专利名称：鬼针草总黄酮在制备防治血吸虫性肝纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鬼针草总黄酮的新用途，确切的说是鬼针草总黄酮在制备防治血吸虫性肝纤维化药物中的用途。
背景技术：
鬼针草又名婆婆针、鬼杈草，小鬼针，粘身草等，其药用历史悠久，始载于唐·陈藏器《本草拾遗》，谓“鬼钗草，味苦平，无毒，主蛇及蜘蛛咬，杵碎傅之，亦杵绞汁服。生地畔，有桠，方茎，子作钗脚，着人如衣针，北方呼之为鬼针。”鬼针草类药材全草均可用药，味苦性平而无毒，具有清热解毒，散瘀消肿等功效，主治疟疾、腹泻、痢疾、肝炎、急性肾炎、胃痛、噎膈、肠痈、咽喉肿痛、跌打损伤、蛇虫咬伤等。为了更好的认识和了解这一自然资源，更好的开发与利用，现将鬼针草的研究与开发现状综述如下。
鬼针草为菊科(Compositae)管状花亚科鬼针草属(Bidens L.)植物，为一年生草本，其药材资源非常丰富，主要分布于我国东北、河北、山东、山西、河南、江苏、云南、四川、广东、广西等地，生于水边、河岸、湿地、荒地及山坡等处，极易采集。
鬼针草的化学成分鬼针草所含化学成分种类较多，文献报道从该植物中分离得到挥发油类、甾醇、查耳酮、橙酮、聚乙炔类等，其活性成分以黄酮类和聚乙炔类成分为主。乙醇提取物的正丁醇部分鉴定出4个黄酮成分，为金丝桃苷(hyperoside)、奥卡宁(okanin)、异奥卡宁-7-0-葡萄糖甙和海生菊苷(maritimein)。鬼针草各部位中黄酮类成分有较大差异，在花果期，叶和花序中总黄酮含量较高(分别为6.67％和6.68％)，茎枝中含量较低(0.89％)。叶中分离鉴定了21种挥发性成分，主要为脂肪烷和脂肪酸类，另外含少量的醛、酮烯、腈、胺及呋喃类成分；其中脂肪类化合物占相当比例。还有甾体类化合物如菠甾醇、胡萝卜苷，谷甾醇、豆甾醇-3-0-p-D-葡萄糖苷。
鬼针草含有丰富的氨基酸，如天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸等17种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸，总蛋白质157.89g/kg，总游离氨基酸含量达139.89g/kg，必需氨基酸总量57.09g/kg。鬼针草所含氨基酸与传统名贵药材亚香棒虫草、冬虫夏草相比，在种类上多了胱氨酸，在含量上脯氨酸、谷氨酸高于两者，其他氨基酸含量相当另外鬼针草中还含有11种人体必需微量元素，测定结果表明，Mg含量最高，P、Fe、Ca含量较高，Cu、Zn次之，Mn、Co、Ni、Mo、Cr含量最低，鬼针草中含有丰富的P，是其调节神经、催眠、镇静等作用的内在原因。维生素在鬼针草中也有分布，如维生素B1、维生素B2、β-胡萝卜素。
鬼针草药材资源丰富，药用历史悠久，在民间验方中有小人参之称。其生物活性多样，且作用温和持久，具有较高的药用价值，尤其对消化系统、中枢神经系统及心血管系统显示较强的药理作用。近年来对鬼针草药材进行了一些开发和利用，目前国内的鬼针草产品有悦年片、鬼针草口服液、鬼针草保健冲剂等，但也仅限于防治高血压等心血管疾病，还未见对鬼针草总黄酮在抗血吸虫性肝纤维化方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供鬼针草总黄酮的新用途，即在制药中的新应用。实际上，本发明提供了鬼针草总黄酮在制备预防或治疗血吸虫性肝纤维化的药物中的应用。
血吸虫引起的血吸虫病是全世界范围内广泛流行的严重危害人类健康的寄生虫病。新中国成立后，中国共有12个省、自治区、直辖市流行血吸虫病。经过反复防治，全国疫情降低明显，钉螺面积大幅度减少。但近年来，由于多种原因，中国血吸虫病疫区范围有所扩大，部分地区疫情死灰复燃。血吸虫病的流行病学、发病机制、抗虫及抗纤维化药物的研究成为国内外研究的热点。
血吸虫病的流行必须具备以下三个环节①传染源日本血吸虫患者的粪便中含有活卵，为本病主要传染源。②传播途径主要通过皮肤，粘膜与疫水接触受染。③易感性人与脊椎动物对血吸虫普遍易感，流行区以学龄儿童及青少年感染率最高，以后逐渐下降，此与保护性免疫力有关。
