专利名称：六甲蜜胺脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及抗肿瘤药物六甲蜜胺的脂质体制剂及六 甲蜜胺脂质体的制备方法。
背景技术：
六甲蜜胺(Altretamine, Hexamethytmelamine, H固)是需要代谢活化
的细胞毒类抗肿瘤药物，其代谢中间产物可作为烷化剂而产生抗肿瘤作用。 然而六甲蜜胺与传统的烷化剂并没有交叉耐药。近几年来的临床研究发现, 六甲蜜胺对卵巢癌、肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤有肯定的治疗效果，特别 是对晚期卵巢癌的研究，发现六甲蜜胺具有较好的临床应用价值。
六甲蜜胺的抗肿瘤作用机制，目前并不完全清楚。药理研究表明，此 药为嘧啶类抗代谢药物，可以抑制二氢叶酸还原酶，干扰叶酸代谢，选择 性抑制DNA、 RNA以及蛋白质的生物合成。大多数作者认为，六甲蜜胺在体 内实验中并没有显示烷化剂的活性，其N-去甲基中间代谢产物可作为烷化 剂而发挥抗肿瘤作用。临床证明，对烷化剂产生耐药的患者，对六甲蜜胺 仍然有反应，提示六甲蜜胺与烷化剂之间没有交叉耐药性。六甲蜜胺具有 脂溶性的特点，它的水溶性差，因此现在临床上一般只能口服。口服六甲 蜜胺后，血液中药物浓度在1~3小时后达到高峰，在血浆中的半衰期为 13小时。六甲蜜胺的组织浓度在脂肪组织中最高。肿瘤原发部位的浓度与 血浆中的浓度相似，而六甲蜜胺在转移瘤中的浓度高于原发瘤，直径小于 3cm的转移瘤中的浓度是直径大于3cm的转移瘤的2 10倍。六甲蜜胺在 肝内经过N-去甲基化后，发生一系列代谢反应，代谢产物主要由尿排出。
近几年来，六甲蜜胺单药治疗复发或耐药的卵巢癌的研究较多，均取 得了较好的疗效，显示出六甲蜜胺在卵巢癌的二线治疗中较乐观的应用前 景。一经过铂类化疗药治疗后，复发的卵巢癌按复发时间可分为两种情况， 治疗6个月以后复发的称为对铂类药敏感；治疗6个月以内复发或治疗过 程中肿瘤进展的称为铂类耐药。对于这些产生耐药的卵巢癌患者，六甲蜜 胺、异环磷酰胺、拓扑特肯鬼臼乙叉甙和阿霉素脂质体均有较好的疗效， 而获得美国FDA批准的只有六甲蜜胺和拓扑特肯两种。
六甲蜜胺在服用中会产生一些毒副作用，包括①胃肠道反应，这是 六甲蜜胺的主要剂量限制性毒性，发生率为33%~75%,其中严重的呕吐发 生率约为2%。与其他化疗药物联合使用呕吐发生率更高。②血液学毒性， 口服六甲蜜胺l周后，血象有可能开始下降，3~4周下降到最低点，1~2 级白细胞的发生率为5%~32%， 1~2级血小板减少症的发生率为9%左右，中 度贫血的发生率为33%。③神经毒性，5%~31%的患者服药后会有周围神经
的异常，有的还会出现头昏、眩暈等，主要出现在连续用药3个月以上的患 者中。与顺铂联合用药时，神经毒性的发生率可达47%。 口服六甲蜜胺的其
它毒副作用有嗜睡、虛弱、疲劳和厌食等。
脂质体(liposome)作为近年来研究较为广泛的一种药物载体，其主 要特点是可以保护被包封药物，增加药物稳定性，改变药物在体内的分布 行为，携载药物被动或主动靶向到病变部位。近年来随着生物技术的发展, 各种不同的脂质体药物转运系统也逐渐被设计、建立，例如长循环脂质体、 靶向脂质体、PH敏感脂质体、热敏脂质体、磁敏脂质体等，脂质体的制备 工艺也更加成熟、完善。脂质体的研究愈来愈受到重视，且发展迅速，其 诱人的巿场前景和良好的技术性已经渗透到制药、生物技术、免疫调节、 基因药物、化妆品开发等各个领域。
脂质体作为先进药物载体应用于临床主要优势体现在①增强药物的 溶解性；②降低药物毒性；③赋予药物靶向性；④增加药物的缓释作用； ⑤提高对药物的保护作用；⑥通过融合作用将药物送入细胞浆或细胞核中。 从1988年第一个脂质体药物在美国进入临床试验，到目前世界上已有多
种脂质体药物工业化生产并上巿销售，如脂质体阿霉素、脂质体柔红霉素、 脂质体两性霉素、脂质体甲肝疫苗和脂质体乙肝疫苗等。而且经过几十年 的不断努力，脂质体传递技术也从最初的普通脂质体发展为长效脂质体、 靶向脂质体和智能脂质体作为抗癌药物载体，脂质体具有能增加与癌细胞 的亲和力、克服耐药性、增加药物被癌细胞的摄取率，降低用药剂量，提 高疗效和降低毒副作用等特点，脂质体化疗药物制剂理所当然的成为当今 研究的热点。
