一种白芷总香豆素组合物的制作方法

专利名称：：一种白芷总香豆素组合物的制作方法一种白芷总香豆素组合物
技术领域：
本发囌渉及一种单味中药的提取物及其用途，具体的说，本发明涉及一种白芷总香豆素提取物及其翁l备方法、用途和药物组合物。技术背景白癜风是一种常见的色素瘅碍性慢性皮肤病，可发生在身体任何部位，形成境界清楚、大小不等、形态不一的色素脱失斑。病变部位毛发也可变白，白斑周围皮肤有时出现黑色素增多现象，虽然无明显疼痛的症状，但严重影响容貌。有资料显示，全世界人群发病率平均在1%2%,人口如按60亿计，白癜风的发病人数将高达80(多万，且其中幼龄发病率有继续上升的趋势。对白赚风的治疗现代医学有三大疗法，一是皮肤移植疗法，二是紫外线治疗，三是化学药物治疗。这些疗法都有一定效果，但是又都有一定的局限性。直到现在，各国都尚未有确切有效的滄疗白癧风方法。中医称白癧风为"白驳风"，认为其发病机理是由肝肾亏损或七情内伤，风邪博于肌表，致气血不和，气滞血淤不能营养肌肤而出现皮肤白斑。世界各国的白癜风分型不同，根据中国色素性皿病学组1994年制定的白癜风临床分型标准，白癜风分为二型、二类、二期。采用中药治疗白瘫风的临床病例很多，也有相当多处方取得了一定的效果，但总体治愈率仍较低，或者疗效不稳定，难以令人满意。目前临床上用于白癜风治疗的中药制剂主要有-复方白苴酊、白癱风片、白癜风丸、复方补骨脂素凝胶、复方卡力孜然酊等。复方白芷酊的配方为防风、补骨脂、白芷、蒺藜、马齿苋、栀子、蛇床子、甘草、冰片和秦艽；复方补骨脂素凝胶是以补骨脂素及醋酸地塞米松为主药。在中國，有关白癜风治疗的药物专利已有一百多个，但大多为中药验方或复方，未见有单方中药报道。如申请号为CN200610000788.1的"一种用于白癜风的外搽白灵凝胶剂及其制备方法"中所述的外搽白灵提取物是由以下中药"当归尾、红花、红花夹竹桃(叶)、苏木、没药、白芷、马齿苋和白矾"提取得到，申请号为CN200610001868.9的"一种治疗白癜风的药鄉，，中所述的配方为补骨脂、防风、刺蒺藜、白芷、苍术、莪术、桃仁、红花、干地黄、三梭、知母、牡蛎、黄柏、青蒿、三七、山药、蝉蜕、苦参、白鲜皮和地骨皮。白芷为伞形科多年生草本植物白芷^^eh'cat/a/wrica(Fisch.exHoffra.)Benth.etHook,f-或杭白芷/1.(/aAuri.ea(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook,fvar.jfer斑cw朋a(Boiss)ShanetYit抑的干燥根，味辛，性温，归肺、胃、大肠经。白芷具有祛风解表、散寒除湿，通窍止痛、消镟雄膽等功能，现代药理研究证明，白芷具有解热、镇痛、抗炎等作用。白芷作为一种常用中药，在临床上广泛运用。多年来国内外学者的研究表明，白芷的主要化学成分为香豆素类成分、挥发油成分以及微量元素，其中，香豆素类成分的含量较高，可达1%左右。研究表明，白芷可通过增加黑素细胞黏附和/或迁移对白癜风产生治疗作用(现代中西医结合杂忐,2005,14(7)，p850)，白芷能够治疗白癜风与其含有光毒活性有效成分有关，其中欧前胡素(imperatorin)的光毒活性较强(中国医院药学杂志，1988,8(5),p220)。将白芷生药经进一歩提取纯化得到的白芷总香豆素提取物也可用于治疗白癜风(铁道医学，1980,3，p142)。刘红梅等报道了以超临界流体萃取白芷，得到白芷提取物，对其中的总香豆素和总香豆素中3种主要香豆素的含量进行了测定，主要成分氧化前胡素(oxypeucedanin)、欧前胡素(i鹏peratorin)、异欧前胡素(isoi鹏peratorin)的相对含量分别为42.40%,22.14%和12.12%(中国中药杂志,2004,29('3)'p241)。不同的制备方法对白芷提取物中主要有效成分的含量影响很大，另外提取物中活性成分的含量对于疗效具有很大影响。因此，控制活性成分在提取物中的含量，来摸索出适合制备成药物的研究成为重点和难点。本发明正是在积累了多年使用生药的基础上，结合中药现代化提取纯化方法，从中药白芷中提取分离纯化得到的以欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素为主要活性成分的总香豆素提取物，保证了主要活性成分在提取物中的含量可以用于治疗白癜风和提高免疫能力。