血吸虫病临床主要分为四个阶段①侵袭期②急性期③慢性期④晚期。尤其是晚期血吸虫病人极度消瘦，出现营养不良性水肿，此时肝硬化多发展至后期，因门静脉栓塞形成，侧枝循环障碍，出现腹水、巨脾，腹壁静脉怒张等晚期严重症状。患者可随时因门静脉高压而引起食道静脉破裂，造成致命性上消化道出血，或因此诱发肝功能衰竭而死亡。
血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化是血吸虫病两种最主要的病理改变，肝纤维化是肉芽肿的间接延伸，是导致血吸虫病严重并发症与死亡的最根本的原因。动物实验和临床研究均表明，彻底的杀虫治疗后，血吸虫病肝纤维化不能完全消退，抗肝纤维化治疗仍属必要。近年来的研究表明，血吸虫肝纤维化的病理是可逆的。只要在肝纤维化阶段而非延误至中晚期肝硬变进行合理治疗是完全可以达到逆转肝纤维化进程，进而缓解乃至治愈肝纤维化的目的。血吸虫肝纤维化是在虫卵肉芽肿基础上产生的，其核心机制是在可溶性虫卵抗原刺激下，巨噬细胞与淋巴细胞产生PDGF、VEGF等各种细胞因子刺激肝星状细胞(HSC)活化、增殖、转化成肌成纤维细胞，并大量合成以I、III型胶原为主的细胞外基质(ECM)。因此抑制HSC活化、增殖成为抗肝纤维化治疗的重要对策。
基于血吸虫性纤维化发生机制，抗纤维化治疗的策略包括①治疗原发病，控制肝内坏死炎症，即抗血吸虫治疗，代表药物有吡喹酮；②抑制细胞因子，阻抑星形细胞增殖和活化，直接抑制星形细胞，中和星形细胞的增生性、致纤维化性和收缩性反应，主要药物有IL-10、IFN、马洛替酯、秋水仙碱等；③强化胶原酶等酶活性，促进胶原纤维降解，代表药为水飞蓟宾。已有许多因子和药物被证明对肝纤维化发生和发展的不同阶段具有作用，但尚处于临床前或实验阶段。迄今的研究表明，无论是在临床应用还是基础研究，中医药在抗纤维化治疗中具有明显的优势，常用的治法为理气活血、祛湿化瘀、益气活血化瘀、养阴益气化瘀、软坚活血化瘀。
本发明遵循以上治疗原则，基于长期治疗经验，发现鬼针草具有清热解毒，散瘀消肿等功效，对病毒性肝炎引起的肝纤维化具有很好的治疗作用，并对CCl4引起的化学性肝损伤也有一定的保护作用。为将其开发成对防治血吸虫性肝纤维化的有效药物提供非常珍贵的依据。我们提取其有效部位总黄酮，通过体内实验证实其有显著的抗血吸虫性肝纤维化作用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用鬼针草总黄酮的药理实验及结果来说明其在防治血吸虫性肝纤维化中的应用。
鬼针草总黄酮防治血吸虫性肝纤维化试验如下(一)鬼针草总黄酮的制备取鬼针草生药粉碎，40～80％的乙醇回流提取2～3次，提取液合并，回收乙醇，减压浓缩得浸膏。浸膏水溶，静置，过滤，澄清液上树脂柱，水洗后收集40～95％乙醇洗脱部分，回收乙醇，减压浓缩，干燥即得提取物，所述提取物为鬼针草总黄酮。鬼针草总黄酮为红棕色粉末，具有芳香味；其主要成分总黄酮含量为30～80％。提取物可加入相应辅料，制成片剂、胶囊、缓释片、滴丸、冲剂、微粒剂，并进一步纯化制成针剂。
(二)实验鬼针草总黄酮对血吸虫致小鼠肝纤维化的保护作用1.材料及试剂鬼针草总黄酮由本院天然药物化学实验室提供，总黄酮含量＞50％；钉螺由湖南省血吸虫病防治研究所提供；吡喹酮购自韩国；秋水仙碱云南西双版纳制药有限公司；ALT，AST试剂盒南京建成生物技术公司；ALB，TP试剂盒长春惠利生物技术公司；Balb/c雌性小鼠，体重18～22g购自上海实验动物中心。
