专利名称：：基于热反应生物聚合物的直接药物送递系统的制作方法基于热反应生物聚合物的直接药物送递系统本发明是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的基金号AR047442和EB002263的lW支持下完成的。对本发明享有一定的权利。相关申请本申请要求2005年6月24日提交的美国临时专利申请系列号60/693966的利益，特此将其全部公开内容并入本文作为参考。发明领域本发明涉及用于药物化合物控释送递的方法和组合物。
背景技术：
：骨关节炎(OA)是关节变性病，比任何其他的肌骨骼病症影响更多的患者。其是每年皿4百万的住院的原因，且在接下来的20年中估计其流行率将增加超过50%。OA影响个体关节，且历史上认为是由于关节负荷引起"磨损"造成的。现在，了解到OA由多种原因引起，包括生化、遗传和生物力学因素，其相互作用并促进关节疾病的进展。尽管对于患有晚期关节变性的患者，可选择关节重排(re-alignment)(骨切开术)、人工假体置换术(关节成形术)或融合(关节固定术)的外科手术，但是只有一小部分患者需要手术治疗。因此，对于提供非外科手术治疗有巨大且渐增的需要，所述治疗能减轻患者的症状而且能改变疾病进展的过程。长期使用NSAIDs是早期至中等关节疾病患者所能获得的最广泛的治疗。尽管这些药物有效减轻疼痛，但是它们伴随着频繁的不利状况，包括胃肠出血和溃疡。另外，据报道NSAIDs抑制细胞生物合成，这可能破坏关节变性中长期的内在修复过程。最近，已经鉴定出育,改变OA疾病状态的蛋白质药物。这些蛋白质药物包括TNF-a抑制剂和IL-l抑制剂，已经在临床前和临床研究中显示出有相当大希望预防疾病的发作和延迟疾病的进展。由于OA是每次定位在少数关节的疾病，所以治疗剂的局部化送递是高度4腿的。一种这样的技术是将药物直接施用至U所影响的关节腔，也就是关节内注射，目前这是皮质甾类和乙酰透明质酸溶液治疗OA的推荐方法。尽管关节内送递药物的机制对于患者和临床医生同样具有吸引九但其被存在高效淋巴系统所破坏，所述淋巴系统快速从滑膜腔清除分子。因此，必须频繁的施用治疗药物或以高浓度施用治疗药物才有效。这反过来是昂贵的，并且导致不利副作用和患者的高度不适。已经寻求受控药物;^ii系统以克服这些挑战。Uny的美国专利号6328996描述了生物弹性体(bioelastomeric)药物i^il系统，但是并没有暗示其可直接施用于目标区域。发明相M本发明的目的是提供热反应生物相容的聚合物，用于辦卖送递药物，如DL一l受体拮抗剂。本发明的送递系统利用热反应生物聚合物独特的快速聚集和缓慢解聚的特性，以直接蛋白质药物到病理部位，如OA影响的关节。本发明提供送递目标化合物的药物库至受试者中选定区域的方法。所述方法包括将组合物直接施用于所述目标区域，所述组合物包括待送递的所述化合物和经历逆温相变(inversetemperaturephasetranstion)的聚合物，从而提供所述目标化合物在所述选定区域的持续释放。在一些实施方案中，本发明提供送递目标化合物的药物库至受试者中选定区域(例如，关节或滑膜关节)的方法。所述方法包括将组合物施用于目标区域(例如，直接地，如ffi5i注射A^到目标区域)。所述组合物包括纟維递的所述化合物和经历逆温相变的聚合物。聚合物具剤氐于受试者術显的转变鹏(Tt)(例如，低于37")。所述组合物或缀合物在目标区域聚集，且随后缓優解聚，从而提供所述目标化合物在选定区域的持续或受控释放。在一些实施方案中，本发明提供送递目标化合物的药物库至受试者中选定区域的方法，所述方法包括直接将组合物施用于所述目标区域，所述组合物包括待送递的所述化合物和经历逆温相变的聚合物，其中所述聚合物具有低于所述受试者体温的转变温度(Tt);从而所述组合物(或所述缀合物)从所述目标区域中的溶液中分离以形成大块聚集体，且随后从大块聚集体中缓慢分离以回到溶液中，从而提供所述目标化合物在所述选定区域的持续释放(或者换种说法，从而所述缀合物从所述目标区域中的溶液分离，且随后缓慢回到溶液相中，从而提供所述目标化合物在所,定区域的持续释放)。在一些实施方案中，所述组合物包括与所述聚合物缀合的待，的化合物；5在其他实施方案中，所述组合物包括与所述聚合物混合，而不是缀合或化学偶联的待送递的化合物。本发明的另一方面是药学上可接受的组合物，其包括与聚合物组合(例如与其混合或缀合)的治疗化合物，所述聚合物经历逆温相变。这类治疗化合物的例子包括，但不限于TNF抗体、IL"1抗体、可溶性TNF受体、可溶性IL-1受体、TNF受体拮抗剂和IL-1受体，封亢剂，具体的例子是重组人IL-1受体拮抗齐诉n其同工型。