专利名称：一种组织工程血管的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程血管的构建方法，更具体地说是一种自体活组织材料体 外构建血管移植物的方法，属于组织工程领域。
技术背景目前，心血管疾病已经成为严重危害人类健康的疾病之一，特别是血管闭塞性疾 病最终必须依靠外科手术的方法置换病变血管。目前常用的血管移植材料包括以不可 降解的人工合成材料制作的人工血管、以及经过不同方法处理过的同种或异种血管和 自体血管。人工血管材料的主要问题是存在血栓形成、凝血问题；同种或异种血管主 要存在排异反应、钙化、耐久性差等问题。自体血管目前仍然是中小血管移植材料的 主要来源，但自体血管来源受限，数量有限，特别是老年患者、肾脏疾病患者、糖尿 病、高血压患者中，可移植的无病变血管更显稀少，尤其是在需要多支旁路或在手术 病人中，更是如此。虽然经过多年的努力，但目前仍未获得突破性进展。近年来，组织工程学方法的提出，有望彻底的解决这些问题，其原理是应用细胞 种植的方法，将病人的活细胞在体外培育成为有活性的组织，再植入到病人体内，活 细胞分泌细胞外基质成分逐渐改造，最终实现活组织器官的再生。传统的组织工程技术以可降解的高分子材料为支架，但高分子材料存在力学性能 差、难以塑形、降解产物在局部存在不同程度的毒性等缺点。因此，生物来源的材料 越来越受到重视。以胶原基架为代表的重组细胞外基质材料在生物相容性上具传统材 料无法比拟的优势，然而在力学性能、顺应性等方面存在的问题极大的制约了这类材 料在组织工程中的广泛应用。异种或异体来源的脱细胞材料在力学强度、顺应性上存 在着特有的优势，但同时存在传染疾病、抗原残留等问题。此外，组织钙化已经成为 制约此类材料应用的重要原因。近年来，受体自身来源的组织材料以其独具的优势， 引起了人们的注意。 发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种以自体活组织材料构建组织工程血管移植材料 的方法，在体外应用该方法可以构建适合于作为血管移植材料的组织工程血管移植物。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案(见图l):一种组织工程血管的构建方法，包括如下步骤 (1 )将管状自体活组织基架材料在体外无菌条件下连接于持续灌流的生物反应器 内，管腔外贮满培养液；血管培养生态模拟系统分内循环和外循环，分别由两台多档 可调蠕动泵驱动。反应器参照文献设计(见图2)(参见Mali JW, Philipp AW， Rademacher A， et al. Re-endothelialization of punctured ePTFE graft: an in vitro study under pulsed perfusion condition. Nephrol Dial Transplant, 2004， 19:61-67.)。内夕卜循环分另U充盈自行配置的内循环培养液和外循环培养液。图中(A)内循环的蓄液瓶；(B)内循环的蠕 动泵，液流方向如箭头所示；(C)内循环的液容；(D)反应器的灌流室；(E)外 循环的蠕动泵；(F)外循环的蓄液瓶。al、 a2分别为内循环和外循环的气体交换进 气道，bl、 b2分别为内循环和外循环的气体交换排气道，均接有孔径小于0.2um的 针式微孔滤器，过滤除菌。(2) 将体外培养获得的自体内皮细胞以M199悬浮，或将骨髓单个核细胞诱导生成 的自体内皮样细胞以内皮祖细胞诱导培养液悬浮，按高密度种植法接种于管腔内表面；(3) 待内皮细胞或者内皮样细胞黏附后接通管腔内循环和外循环，并模拟血液循 环逐渐给予适当的剪切力刺激(5~15dyn/cm2)，压力95/55mmHg，于37°C 5%二氧 化碳培养箱内培育5 7天，获得组织工程血管样复合物。