专利名称：细胞核靶向壳寡糖－脂肪酸嫁接物载药胶团的应用的制作方法
技术领域：
本发明属细胞核靶向抗肿瘤药物载药胶团的应用，涉及细胞核靶向的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤一直是直接威胁人类健康的重大疾病，肿瘤化疗由于药物本身缺乏分子靶向性，因而出现治愈率低、毒副作用巨大等重大治疗问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织(器官)、细胞及亚细胞器是解决癌症化疗治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前国内外的科学家通过纳米载体技术在抗肿瘤药物的组织(器官)和细胞靶向上取得了一定的进展，但并没有取得突破性的疗效，其本质在于绝大多数抗肿瘤药物的分子作用靶点位于细胞内。因此，肿瘤细胞内药物分子作用靶点(亚细胞器)靶向性纳米载体材料技术的研究开发，是突破癌症化疗瓶颈的关键。
聚合物胶团(polymeric micelles，PMs)是近几年正在发展的一类新型纳米载体，具有增溶、靶向、低毒和长循环的优点。聚合物胶团由两亲性的聚合物在水性环境中自发形成，具有独特的核-壳结构。其内核可为难溶性药物提供储库，亲水性外壳则可进行理化性质修饰，可包封多肽蛋白类药物及基因药物，并达到体内靶向分布、逃避单核巨噬细胞的吞噬、提高生物膜转运等作用。聚合物胶团自身可通过“增强的透过及滞留效应”(enhanced permeability andretention effect)聚集到肿瘤组织。
大多数抗肿瘤药物的分子作用靶标位于细胞核，如阿霉素、丝裂霉素C等。现有的肿瘤化疗技术，基本沿用了药物的非靶向性给药模式，存在严重的毒副反应，很多患者因此而停止治疗，依从性差。国内外的研究者通过载体的被动靶向和主动靶向技术，在一定程度上提高了肿瘤细胞周围药物的蓄积，但并没有体现出显著的抗肿瘤疗效，其主要问题在于大多数抗肿瘤药物的分子作用靶标位于细胞核内，而现有的载体技术并不具备细胞核转运功能。
壳聚糖是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。壳聚糖被广泛应用于药物辅料、止血材料、组织工程支架等。虽然以壳聚糖为基本材料所制备的微粒和纳米粒，已被广泛应用于药物载体材料的研究，但由于壳聚糖本身的亲水性结构，使它难以被细胞大量摄取，无法实现亚细胞器靶向。
发明内容
本发明的目的是提供壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物的靶向载体中的应用。
本发明的另一个目的是提供壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备分子靶标位于细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中的应用。
本发明提供的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备分子靶标位于肺癌细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
本发明提供的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备分子靶标位于宫颈癌细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
本发明提供的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备分子靶标位于乳腺癌细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
本发明提供的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团，当壳寡糖-脂肪酸嫁接物浓度超过临界胶团浓度时，在水性介质中可自发形成嫁接物胶团，胶团具备被细胞快速摄取，并靶向细胞核的功能。本发明的嫁接物胶团的组成已为专利“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利申请号200610051601.0)和专利“一种非病毒基因转染载体及制备方法和用途”(专利申请号200610050516.2)所涵盖。
采用本发明提供的嫁接物载药胶团，由于该嫁接物载体毒性低、具有被细胞快速摄取，并靶向细胞核的功能，因此最大可提高80倍以上的抗肿瘤药物疗效。
本发明将含羧基的疏水性物质(如脂肪酸)，与壳聚糖分子结构中的部分氨基嫁接，可增强壳聚糖分子结构的疏水性，制备得到的壳聚糖-脂肪酸嫁接物，该嫁接物能够在水性介质中通过自聚集形成嫁接物胶团。嫁接物胶团的疏水性内核，可增溶疏水性的药物分子。通过壳聚糖水解控制分子量，得到壳寡糖；通过控制嫁接物合成过程中的投料比例。
本发明的有益之处是所合成的低细胞毒性的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团，具有快速透过细胞膜、很少被细胞内溶酶体破坏、细胞核靶向的功能，即可制备得到具有特定氨基取代度壳寡糖-脂肪酸嫁接物。该嫁接物胶团具备被细胞快速摄取，并浓集于细胞核的载体靶向功能。并通过自身的疏水性内核特性、包封分子靶标位于细胞核的疏水性抗肿瘤药物，形成嫁接物载药胶团，为高效低毒的抗肿瘤治疗，提供新型的纳米亚细胞器靶向给药系统。将该载体材料应用于分子靶标位于细胞核抗肿瘤药物的传递，可大幅度提高该类药物的抗肿瘤疗效。
图1壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的A549细胞摄取荧光显微镜照片。
具体实施例方式
本发明通过实施例和附图作进一步的说明。
实施例1壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在肺癌A549细胞上的抗肿瘤治疗应用1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为92.5％)90g，加至3000mL1.25％(v/v)的盐酸水溶液中，55～60℃温度条件下，溶涨2小时后，加入5％的纤维素酶(w/w)，在55～60℃温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖(壳寡糖)。所得降解反应液，使用50Kda和10Kda超滤膜(Biomax-10，Millipore Co.，USA)超滤分级后，取分子量10～50Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳寡糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色谱柱，0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相，分别以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0Kda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳寡糖分子量。经测定，所得壳寡糖的重均分子量为18.4kDa。
2)壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定取上述壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1∶100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照壳寡糖∶硬脂酸(摩尔比)1∶20，称取硬脂酸溶于20mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400rpm磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5小时，冷却至室温(25℃)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2mL，37℃孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为9.52％。