目前国外上巿的脂质体抗癌药物有PEG长循环脂质体(Caelyx)、长 循环阿霉素脂质体(Doxil)、常规阿霉素脂质体(Evacet, Myocet )、柔 红霉素脂质体(DaunoXome)和阿糖胞苷脂质体(DepoCyt)。还有约30种
脂质体抗癌药物正在临床试验或等待批准上巿。
六甲蜜胺为脂溶性药物，可以插在脂质双层膜之间，进而将其在水中 增溶，同时脂质体包裹药物可降低药物的毒副作用，还可以增加药物分子 在肿瘤部位的分布，减少其对其他正常组织的毒性。六甲蜜胺主要经肝脏 代谢，并代谢成同样有药理活性的代谢产物，将其脂质体制剂制成适当粒 径，可使其富集于巨噬细胞丰富的肝脏。将六甲蜜胺制成脂质体给药，可 以提高药物的稳定性，增强靶向性，适当延缓药物释放，具有较高的应用 价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决六甲蜜胺水不溶性和毒副作用而制备了六甲
蜜胺脂质体。
本发明也相应提供了六甲蜜胺脂质体的制备方法。 本发明通过以下措施实现
六甲蜜胺脂质体的配方包括六甲蜜胺、磷脂、胆固醇以及壳聚糖的 重量比为l: 5-80: 0-20: 0-30，并含有适量抗氧剂和缓冲盐。
本发明中所述的磷脂采用现已上巿的商品磷脂，包括天然提取的磷脂, 或者半合成或者全合成的磷脂，或者天然磷脂和半合成或全合成磷脂的混 合物。
本发明中所述的商品天然磷脂源于大豆、蛋黄、动物脑或脏器中的天 然磷脂。
本发明中所述的商品半合成活全合成磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷 脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、二 鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷 脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱。
本发明中所述的壳聚糖包括分子量为1000-1000000的水溶性脱乙酰基 甲壳素、壳聚糖盐酸盐、氯化壳聚糖、壳聚糖寡糖、类透明质酸壳聚糖。
本发明中所述的抗氧剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫 酸钠、抗坏血酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁基对羟基茴香 醚、二叔丁基对甲酚、维生素E、半胱氨酸、蛋氨酸中的一种或一种以上 混合物；丁羟基茴香醚、丁羟基甲苯、硫二丙酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、 二碌代氨基苯甲酸类、抗坏血酸、枸橼酸、苹果酸、山梨醇、甘油、丙二 醇、抗坏血酸棕榈酸酯、氢醌、羟基香豆素、维生素E、乙醇胺、磷酸及 其盐、亚磷酸及其盐中的一种或几种。
本发明中所述的缓冲液为乙醇-醋酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、 巴比妥缓冲液、甲酸钠缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、 枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、硼砂-氯化钙缓冲液、醋酸 盐缓冲液、醋酸-锂盐缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、 磷酸-三乙胺缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等，且pH范围为3-10。
一种六甲蜜胺脂质体的制备方法，其特征在于经下述步骤制备，