发明内容本发明旨在提供一种白芷总香豆素提取物及其制备方法，药物组合物和用途。本发嘴提供了一种白芷总香豆素提取物，其主要活性成分含量为欧前胡素占10%45%，优选为欧前胡素占10%20%;异欧前胡素占5%40%，优选为异欧前胡素占5%10%:氧化前胡素占10%40%,优选为氧化前胡素占10%20%。以上均为重量百分含量。本发明提供的白芷总香豆素提取物，其制备方法包括以下步骤(1)提取取白芷药材酌予碎断，置提取罐中，加适当溶剂提取，合并提取液，滤过。(2)分离纯化上述滤液浓縮后，加适量溶剂溶解，滤过，滤液过层析柱，再用溶剂洗脱，收集含番豆素类成分的洗脱液，减压回收洗脱液至不含溶剂，得到白芷总香豆素提取物。步骤(1)中提取溶剂可以为水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或任意几种的混合溶剂，，水和80%的乙醇溶液。在已有文献搌道中，提取白芷所用的溶剂通常都为乙醇或甲醇，很少用水来进行，通常认为用醇攝取优于水提(中国中药杂志，2006，31(12),p1021)，而在实际工艺研究过程中，本发明人发il0用水对本品进行提取时，不但可以确保白芷中的香豆素类成分可以被充分提取出来，而且提取溶液中的杂质少，便于分离纯化。选用80%的乙醇进行提取时，提取效率最高，经过两次30分钟的提取后，主要香豆素类成分就能基本够提取完全，但提取液中相对杂质较多。步骤(2)分离纯化过程中，层析柱填料可以为硅胶、氧化铝或大孔树脂，优选为氧化铝柱或大孔树脂柱。所用的^胶可以为100200目或2003(X)目；所用的大孔树脂型号可以为AB-8、D101、HPD400、HPD100、D1300，优选为HPD400、HPD100;所用氧化铝最优选为中性氧化铝，本发明人发现中性氧化铝不仅可以充分吸附上柱物中的非香豆素类成分杂质及其它色素，对本品纯化有着狨到的效果，而且成本相对较低，操作较硅胶柱层析简易。溶解揚取物所用溶剂可以为水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚中的一种或任意几种的混合溶剂，优选为乙醇、乙酸乙酯，最优选为乙醇一乙酸乙酯(]，V/V)混合溶剂。柱层析过程中所用的洗脱溶剂可以为水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚中的一种或任意几种的混合溶剂，优选为乙醇、丙兩、乙酸乙酯，最优选为乙醇一乙酸乙酯(1:2,V/V)的混合溶剂。本发嘴还提供了一种白芷总香豆素提取物药物组合物。它包含治疗有效量的白芷总香豆素提取物和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂。由于白癜风疾病表现为体表症状，所以该药物组合物应该选用为外用制剂，优选为凝胶、软膏或乳膏，结合本品的溶解性等理化性质特征，最优选为将本品制成外用凝胶剂。采用本领域公知的方法来制备本发明的药物组合物，如将上述白芷总香豆素提取物加入适量载体或陚型剂即可以得到软膏、乳膏或凝胶等外用制剂。本发明所述及的载体或赋型剂包括本领域内常用的所有辅料，如卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠、明胶、硬脂酸、石蜡、液状石蟮、凡士林、地蜡、蜂蜡、鲸蜡、胆固醇、羊毛脂、植物油、高级醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、失水山梨醇高级脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯缩合物、聚氧乙烯高级脂肪酸缩合物、聚氧乙烯高级脂肪醇缩合物、聚氧乙烯蓖麻油缩合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油縮合物、十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠、聚甘油硬脂酸酯、硬脂酸聚烃氧脂、平平加O、月桂氮卓酮、油酸、磷脂、甘油、丙二醇、山梨醇、麦芽糖醇、乙酵、三氯叔丁醇、苯甲醇、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、苯甲酸钠和蒸馏水等。