采用芘荧光法测定壳寡糖-硬脂酸的临界胶团浓度。制备不同浓度壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7×10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定I375/I396倾斜率的突然变化，确定该嫁接物的临界胶团浓度为0.04mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位。经测定，1mg/mL的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位分别为24.6nm和30.1mV。
3)壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团细胞摄取采用壳寡糖-硬脂酸嫁接物荧光标记胶团进行细胞摄取研究。以异硫氰基荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物。取壳寡糖-硬脂酸嫁接物20mg，溶解于2.4mL的50％甲醇溶液中；另取5.0mg异硫氰基荧光素，溶解于5.0mL乙醇。取0.5mL FITC的乙醇溶液与0.5mL蒸馏水混合，在冰浴、避光与磁力搅拌条件下，将壳寡糖-硬脂酸嫁接物的甲醇溶液，滴加到FITC-乙醇溶液中，室温反应24小时后，以蒸馏水透析(MWCO10,000)24小时，最终得FITC标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物，避光保存备用。
取A549细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI 1640培养液中培养(5％CO2，37℃孵箱)。取对数生长期细胞，pH7.4的PBS润洗后，加入胰酶消化，并用培养液稀释，按每孔1×105个细胞的密度，接种于24孔培养板内，孵箱内培养24小时。24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，PBS润洗2次后，分别加入新鲜培养液1mL及FITC标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液(终浓度200μg/mL)。孵育一定时间后，用PBS冲洗细胞2遍，置荧光倒置显微镜观察并拍照。嫁接物与A549细胞孵育2小时后，嫁接物细胞摄取的荧光显微镜照片见图1，其中A图为FITC标记胶团细胞摄取荧光照片，B图为核染对照照片。
4)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团制备取40mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入40mL蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，转移至量瓶，蒸馏水定容至50mL，得0.8mg/mL的胶团溶液。移取该壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液20mL，加入7mg丝裂霉素C，冰浴条件下探头超声30次(400W，工作2s停3s)，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液。
经测定，壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为48.6nm，表面电位为30.4mV。药物包封率为64.14％。
5)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团抗肿瘤疗效本发明以肿瘤细胞抑制率(IC50值)，评价壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。以人肺癌细胞A549细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入100μL含5×103个A549细胞的培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和丝裂霉素C溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加浓度5mg/mL噻唑兰(MTT)溶液20μL，置于37℃、5％CO2孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算细胞抑制率％＝(空白对照组吸光度-实验组吸光度)/空白对照组吸光度×100％经计算，壳寡糖-硬脂酸嫁接物的IC50(细胞半数致死率)为309.5μg/mL，丝裂霉素C溶液的IC50为17.84μg/mL，而壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.31μg/mL。结果显示，壳寡糖-硬脂酸嫁接物为低细胞毒性材料，丝裂霉素C经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在肺癌A549细胞上，可提高抗肿瘤疗效57.5倍。
实施例2壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团在宫颈癌细胞Hela细胞上的抗肿瘤治疗应用1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为92.5％)90g，加至3000mL1.25％(v/v)的盐酸水溶液中，55～60℃温度条件下，溶涨2小时后，加入5％的纤维素酶(w/w)，在55～60℃温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖(壳寡糖)。所得降解反应液，使用50Kda和10Kda超滤膜(Biomax-10，Millipore Co.，USA)超滤分级后，取分子量10～50Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳寡糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色谱柱，0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相，分别以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0Kda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳寡糖分子量。经测定所得壳寡糖的重均分子量为18.4kDa。
2)壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定取上述壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1∶100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照壳寡糖∶硬脂酸(摩尔比)1∶20，称取硬脂酸溶于20mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400rpm磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5小时，冷却至室温(25℃)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2mL，37℃孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为9.52％。