本发明的另一方面是注射装置(包括注射器和其他注射装置)，其包括此处描述的组合物。本发明的另一方面是此处描述的注射装置在实施此处描述的方法中的用途。附图简述图l.示意图是提议的药物送递系统的一个实施方案的例子。(a)可将附着至热敏生物弹性(bioelastic)聚合物(ELP)的化合物(药物)注射到组织区域(例如，关节腔)，且随着时间的推移发生所述化合物从聚集体的释放。如图所示在其游离的形式，所述化合物可与受体结合。化合物一生物弹性聚合物的"游离"级分随着时间推移将从所述组织区域(例如，关节腔)清除。(b)可选择的例子显示在送递给组织区域过程中或之前化合物最初与热敏生物弹性聚合物混合，从而促进化合物的包载。所述化合物随时间推移发生释放，同时所述"游离"化合物随时间推移从组织区域清除。图2.ELP聚集4tt37X:平衡后，随着时间推移在上清液中检测到的ELP级分。显示ELP4-90([(VPGVG)o]9,SEQIDNO:l)和ELP4-120([(VPGVG)10]12,SEQIDNO:2)(平均值士SD,n4)的结果。在其转变^Jt以上的ELP在3TC平衡，以促舰温相变。在37"C用新鲜PBS替换上清液，并M3l280nm下的吸光度随时间推移定量上清液等^H式样中ELP的浓度。使数据拟合一阶指数函数(实线)，形式为[ELPHELP]ss—Aexp(-t/力，以获得平衡时间常数(力和平衡时未包含在聚集体形式中的ELP的分敬[ELP]ss)。发Jj^t于ELP4-90，常数为[ELP〗SS=0.21和x=31小时。发JJM于ELP4-120，常数为[ELP]SS=0.18禾口t=43小时。图3.向大鼠模型的右膝关节内进行关节内注射后，非聚集["C]ELP(Tt6>50"的生物分布。注射的剂量(ID/gm)是在注射后10分钟从注射的膝室回收的14C的量(每克回收的组织和流体)。对于个别的室，用这个值对"C(每克回收的组织或流体)进行归一化以确定每个组织或流体的c/。ID/gm。所有均表示为平均值士SE(n二5)。(A)*p<0.05，与计时起点统计学上不同；+p<0.05，与未注射的(左)膝室统计学上不同。(B)*p<0.05，与计时起点统计学上不同;+p<0.05，与血液统计学上不同。(C)发m^有器官的[Mc]ELP浓度低于P/。ID/gm，且在所有时间点未发现这些组织与未注射的(左)膝有统计学上的不同。图4.向大鼠模型的右膝关节内进行关节内注射后，聚集["C]ELP(Tt〈35t:)的生物分布。注射剂量(ID)是在计时起点(注射后10:5H中)从注射的膝室回收的14C的量(每克回收的组织和流体)。对于个别的室，用这个值对MC(每克回收的组织或流体)进行归一化以确定每个组织或流体的MID/gm。所有数据均表示为平均值士SE(r^5)。(A)*p<0.05，与计时起点统计学上不同；+p<0.05，与未注射的(左)膝室统计学上不同。(B)*p<0.05，与计时起点统计学上不同；+p<0.05,与血液统计学上不同。(C)发现所有器官的["C]ELP浓度低于l%ID/gm，且在所有时间点未发现这些组织与未注射的(左)膝有统计学上的不同。图5.注射的关节室内["C]ELP随时间推移的生物分布。注射剂量(ID/gm)是在计时起点(注射后10併中)从注射的膝室回收的14C的量(每克回收的组织和流体)；用这个fW随后的时间点的ID/gm进行归一化以确定作为时间函数的膝关节室的。/。ID/gm。(A)非聚集ELP(Tt〉5(TC)和(B)聚集ELP(T^35。C)。数据表示为平均值±SE(n=5)，使其拟合一阶指数衰减函数(实线)，且在半对数轴上绘图。也显示了置信区间(95%，虛线)。每种拟合的时间常数(t)用来计算两种ELP类型的关节半衰期[t^t1n(2)]。图6.在体外与ELP混合后定量释放到溶液的方妇寸性标记化合物的结果。2.5|iig/ml的fH]rhlLlRa与不同浓度的不同ELP制剂在37"C混合(ELP4-120([(VPGVG)10]12,SEQIDNO:2)禾口ELP5([(VPGVG)6(VPGKG)]16,SEQIDNO:3))。制备总反应体积200微升中浓度为0mg/ml(对照)、20和50mg/ml的ELP溶液。观察到ELP-ILlRa混合物复合形成聚集体。经由闪烁计数随时间推移测定上清液等^H式样(5微升)的[3H]，作为所述上清液中的rhILlRa浓度的测量。将测量值对于对照(0mg/ml，中空条)进行归一化以确定溶液中游离rhILlRa%=(样品的CPM/对照的CPM)X100。在24小时的包载中数据稳定；此处显示平衡96小时的数据(11=5，平均值±SD)。