本发明提供的白芷总香豆素提取物及其药物组合物可有效治疗白癜风和具有增强免疫的功能。薄层德^检湖香豆素类成分的方法是本领域公知的，在此不予详述。主要活性成分欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素的含量测定采用本领域公知的高效液相色谱法测定，也不予详述。本发明使用的白芷药材为伞型科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth-etHook-f或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook,f,var.formosana(Boiss.)ShanetYuan的干燥根。本发明所称的"香豆素类"(coumarins)是指本领域内公知的以顺式邻羟基桂皮酸内酯为母核的不同取代基化合物。本发明与现有技术相比，具有以下显著的优点(1)本发明人经实验发现，白芷经上述特定的提取纯化后得到的白芷总香豆素提取物中保证了各有效成分相应的含量，从而保证了经过提取纯化后的总香豆素提取物可以增加酪氨酸酶含量賴JBM酯酶活力，减少单胺氧化酶活力，同时减少代谢产物丙二醛的产生；白芷总香豆素提取物可以明显的增加大鼠血中T细胞亚群CD4/CD8比值，增加正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能，还能促进正常小鼠鸡红细胞溶血素的生成，具有增强免疫的功能。(2)本发明的提取和纯化方法简便易行，重现性好，适合工业化生产。(3)以提取物为活性成分制成的药物组合物对白癜风的治疗效果显著，作用明确。下面通过本发明提供的中药组合物的药效学和安全性研究结果，采用国内常用于治疗白癜风的中药复方制剂一复方卡力孜然酊(商品名是维阿露)作为阳性对照药比较，来进一步说明本发明的有益效果。复方卡力孜然酊主要成份为驱虫斑鸠菊、补骨脂、何首乌、当归、防风、蛇床子、白鲜皮、乌梅、白芥子、丁香。试酴錢的s通过对实验性白癜风模型豚鼠的酪氨酸酶、单胺氧化酶、胆碱酯酶、丙二醛、血流变和皮肤黑色素，以及对正常大、小鼠的免疫功能的影响等的实验研究，验证本发明所提供的白芷香豆素提取物制成的外用凝胶制剂(下面简称为"祛白凝胶")对实验性白癜风模型动物的治疗作用以及对免疫功能的影响。祛白凝胶的制备-取白IE药材20kg，酌予碎断，置提取罐中，加80%乙醇提取3次，每次2h，合并乙醇提取液，滤过；滤液浓縮后，加乙醇2.0L溶解，滤过，滤液过硅胶层析柱，加混合有机溶剂乙酸乙酯一丙覿(8:1，V/V)洗脱，薄层监测，收集含香豆素类成分的洗脱液，减压回收洗脱液至不含有机溶剂，得到白芷总香豆素提取物160g。经含量测定，其中含主要活性成分欧前胡素15.涨、异欧前胡素10.6%、氧化前胡素15.5%，以上均为重量百分含量。取10g卡波姆，加丙二醇50g、水10ml使润湿后，再加入蒸馏水适量搅拌制成溶液，边搅拌边缓慢滴加三乙醇胺溶液适量调节pH至6.82，制成凝胶溶液，备用。将凝胶溶液与处方药物溶液研匀，得到本品的外用制剂一祛白凝胶。下述试验中，10%的祛白凝胶即取10g提取物溶于10ml的乙醇和2g吐温80中，与90g的凝胶溶液研匀；20%的祛白凝胶即取20g提取物溶于20ml的乙醇和4g吐温80中，与80g的凝胶溶液研匀；40%的祛白凝胶即取40g提取物溶于40ml的乙醇和8g吐温80中，与60g的凝胶溶液研匀。l.试验药品1.l实验药品l.l.l祛白凝胶1.1.2复方卡力孜然酊(新疆新时代制药有限责任公司提供)。1.2用法用量一日34次，擦药30分钟后，局部日光浴。1.3其他药品及试剂1.3.1CD4、CD8试剂盒由英国serotec公司提供1.3.2CHE、MDA、MAO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供1.3.3酪氨黢酶sigma公司生产1.3.4L-多巴由瑞士Fiuka公司生产1.3.5对苯二酚(氢醌)由广东汕头市西拢化工厂生产其余均为合肥市场购买。