采用芘荧光法测定壳寡糖-硬脂酸的临界胶团浓度。制备不同浓度壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7×10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定I375/I396倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶团浓度为0.04mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位。经测定，1mg/mL的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位分别为24.6nm和30.1mV。
3)壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团细胞摄取采用壳寡糖-硬脂酸嫁接物荧光标记胶团进行细胞摄取研究。以异硫氰基荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物。取壳寡糖-硬脂酸嫁接物20mg，溶解于2.4mL的50％甲醇溶液中；另取5.0mg异硫氰基荧光素，精密称定后溶解于5.0mL乙醇。取0.5mL FITC的乙醇溶液与0.5mL蒸馏水混合，在冰浴、避光与磁力搅拌条件下，将壳寡糖-硬脂酸嫁接物的甲醇溶液滴加到FITC-乙醇溶液中，室温反应24小时后，以蒸馏水透析(MWCO 10,000)24小时，最终得FITC标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物，避光保存备用。
取A549细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI 1640培养液中培养(5％CO2，37℃孵箱)。取对数生长期细胞，PH7.4 PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×105个细胞的密度接种于24孔培养板内，孵箱内培养24小时。24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，PBS润洗2遍后，分别加入新鲜培养液1mL及FITC标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液(终浓度200μg/mL)。孵育一定时间后，用PBS冲洗细胞2遍，置荧光倒置显微镜观察并拍照。嫁接物与A549细胞孵育2小时后，嫁接物细胞摄取的荧光显微镜照片见图1。
4)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团制备取40mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入40mL蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，转移至量瓶，蒸馏水定容至50mL，得0.8mg/mL的胶团溶液。移取该壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液20mL，加入7mg丝裂霉素C，冰浴条件下探头超声30次(400W，工作2s停3s)，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液。
经测定，壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为48.6nm，表面电位为30.4mV。药物包封率为64.14％。
5)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团抗肿瘤疗效本发明以肿瘤细胞抑制率(IC50值)，评价壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。以宫颈癌细胞Hela细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×103个Hela细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和丝裂霉素C溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加浓度5mg/mL噻唑兰(MTT)溶液20μL，置于37℃、5％CO2孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算细胞抑制率％＝(空白对照组吸光度-实验组吸光度)/空白对照组吸光度×100％经计算，壳寡糖-硬脂酸嫁接物的IC50(细胞半数致死率)为383.6μg/mL，丝裂霉素C溶液的IC50为31.72μg/mL，而壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.39μg/mL。结果表明，壳寡糖-硬脂酸嫁接物为低毒性材料，丝裂霉素C经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在宫颈癌细胞Hela细胞上可提高抗肿瘤疗效81.3倍。
实施例3不同氨基取代度壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在肺癌A549细胞上的抗肿瘤治疗应用
1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为92.5％)90g，加至3000mL1.25％(v/v)的盐酸水溶液中，55～60℃温度条件下，溶涨2小时后，加入5％的纤维素酶(w/w)，在55～60℃温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖(壳寡糖)。所得降解反应液，使用50Kda和10Kda超滤膜(Biomax-10，Millipore Co.，USA)超滤分级后，取分子量10～50Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳寡糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色谱柱，0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0Kda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳寡糖分子量。经测定所得壳寡糖的重均分子量为18.4kDa。
2)壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定取上述壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1∶100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照壳寡糖∶硬脂酸(摩尔比)1∶10，称取硬脂酸溶于20mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400rpm磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5小时，冷却至室温(25℃)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2mL，37℃孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为5.40％。
采用芘荧光法测定壳寡糖-硬脂酸的临界胶团浓度。制备不同浓度壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7×10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定I375/I396倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶团浓度为0.05mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位。经测定，1mg/mL的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位分别为31.4nm和33.4mV。