2.方法将小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、鬼针草总黄酮治疗组分低、中、高三个剂量(57.5mg/kg、115mg/kg和230mg/kg)、阳性对照组(秋水仙碱0.15mg/kg)。除正常对照组外，其余各组每只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴30±2条，并于感染6周后给予吡喹酮作杀虫治疗，次日治疗组ig.给予鬼针草总黄酮和秋水仙碱治疗，1次/d，共8周。正常组和模型组给予同剂量NS。治疗结束后，禁食16 h，自小鼠后眼眶静脉从取血，3000rpm离心10min，测定血清中ALT，AST活性及TP，ALB值。取肝脾称重，得肝脾指数，称取同一部位肝组织100mg，组织匀浆器匀浆，加生理盐水至1ml，从充分混匀的组织悬液中量取50μl，涂片5张，加盖玻片镜检全部虫卵数，计算每克肝组织虫卵数(EPG)。取肝脏左叶同一部位，放在10％福尔马林溶液中固定，做病理切片，进行肝脏病理组织学HE染色及Masson染色检查，结果对光镜下肝纤维化程度进行评分并拍照保存。
附肝脏病理组织学观察及评分标准光镜下观察，将肝脏纤维化程度分为4级0级(20＝1)肝细胞正常，几乎无纤维化；I级(21＝2)胶原纤维包绕虫卵肉芽肿周围；II级(22＝4)汇管区有大量纤维化，小叶间仅有少量纤维；III级(23＝8)纤维组织大量延伸至肝小叶间；3.结果3.1.TFB对肝脾指数和虫卵计数的影响 表1鬼针草总黄酮对血吸虫性肝纤维化小鼠肝脾指数及虫卵肉芽肿数目的影响(n＝10， )
#P＜0.05，##P＜0.01与正常对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比。
表1结果表明，小鼠经血吸虫感染后肝脾肿大，指数升高，经小剂量鬼针草总黄酮治疗后可显著降低肝脾指数(P＜0.05)；虫卵计数表明经药物治疗后可减少肝中的虫卵数，大剂量鬼针草总黄酮治疗组与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。
3.2 TFB对血清中ALT、AST的影响表2结果表明，小鼠经感染后血清中ALT、AST活性(P＜0.01)显著升高，而鬼针草总黄酮和秋水仙碱可显著降低血吸虫性肝纤维化小鼠血清中过高的ALT、AST活性(P＜0.05)。
表2鬼针草总黄酮对血吸虫性肝纤维化小鼠血清中ALT、AST的影响(n＝10，
)
#P＜0.05，##P＜0.01与正常对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比。
3.3TFB对小鼠血清中ALB、TP和A/G的影响表3结果表明，小鼠经血吸虫感染后血清中的白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)均降低(P＜0.05)，与模型组比较鬼针草总黄酮和秋水仙碱可明显升高ALB值(P＜0.05)，对总蛋白(TP)和A/G值也有升高的趋势，但是与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，提示鬼针草总黄酮对血吸虫性肝纤维化小鼠有一定的保护作用。
表3鬼针草总黄酮对血吸虫性肝纤维化小鼠血清中ALB、TP、A/G的影响(n＝10，
)
#P＜0.05，##P＜0.01与正常对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比。
3.4TFB对血吸虫性肝纤维化小鼠病理改变的影响(1)大体改变图1是小鼠经血吸虫感染及治疗前后的肝脏形态图，其中A为正常组，B为模型组，C为57.5mg/kgTFB组，D为115mg/kgTFB组，E为230mg/kgTFB组，F为0.15mg/kg秋水仙碱。
从图1可见，正常组小鼠肝脏颜色红润，表面光滑，边缘锐利，包膜完整，质地柔软，无肝纤维化病理改变现象。模型组小鼠肝脏颜色呈暗褐色，肝脏表面布满米粒样虫卵结节，肝脏明显肿大，质脆，包膜紧张。鬼针草总黄酮各用药组上述病理改变有所减轻，尤其是大剂量组肝脏明显好转。
(2)HE和Masson胶原染色图2是小鼠经血吸虫感染后肝组织的形态学改变图(HE染色×100)，其中A为正常组，B为模型组，C为57.5mg/kgTFB组，D为115mg/kgTFB组，E为230mg/kgTFB组，F为0.15mg/kg秋水仙碱。
