专利名称：：转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种生物
技术领域：
的基因序列。具体的说，涉及一种转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列。技术背景水稻是我国最重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。对转基因植物进行品系特异性的检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。而转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。目前已经有部分专利和文献报道了转基因植物外源插入载体旁侧序列，例如张大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。
发明内容针对上述领域中的空白，提供了一种转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列。进一步，本发明还提供该转基因品系特异性的PCR检测方法。一种转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5'端旁侧序列，其特征在于5'端旁侧序列如SEQIDN01所示。一种转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3'端旁侧序列，其特征在于3'端旁侧序列如SEQIDN02所示。5'端旁侧序列的制备方法，是通过TAIL-PCR扩增得到。3'端旁侧序列的制备方法，是通过LD-PCR扩增得到。转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物一条引物为依据SEQIDN01中l-884位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQIDN01的885-1544位序列设计的反向引物。所述正向弓l物为Dfl:5'-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3，，所述反向弓l物为LB-P3:5'-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3，。转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物一条引物依据SEQIDN02中1-1311位序列设计的正向引物，另一条引物依据SEQIDN02的1312-1581位序列设计的反向引物。所述正向序列为1145f:5'-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3'，所述反向序列为Drh5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3'。根据Wu等(稱etal，2002，TheorApplGenet，104:727-734)报道的用于转化的载体pKUB的结构图，其中T-DNA区域结构见图1，由叩tll抗性基因表达盒、cryJAb基因表达盒、hpt抗性基因表达盒和gus基因表达盒组成。本发明采用常规方法，提取植物基因组DNA，利用TAIL-PCR分离法得到5，端旁侧序列1544bp，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。通过分析，该5'端旁侧序列包括水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号AP008208)的24707035-24707918位，其核苷酸序列与SEQIDNO.l中从l-884位的核苷酸序列完全相同；T-DNA左边界区域序列，来源于外源插入载体pKUB，其核苷酸序列与SEQIDNO.l中885-1544位的核苷酸序列完全相同。利用LD-PCR分离法得到3'端旁侧序列1581bp，其核苷酸序列如SEQIDN02所示。通过分析，该3，端旁侧序列包括玉米启动子PW/的部分序列，来源于外源插入载体pKUB，其核苷酸序列与SEQIDN0.2中的1-1311位的核苷酸序列完全相同；水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号AP008208)的24707954-24708223位，其核苷酸序列与SEQIDN0.2中从1312-1581位的核苷酸序列完全相同。转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，可以5'端旁侧序列和/或3'端旁侧序列作为目的DNA扩增片段。根据5'端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据l-884位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列设计，位于水稻2号染色体(GenBank登记号AP008208)的24707035-24707918位，反向引物可根据885-1544位的核苷酸序列设计，即是按照T-DNA左边界区域序列设计，本发明设计的正向引物为Dfl:5，-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3，，反向引物为LB-P3:5，-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3'。根据3'端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据卜1311位的核苷酸序列设计，即是按照玉米启动子P"W的部分序列设计，反向引物可根据1312-1581位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号AP008208)的24707954-24708223位设计，本发明设计的正向序列为1145f:5'-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3，，反向序列为Drh5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3'。本发明首次克隆了转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的品系特异性定性、定量PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一歩用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。