3)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团制备取40mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入40mL蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至50mL，得0.8mg/mL的胶团溶液。移取该壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液20mL，加入7mg丝裂霉素C，冰浴条件下探头超声30次(400W，工作2s停3s)，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液。
经测定，壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为43.5nm，表面电位为32.9mV。药物包封率为58.14％。
4)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团抗肿瘤疗效本发明以肿瘤细胞抑制率(IC50值)，评价壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。以人肺癌细胞A549细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×103个A549细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和丝裂霉素C溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加浓度5mg/mL噻唑兰(MTT)溶液20μL，置于37℃、5％CO2孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算细胞抑制率％＝(空白对照组吸光度-实验组吸光度)/空白对照组吸光度×100％经计算，壳寡糖-硬脂酸嫁接物的IC50(细胞半数致死率)为418.2μg/mL，丝裂霉素C溶液的IC50为17.84μg/mL，而壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.58μg/mL。结果表明壳寡糖-硬脂酸嫁接物为低毒性材料，丝裂霉素C经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在肺癌A549细胞上可提高抗肿瘤疗效30.8倍。
实施例4不同氨基取代度壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在宫颈癌细胞Hela细胞上的抗肿瘤治疗应用1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为92.5％)90g，加至3000mL1.25％(v/v)的盐酸水溶液中，55～60℃温度条件下，溶涨2小时后，加入5％的纤维素酶(w/w)，在55～60℃温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖(壳寡糖)。所得降解反应液，使用50Kda和10Kda超滤膜(Biomax-10，Millipore Co.，USA)超滤分级后，取分子量10～50Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳寡糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色谱柱，0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0Kda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳寡糖分子量。经测定所得壳寡糖的重均分子量为18.4kDa。
2)壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定取上述壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1∶100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照壳寡糖∶硬脂酸(摩尔比)1∶10，称取硬脂酸溶于20mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400rpm磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5小时，冷却至室温(25℃)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2mL，37℃孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为5.40％。
采用芘荧光法测定壳寡糖-硬脂酸的临界胶团浓度。制备不同浓度壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7×10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定I375/I396倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶团浓度为0.05mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位。经测定，1mg/mL的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位分别为31.4nm和33.4mV。
3)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团制备取40mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入40mL蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至50mL，得0.8mg/mL的胶团溶液。移取该壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液20mL，加入7mg丝裂霉素C，冰浴条件下探头超声30次(400W，工作2s停3s)，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液。
经测定，壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为43.5nm，表面电位为32.9mV。药物包封率为58.14％。
4)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团抗肿瘤疗效本发明以肿瘤细胞抑制率，评价壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。以宫颈癌细胞Hela细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×103个Hela细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和丝裂霉素C溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加浓度5mg/mL噻唑兰(MTT)溶液20μL，置于37℃、5％CO2孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算细胞抑制率％＝(空白对照组吸光度-实验组吸光度)/空白对照组吸光度×100％经计算，壳寡糖-硬脂酸嫁接物的IC50(细胞半数致死率)为492.5μg/mL，丝裂霉素C溶液的IC50为31.72μg/mL，而壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.98μg/mL。结果表明，壳寡糖-硬脂酸嫁接物为低毒性材料，丝裂霉素C经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在宫颈癌细胞Hela细胞上可提高抗肿瘤疗效32.4倍。