所述自体活组织基架材料的构建方法以微创小切口技术将适合长度的医用硅胶 管埋植入实验动物腹腔或皮下，做为异物模型，2~3周后，以无菌手术的方法将自体 活组织包裹形成的硅胶管荚囊完整取出。剪除封闭荚囊的两端后，抽出硅胶管后，形 成管状自体活组织结构，作为组织工程血管构建的基架材料。本发明首先以异物植入体内，诱导机体产生包裹反应，以构建可供组织工程应用 的血管基架材料(一般来说肌性管道及囊性器官的构建都适宜用此方法)。同时在体 外扩增培养自体血管内皮细胞或将骨髓来源的间充质细胞向内皮方向诱导，作为种子 细胞。然后在静态或旋转条件下，将种子细胞接种于血管基架材料的内表面。接着在 体外持续灌流情况下，给以脉动和搏动刺激，在保证基架材料存活的基础上，促进活 细胞的成熟和分化。最终形成可供移植的血管样移植材料，达到应用组织工程技术构 建血管移植材料的目的。我们以自体活组织为基架构建的组织工程血管移植材料移植到细胞供体的股动 脉，l个月后随访，无明显阻塞及血栓形成，组织学发现内膜无明显增生表现。本发明的优点是首次尝试了以自体活组织作为组织工程基架材料构建组织工程4器官，在保证自体活组织材料存活的基础上，在材料表面进行了细胞种植的研究。自 体来源的活组织基架管具有完美的细胞相容性和足够的力学强度，且所构建的器官可 完全排除异种、异体免疫排斥反应发生的风险,克服了异源性材料引起免疫排斥及炎症 反应等缺陷。本发明所需时间较短，远远低于同类技术所需时间的3 6个月的周期。下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领 域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作 出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为本发明基本原理的示意图，将种植于腹腔内获得的自体活组织生物管连接于体外反应器，于管腔面种植内皮细胞，形成类似血管样结构。 图2为本发明所使用的反应器及血管生物模拟系统的示意图。 图3为自体活组织生物管的HE染色400倍普通光镜照片。 图4为经本发明构建的组织工程化血管复合物的HE染色400倍普通光学显微镜照片。 图5为种植细胞后的自体活组织生物管Masson染色的200倍普通光学显微镜照片。 图6为天然血管的Masson染色的200倍普通光学显微镜照片。 图7为经本发明方法构建的组织工程化血管复合物的地衣红法弹力纤维染色的200倍普通光学显微镜照片。图8为天然动脉血管的弹力纤维染色的200倍普通光学显微镜照片。图9为未种植细胞前的新鲜自体活组织生物管表面结构的200倍扫描电镜照片。可见大量纤维结构及细胞外基质成分，偶见血细胞及成纤维细胞突起。图10为旋转高密度法接种内皮6小时后管腔内表面的200倍扫描电镜照片。图11为图IO放大至IOOO倍的扫描电镜照片。可见管腔内表面大量细胞黏附，多数细胞仍呈圆形，部分细胞伸展黏附呈梭形。图12为静态种植24小时后管腔内表面的200倍扫描电镜照片。图13为图12放大至IOOO倍的扫描电镜照片。可见黏附细胞贴壁生长，伸展，局部有一定的极向性，但总体极性不明显。图14为给予渐增的剪切力刺激后，种植72小时后管腔内表面的200倍扫描电镜照片。图15为图14放大至IOOO倍的扫描电镜照片。可见细胞生长极向性明显，细胞长 轴普遍沿液流方向排列，可见细胞间有汇合生长趋势。图16为动态灌流培养达5天时，管腔内表面的200倍扫描电镜照片。图17为图16放大至IOOO倍的扫描电镜照片。可见细胞极向性明显，细胞排列紧密，管腔内表面光滑，细胞生长汇合。图18为天然犬股动脉血管内腔面200倍扫描电镜照片。图19为图18放大至IOOO倍的扫描电镜照片。可见细胞汇合生长，表面光滑，细 胞排列极向性明显。图20为本方明构建的组织工程化血管样复合物的平滑肌特异性肌动蛋白(SM-ci-actin)免疫组化染色的400倍普通光学显微镜照片。