图l转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的转化载体pKUB的T-DNA区域结构示意2通过TAIL-PCR方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5'端旁侧序列。M:markerDL2000;泳道上方的编号代表使用的简并引物分别与第三级巢式引物组合的扩增结果。图3通过LD-PCR方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3'端旁侧序列。M:marker入/HindlII;1:Drl/crylA-R引物扩增；2:Drl/nos-R引物扩增图4转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端旁侧序列特异性引物Dfl/LB-P3检测M:markerDL2000;1,2:转基因水稻品系克螟稻1(KMD1);3，4:对照秀水11图5转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的3'端旁侧序列特异性引物Drl/1145f检测。M:markerDL2000;1,2:转基因水稻品系克螟稻1(KMD1);3，4:对照秀水1具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的克隆一、实验材料1、植物材料转基因水稻转基因水稻品系克螟稻l(KMDl)。常规水稻秀水ll。2、酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和简并引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。3、实验仪器PCR扩增仪EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA测序仪(AppliedBiosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。二、实验方法和过程1、外源插入载体Wu等(wuetal,2002)报道了用于转化的载体pKUB的结构图，其中T-DNA区域结构见图l，由nptll抗性基因表达盒、czyiAb基因表达盒、hpt抗性基因表达盒和giis基因表达盒组成。2、植物基因组DNA提取与检测2.1、植物DNA提取2丄1、抽提液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2丄3、提取方法a称取200-400mg水稻叶片，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的1.5ml离心管中。b加入lml预冷至4。C的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13000r/min离心机，4。C离心15min，弃去上清液。c加入600^1预热到65。C的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65'C的水浴锅中裂解40min。d用13000r/min离心机室温离心10min，将上清液转至另一离心管中，加入5plRNaseA(10mg/ml)，37°C水浴30min。e分别用等体积苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)和氯仿异戊醇(24:1)各抽提一次。f用13000r/min离心机室温离心10min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10体积3M乙酸钠(pH5.6),-20。C放置2-3h，充分沉淀DNA。g13000r/min，4。C离心15min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50nlTE(pH8.0)溶解DNA。h把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng尔l，储存于-20t:备用。3、TAIL-PCR分离已知序列的旁侧序列TAIL-PCR详细的描述见Liu等(Liuetal"1995,ThePlantJournal,8(3):457-463)，用于扩增已知区域的侧翼序列。根据T-DNA左边界区域设计三个巢式特异性PCR引物LB-P1LB-P3，依次与8个简并引物AD2-6、AD8、AD9、AD11分别组合进行三次PCR扩增，引物序列见表l。PCR反应条件见表2。表l用于TAIL-PCR扩增的简并引物和特异性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>长链PCR用于扩增水稻基因组中的长片段。本实施例中用于扩增转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入载体的3'端旁侧序列。根据扩增得到的5'端旁侧序列中的水稻基因组，设计其下游区域的特异性引物Drl，在转化载体pKUB右边界附近设计引物nos-R和c/y"-R。引物Drl分别与nos-R和c/y"-R组合进行扩增，引物序列见表3。表3用于LD-PCR的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>LD-PCR扩增体系为总体系50nL，ExTaq(Takaraco..Dalian)，1.25U10xExTaqBuffer5pL,dNTP(各2.5mM)4pL，水稻DNA2(iL(10ng/|iL)，引物各2^iL(25一)。LD陽PCR扩增程序94。C4min;(98°C10s，68°C15min)，30cycles;72°C10min。5、序列测定和分析PCR扩增产物在0.8X的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收扩增片段，连接至UpGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer进行序列测定。采用vectorNTI10.0(Invi加gen)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的水稻基因组序列。三、实验结果1、TAIL-PCR扩增和LD-PCR扩增分别获得了5'端和3'端外源插入片段的旁侧序列根据转化载体T-DNA左边界区域设计的特异性引物与8个简并引物组合进行TAIL-PCR扩增，获得了5'端外源插入片段的旁侧序列(图2)。根据其中的水稻基因组序列，设计特异性的下游引物，与转化载体pKUB右边界附件的crylAb上的引物组合进行扩增，获得了3'端外源插入片段的旁侧序列(图3)。