结果表明混合后ELPs育^I多包载这种化合物的25-55%。图7.(A)经过两轮热纯化后的两种融合蛋白的SDS-PAGE。(B)两种融合蛋白随温变的聚集以及颗粒大小柳以，从而显示在低于37"C的温度开始形成斕粒(〉100nrn)。图8.rhILlRa或ELP4-ILlRa融合蛋白抑制伴刀豆球蛋白A诱导的IL-1依赖性原代鼠胸腺细胞增殖。在含有lng/ml鼠IL-ie和增加浓度的融合蛋白或rhILlRa下±咅养细胞48小时。数据显示为对照增殖百分比相对添加的超过存在的EL-ie量的摩尔过量IL-l抑帝跻'」的量的半对数图。平均值iSD(n^)，数据拟合S形函数，以测定每种蛋白的IC50。图9.聚集(实心条)和非聚集(阴影条)ELPs的肿瘤中注射的齐糧的百分比(％ID)。两种鄉的ELPsi^主(4^L/分钟)到AP状细胞癌(FaDu)肿瘤中，所述肿瘤位于裸鼠(Balb/cnu/nu)的MJ:。数据为平均值士SE]Vtn-1-9。^Jl实施方案详述此处所用的"生物弹性聚合物"指的是包含重复弹性体单元的化合物。弹性体单元一般是五肽、四肽或九肽。例子有弹性蛋白样多肽或"ELPs"。此处所用的"受试者"包括人类受试者(包括男性和女性受试者，且包括幼年、青少年、j^和;g^受试者)，和动物受试者，特别是用于兽医目的的其他哺乳动物受试者，如灵长类、狗、猫和马。此处所用的"关节炎"表示任何类型的关节炎，包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎和强直性脊柱炎。此处所用的"聚集"表/禾许多分子的集合或团聚，从而形成颗粒。此处所用的"解聚"表示从聚集体分离一个或多个分子，聚集体大小的进行性缩小；，粒大小的进行性缩小。此处所用的"目标区域"可以是任何目标区域，包括但不限于关节和实体瘤("实体瘤"包括实体瘤在外禾样棘出其主要团i央后的切除腔，本发明的组合物可以直接施用于该切除腔)。在关节施用的一些实施方案中，目标区域是椎间盘隙或相关的脊柱关节结构。此处所用的"術显"包括核心j拟显和区域1拟显(例如，肢術鹏，当目标8区域如关节位于肢体时)。此处所用的"关节"指的是在两个骨接触处的可移动点，通常是滑膜关节或韧带联合，且包括但不限于球窝关节、椭圆关节、摩动关节、屈戌关节、车轴关节和鞍状关节。这样的关节可位于，例如，肩、颈、脊柱、肘、髋、腕、手、膝、踝绷却。此处所用的"实体瘤"可以是任何实体瘤或癌，包括但不限于下述癌的原发和继发(或转移)实体瘤肺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、皮肤癌(包括黑素瘤)、脑癌等等。此处所用的"注射(injection)"或"注射(injecting)"可采用任何合适的方式进行，其中舰针、注射器、分流器、插管(例如，7—33规格)或任何其他合适的装置，所述装置将所述组合物直接送蹈目标区域(与全身性送递相反，并不包括全身性^3H),作为快速灌注方式或作为随时间推移的lr注。此处所用的"抗体(antibody)"或"抗体(antibodies)"是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD禾口IgE。术语"免疫球蛋白"包括这些免疫球蛋白的所有亚型，例如Ig^、IgG2、IgG3、IgOi等等。在这些免疫球蛋白中，IgM和IgG劍m的，而特别4腿的是IgG。所述抗体可以是任何物种来源的，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马或人，或者可以是嵌合抗体。此处所用的术语"抗体"包括保留与靶抗原结合能力的抗体片段，例如Fab、F(ab'》和Fv片段，和由除了IgG以外的抗体获得的相应片段。这样的片段也可以由已知的技术制备。此处所用的"化疗剂"(或"抗癌剂")包括但不限于甲氨蝶呤、柔红霉素、丝裂霉素、顺铂、长舂新碱、表柔比星、氟尿嘧啶、维拉帕米、环磷翻安、阿糖胞苷、氨基蝶呤、博来霉素、丝裂霉素C、democdcine、依托泊苷、光辉霉素、苯丁酸氮芥、美法仑、红比霉素、阿霉素、他莫昔芬(tamosifen)、紫杉醇、长春新碱、长#咸、喜树碱、放线菌素D和阿糖胞嘧啶。此处所弓i用的所有美国专利参考文献的公开内M体在此弓1入作为参考。z^薪众^欽任何合适的化合物，包括但不限于蛋白质和肽，可如上所述与聚合物偶联(例如，舰化学键或以融合蛋白生产)，或与所述聚合物混合。通常，目标化合物可以是可检测的基团或治疗基团。例如，目标化合物可选自骨形态发生蛋白、肽和生长因子，更具体是人降钙素类似物、成骨生长肽和成骨生长肽-人辭丐素类似物杂合体。