2.试验动物豚鼠(黑色或黑花色)体重300350g，雌雄兼用，由南京安立默科技有限公司提供。昆明种小鼠和wistar大鼠均由南京安立默科技有限公司提供。3.试验溶剂凝胶溶液4试验条件温度2025℃，湿度5565%，由空调控制。5.试验仪器XL-Md型流式细胞计数仪、YDA-IV血液粘度计、754紫外可见分光光度计6.试验内容6.1对实验性白癜风模型豚鼠治疗作用6.1.1对实验性白癜风模型豚鼠酪氨酸酶活力的影响6.1.2对实验性白癜风模型豚鼠MA0(单胺氧化酶)活力的影响6.1.3对实验性白癜风模型豚鼠CHE(胆碱酯酶)活力的影响6.1.4对实验性白癜风模型豚鼠MDA(丙二醛)含量的影响6.1.5对实验性白癜风模型豚鼠皮肤黑色素的影响6.1.6对实酴性白癜风模型豚鼠血流变的影响6.2对正常大、小鼠免疫功能的影响6.2.1对正常大鼠外周血T细胞亚群的影响6.2.2对正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能的影响6-2.3对正常小鼠鸡红细胞溶血素生成的影响7.1对实骏性白癱风模型豚鼠治疗作用7.1.1对实验性白癜风模型豚鼠酪氨酸酶、MAO、CHE、MDA和皮肤黑色素的影响7.1.1.1动物模型的制备、分组及给药方法取体重300350g黑色和黑花色豚鼠60只，雌雄各半，按体重随机分为正常组、模型组、阳性药物组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶浓度分别为10%、20%、40%)，各剪去背部黑色皮肤区毛约4X4cm2，用8%的硫化钠脱毛，每四天1次，除正常组涂自来水外，其余各组在脱毛区每天涂5%的氢醌0.5ml两次，第10d开始各组分别每天在涂抹氢醌过后1小时按剂量分别涂药，其中正常组、模型组涂赋形剂lg，阳性组(复方卡力孜然酊)涂l鹏l、祛白凝胶小、中、大剂量组祛白凝胶lg,每天一次，连续40d,共50d。末次药后2h，以20X乌拉坦按照0.5ml/100g腹腔注射麻醉，于腹主动脉取血，分别放入抗凝和不抗凝试管中，取血清和血浆经各试剂盒处理后，用754分光光度计比色测酪氨酸酶、MAO、CHE、MDA的含量，并在脱毛区中心取1X1缀2皮肤做病理切片，观察皮肤黑色素的变化，结果如下。7.1.1.2对实验性白癜风模型豚鼠酪氨酸酶含量的影响7.1.1.2.1^M酸il:际准回归方程取试管5支，分别加入lmlL-多巴溶液(2mg/ml)和2.8ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)，摇匀，放入25'C恒温水浴箱中预热lOmiti,再向上述试管中分别加入不同浓度的酪氨酸酶溶液l姐l,立即混匀，并准确计时，25'C水浴反应5min，迅速加入0.2ml硫脲一乙醇溶液，混匀，终止反应。以0.1M磷酸盐缓冲液为空白对照管，用754紫外可见分光光度计在波长475rnn处测吸收值，根据吸收值求回归方程，结果见表1。表l标准浓度酪氨酸酶吸收度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根据爽1数賴求回归方程为尸O.3579x-0.0073相关系数r=0.99387.1.1.2.2血浆中酷氨酸酶含量的测定检瀰方法同上，将测得吸收值代入回归方程，求得酪氨酸酶含量，结果见表2。表2祛白凝胶对实验性白瘢风模型豚鼠酪氨酸酶含量的影响(;d:s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可见，用5%的氢醒后，豚鼠血浆中酪氨酸酶含量明显减少，用药后，阳性组和祛白凝胶各剂量组豚鼠血浆中酪氨酸酶含量明显增加，与模型组比较，有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显增加实验性白癜风模型豚鼠血浆中酪氨酸酶含量。7.1.1.3对实验性白癜风模型豚鼠MAO活力的影响取血清200ul，按鹏O试剂盒要求进行，用754紫外可见分光光度计在242咖处比色，测定血清中MAO的活力。结果见表3。