2、5'端外源插入片段的旁侧序列分析TAIL-PCR扩增方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5'端外源插入片段的旁侧序列，经DNA序列分析和核酸数据库中检索表明5'端旁侧序列长度为1544bp，其中含有884bp的水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号AP008208)的24707035-24707918位；660bp的T-DNA左边界区域序列，来源于外源插入载体pKUB。具体的转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端外源插入片段的旁侧序列的信息见SEQIDNO1。3、3'端外源插入片段的旁侧序列分析采用LD-PCR扩增的方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3'端外源插入片段的旁侧序列，经DNA序列分析和核酸数据库中检索表明3'端旁侧序列长度为1581bp，其中含有1311bp的玉米启动子Pubi的部分序列，来源于外源插入载体pKUB，270bp的水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号AP008208)的24707954-24708223位。具体的转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的3'端外源插入片段的旁侧序列的信息见SEQIDN02。实施例2基于转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法一、实验材料1、植物材料转基因水稻转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)。常规水稻秀水ll。2、酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。3、实验仪器PCR扩增仪EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。二、实验方法和过程1、植物基因组DNA提取与检测见实施例l中的"植物基因组DNA提取与检测"2、基于5'端和3'端旁侧序列的品系特异性PCR检测根据实施例1中测定的5'端和3'端旁侧序列，分别在其水稻基因组序列部分和转化载体序列部分设计引物，见表4。PCR扩增结果表明，转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端和3'端扩增引物组合分别得到了预期的508bp和437bp的扩增片段，而对照秀水ll均没有相应的扩增片段，见图4和图5。表4转基因水稻品系克螟稻l(KMD1)的5'端和3'端品系特异性检测引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Drl5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3'附录序列表SEQIDN01:5'端序歹U:(1544bp)1ACGAACCAACGCTCGAGCACAGATGCAGGTGAGCTCGATCAGATTCAGAACTGAATCACA61GGCAGCGAACTCTTTTTTTCTGTACATTCTGATTTCTAAATGAAGCTCAACGTTACGATG121CGCCAAACTAGTGCTCAATGAGTACAATATACGACCTCCTCGGATCGCGTACCCCTGACA181CCATGAAACGGTTGGCAGGTAATACGGTTTGAAATCGGAAATACTCCGTTTCACATGATA241GTACAGTACAATTGCGCTCGCGTTTCACATGATAGGTCACACTATTCTGTCAGGAGCAAA301CAGCTAAAACATTTTCATAAGATTCAGCAAATGAGGGGAGAGGCCAAATCCACTGTAAAC36丄TCAAAATACTATAATCGGCAGCAGGACGGTGATGTCAGACGAAAAACAGAGAGGAGAACA421CTTCCTTAATCACAATCCACAAGTCAACGGCAGATCCAGACACCGCATATGTGTTTCCGG481ACTCTGGATTCAGGCATAGTTTACTCGGGAGCAGCTCTTCGGGACACGGAAGATGCACAC541TGGATGGCATGGAGGTCAGGGGGAATAATCGAACATGCGAAATGGAAATTGGCTAGTTGT601GGAGCGTCAACTGGGAGCTTATCTTATTACTAATTAGTATTACCATTGCCATTACGTCTG661AAACAGACGGGGCTCCCATTTCTTTTTGATGTCGTTAGTACAGCCGGCTTCGTTTTTCTT"721TTCTGGCTGTCTCGGCTGTCACCTGTCAGTCTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGCCGACG781AGGGCGCCGTGGACTTCGCGGGCTCGCGGCGATGGCGATGCGCGCTCCAACTGCGGCGGG841TCTCACCGGGCTGCGTGCGTACGCCGATATGCCTGCCCATCTCGGGATATATTGTGGTGT901AAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGGGG961TGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCT1021GAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGA1081TGGTGGTTCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTT1141GAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAA1201AGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAG1261TTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATT1321TAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGG1381AGCGGGCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCi'mTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAG二501GGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCSEQIDNO2:3'立崭序歹[J:(1581bp)1.TCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGGGTGAGCATCGACAAAAGAAACA61GTACCAAGCAAATAAATAGCGTATGAAGGCAGGGCTAAAAAAACCCACATATAGCTGCTGmCATATGCCATCATCCAAGTATATCAAGATCAAAATAATTATAAAACATACTTGTTTATTA181TAATAGATAGGTACTCAAGGTTAGAGCATATGAATAGATGCTGCMATGCCMOVTGTM1241ATGCATCAGTAAAACCCACATCAACATGTATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCAT301CTTAAACTCGTAACTATGAAGATGTATGACACACACATACAGTTCCAAAATTAATAAATA361CACCAGGTAGTTTGAAACAGTATTCTACTCCGATCTAGAACGAATGAACGACCGCCCAAC421CACACCACATCMCACAACCAAGCGAACAAAAAGCATCTCTGTATATGCATCAGTAAAAC481.CCGCATCAACATGTATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCATCATCTTCAATTCGTA541ACTATGAATATGTATGGCACACACATACAGATCCAAAATTAATAAATCCACCAGGTAGTT601TGAAACAGAATTCTACTCCGATCTAGAACGACCGCXAACCAGACCACATCATCACAAC.C661AAGACAAAAAAAAGCATGAAAAGATGACCCGACAAACAAGTGCACGGCATATATTGAAAT721AAAGGAAAAGGGCAAACCAAACCCTMGCAACGAAACAAAAAAAATCATGAAATCGATCC781CGTCTGCGGAACGGCTAGAGCCATCCCAGGATTCCCCAAAGAGAAACACTGGCAAGTTAG841CAATCAGAACGTGTCTGACGTACAGGTCGCATCCGTGTACGAACGCTAGCAGCACGGATC901TAACACAAACACGGATCTAACACAAACATGAACAGAAGTAGAACTACCGGGCCCTAACCA961.TGGACCGGAACGCCGATCTAGAGAAGGTAGAGAGGGGGGGGGGGGGAGGACGAGCGGCGTi021ACCTTGAAGCGGAGGTGCCGACGGGTGGATTTGGGGGAGATCTGGTTGTGTGTGTGTGCG1081CTCCGAACAACACGAGGTTGGGGAAAGAGGGTGTGGAGGGGGTGTCTATTTATTACGGCG1141GGCGAGGAAGGGAAAGCGAAGGAGCGGTGGGAAAGGAATCCCCCGTAGCTGCCGTGCCGT12OGAGAGGAGGAGGAGGCCGCCTGCCGTGCCGGCTCACGTCTGCCGCTCCGCCACGCAATTTCTGGATGCCGACAGCGGAGCAAGTCCAACGGTGGAGCGGAACTCTCGAGAGGGGTCGGCACGATGGTCGCATCGTCGTGCGTGAGCTGCCTATCGACAGGTGGTGTGCCAATGAGGAGAT1381ACGTTGATCTGTGGTTTCCAAAAGTCCGGTGCAAAATGGGAGATAGCTGCGATGGCTTAT1441TTACTTGGGTGGTGCACACTTGTACAGGTTAGCTTGACAGTTAGAGAAGTACGTACTCCT1501ATAAAAGATTTCCAGGAATTCTCGTGCTGGACTCTTTCGCGAGCACCTGCACTTTGAGCA1561TGAGGTGCAACGGCTGATCTT权利要求1.一种转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5’端旁侧序列，其特征在于5’端旁侧序列如SEQIDNO1所示。2.—种转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3，端旁侧序列，其特征在于3'端旁侧序列如SEQIDN02所示。3.权利要求1所述的旁侧序列的制备方法，是通过TAIL-PCR扩增得到。4.权利要求2所述的旁侧序列的制备方法，是通过LD-PCR扩增得到。5.转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物一条引物为依据SEQIDN01中l-884位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQIDNOI的885-1544位序列设计的反向引物。6.根据权利要求5所述的检测方法，所述正向引物为Dfl:5'-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3'，所述反向引物为LB-P3:5'-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3'。7.转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求2所述旁侧序列的特异性引物一条引物依据SEQIDN02中l-1311位序列设计的正向引物，另一条引物依据SEQIDN02的1312-1581位序列设计的反向引物。8.根据权利要求5所述的检测方法，所述正向序列为1145f:5'-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3'，所述反向序列为Drh5'-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3，。全文摘要本发明涉及“一种转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列”，其特征在于5’端旁侧序列如SEQIDNO1所示，3’端旁侧序列如SEQIDNO2所示。利用该旁侧序列作为目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的品系特异性定性、定量PCR检测。文档编号C12Q1/68GK101240278SQ200710063778公开日2008年8月13日申请日期2007年2月9日优先权日2007年2月9日发明者彭于发,王锡锋,谢家建申请人:中国农业科学院植物保护研究所