1)按重量比取六甲蜜胺l份与磷脂5-80份及胆固醇0-20份，溶于氯 仿和/或甲醇溶剂中，除去溶剂；再加入pH6-8的磷酸盐缓冲液；形
-成脂质体混悬液，匀化；加入等体积壳聚糖0-30份的溶液或者
2 )按重量比取六曱蜜胺1份与磷脂5-80份及胆固醇0-20份，溶于低 极性有机溶剂中，混合入pH6-8的磷酸盐缓冲液中；除去有机溶剂； 形成脂质体混悬液，匀化；加入等体积壳聚糖0-30份的溶液或者
3)按重量比取六甲蜜胺1份与磷脂5-80份及胆固醇0-20份，加入 pH6-8的磷酸盐缓冲液中，混合乳化，匀化；加入等体积壳聚糖0-30 份的溶液。
较好的六甲蜜胺脂质体的制备方法，其特征在于
1) 按重量比取六甲蜜胺1份与磷脂20-60份及胆固醇5-10份，溶于 氯仿和/或甲醇溶剂中，加热除去溶剂；再加入pH7-8的磷酸盐缓 冲液；形成脂质体混悬液，匀化；加入等体积壳聚糖10-20份的溶 液或者
2) 按重量比取六甲蜜胺l份与磷脂20-60份及胆固醇5-10份，溶于 乙醇和/乙醚中，混合入pH7-8的磷酸盐缓冲液中；减压除去有机溶 剂；形成脂质体混悬液，匀化；加入等体积壳聚糖10-20份的溶液 或者
-3)按重量比取六甲蜜胺l份与磷脂20-60份及胆固醇5-10份，加入 pH7-8的磷酸盐缓冲液中，混合乳化，勻化；加入等体积壳聚糖10-20 份的溶液。
本发明的脂质体可用薄膜分散法、逆向蒸发法、高压乳匀法、注入法、 pH梯度法等方法制备。
本发明六甲蜜胺脂质体的配方与工艺可使脂质体达到较高的包封率， 且在放置过程中粒径均一稳定，不易沉降聚集，提高了脂质体液体制剂的 贮存稳定性。
图1为六甲蜜胺脂质体大鼠体内药动学经时曲线图。
具体实施方式
一实施例1
称取10mg六甲蜜胺、400mg大豆嫌脂(纯度>90%磷脂酰胆碱)和20mg 胆固醇溶解于氯仿/甲醇(1: 0-2)混合溶剂中，将该溶液置于磨口圆底烧 瓶中，于35-45。C恒温水浴上用旋转蒸发仪在50rpm并减压条件下蒸去有
机溶剂，使药物和磷脂等在烧瓶底部形成一均匀类脂膜，置于真空干燥箱 内继续除有机溶剂(4-12h),再将5mLpH7.4的磷酸盐缓冲液加入上述圆底 烧瓶中，在4(TC下旋转蒸发水化脂膜，直至瓶壁上的薄膜全部水化脱落形 成乳白色脂质体混悬液，通过挤出仪挤出匀化减小粒径(微孔滤膜0.22n m, 5次)。将含200mg壳聚糖的溶液等体积与上述脂质体混悬液混合，并 再次挤出即得。
将该脂质体在室温(20-25°C)贮存3个月后，包封率仍在80U乂上， 粒径变化微小仍为200nm左右，再用缓冲盐溶液稀释无沉淀析出。
实施例2
称取lOmg六甲蜜胺、400mg大豆磷脂(纯度〉90°/。磷脂酰胆碱)和20mg 胆固醇溶解于乙醇中，同时将5mLpH7.4磷酸盐缓冲液置于三颈瓶中，于 4(TC恒温水洛上保温，在磁力搅拌下缓缓将有机相注入到水相中，形成的 乳白色混悬液在50rpm撹拌4(TC恒温水洛减压条件下蒸去有机溶剂，待有 机溶剂除净，通过挤出仪挤出匀化减小粒径(微孔滤膜0.22Mm, 5次)。 将含200mg壳聚糖的溶液等体积与上述脂质体混悬液混合，并再次挤出即 得。
将该脂质体在室温(20-25°C)贮存3个月后，包封率仍在80。/。以上， 粒径变化微小仍为200nm左右，再用缓冲盐溶液稀释无沉淀析出。 实施例3
称取10mg六甲蜜胺、400mg大豆磷脂(纯度>90°/。磷脂酰胆碱)和20mg 胆固醇溶解于乙醚中，将该溶液置于磨口圆底烧瓶中，同时加入少量pH7.4 磷酸盐缓冲液，于35-45。C恒温水洛上用旋转蒸发仪在lQrpm条件下蒸有 机溶剂，待呈凝胶态物质时，向圆底烧瓶中加入其余PH7.4的磷酸盐缓冲 液^化，得乳白色脂质体混悬液，通过挤出仪挤出匀化减小粒径(微孔滤 膜0.22nm， 5次)。将含200mg壳聚糖的溶液等体积与上述脂质体混悬液
混合，并再次挤出即得。
将该脂质体在室温(20-25°C)贮存3个月后，包封率仍在80%以上， 粒径变化微小仍为200nm左右，再用缓冲盐溶液稀释无沉淀析出。
实施例4
六甲蜜胺脂质体稳定性考察，通过测定脂质体在室温下存放的包封率 及粒径来评价其稳定性，有关数据如下
l个月2个月3个月4个月5个月6个月