MAO活力(u/h/ml)-测定管吸光度/0.01+反应时间(h)+取样量(ail)表3祛白,对实验性白癜风模型豚鼠MAO活力的影响(;c士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表3可见，用5%的氢醌后，豚鼠血浆中MAO活力明显增加，与正常组比，有显著性差异；用药后，豚鼠血浆中MAO活力明显减小，与模型组比较，祛白凝胶各剂量组均有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显减少实验性白瘢风模型豚鼠血清中船0活力。7.1.1.4对实验性白癜风模型豚鼠CHE活力的影响按上^^T法处理动物，取血浆50ul，按C服试剂盒要求迸行处理后，用754紫外可见分光光度计在520n趣处比色，测得血浆中CHE活力。结果见表4。CHE活力(D/m1)=(对照管(3D值—测定管OD值)/对照管OD值X标准品浓度(8umol/ml)+取样量(ral)表4祛白凝跤对实验性白癜风模型豚鼠C服活力的影响(x土"<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与正常组比较卞<0.05"P<0.01与模型组比较aP<0.05"P<0.01由表4可见，用5%的氢醌后，豚鼠血浆中CHE活力明显减小，与正常组比，有显著性差异；用药后，豚鼠血浆中C服活力明显增加，与模型组比较，阳性组和祛白凝胶中、大剂量组有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显增加实验性白癜风模型豚鼠血浆中CHE活力。7.1.1.5对实验性白癜风模型豚鼠MDA含量的影响按上述方法处理动物，取血清100ul，按MDA试剂盒要求进行处理后，用754紫外可见分光光度计在532n粗处比色，溯得血浆中MDA含量。结果见表5。MDA含量0>1/1111)=(测定管吸光度一测定空白管吸光度)/(标准管吸光度一标准空白管吸光度)X标准品浓度(lOrnnol/ml)X样本测试前稀释倍数(1)表5祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠MDA含量的影响(义土.s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与正常组比较"P<0.01;与模型组比较"P〈0.01由表5可见，用5%的氢醌后，豚鼠血浆中MDA含量明显增加，与正常组比，有显著性差异；用药后，豚鼠血浆中MDA含量明显减少，与模型组比较，有显著性差异。说明祛白凝胶能够明篡,实验性白癜,型豚鼠血清中MM含量。7.1.1.6对实验性白癜风模型豚鼠皮肤黑色素的影响将各组豚鼠在用药部位中心取皮肤lXlcm2,用10W甲醛固定，常规石蜡包埋切片，用硫酸亚铁Lillie法进行黑色素染色，观察表皮基底细胞和棘细胞黑色素分布，和毛囊有黑色素的豚鼠个数，结果见表6。表6祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠皮肤黑色素的影响(;c土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>观察指标程度分级-"一"表示表皮基底細胞和棘细胞无黑色素"±"表示表皮基底细胞和棘细胞偶见黑色素"+"表示表皮基底细胞和棘细胞3050%有黑色素"++"表示表皮基底细胞和棘细胞5185%有黑色素"+++"表示表皮基底细胞和棘细胞85%以上有黑色素由表6可见，正常对照组所有豚鼠表皮基底细胞和棘细胞黑色素达到85%以上，且都有黑色素毛囊,模型组豚鼠表皮基底细胞和棘细胞黑色素分布明显减少，其中无黑色素有6例，偶见黑色素3例，黑色素达3050%有1例，说明涂5%的氢醌能明显增加豚鼠黑色皮肤的黑色素分解，而用祛白凝胶后各组豚鼠皮肤表皮基底细胞和棘细胞黑色素明显增多，说明祛白凝胶明显增如皮肤的黑色素生成。