图21为天然股动脉的SM- a -actin免疫组化染色的400倍普通光学显微镜照片。 图22为本方明构建的组织工程化血管样复合物的第W因子相关抗原免疫组化染色的400倍普通光学显微镜照片。图23为天然动脉的第VDI因子相关抗原免疫组化染色的400倍普通光学显微镜照片。 图24为以PKH-26标记的内皮细胞种植后，血管内腔面的激光共聚焦显微镜200倍照片。图25为图24标本的激光共聚焦显微镜400倍照片。图26为图24标本的横切面激光共聚焦显微镜200倍照片。图27为图24标本的横切面激光共聚焦显微镜的400倍照片。可见荧光标记的细 胞种植并铺展生长于管腔内表面，呈单层排列。图28为未种植细胞的自体活组织生物管与血小板作用后的内表面的1000倍扫描 电镜照片。未种植内皮细胞的组织表面可见明显的血小板黏附聚集，呈团状，难于分 辨单个血小板的形态。图29为种植内皮细胞后的组织工程复合物与血小板作用后的内表面1000倍扫描 电镜照片。种植内皮细胞的组织工程复合物表面几乎无明显血小板黏附，表面依然保 持光滑。图30为本发明构建的组织工程化血管复合物内表面的6000倍透射电镜照片。可见内皮细胞间有紧密连接形成，细胞表面有绒毛样结构。图31为本发明构建的组织工程化血管复合物管壁细胞的20，000倍透射电镜照片。 图32为本发明构建的组织工程化血管复合物管壁细胞的30，000倍透射电镜照片。可见细胞膜表面可见多个致密斑、细胞内可见成束的细丝样结构及吞饮小泡、细胞表面被覆蛋白多糖等细胞外基质。
具体实施方式
实施例1.一. 试剂和材料1. 磷酸盐缓冲液(PBS液)市售PBS粉末(Gibco) —小包，溶于1000ml蒸 馏水中，调整pH7.2，过滤除菌后，分装，置4'C备用。2. M199培养液市售M199粉末(Gibco) —小袋，加碳酸氢钠1.2g， 1.5mol/L HEPES 10ml，三蒸水加至1L，调节pH至7.2，过滤除菌，按250ml分装，置4。C贮存备用。3. DMEM培养液市售DMEM粉末(Gibco)—小袋，加碳酸氢钠1.2g， 1.5mol/L HEPES 10ml，三蒸水加至1L，调节pH至7.2，过滤除菌，按250ml分装，置4'C贮 存备用。4. 内皮细胞及内循环培养液含15 20。/。FBS和0.1mg/ml的内皮细胞生长补充物 (ECGS，购自中日友好医院临床医学研究所)的M199培养液。5. 外循环培养液含20%胎牛血清(FBS, Gibco) 、 2ng/ml碱性成纤维细胞生 长因子(b-FGF, PeproTech) 、 50ng/ml血小板衍生生长因子-BB (PDGF-BB， PeproTech) 、 10ng/ml胰岛素样生长因子(IGF, PeproTech) 、 0.5ng/ml表皮细胞生 长因子(EGF， PeproTech)的DMEM溶液。6. 内皮祖细胞诱导培养液将购自美国Canbrex bio science valkersville公司的 EBM-2加EGM-2MV SingleQuots无菌条件下按说明书混合，分装后置4。C保存。7. 0.05。/。胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.4Na溶液:胰蛋白酶(1: 250) (Gibco) 0.5g， EDTA.4Na0.2g，加无Ca2+、 Mg2+BSS加至1L，过滤除菌，分装小瓶，.20。C保 存。8. 医用硅胶管选择直径4mm的医用中空硅胶管，分别剪裁为长度2cm、 4cm、 6cm的小段，密封包装后环氧乙烷消毒灭菌，室温空气中放置1周后备用。9. 青霉素/链霉素溶液(100倍浓度)青霉素1.0 106IU,链霉素lg，加0.9%生理 盐水至100ml，过滤除菌，分装小瓶，置-2(TC保存。10. 0.1%胶原酶溶液市售IV型胶原酶(Sigma) 100mg，加PBS溶液至100ml， 过滤除菌，分装置-2(TC保存。