参见例如美国专利号6593394。目标化合物可选自抗感染剂，例如抗生素和抗病毒剂；化疗剂(也就是抗癌剂)；抗排斥剂；止痛剂和止痛组合；抗炎剂；激素如类固醇；生长因子，包括骨形态发生蛋白(也就是BMP's1-7)、骨形态发生样蛋白(也就是GDF-5、GDF-7和GDF-8)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(即FGFl-9)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-n)、转化生长因子(即TGF,M-in)、血管内皮生长因子(VEGF);和其他天然衍生或基因工程改造的蛋白、多糖、糖蛋白或脂蛋白。参见，例如，D.Overaker,美国专利号6,575,986。目标化合物可以是实际上促进或加快愈合的化合物或试剂，效应物也可包括防止感染的化合物或试剂(例如，抗微生物剂和抗生素)，减少炎症的化合物或试剂(例如，抗炎剂)，预防或使粘附形成最小化的化合物，例如氧化再生纤维素(例如，MTERCEED和SURGICELTM，获自Ethicon，Inc.)，透明质酸，和抑制免疫系统的化合物或试剂(例如免疫抑制齐IJ)。合适的目标化合物包括异源或自体生长因子，蛋白质(包括基质蛋白)，肽，抗体，酶，血小板，糖蛋白，激素，细胞因子，糖胺聚糖，核酸，止痛剂，病毒，病毒颗粒和细胞类型。应理解一种或多种相同或不同功能的效应物可掺入到支架中。合适的目标化合物包括众多异源或自体生长因子，已知所述生长因子鹏愈合和/或损伤或损害的组织再生。合适的目标化合物包括趋化剂；治疗剂(例如，抗生素，类固醇和非类固醇止痛齐诉口抗炎剂，抗排斥齐咖免疫抑制剂和抗癌药物)；各种蛋白(例如，短期肽、骨形态发生蛋白、糖蛋白和脂蛋白)；细胞附着介质；生物活性配体；整联蛋白结合序列；配体；各种生长和/或分化齐诉口其片段(例如，表皮生长因子(EGF)，肝细胞生长因子(HGF)，IGF-I，IGF-U，TGF-M-m，生长禾口分化因子，血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素衍生生长因子(IGF)，和转化生长因子，甲状旁腺素，甲状旁腺素相关肽，bFGF;TGFB超家族因子；BMP-2;BMP4;BMP-6;BMP-12;Shh(sonichedgehog);GDF5;GDF6;GDF8;MP52，CDMP1);影响特定生长因子上调的小分子；生腱蛋白"C;透明质酸；硫酸软骨素；纤连蛋白；饰胶蛋白聚糖；血栓弹性蛋白(thromboelastin);凝血酶衍生肽；肝素结合结构域；肝素；硫酸乙酰肝素；DNA片段和DNA质粒。合适的效应物同样包括上述试剂的激动齐诉口拮抗剂。生长因子也包括上述生长因子的组合。另外，生长因子可以是血液中血小板提供的自体生长因子。在这种情况下，源自血小板的生长因子将是不确定的各种生长因子的混合物。参见例如J.Hwang等，美国专利申请公开号No.2004/0267362。在一些实施方案中，特别是用于治疗关节炎，目标化合物是抗炎剂，其例子包括但不限于TNF抗体，IL-1抗体，可溶性TNF受体，可溶性IL-1受体，TNF受体拮抗剂，EL-1受体拮抗剂，COX-2抑制剂，禾口非类固醇抗炎剂(包括其蛋白或肽化合物如抗体和受体的活性片段)。这样化合物的大量例子是已知的。参见，例如，美国专利号6,846,834;也可参见美国专利号6,624,184;6,596,746;6,498,165禾n6,420,373。一个具体的例子是rhILlRa(包括其同工型)(作为KINERET,由Amgen商业化提供)，如美国专利号6,599,873和5,075,222中描述的。f激,丝覆会欽生物弹性聚合物是已知的并且描述于，例如，Uny等的美国专利号5,520,672中。通常，生物弹性聚合物是包括生物弹性五肽、四肽和/或九肽弹性体单元的多肽。因此，在一些实施方案中所述弹性体单元是五肽，在其他实施方案中，弹性体单元是四肽，以及在其他实施方案中，弹性体单元是九肽。可用于实施本发明的生物弹性聚合物在美国专利号4,474,851中阐明，其描述了许多可用于形成生物弹性聚合物的四肽和五肽重复单元。可用于实施本发明的特异性生物弹性聚合物也描述在美国专利号4,132,746;4，187,852;4,500,700;4,589，882禾n4,870,055中。生物弹性聚合物的其他例子也在Uny的美国专利号6,699,294，Fertala和Ko的美国专利号6，753，311,Wallace的美国专利号6,063,061和Chilkoti的美国专利号6,852,834中阐明。