7.1.2对实验性白癜风模型豚鼠血流变的影响取体重200250g黑色和黑花色豚鼠60只，雌雄各半，按体重随机分为正常组、模型组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶浓度分别为10%、20%、40%),各剪去背部黑色皮肤区毛约4X4cffl2，除正常组外，其余各组在祛毛区每天涂5%的氢醌0.5ml两次，正常组涂自来水，第10d开始各组分别每天在涂抹氢醌过后1小时正常组、模型组涂賦形剂lg、阳性组涂复方卡力孜然STIidI、祛白凝胶小、中、大剂量组涂祛白凝胶浓度分别为10%、20%、40%lg，每天一次。连续40d，共50d。末次药后2h，以20%乌拉坦按照C5Bl/i00g腹腔注射麻醉，于腹主动脉取血，用血液流变仪检測祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠血流变的影响，结果表明，用5%的氢醌后，豚鼠血液低切、中切、高切、血浆粘度和纤维蛋白原明显增加，与正常组比，有显著性差异；用药后，祛白凝胶各剂量组的豚鼠血液流变性明显好转，与模型组比较，有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显改善实验性白癜自型豚鼠的血流变。7.2对正常大、小鼠免疫功能的影响7.2.1对正常大鼠外周血T细胞亚群的影响取体重l柳200g的大鼠50只，雌雄各半，按体重随机均分为正常组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶10%、20%、40%浓度)。在各鼠背部用8W硫化钠脱毛4X4cm2，24h后各组按表8剂量分别外涂给药，l次/日，连续给药30天，其中每隔7天用8%硫化钠脱毛一次。于末次药后30min，各组称重，用20%乌拉坦按照0.5ml/100g腹腔注射，腹主动脉血管取血，分别用流式细胞计数仪测外周血CD4、CD8。结果见表7。表7祛白,对正常大鼠外周血T细胞亚群的影响(jc土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与正常组比较，*P〈0.05林P〈0.01由表7可见,用药后，豚鼠外周血中CD4含量明显增加，而CD8含量基本保持不变，CD4/CD8比值增加。与正常组比，祛白凝胶大剂量组外周血中CD4/CD8有显著性差异；说明祛白凝胶对正常大鼠血中T细胞亚群CD4/CD8有明显的增加作用。7.2.2对正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能的影响取^^重1822g小鼠50只，雌雄各半，按体重随机均分为正常组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶10%、20%、40%浓度)。第一天在各鼠背部用8%硫化钠鋭毛，暴露2X2cm2大小的皮肤，24h后各组按表9剂量外涂给药0.4g/只，l次/日，连续7天，末次药后40min,称体重，然后各组小鼠尾静脉注射印度墨汁O.05ml/10g体重，分别于l、5fflin从眶后静脉丛取血20ul，溶于2mlO.WNa2C()3溶液中摇匀，置754型紫外可见分光光度计在波长700咖处比色，测定光密度(OD)。最后将小鼠颈椎脱臼处死称取肝、脾重量。按照公式求出吞噬(麻清)指数K，求出吞噬活性(校正廓清指数)a，结果见表8。K-logOD「logOD2/t2-1,a=1TX体重/(肝重+脾重)表8祛白凝胶对小鼠单核吞噬细胞吞噬功能的影响(J±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表8中的敷据可见，祛白凝胶对正常小鼠的单核吞噬细胞的吞噬指数和吞噬活性明显增加，祛白凝胶各剂量组吞噬指数与正常组比均有显著性的差异，祛白凝胶大剂量组与正常组比有显著性差异。说明祛白凝胶对正常小鼠的免疫功能有增强作用。7.2.3对正常小鼠鸡红细胞溶血素生成的影响取体重1822g小鼠50只，雌雄各半，按体重随机均分为正常组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶10%、20%、40%浓度)。