实施例5壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在乳腺癌细胞MCF-7细胞上的抗肿瘤治疗应用1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为92.5％)90g，加至3000mL1.25％(v/v)的盐酸水溶液中，55～60℃温度条件下，溶涨2小时后，加入5％的纤维素酶(w/w)，在55～60℃温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖(壳寡糖)。所得降解反应液，使用50Kda和10Kda超滤膜(Biomax-10，Millipore Co.，USA)超滤分级后，取分子量10～50Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳寡糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色谱柱，0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0Kda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳寡糖分子量。经测定，所得壳寡糖的重均分子量为18.4kDa。
2)壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定取上述壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1∶100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照壳寡糖∶硬脂酸(摩尔比)1∶20，称取硬脂酸溶于20mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400rpm磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5小时，冷却至室温(25℃)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2mL，37℃孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为14.8％。
采用芘荧光法测定壳寡糖-硬脂酸的临界胶团浓度。制备不同浓度壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7×10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定I375/I396倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶团浓度为0.03mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位。经测定，1mg/mL的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径和表面电位分别为57.6nm和36.8mV。
3)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团制备称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，加水5ml溶解。于磁力搅拌下，逐滴滴入阿霉素二甲亚砜溶液适量，使阿霉素的投药量为1.5％。室温搅拌4小时后，转移至透析袋中，外相为水，透析24小时除去二甲亚砜。将透析液加适量水定容在10ml容量瓶中，使得壳寡糖-硬脂酸嫁接物的终浓度为1mg/mL。将透析液继续以4000rpm离心10min，除去尚未增溶的阿霉素固体，得载药胶团。取分散液适量，以微粒粒度与表面电位测定仪，测定载药胶团的粒径及表面电位。
经测定，壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为76.1nm，表面电位为35.2mV。药物包封率为56.5％。
4)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团抗肿瘤疗效本发明以肿瘤细胞抑制率，评价壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。以乳腺癌细胞MCF-7细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×103个MCF-7细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和阿霉素溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加20μL噻唑兰(MTT)(5mg/mL)溶液，置于37℃、5％CO2孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算细胞抑制率％＝(空白对照组吸光度-实验组吸光度)/空白对照组吸光度×100％经计算，壳寡糖-硬脂酸嫁接物的IC50(细胞半数致死率)为285.7μg/mL，阿霉素溶液的IC50为0.49μg/mL，而壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.18μg/mL。结果表明壳寡糖-硬脂酸嫁接物为低毒性材料，阿霉素经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在乳腺癌细胞MCF-7细胞上可提高抗肿瘤疗效2.7倍。
权利要求
1.细胞核靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
2.根据权利要求1所述的细胞核靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备分子靶标位于细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
3.根据权利要求2所述的细胞核靶向壳聚糖-脂肪酸嫁接物载药胶团制备分子靶标位于肺癌细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
4.根据权利要求2所述的细胞核靶向壳聚糖-脂肪酸嫁接物载药胶团制备分子靶标位于宫颈癌细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
5.根据权利要求2所述的细胞核靶向壳聚糖-脂肪酸嫁接物载药胶团制备分子靶标位于乳腺癌细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。
全文摘要
本发明提供一种壳寡糖－脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物的靶向载体中应用。尤其在制备分子靶标位于肺癌细胞核、宫颈癌细胞核、乳腺癌细胞核的抗肿瘤药物的靶向载体中应用。本发明提供的壳寡糖－脂肪酸嫁接物胶团，由于该嫁接物载体毒性低、具有被细胞快速摄取，并靶向细胞核的功能，因此最大可提高80倍以上的抗肿瘤药物疗效。本发明的壳寡糖－脂肪酸嫁接物胶团具有快速透过细胞膜、很少被细胞内溶酶体破坏、细胞核靶向的功能，并通过自身的疏水性内核特性、包封分子靶标位于细胞核的疏水性抗肿瘤药物，形成嫁接物载药胶团，为高效低毒的抗肿瘤治疗，提供新型的纳米亚细胞器靶向给药系统。
文档编号A61P35/00GK101066461SQ20071006911
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月29日 优先权日2007年5月29日
发明者胡富强, 杜永忠, 袁弘, 游剑 申请人:浙江大学