生物弹性聚合物可包括其他的残基或单元，例如本领域己知的前导和/或尾随序列。在一个非限制的实例中，用于实施本发明的生物弹性聚合物是多肽，其包括至少通常的块状结构[(VPGX'Gy]m(SEQEDNO:4)，其中户1一J，X1是除脯氨!t^卜的任何氨基酸(例如，Ala、Leu、Phe)，J是临近并在块i+l前的块i的连续重复的数目。n1是任意数字，如l、2、3或4直到20，并且n'不1^于i。J是任意数字，如1、2或3到5或更大。m是块结构重复的数，其中m是任意合适的数字，如2、3或4直到60、80或300或更大。第四位的各种氨基酸的特性和频率可以改变。例如，用于实施本发明的生物弹性聚合物可是下述通式的多肽[(VPGAG)5乂VPGVG)2(VPGGG)23]m,(SEQIDNO:5)，其中X=A，X2=V，X3=G，n是5，n2是l，n3是2，m至少是1、2或3直到100、150或300或更大。在另夕卜一个非限制的实例中，用于实施本发明的生物弹性聚合物可包括选自生物弹性九肽、五肽和四肽的重复弹性体单元，其中的重复单元包括选自所有氨基酸和甘氨酸残基的氨基酸残基。f雄的氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在许多情况下，重复单元的第一个氮基酸残基是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸残基；第二个氨基酸残基是脯氨酸残基；第三个氨基酸残基是甘氨酸残基；且第四个氨基酸残基是甘氨酸或高度疏7k性残基如色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸。具体的例子包括四肽Val-Pro-Gly-Gly(SEQIDNO:6)、四肽GGVP(SEQIDNO:7)、四肽GGFP(SEQIDNO:8)、四肽GGAP(SEQIDNO:9)，五肽是Val-Pro-Gly-Val-Gly(SEQIDNO:10)、五肽GVGVP(SEQIDNO:ll)、超太GKGVP(SEQIDNO:12)、五肽GVGFP(SEQIDNO:13)、五肽GFGFP(SEQIDNO:14)、五肽GEGVP(SEQIDNO:15)、五肽GFGVP(SEQIDNO:16)和SI太GVGIP(SEQIDNO:17)。参见，例如Uny的美国专利号6,699,294。如以上描述，本发明的方法一般包括向目标区域施用组合物(例如，直接的，如注射A^到目标区域)。所述组合物包括#的化合物和经历逆温相变的聚合物，所述聚合物具有低于受试者体温的转变温度(Tt)(例如，低于37°C)。缀合物在目标区域聚集，随后逐渐解聚，从而提供了目标化合物在所选定区域的持续释放。可采用任何合适的方式实施施用步骤，例如注射，和具体地关节内注射(例如，注射到滑膜关节的滑、m)。受需要贮存药物的任何疾病或状况折磨的患者可以采用这种方法治疗，其中具体的例子是受关节炎折磨的患者。目标化合物可以以任何合适的量施用，所述的量依赖于注射的部位、受试者的年龄、重量和状况，特别是活性剂等等。通常，施用的化合物的量是每次施用或注射0.001、0.01、0.1、1、5或10毫克，最高每次施用或注射约100、200或300毫克。通常，施用的化合物浓度为lpg/ml—500mg/ml，注射体积取决于目标区域。通常，在混合化合物和弹性体的实例中，ELP也可以以lpg/ml12到500mg/ml的等价浓度或更高浓度共同施用。在一些实施方案中，目标化合物在所述区域4，地具有一或二个小时或更长的体内半衰期；在一些实施方案中，所述施用方法中目标化合物与ELP组合施用伴随着所述化合物在所述区域的体内半衰期为至少2或3天，一周或四周或更长，最高2或3个月，或更长。另外申明，预期施用步骤将在规贝诉n重复基础上实施(例如，为了治疗慢性状况，如关节炎)，但是施用频率将不大于每月1、2、3或4次，而仍旧保留所需要的治疗有效量。本发明由下述非限制实施例更详细地阐明。实施例弹性蛋白样多肽(ELPs)是基因工程改造的生物聚合物，由上述响应温度增加进行聚集的五肽重复单元组成。ELPs在低于其转变温度(Tt)时是可溶的，而在高于其Tt时Mi不可溶的并且形成微米大小的聚集体。在此我们公开，与所述药物载体附着的蛋白质药物在注射时聚集并在注射部位形成药物"库(depot)",其随后将以f转卖的方式缓慢解聚至咲节隙(参见，例如，图l)。在这些实施例中，謝门将评估ELPs在高于其Tt的驢下的体夕卜解聚，和关节内注射后聚集(Tt<30°C)和非聚集(Tt>50'C)ELPs的体内生物分布和关节半衰期。