第一天在各鼠背部用8%硫化钠脱毛，暴露2X2cW大小的皮肤，24h后每鼠腹腔注射5%生理盐水鸡红细胞混悬液0.2粗1进行免疫，各组皮肤给药0.4g/只，l次/日，连续给药7天，末次药后40min,摘眼球取血，离心，取血清用生理盐水稀释100倍,取稀释血清lml，与5W鸡红细胞悬液0.5ffll、10%补体0.511混合，在37。C恒温箱中保温40min后，0。C冰箱中止反应。离心，取上清液与754分光光度计540nm出比色，检测光密度(OD)，另设不加血清的空白对照组，取其上清液作为比色时调"0"的基准。以光密度(OD)读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异，结果见表9。鸡红细鵰^液制备从鸡翼下静脉取血10ml，去纤维蛋白后，用生理盐水洗涤三次，配成5%鸡红细驄潘^&液备用；补体镧备取3只豚鼠血清混合，用生理盐水配成10%即可。衮9祛白凝胶对鸡红细胞溶血素生成的影响(J±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>与正常组比较，*P<0.05**P<0.01由表9可见，用药后，鸡红细胞溶血素生成明显增加,祛白凝胶大剂量组与正常组比有显著性的差异。说明祛白凝胶对正常小鼠免疫功能有增强作用。s.药效学w^小绻采用5%的毓醌使黑色皮肤豚鼠的黑色皮肤的黑色素减少，酪氨酸嗨含量减少，MA0活力增加，CHE活力减少，MM含量增加，血液的粘稠度增加，与临床白癜风患者病理状况类似，说明采用5%的煞鵰可复制实验性白癜风模型动物。而模型动物每天应用祛白凝胶，结果显示..(D明显增加实验性白瘢风模型豚鼠皮肤黑色素，明显it加皮肤表皮基底细胞和棘细胞黑色素分布和皮肤毛囊中黑色素，血液中酪氨酸酶含量增加，MAO活力降低，CHE活力增加，代谢产物丙二醛的含量降低；还能显著改善模型动物的血液流变性措标；②对正常大、小鼠的免疫功能有一定的增强作用，明显的增加大鼠血中T细胞亚群CM/CD8比值，增加正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能，还能促进正常小鼠鸡红细胞溶血素的生成，说明祛白凝胶能增加实验性白癜风模型动物皮肤黑色素生成，减少皮肤黑色素分解、改善血液流变性和减少代谢产物的生成，增强免疫功能等作用。此外，毒理试验研究还表明，本发明所提供的中药组合物给予家兔正常和破损皮肤小大剂量组每天应用20%和40%祛白凝胶38/只，l天2次，连续用药6个月，结果显示，家兔行动、毛发、体重、食量等均正常；血象、血脂、血糖、肝肾功能，及脏器系数等与对照组比，均无明显差别(除个别指标外)，说明本品长期应用很安全。具体实施方式通过下述实麄倒将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素等主要活性成分的含量测定采用本领域公知的高效液相色谱法瀕定，在此不予详述。实施例一取白芷药材20kg，酌予碎断，置提取罐中，加80%乙醇提取3次，每次2h，合并乙醇提取液，滤过滤液浓缩后，加乙醇2.0L溶解，滤过，滤液过200300目硅胶层析柱，加混合有机溶镧乙酸乙酯—丙翻(8:1，V/V)洗脱，薄层监测，收集含香豆素类成分的洗脱液，减压回收洗脱液至不含有机溶剂，得到白芷总香豆素提取物160g。经含量测定，其中含主:要活性成分欧前胡素15.8%、异欧前胡素10.6%、氧化前胡素15.5%，以上均为重量百分含鼂。取上述提取物100g,加入100ml乙醇，20g吐温80溶解，备用另取卡波姆lOg，加内二醇50g使;SS后，再加入蒸馏水适量搅拌制成溶液，边搅拌边缓慢滴加三乙醇胺溶液适量调节pH至6.82，制成凝胶溶液将凝胶溶液与处方药物溶液研匀,补水至总重500g,搅拌均匀，得到漆品釣外用凝胶制剂。实施例二-取白芷药材10kg，酌予碎断，置提取罐中，加75%乙醇提取2次，每次2h，合并乙醇提取液，滤过滤液浓縮后，加水10L使分散溶解，滤过，滤液过HPD-100大孔树脂柱，水充分洗脱后，加郞％乙醇洗脱，薄层监测，收集含香豆素类成分的洗脱液，减压回收洗脱液至不含溶剂，得到白芷总香豆素提取物97g;经含量测定，其中含主要活性成分欧前胡素12.9%、异欧前胡素8.6%、氧化前胡素13.6%,以上均为重量百分含量。