二. 方法(一)内皮细胞体外培养无菌手术条件下，切取实验动物颈外静脉血管组织约10cm，以0.1%的胶原酶腔 内灌注消化后收集细胞，离心洗涤后，以1X10e个/ml细胞密度接种于预先以明胶铺 底的培养瓶，加入20%胎牛血清、0.1mg/ml血管内皮生长补充物(ECGS) 、 200U/ml 青霉素、0.2ug/ml链霉素的M199培养液，37°C 5%C02培养箱内帖壁培养，取第二 到六代细胞用于实验。实验细胞留取样本进行VI因子、CD31免疫组织化学染色鉴定。骨髓间充质细胞向内皮的诱导培养与鉴别试验动物麻醉后，无菌条件下抽取骨髓lOml。以PBS 1: l稀释后，铺于密度为 1.073的淋巴细胞分离液表面，室温下2000转离心20分钟，吸取单个核细胞层，以 PBS液稀释后1500转离心洗涤5 10分钟，以EBM-2 EGM-2V培养液悬浮，计数并 调整细胞密度，按5X10S/cr^接种于预先以纤维连接蛋白(Fn)铺底的培养瓶内，置 于37°C 5%C02饱和湿度的培养箱内培养，诱导骨髓基质干细胞定向分化为内皮细 胞。接种培养后每2~3天换液一次，相差显微镜下观察细胞形态，待细胞长满瓶底80% 时用0.05y。胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA.4Na (Gibco)溶液消化传代。第二代细胞种植 于盖玻片上，进行V111因子、CD31、 FLK-1免疫组化染色鉴定。(二) 自体活组织生物材料的获得实验动物麻醉后，无菌条件下，作一长l 2cm切口，将适合长度的医用硅胶管埋 植入实验动物腹腔内或背部皮下。2~3周后，同样以微创的方法将腹膜或皮下组织包 裹的硅胶管荚囊完整取出。于无菌条件下适当修整后，剪除封闭荚囊的两端后，抽出 硅胶管后，形成管状结构。(三) 自体活组织基架管的体外培养及细胞种植 将获得的自体活组织生物材料管以3-0丝线无菌条件下连接于体外持续灌流的血管生物反应器内，管腔外腔注满外循环液，采用高密度种植法将体外培养获得的自体 颈静脉内皮细胞以内循环培养液悬浮，按5X106/1111浓度接种于试验管腔内，于二氧 化碳温箱内(5%C02 37°C)以手工翻转或匀速缓慢旋转孵育2 4小时，以使细胞充分 黏附，然后接通内循环和外循环，首先静态培养24小时，然后模拟血液循环，调节灌 流速度，3天内逐渐由增加到3~9ml/s，剪切力剌激(5~15dyn/cm2)，压力95/55mmHg。 于二氧化碳培养箱内继续培育至5天，即得组织工程血管。实施例2.结果评价对实施例1涉及的新鲜自体活组织生物管及组织工程血管分别留取标本，依下法进行力学测定和生物学检测。 一.方法(一) 力学检测1. 断裂拉伸强度的测定将标本裁成板材状，在拉力机上将其拉断，所测的最大 拉力除以实验材料的横截面积，即为标本的材料拉伸强度，表示自体活组织材料的抗 拉伸能力。2. 断裂伸长率的测定将标本裁成板材状，在拉力机上将其拉断，记录样品从被 拉伸到被拉断的长度变化，除以样品的原始长度，所的百分比即为标本材料的断裂伸 长率，表示材料的变形能力。3. 标本的爆破强度测定将自体活组织管标本连接于爆破压测量表，游离端封闭， 装置内充盈PBS液，调节加压螺栓压縮腔内液体，以压力表记录管道系统内增加的压 力。爆破压被定义为管型材料破裂前所达到的最高压力，表示材料对压力变化的耐受 能力。4. 标本的缝合强度测定实验标本一端夹在拉力机上，另一端以6-0的尼龙缝线连接于拉力机的另一个夹具上。然后以lmm/min的速度匀速牵拉，记录完全断裂时的 拉力。表示材料的可缝合性。(二) 生物学检测1. 标本的基本结构用10%的中性福尔马林固定标本，石蜡包埋，切成4微米厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水、苏木素-伊红染色，观察标本的大致细胞组成和排列分布。2. 