图3是小鼠经血吸虫感染后肝组织的形态学改变图(Masson染色×100)，其中A为正常组，B为模型组，C为57.5mg/kgTFB组，D为115mg/kgTFB组，E为230mg/kgTFB组，F为0.15mg/kg秋水仙碱。
从图2可见，正常组小鼠肝脏镜下肝细胞排列整齐，无炎症和坏死现象。模型组小鼠肝脏汇管区可见大量炎性细胞浸润，肝细胞有不同程度变性和坏死，同时可见肝细胞排列紊乱，肝小叶正常结构破坏。TFB治疗组可见少量炎性细胞浸润，肝小叶结构基本正常。
从图3可见，正常组小鼠肝组织中无胶原纤维形成，模型组小鼠肝小叶间均有大量胶原增生，小叶内有粗大纤维性间隔伴肝小叶结构紊乱，严重的可见纤维结缔组织包绕分割肝小叶，使正常肝小叶结构破坏，有假小叶形成。TFB治疗组仅见汇管区有少量胶原沉积，肝小叶间很少有胶原沉积。
3.5鬼针草总黄酮对血吸虫肝纤维化程度的影响表4鬼针草总黄酮对血吸虫肝纤维化程度的影响(n＝10，
)
#P＜0.05，##P＜0.01与正常对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比。注表中数据为肝纤维化4个等级相对应的得分根据上述血吸虫性肝纤维化评分标准，表4结果显示，小鼠经血吸虫感染后肝纤维化评分显著升高(P＜0.01)，TFB 57.5，115，230mg/kg治疗组与模型组比较其肝纤维化评分明显降低(P＜0.05)，尤以TFB230mg/kg最为显著(P＜0.01)，与上述HE染色结果一致。
上述实验结果表明，本发明具有几个方面的优点1、本发明发掘了鬼针草总黄酮新的药用前景，开拓了一个新的药用领域；
2、本发明的鬼针草总黄酮采用口服给药，服用方便，毒副作用小，长期服药无危害；3、本发明鬼针草总黄酮的原药资源非常丰富，具有良好的社会和经济效益；4、本发明的鬼针草总黄酮适用于血吸虫性肝纤维化，作用于多个环节，疗效确切；5、本发明为将鬼针草进一步开发成新药提供了强有力的基础。
图1为小鼠经血吸虫感染及治疗前后的肝脏形态图，图2为小鼠经血吸虫感染后肝组织的形态学改变图(HE染色×100)，图3为小鼠经血吸虫感染后肝组织的形态学改变图(Masson染色×100)。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步地描述。
实施例称取鬼针草生药10kg，粉碎后加入80％乙醇120L，热回流提取2次，每次1h，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩得浸膏。浸膏水溶，静置，过滤，澄清液上大孔树脂柱，水洗后收集80％乙醇洗脱部分。回收乙醇，减压浓缩，干燥即得提取物，提取物为鬼针草总黄酮。鬼针草总黄酮为红棕色粉末状，具有芳香味；其主要成分总黄酮含量为30-80％。提取物可加入相应辅料，制成片剂、胶囊、缓释片、滴丸、冲剂、微粒剂，并进一步纯化制成针剂。鬼针草总黄酮临床推荐剂量300-1200mg/天，口服，一日三次。
权利要求
1.鬼针草总黄酮在制药中的应用，其特征在于鬼针草总黄酮在制备防治血吸虫性肝纤维化药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及鬼针草总黄酮的新用途，具体地说涉及鬼针草总黄酮在制备防治血吸虫性肝纤维化药物中的应用。本发明药物清热解毒、活血散淤、舒肝健脾，特别是具有改善肝功能、提高机体的免疫能力，调节免疫紊乱的作用。本发明适用于血吸虫病引起的肝纤维化，并作用于多个环节，疗效确切。用于治疗或预防血吸虫病引起的肝纤维化采用口服给药，服用方便，毒副作用小，长期服药无危害。
文档编号A61P1/00GK101091739SQ20071002478
公开日2007年12月26日 申请日期2007年6月25日 优先权日2007年6月25日
发明者陈飞虎, 沈际佳, 吕元庆, 李俊 申请人:安徽医科大学