取PEG400、PEG4000各200g，置于蒸发皿中，水浴加热熔融，另取月桂氮卓酮10ml，甘油20ml、磷脂10g、蒸馏水50ml混合搅拌至冷，加入上述白芷提取物50g，混合均匀，即得白色软裔。实施例三取白ll药树50kg，酌予碎断，置提取罐中，加50%乙醇提取3次，每次lh，合并乙醇提取液，滤过；滤液浓縮后，加乙醇乙酸乙酯U:1，V/V)4L溶解，滤过，滤液过中性氧化铝层析柱，加混合有机溶剂乙醇一乙酸乙酯(1:2,V/V)洗脱，薄层监测，收集含香豆素类成分的洗脱液，减压回收洗脱液至不含有机溶剂，得到白芷总香豆素提取物516g，经含量測定，其中含主要活性成分欧前胡素11.4%、异欧前胡素7.1%、氧化前胡素11.2%,以上均为重量百分含量。取上遂提取物20g，加入30ml乙醇和3g吐温80溶解，备用；将硬脂酸20g、凡士林10g、月桂氮卓醣2g水浴加,融，另将10g丙二醇、1.5g吐温和20nil水混和，加热至同温，细流加入上述*&黻物中，搅拌至冷，加入白芷提取物溶液，搅匀，即得白色乳膏。实施例四取白芷药材50kg，酌予碎断，置提取罐中，加甲醇提取2次，每次1.5h，合并提取液，滤过；滤瀋浓縮后，加乙酸乙酯5.0L溶解，滤过，滤液过200300硅胶层析柱，加混合有机溶剂乙醆乙酯一丙酮(3:1，V/V)洗脱，薄层监測，收集含香豆素类成分的洗脱液，减压回收洗脱液至不含有机溶剂，得到白芷总香豆素提取物388g。经含量测定，其中含主要活性成分欧前胡素17.8%、异欧前胡素13.3%、氧化前胡素19.3%，以上均为重量百分含量。取上述提取物100g,加入150ml乙醇和10g吐温80溶解，备用；另取卡波姆2.5g，加丙二醇100g使润湿后，再加入蒸馏水适量使充分溶胀，制成溶液，边搅拌边缓慢滴加三乙醇胺溶液适量调节pH至6.78，制成凝胶溶液；将凝胶溶液与处方药物溶液研匀，再补水至总重500g,據拌均匀，得到本品的外用凝胶剂。权利要求1.一种用于治疗白癜风的白芷总香豆素提取物，其中按重量百分含量计，欧前胡素为10％～45％，异欧前胡素为5％～40％，氧化前胡素为10％～40％。2、权利要求l的白芷总香豆素提取物，欧前胡素为10%20%;异欧前胡素为5%10%;氧化前胡素为10%20%。3、权利要求1或2所述的白芷总香豆素提取物，其制备方法包括-U)提取取白芷药材酌予碎断，置提取罐中，加适当溶剂提取，合并提取液，滤过；(2)分离纯化上述滤液浓縮后，加适量溶剂溶解，滤过，滤液过层析柱，再用溶剂洗脱，收集含香豆素类成分的洗脱液，减压回收洗脱液至不含溶剂，得到白芷总香豆素提取物。4、、权利要求3所述的制备方法，其中步骤(2)所述的层析柱填料可以为硅胶、氧化铝或大孔树脂。5、权利3I求3所述的制备方法，其中步骤(2)所述的层析柱的洗脱液为水、乙醇、甲醇、丙酮、乙醱乙酯、氯仿、石油醸中的一种或任意几种的混合溶剂。6、一种药物级合物，它包含治疗有效量的权利要求1所述的总香豆素提取物和一种或多种药学上可接受,体或赋型剂。7、权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的组合物为外用制剂。8、权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述的外用制剂为凝胶、软裔或乳膏。9、权利要求1所述的总香豆素提取物用于制备治疗白癜风的药物的用途。10、一种用于增强免疫功能的白芷总香豆素提取物，其中按重量百分含量计，欧前胡素为10%45%,异欧前胡素为5%40%，氧化前胡素为10%40%。11、权利要求10的白芷总香豆素提取物，欧前胡素为10%20%;异欧前胡素为5%10氧化蕭稱素为10%20%。全文摘要本发明提供了一种白芷总香豆素的提取物及其制备方法、药物组合物和用途。将白芷药材经过中药现代化技术分离纯化后，加入辅料制成适当剂型使用。该发明的总香豆素提取物对白癜风的疗效显著，且具有增强免疫的功能。提取物的制备方法重现性好，适合工业化生产。文档编号A61K36/185GK101234103SQ200710019809公开日2008年8月6日申请日期2007年1月30日优先权日2007年1月30日发明者煦冯,杨永安,鸣王,鸯王,王年鹤,程艳菊,郭安军申请人:江苏省中国科学院植物研究所;江苏正大天晴药业股份有限公司