标本的纤维结构用10%的中性福尔马林固定标本，石蜡包埋，切成4微米 厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水、Masson染色及地衣红法弹力纤维染色，观 察标本的纤维排列和组成。3. 标本的表面结构标本用2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，乙醇逐级脱水，二 氧化碳临界点干燥,真空喷金，扫描电镜(SEM)观察生物管内腔面的超微结构。4. 标本的免疫组化染色检査用中性福尔马林固定标本，石蜡包埋，切成4微 米厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，抗原修复，按二步法依次加一抗及二抗 后，滴加显色剂显色，苏木素复染，观察特定VII因子、a-actin的表达情况。5. 内皮细胞的荧光标记示踪用PKH26-GL预标记内皮细胞，按3X1(^M剂量标记1X10"个细胞。按前述方法将标记的内皮细胞种植于自体活组织血管基架材料的表面。所得组织管行2.5%的戊 二醛固定。将管样结构修剪为片状，内腔面朝下，置于荧光共聚焦显微镜下观察，并 摄像。同时取部分标本，以OCT胶包埋，液氮冰冻15秒，冰冻切片机内-25'C切片， 厚度为8um，载玻片上甘油指甲油封片后，置共聚焦显微镜下观察。6. 血小板黏附试验以置入反应器经相同条件处理而未种植内皮细胞的基架管为对照，将血小板悬液 与种植内皮后的血管样类似物静态孵育，2小时后取出，以PBS冲洗管腔面3遍，2.5% 戊二醛固定后，行SEM观察。7. 组织工程血管的透射电镜观察将2.5%戊二醛固定过夜的标本，PBS冲洗3次后，1%的四氧化锇4'C媒染固定 30min，丙酮系列脱水，环氧树脂包埋，半薄切片制备，甲苯胺蓝染色，选择兴趣区 域，切成8纳米的超薄切片，电镜下观察。本组试验标本均送首都医科大学附属天坛 医院电子显微镜室完成。三.实验结果(一) 力学检测结果1. 断裂拉伸强度新鲜自体活组织管拉伸强度4.7士2.3MPa，培养后血管类似物 为4.5土1.8MPa，统计学无显著差异。2. 断裂伸长率新鲜自体活组织管的断裂伸长率为34.2±8.3%，培养后血管类 似物为33.1±10.2%，统计学无明显差异。3. 爆破强度新鲜自体活组织管的爆破强度1100土187mmHg，种植细胞后的组 织工程血管复合物为1070土115mmHg，统计学无显著差异。4. 缝合耐受强度新鲜活组生物管的缝合耐受强度为2.5士0.3N，种植细胞后的 组织工程血管复合物为2.4士0.7N，统计学无显著差异。(二) 生物学检测结果1. 基本结构新鲜自体活组织生物管的普通HE染色染色显示由大量呈同心圆状排列的梭形细胞构成，细胞呈长梭形，内层较外层细胞稀薄，管壁内可见少量炎性细胞浸润(见图3)。种植后的组织工程复合物可见管腔内表面单层扁平细胞覆盖，管壁亦 由大量同心圆状排列的梭形细胞组成，而炎性细胞明显减少，仅偶见(见图4)。2. 纤维结构种植细胞后的组织工程复合物经Masson染色可见胶原纤维呈波浪 状排列，类同心圆样结构，其间可见平滑肌样细胞，与天然血管结构相似(见图5、6)。两者相比较可以看出，两者的细胞外基质成分均有大量的胶原纤维构成，呈同心圆样 排列，胶原纤维成波浪状排列，图中染为蓝色；纤维间可见的细胞结构，平滑肌细胞 染成发紫红色；但图6中表层细胞下可见明显的连续的基底膜结构形成，图中呈粉红 色线状，而图5中无此结构。地衣红法弹力纤维染色可见组织工程复合管中无明显弹 力板样结构(见图7、 8)。两者相比较可以看出，图7中无明显的弹力纤维板样结构 形成，而图8中可见明显的弹力纤维板样结构。3. 表面结构新鲜自体活组织生物管表面可见纤维状结构，及大量的细胞外基质 成分，偶见血细胞成分及成纤维细胞突起(见图9)。