另外，劍门将设计ELP和ILlRa的融合蛋白，并评估其与IL-1受体的结合亲和力和抑制IL-1的生物活性，以显示ELP融合蛋白药物载体系统的概念证明(proofofconcept)。实施例1体外ELP解聚和肽释放评价弹性蛋白样多肽(ELPs)或生物弹性聚合物提供从聚集体形式持续释放"游离"聚合物的能力，作为治疗局部疾病提议的送递系统的捐J^证明，所述疾病如骨关节炎。药物系统应用快速热诱导的聚集的独特的ELP特性，以形成大的颗粒，随后从大量聚集的^I^封恭卖释放ELP，称作"游离"形式。为了评估这一点，采用基因工程技术合成并热纯化两种ELP分子:(1)ELP4-90=[(VPGVG)k)]9(SEQIDNO:l)，Tt=30.6°C，MW=37kDa;和(2)ELP4-120=[(VPGVG)k)]12(SEQIDNO:2)，Tt=28.6°C，MW=49kDa，其中根据已知的技术(参见Uny的美国专利号6,699,294和Chilkoti的美国专利号6,852,834)。为进行体外研究，30mg/ml浓度的1.5ml每一种ELP被方JL^锥形管中，并于37°C13温育24小时。所述时间结束时，在37。C上清液完全交换成PBS，并31il280nm的吸光度定量上清液中ELP的量，其作为起始ELP的函数(图2，t^O小时)。使样品返回到37°C，且随时间推移测定7u1上清液等iH式样中游离ELP的量。Sil将游离ELP浓度的娜拟合一阶指数函数，观啶平衡的时间常数。对于两种ELP类型，在方爐在37r后不久多肽发生逆温相变，并缓慢达到平衡，其中15-20。/。的起始ELP是游离形式(图2)。在上清液完全交换后，平衡的时间常数为l一2天的数量级。描述游离相对聚集ELP浓度稳定M的平衡常数是0.15—0.20。这些结果表明聚集的ELP形式将随时间推移缓慢释放游离的ELP。在动关节性关节，其中游离形式不断iH过滑膜组织清除，从而促进ELP聚集体的持续"解聚"。实施例2关节内注射后ELP的生物分布聚集ELP4-120([(VPGVG)K)h2，SEQIDN0:2，Tt<32°C，MW47kDa)和非聚集ELP2([(VPGVG;h(VPGAG)8(VPGGG)7〗K)，SEQIDNO:18,，磨61kDa，Tt>5(TC)的生物分布和关节半衰期。在大鼠动物模型中评估关节内注射后的ELPs。用[14。]标记ELP以产生32-37mCi/mmole的比活性。透析标记的ELP，无菌过滤(0.22,过滤器)，且将30pl体积、约650的每一种肽注射入Wistar大鼠右膝的关节腔内。注射后，所述动物圈养在笼中最多4周。在針时间点，处死5只大鼠，收集并消化其右和左膝(滑液、半月板、软骨、滑膜)、血液、心脏、肺、月干、脾、肾和膀胱。采用液体P闪烁计数测定每种组织的方謝性。测量每个动物和每种组织或体液(每组和每个时间点n=5只动物)的总计激组织重量，并画出每种组织作为时间函数的图。关节组织和关节流体的值总计为总的"关节"值(滑液、半月板、软骨、滑膜)。针对非特异分布的注射的["C]-ELP，调整在注射后10分钟从关节腔中所有组织和流体回收的总方妇射生，其中发现起始剂量为施用的剂量的70-75%。然后用所,始注射的膝关节腔的值(注射后10併中)将放射掛组织重量进行归一化，以获得每克组织注射的剂量相对于所有回收的组织和流体送递的量的百分比(％ID/gm)。在所有时间，都没有观察到任一种肽在外周器官中的优先积累(图3C或4C)。除了在接受注射的膝和血t桫卜，每种肽的总量在所有的其他器官中都低于l%ED/gm(图3B或4B)。图3显示接受注射的膝中非聚集ELP的特征(针对以小时表示的时间作图)，且图4所绘的是接受注射的膝中聚集ELP的特征(针对以天表示的时间作图)。在最初的24小时内，关节隙内的非聚集ELP低于10%ID/gm，而聚集ELP花了将近两周以达到相同的水平。ffiil总计所述关节的总力谢性计数，测定接受注射的膝关节室的方Mt性半衰期(t1/2)(图5)。图5A显示接受注射的膝关节室的非聚集ELP(Tt>50°C)值，且5B显示聚集ELP(Tt<35°C)的值。麵表示为平均值士SE(n-5)，使所述数据拟合一阶指数衰减函数(实线)，并绘图在半对数轴上。还显示了置信区间(95%,虚线)。每种拟合的时间常数(t)用于计算两种ELP类型的关节半衰期[tm=tln(2)]。发m^述关节中非聚集和聚集ELP的半衰期分别为3.4±0.2小时和3.7±0.2天。这表明ELP聚集特性极大地延长了所述肽在关节内的半衰期，S3124倍(p<0.05，ANOVA),从而证实了提议的持续释放机制。