一种红松松塔提取物的制备方法

专利名称：：一种红松松塔提取物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种松塔提取物的制备方法。
背景技术：
：白松松塔作为一种中药，可用于镇咳，祛痰，消炎，平喘。治慢性气管炎，咳嗽、气短，吐白沫痰。日本学者Tanaka将其研究的提取方法申报美国专利(专利号6703053)，其白松有效成分提取方法简单来说是采用热水提取，并通过改变提取液pH值以得到有效成分酸性多糖。但是提取液的pH值不易控制，容易造成提取物中活性成分的丢失，从而影响提取率，导致白松松塔的提取率只有4%~5%。红松(尸/m^tora/era&)系松科(Pinaceae)松属植物，材质优良、纹理通直，抗压性强是优质的木材，作为高附加值经济树种作被大面积栽种。虽然红松松塔没有被列入药典，但红松松塔提取物的药用价值已被公众慢慢所知，如中国发明专利"一种红松松塔提取物及其应用和提取方法"(专利申请号200710072149.0，公开日为2007年11月07曰)和中国发明专利"红松松塔提取物的提取方法"(专利申请号200710071752.7，公开日为2007年8月15日)。尽管现有技术红松松塔的提取率较高，但在硅胶柱洗脱的过程中都使用有毒的有机溶媒氯仿。氯仿属于三类致癌物质，在动物实验中己被证实，而且氯仿也是心脏血管抑制剂，对肝脏、肾脏也有毒性，可能造成肝脏的肿大和坏死，同时对中枢神经系统会产生抑制作用。因此在药物的制备过程中使用氯仿，严重存在安全隐患。
发明内容本发明的目的是为了解决目前红松松塔提取物制备、提取过程中使用氯仿，严重存在安全隐患的问题，而提供的一种红松松塔提取物的制备方法。红松松塔提取物按以下方法制备一、将红松松塔粉碎成小于20目的颗粒，然后用水加热回流提取1小时；二、保持提取液温度过滤，再将滤液上样于大孔吸附树脂柱；三、用大孔吸附树脂柱体积46倍的、温度为2030。C的水洗柱，然后再用质量浓度为40%的乙醇溶液洗脱；四、减压浓縮乙醇洗脱液，将乙醇回收后的剩余物经喷雾干燥即得红松松塔提取物。本发明红松松塔提取物的制备方法中不使用氯仿，避免了严重的安全隐患。本发明方法红松松塔提取物的提取率为8.08%~11.5%。本发明方法红松松塔提取物可增强NK细胞杀伤活性，提高机体固有免疫力。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式红松松塔提取物按以下方法制备一、将红松松塔粉碎成小于20目的颗粒，然后用水加热回流提取1小时；二、保持提取液温度过滤，再将滤液上样于大孔吸附树脂柱；三、用大孔吸附树脂柱体积4~6倍的、温度为203(TC的水洗柱，然后再用质量浓度为40%的乙醇溶液洗脱；四、减，浓縮乙醇洗脱液，将乙醇回收后的剩余物经喷雾干燥即得红松松塔提取物。本实施方式步骤三中的大孔吸附树脂柱水洗液可弃去不要，也可回收再次提取。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中加热回流的温度为100~110°C。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中加热回流提取的用水量为红松松塔质量的12~16倍。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中加热回流提取的用水量为红松松塔质量的14倍。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中大孔吸附树脂柱为AB-8型大孔吸附树脂柱。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式用AB-8型大孔吸附树脂填装。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中用大孔吸附树脂柱体积5倍的、温度为25。C的水洗柱。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中将红松松塔粉碎成200目的颗粒。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中将红松松塔粉碎成500目的颗粒。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中上样速度为0.5~1倍柱床体积(bedvolume,BV)/h。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中上样速度为0.60.8倍柱床体积(bedvolume,BV)/h。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中选用10cmX200cm的层析柱，装柱后大孔吸附树脂柱的径高比大于、等于1:12。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中水的洗脱速度为11.5倍柱床体积/h。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中水的洗脱速度为1.21.4倍柱床体积/h。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中乙醇的洗脱速度为0.5~1倍柱床体积/h。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十五本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中乙醇的洗脱速度为0.60.8倍柱床体积/h。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十六本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中减压浓縮乙醇洗脱液的温度为3(K40。C。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十七本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中减压浓縮乙醇洗脱液的温度为35°C。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十八本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中喷雾干燥的进风温度为130°C，出风温度为70。