种植细胞后的组织工程复合物 表面由内皮细胞覆盖，且细胞随液流方向规律排列，且随时间延长而渐趋汇合，表面 光滑，与天然血管类似(见图10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19)。4. 免疫组化染色种植细胞后的组织工程血管复合物具有与天然血管类似的结构，管壁均含有大量的a-actin阳性细胞，内腔面被覆单层细胞，VIII因子染色阳性(见图 20、 21、 22、 23)。可以看出，本发明构建的组织工程样血管复合物与天然血管类似， 内腔面被覆的单层细胞染色阳性，呈棕黄色。5. 内皮细胞的荧光标记示踪显示PKH26示踪免疫荧光阳性的细胞被覆于组织 工程血管复合物内腔面，共聚焦显微镜显示内腔面被覆细胞彼此汇合，几乎覆盖全部 内腔面，横切面上可见荧光标记阳性的细胞呈单层状，局限被覆于管腔内表面(见图 24、 25、 26、 27)。6. 血小板黏附实验种植内皮细胞后的组织工程复合物表面几乎无明显血小板黏 附，而在反应器内经同样条件处理的未种植细胞的自体活组织生物管表面，则可见明 显的血小板黏附聚集成团，难于分辨单个血小板的形态(见图28、 29)。7. 透射电镜检测种植的内皮细胞呈单层排列于管腔表面，细胞间有紧密联结， 可见细胞表面有微绒毛样结构(见图30)。内皮下管壁中层细胞具有明显的平滑肌样 结构，如成束的细丝状结构、吞饮小泡、细胞表面被覆的蛋白多糖等细胞外基质成分(见图31、 32)。
权利要求
1. 一种组织工程血管的构建方法，包括如下步骤(1)将管状自体活组织基架材料在体外无菌条件下连接于持续灌流的生物反应器内，管腔外贮满培养液，血管培养生态模拟系统分内循环和外循环；(2)将体外培养获得的自体内皮细胞以M199悬浮，或将骨髓单个核细胞诱导生成的自体内皮样细胞以内皮祖细胞诱导培养液悬浮，按高密度种植法接种于管腔内表面；(3)待内皮细胞或者内皮样细胞黏附后接通管腔内循环和外循环，并模拟血液循环，调节灌流速度，给予适当的压力刺激、剪切力刺激，于二氧化碳培养箱内培育5～7天，获得组织工程血管样复合物。
2. 根据权利要求1所述的一种组织工程血管的构建方法，其特征在于所述自体 活组织基架材料的构建方法为以微创小切口技术将适合长度的医用硅胶管埋植入实 验动物腹腔或皮下，做为异物模型，2~3周后，以无菌手术的方法将自体活组织包裹 形成的硅胶管荚囊完整取出；剪除封闭荚囊的两端后，抽出硅胶管后，形成管状自体 活组织结构，作为组织工程血管构建的基架材料。
3. 根据权利要求1所述的一种组织工程血管的构建方法，其特征在于所述压力 为95/55mmHg 。
4. 根据权利要求1所述的一种组织工程血管的构建方法，其特征在于所述剪切 力刺激为5 15dyn/cm2。
5.据权利要求1所述的一种组织工程血管的构建方法，其特征在于所述调节 灌流速度为3天内逐渐增加到3 9ml/s。
全文摘要
本发明涉及一种组织工程血管的构建方法，属于组织工程领域。一种组织工程血管的构建方法，包括如下步骤(1)将管状自体活组织基架材料在体外无菌条件下连接于持续灌流的生物反应器内，管腔外贮满培养液；(2)将体外培养获得的自体内皮细胞以M199悬浮，或将骨髓单个核细胞诱导生成的自体内皮样细胞以内皮祖细胞诱导培养液悬浮，按高密度种植法接种于管腔内表面；(3)待内皮细胞或者内皮样细胞黏附后接通管腔内循环和外循环，并模拟血液循环给予适当的压力刺激、剪切力刺激，于二氧化碳培养箱内培育5～7天。本发明的优点是具有完美的细胞相容性和足够的力学强度，克服了异源性材料引起免疫排斥及炎症反应等缺陷，制备需时间较短。
文档编号A61L27/00GK101259292SQ200710064210
公开日2008年9月10日 申请日期2007年3月6日 优先权日2007年3月6日
发明者俞衡锡, 吴应锋, 崔世军, 建 张, 东 徐, 李学锋, 李建新, 涛 罗, 谷涌泉, 郭连瑞, 兵 陈, 陈晓松, 齐力行 申请人:首都医科大学宣武医院