这些发现是重要的，因为其证明了ELP热反应特性可用于，蛋白质药物到关节炎影响的关节。实施例3包载的证明图6证实采用本发明的方法和组合物的包载。图6显示对与ELP在体外混合后释放到溶液中的放射性标记化合物定量的结果。2.5pg/ml的fH]rWLlRa与不同浓度的不同ELP制剂在37t:混合(ELP4-120[(VPGVGVkSEQIDNO:2和ELP5[(VPGVG)6(VPGKG)]16，SEQIDNO:19)。制备总反应体积为200微升中浓度为0mg/ml(对照)、20和50mg/ml的ELP溶液。观察到ELP-ELlRa混合物复合形成聚集体。随时间推移通过闪烁计数测定上清液等尔式样(5微升)中的fH]，作为所M清液中rhILlRa浓度的测量。针对对照(0mg/ml)对测量值进行归一化，以确定溶液中游离rWLlRa。/^(样品的CPM/对照的CPM)X100。在24小时包载内数据稳定；此处显示平衡96小时的数据。结果表明混合后ELPs育^多包i^万述化合物的25-55%。实施例4ELP-ELlRa融合蛋白设计、合成和表征在所述药物皿系统的推脸证明测试中，按下面所述基因合成ELP和ILlRa的两种聚集融合蛋白。按照先前Carter等人(1990)Nature344:633-8所述，从LPS15活化的U937细胞PCR克隆得到人ILlRa的基因。如Chilkoti的美国专利号6,852,834中描述，合成两禾中ELP制齐!j:ELP1[(VPGVG)5(VPGGG)3(VPGAG)2〗9，(SEQIDNO:20)，MW36kDa，和ELP4[(VPGVG)10]3,(SEQIDNO:21)，MW14.5kDa。采用传统分子生物学技术将每种ELP基因亚克隆至包含ILlRa的载体(pET-25bf)中，以产生两种ELP-ILlRa融合蛋白(参见表l-2)，分子量为30.2和53kDa.。融合蛋白根据Uny的美国专利号6,699,294和Chilkoti的美国专利号6，852,834中已知的技术在大肠杆菌(Eco/O中表达并热纯化。通过SDS-PAGE观啶融合蛋白的大小和纯度，并示于图7A。此处所用的热纯化方法产生〉50mg融合蛋白/升细菌生长物，纯度>95%。采用动态光翻寸评估温度驱动的每种融合蛋白的聚集，其中当融合蛋白的稀释溶液(25mM)在20-6(TC范围内以rC间隔加热时，监控融合蛋白的激光翻寸。利用球形颗粒的Stokes-Einstein关系从翻t数据中测定流体动力学半径(Rh)。聚集^^定义为在该、温度以上开始形成，粒(>100nm)，并且融合蛋白聚集的^it。图7B显示所述设计的融合蛋白经历温度驱动的相变并形成大的聚集体。在低于37"的^t时，开始形成聚集体。所述热反应行为是所述药物送递系统的重要部分；其暗示所设计的ELP和ILlRa融合蛋白将在注射时和在注射部位聚集，这导致蛋白药物IRlRa延长的半衰期。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(ELP4基因跨越前462个核苷酸，随后为33个^S长的间隔区。ILlRa基因跨越492-942碱基)(表l:(A)ELP4-ELlRa的基因(SEQIDNO:22)和蛋白质序列(SEQIDNO:23)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>表2(2部分的第1部分)ELPl-ILlRa的基因(SEQIDNO:24)和蛋白质(SEQIDNO:25)序列。ELP1基因跨越前1362个核苷酸，随后为33个碱基长的间隔区。ILlRa基因跨越1395-1845鹏。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2(2部分的第2部分)ELPl-ILlRa的基因(SEQIDNO:24)和蛋白质(SEQIDNO:25)序列。ELP1基因跨越前1362个核苷酸，随后为33个碱基长的间隔区。RJRa基因跨越1395-1845碱基。(SEQIDNO:2)ELP1基因跨越前1362个核苷酸，随后为33个MS长的间隔区。ELlRa基因踪隨1395-1845110013001400实施例5ELP-ELlRa融合蛋白的生物活性按照先前描述检查代表性融合蛋白(ELP4-ILlRa)的生物活性，确定其抑制EL-1P增加的伴刀豆球蛋白A刺激的鼠C57原代胸腺细胞增殖的能力。简单来说，从新鲜处死的5-7周龄的C57老鼠机械分离原代胸腺细胞，并将其悬浮在RPM1640中，所述RPMI1640补加了5%FCS，1p^ml伴刀豆球蛋白A(Sigma)禾口lng/mlrmlL"ip(Pierce),密度为2X106细鹏200^1。