C，转速为40Hz，进料速度为10mL/min。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式十九:本实施方式红松松塔提取物按以下方法制备一、将红松松塔粉碎成100目的颗粒，然后用质量为红松松塔质量的14倍、100-110。C的水加热回流提取1小时；二、保持提取液10011(TC过滤，再将滤液上样于AB-8型大孔吸附树脂柱；三、用大孔吸附树脂柱体积5倍的、温度为25。C的水洗柱，然后再用质量浓度为40。/。的乙醇溶液洗脱；四、减压浓縮乙醇洗脱液，将乙醇回收后的剩余物经喷雾干燥即得。本实施方式得到的水洗部分为黄色粘稠状固体，质量占原料(红松松塔)质量的16.2%。本实施方式得到的醇洗部分为棕黄色固体粉末，质量占原料(红松松塔)质量的11.0%。对比试验第一组采用生理盐水，第二组采用本实施方式步骤三中的大孔吸附树脂柱水洗液，第三组采用红松松塔总水提物，第四组采用本实施方式制备的红松松塔提取物。用4组成分的不同浓度分别给昆明小鼠灌胃，每组每个浓度10只实验鼠，连续灌胃15天，然后对各实验组实验鼠的NK细胞的活性进行测定(乳酸脱氢酶释放法)，NK细胞活性计算公式如下A^细胞活性(％)=一.j验组感-自然释放，组A值..xlQQ%最大释放对照组A值一自然释放对照组A值试验结果如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注自然释放孔A值二0.377，最大释放孔A值二0.595。自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK细胞)是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。NK细胞杀伤的耙细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体(如真菌和寄生虫)、同种异体移植的器官、组织等。NK细胞的活性体现了机体的固有免疫力。本实验测定结果表明本实施方式红松松塔总提取物和红松松塔提取物可明显增强小鼠NK细胞杀伤活性，可增强小鼠固有的免疫力，其中红松松塔提取物的活性最为明显，而水洗物活性不明显。以空白样为对照组，用不同浓度的红松松塔提取物分别对对数生长期的人结肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞BGC-823、人肺癌细胞A549和人卵巢癌细胞HELA进行体外活性实验(MTT法，肿瘤细胞抑制率(％)=对照组平=，』药纟，均00值xl,x以提取物的不同浓度对细胞的抑制对照组平均OD值率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药物的半数抑制浓度(IC5C)，如表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>当ICso值小于50pg/mL则认为该受试药物具有细胞毒性，本实验测定结果表明红松松塔提取物具有抑制人结肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞BGC-823、人肺癌细胞A549和人卵巢癌细胞HELA的活性，其中对人结肠癌细胞HCT-8的抑制活性最为明显。权利要求1、一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于红松松塔提取物按以下方法制备一、将红松松塔粉碎成小于20目的颗粒，然后用水加热回流提取1小时；二、保持提取液温度过滤，再将滤液上样于大孔吸附树脂柱；三、用大孔吸附树脂柱体积4～6倍的、温度为20～30℃的水洗柱，然后再用体积浓度为40％的乙醇溶液洗脱；四、减压浓缩乙醇洗脱液，将乙醇回收后的剩余物经喷雾干燥即得红松松塔提取物。2、根据权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤一中加热回流的温度为100~110°C。3、根裙权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤一中加热回流提取的用水量为红松松塔质量的1216倍。4、根据权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤二中大孔吸附树脂柱为AB-8型大孔吸附树脂柱。5、根据权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤二中选用10cmX200cm的层析柱，装柱后大孔吸附树脂柱的径高比大于、等于1:12。6、根据权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤一中将红松松塔粉碎成20目的颗粒。7、根搪权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤三中用大孔吸附树脂柱体积5倍的、温度为25。C的水洗柱。8、根据权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤二中上样速度为0.5~1倍柱床体积/h。9、根据权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤三中水的洗脱速度为11.5倍柱床体积/h。10、根据权利要求1所述的一种红松松塔提取物的制备方法，其特征在于步骤三中乙醇的洗脱速度为0.51倍柱床体积/h。全文摘要一种红松松塔提取物的制备方法，它涉及一种松塔提取物的制备方法。它解决了目前红松松塔提取物制备、提取过程中使用氯仿，严重存在安全隐患的问题。制备方法如下一、粉碎红松松塔，然后用水加热回流提取；二、保持提取液温度过滤，再将滤液上样于大孔吸附树脂柱；三、用水洗柱，然后再用乙醇溶液洗脱；四、减压浓缩乙醇洗脱液，将乙醇回收后的剩余物经喷雾干燥即得。本发明红松松塔提取物的制备方法中不使用氯仿，避免了严重的安全隐患。本发明方法红松松塔提取物的提取率为8.08％～11.5％。本发明方法红松松塔提取物具有增强自然杀伤细胞伤活性，提高机体固有免疫力的作用；还具有体外抑制肿瘤细胞生长的作用。文档编号A61K36/15GK101181312SQ20071014469公开日2008年5月21日申请日期2007年11月28日优先权日2007年11月28日发明者朱文良,霞李,杨宝峰,陈秀杰申请人:哈尔滨医科大学