所述动物痘病毒不再具有任何毒力和免疫特性，并且所述高度减毒的动物痘病毒与常规减毒动物痘病毒株相比具有更小的病毒核酸的分子量、更频繁的末端区域中的缺失以及更多的细胞因子受体丧失。2.根据权利要求l的高度减毒的动物痘病毒，其中所述动物痘病毒显示丧失了干扰素a和Y的细胞因子受体。3.根据权利要求l的高度减毒的动物痘病毒，其中所述动物痘病毒的病毒基因组比野生型病毒基因组小约20%。4.根据权利要求l的高度减毒的动物痘病毒，其中所述痘病毒林为骆駝痘病毒林o5.根据权利要求4的高度减毒的动物痘病毒，其中所述骆駝痘病毒林为保藏号05040602(ECACC)的h-M27毒林。6.根据权利要求l的高度减毒的动物痘病毒，其中所述痘病毒林为粘液瘤病毒林。7.根据权利要求6的高度减毒的动物痘病毒，其中所述粘液瘤病毒林为保藏号05040601(ECACC)的h-M2毒林。8.根据权利要求l的高度减毒的动物痘病毒，其中所述高度减毒的痘病毒林为禽痘病毒林h-HPl。9.根据权利要求l的高度减毒的动物痘病毒，其中所述高度减毒的痘病毒林为缺肢畸形毒林h-Mttl。10.根据权利要求l的高度减毒的动物痘病毒，其中所述高度减毒的痘病毒林可通过以下方法获得(a)使所述动物痘适应允许细胞体系或细胞培养物；(b)在4吏最佳感染效价成为可能的多种允许细胞体系中通过长期传代来转移并持续所述动物待减毒痘病毒；(c)在最佳细胞体系中转移并持续所述动物待减毒痘病毒约100至300代；(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少90代。11.基于痘病毒科动物痘病毒林的副免疫诱导物，其特征在于，所述痘病毒沐故高度减毒并且不再具有任何毒力和免疫特性。12.根据权利要求11的副免疫诱导物，其基于根据权利要求1至10中任一项的动物痘病毒林。13.由高度减毒的动物痘病毒生产副免疫诱导物的方法，其包括(a)4吏所述动物痘适应允i午细胞体系或细胞培养物；(b)在使最佳感染效价成为可能的多种允许细胞体系中通过长期传代来转移并持续所述动物待减毒痘病毒；(c)在最佳细胞体系中转移并持续所述待减毒动物痘病毒约100至300代；(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少卯代。14.由高度减毒的动物痘病毒生产副免疫诱导物的方法，其包括(a)通过IO日龄鸡胚的尿嚢绒膜(CAM)从患病动物中分离所述动物痘病毒，并在这种细胞体系中持续至少2代；(b)从孵化10天的鸡胚(FHE)将所述分离的动物痘病毒在AVIVER和VERO细胞培养物中转移并持续至少300代；(c)在MA细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少100代；(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少170代。15.根据权利要求14的方法，其中所产生的高度减毒粘液瘤病毒的感染效价约为10675CID5()/ml。16.根据权利要求14的方法，其中所述粘液瘤病毒为保藏号05040601(ECACC)的粘液瘤病毒林h-M2。17.由高度减毒的骆駝痘病毒生产副免疫诱导物的方法，其包括(a)通过IO日龄鸡胚的尿嚢绒膜(CAM)从患病动物中分离所述动物痘病毒，并将所分离的骆駝痘病毒在CAM中持续约2代；(b)在VERO细胞传代产物(ATCCCCL-81,WHO,美国典型培养物保藏中心)中转移并持续所述动物痘病毒约120代；(c)在AVIVER细胞中转移并持续所述动物痘病毒约24代；(d)在VERO细胞中再转移并持续所述动物痘病毒约157代；(e)在MA细胞中再转移并持续所述动物痘病毒114代；(f)在VERO细胞中再转移并持续所述动物痘病毒179代。18.根据权利要求17的方法，其中所产生的高度减毒骆駝痘病毒的感染效价约为107CID5Q/ml。19.才艮据权利要求17的方法，所述骆駝痘病毒为〗呆藏号05040602(ECACC)的骆駝痘病毒h-M27林。20.载体疫苗，其包含根据权利要求1至10中任一项的高度减毒、无毒力的非致免疫性动物痘病毒的经缺失核酸，以及插入所述缺失以进行表达的致免疫肽或蛋白质的核,列。21.根据权利要求20的载体疫苗，其中所述高度减毒、无毒力的非致免疫性动物痘病毒的经缺失核酸以及致免疫肽或蛋白质的核酸序列存在于质粒中。22.药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求11或12的副免疫诱导物。23.根据权利要求22的药物组合物，其用于局部或胃肠外给药。24.根据权利要求22或23的药物组合物，其还包含可药用载体。25.根据权利要求11或12的副免疫诱导物用于激活哺乳动物或人的副特异性免疫系统的用途。26.根据权利要求11或12的副免疫诱导物在制备用于预防和/或治疗免疫缺陷相关疾病的药物组合物中的用途。27.根据权利要求26的用途，其中所述免疫缺陷相关疾病选自免疫系统功能障碍、免疫抑制、免疫缺陷疾病、激素、循环、代谢和神经系统之间内稳态的功能障碍、危及新生儿的感染、肿瘤疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、治疗抗性感染因素疾病、混合性病毒和细菌感染、感染过程的慢性表现、不同起源的肝病、慢性皮肤病、疱渗、慢性肝炎、流感、内毒素损伤。28.根据权利要求26的用途，其中所述高度减毒的副免疫诱导物用于帮助创伤愈合、防止外科手术或受伤之后的二次感染的药物组合物。29.根据权利要求20或21的载体疫苗用于诱导哺乳动物或人的副特异性及特异性免疫应答的用途。30.生产高度减毒的动物痘病毒的方法，其包括(a)使动物痘适应允许细胞体系或细胞培养物；(b)在使最佳感染效价成为可能的多种允许细胞体系中通过长期传代来转移并持续所述待减毒动物痘病毒；(c)在最佳细胞体系中转移并持续所述待减毒动物痘病毒约100至300代；(d)在VERO细胞中转移并持续所述动物痘病毒至少卯代。全文摘要本发明涉及高度减毒的动物天花病毒株及其用作副免疫(paramunity)诱导物或用于制备载体疫苗的用途。作为高度减毒方法的结果，所述动物天花病毒株丧失其毒力和免疫特性。本发明还涉及生产这种高度减毒的动物痘病毒株的方法及其用于诱导副免疫(即激活哺乳动物和人类的非特异性免疫系统)或用于生产载体疫苗的用途，所述疫苗用于具有副免疫阳性副作用的特异性免疫。因此，所述高度减毒的动物天花病毒适用于预防和治疗与免疫缺陷相关的疾病。优选的实施方案涉及高度减毒的正痘病毒(例如骆驼痘病毒)、野兔痘病毒(例如粘液瘤病毒)、禽痘病毒、副痘病毒和其它正痘病毒株，比如MVA，其具有优良的副免疫特性，并且其中免疫特性已经丧失。文档编号A61K35/76GK101198339SQ200680021399公开日2008年6月11日申请日期2006年6月16日优先权日2005年6月16日发明者安东·迈尔申请人:安东·迈尔