细胞在商业化rhILlRa(R&DSystems)或ELP4-ILlRa融合蛋白(如上描述)中每一种的连续稀释物存在下温育48小时。M[3H]-胸苷(0.5pCi/L)的摄取评估胸腺细胞的增殖。表示为6次重复培养的[3H]-胸苷摄取的平均CPM士SD。舰将数据拟合S形函数，测定产生50%的抑制(IC50)的最高浓度。ELP4-ELlRa融合蛋白显示显著的生物活性抑制52pMrmlL-l卩的IC50为61.4士19.8nM，参见图8。实施例6肿瘤施用施用本发明的组合物的例子如图9所示。显示了聚集(实心条)禾n非聚集(阴影条)ELPs的肿瘤中注射的剂量的百分比(％ID)。两种类型的ELPs被输注(4mL/併中)到裸鼠(Balb/cnu/nu)liLh人鳞状细胞癌(FaDu)肿瘤中。数据是平均值士SEM，n=l-9。注意与非聚集的ELPs相比，聚集ELPs需要更大的剂量。前述例证了本发明，且并不理解为限制本发明。本发明由下述权利要求限定，其中权利要求的等同方案也包括在内。权利要求1、一种送递目标化合物的药物库至受试者中选定区域的方法，所述方法包括将组合物直接施用于所述目标区域，所述组合物包括待送递的所述化合物和经历逆温相变的聚合物；从而提供所述目标化合物在所述选定区域的持续释放；其中所述聚合物具有低于所述受试者体温的转变温度(Tt)。2、权利要求l的方法，其中所述组合物在目标区域聚集，然后逐纟糊军聚，因此提供所述目标化合物在所述选定区域的持续释放。3、权利要求1的方法，其中M注射实施所述施用步骤。4、权利要求1的方法，其中M经由针或套管的注射实施所述施用步骤，其中所述的针或套管是7-33规格。5、权利要求l的方法，其中所述目标区域是关节。6、权利要求l的方法，其中所述目标区域是关节，所述目标化合物是抗炎化合物，所述患者受骨关节炎折磨；且所述组合物以有效治疗所述骨关节炎的量施用。7、权利要求i的方法，其中m关节内注射实施所述施用步骤。8、权利要求1的方法，其中所述患者受动关节性关节病症和/间盘病理折磨。9、权利要求l的方法，其中所述目标区域是椎间盘隙。10、权利要求l的方法，其中所述目标区域是实体瘤。11、权利要求l的方法，其中所述目标区域是折磨所述受试者的实体瘤，且所述组合物以有效治疗所述实体瘤的量施用。12、权利要求1的方法，其中所述施用步骤重复多次，其频率不大于每月3次。13、权利要求1的方法，其中所述组合物包括缀合到所述聚合物的#^311所述化合物，所述聚合物经历逆温相变。14、权利要求1的方法，其中所述聚合物是生物弹性聚合物，所述生物弹性聚合物包括选自生物弹性五肽、四肽和九肽的弹性体单元。15、权利要求l的方法，其中所述目标化合物是蛋白质劍太。16、权利要求1的方法，其中所述目标化合物是选自TNF封闭性抗体、IL-1抗体、可溶性TNF受体、可溶性EU1受体、TNF受体拮抗剂和EL-1受体拮抗剂的抗炎化合物。17、权利要求l的方法，其中所述目标化合物是重组人EL-l受体拮抗齐lJ。18、权利要求1的方法，其中所述治疗化合物与所述聚合物缀合。19、权利要求1的方法，其中所述治疗化合物与所述聚合物混合。20、一禾中药学上可接受的组合物，其包括与经历逆温相变的聚合物组合的治疗化合物。21、权利要求20的组合物，其中所述治疗化合物选自抗炎齐诉口化疗剂。22、权利要求20的组合物，其中所述治疗化合物是抗炎剂。23、权利要求20的组合物，其中所述治疗化合物是选自TNF抗体、LI抗体、可溶性TNF受体、可溶性EU1受体、TNF受体^t剂和IL-1受体拮抗剂的抗炎剂。24、权利要求20的组合物，其中所述治疗化合物是重组人IL-1受体拮抗剂。25、权利要求20的组合物，其中所述治疗化合物是化疗剂。26、权利要求20的组合物，其中所述治疗化合物与所述聚合物缀合。27、权利要求20的组合物，其中所述治疗化合物与所述聚合物混合。28、一种注射装置，其包含无菌可注射形式的权利要求20的组合物。29、权利要求28的注射装置，其中所述的注射装置是注射器。全文摘要一种送递目标化合物的药物库至受试者中选定区域的方法。所述方法包括将所述组合物直接施用到所述目标区域，所述组合物包括待送递的所述目标化合物(例如抗炎剂或化疗剂)和经历逆温相变的聚合物(如弹性蛋白样肽或ELP)，从而提供所述目标化合物在所述选定区域的持续释放。还描述了用于实施本发明的组合物。文档编号A61M31/00GK101500606SQ200680022353公开日2009年8月5日申请日期2006年6月21日优先权日2005年6月24日发明者A·奇尔科蒂,H·贝特尔,L·A·塞顿,M·R·德雷赫尔,V·B·克劳斯申请人:杜克大学