包封率89. 388. 988. 288. 087. 586. 8
(%).-
粒 径183183184. 5186188. 4191
(nm)
可见，六甲蜜胺脂质体具有较好的稳定性。
实施例5
__六甲蜜胺脂质体大鼠体内药动学考察 将15只清洁级大鼠按体重随机分为三组，分别为原料药混悬液U),普 通脂质体组(B),壳聚糖包覆的脂质体组(C),灌胃前禁食12小时(饮水 自由)。三组大鼠分别给药后于min眼眶取血O. 5mL,置肝素抗凝化离心管 中，离心(3000rpm， 10min)分离血浆样本，处理过的血样用HPLC测定其
药物浓度，得经时曲线如附图1。
有关药动参数如下
AUC (p g，min'm1/1)CL (mL*min_1)
■460 ±3382 ±1
普通H画脂质体584±5163±7
壳聚糖包H醒脂质体649 ±5451±权利要求
1、六甲蜜胺脂质体，其特征在于，处方中各组分组成比例如下六甲蜜胺、磷脂、胆固醇以及壳聚糖的重量比为1∶5-80∶0-20∶0-30，并含有适量抗氧剂和缓冲盐。
2、 根据权利要求l所述的六甲蜜胺脂质体，其特征在于所述的磷脂 釆用现已上巿的商品磷脂，包括天然提取的磷脂，或者半合成或者全合成 的磷脂，或者天然磷脂和半合成或全合成磷脂的混合物。
3、 根据权力要求2所述的六甲蜜胺脂质体，其特征在于所述的商品天然磷脂源于大豆、蛋黄、动物脑或脏器中的天然磷脂。
4、 根据权利要求2所述的六甲蜜胺脂质体，其特征在于所述的商品半合成、全合成磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌 醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、二鲸蜡嫌酸酯、二肉豆蔻 酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂
5、 根据权利要求1所述的六甲蜜胺脂质体，其特征在于所述的壳聚 糖为分子量为1000-1000000的水溶性脱乙酰基甲壳素、壳聚糖盐酸盐、氯 化壳聚糖、壳聚糖寡糖、类透明质酸壳聚糖。
6、 根据权利要求1所述的六甲蜜胺脂质体，其特征在于所述的抗氧 剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、没食 子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、 维生素E、半胱氨酸、蛋氨酸中的一种或一种以上混合物；丁羟基茴香醚、 丁羟基甲苯、硫二丙酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、二硫代氨基苯甲酸类、 抗坏血酸、枸橼酸、苹果酸、山梨醇、甘油、丙二醇、抗坏血酸棕榈酸酯、 氢醌、羟基香豆素、维生素E、乙醇胺、磷酸及其盐、亚磷酸及其盐中的 一种或几种。
7、 根据权利要求1所述的六甲蜜胺脂质体，其特征在于所述的缓冲 液为乙醇-醋酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、巴比妥缓冲液、甲酸钠 缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲 液、氨-氯化铵缓冲液、硼砂-氯化钙缓冲液、醋酸盐缓冲液、醋酸-锂盐缓 冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、磷酸-三乙胺缓冲液、磷 酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等，且pH范围为3-10。
8、如权利要求l所述的六甲蜜胺脂质体的制备方法，其特征在于经 下述步骤制备，J)按重量比取六甲蜜胺l份与磷脂5-80份及胆固醇0-20份，溶于氯仿和/或甲醇溶剂中，除去溶剂；再加入pH6-8的磷酸盐缓冲液；形 成脂质体混悬液，勻化；加入等体积壳聚糖0-30份的溶液或者2) 按重量比取六甲蜜胺l份与磷脂5-80份及脚固醇0-20份，溶于低 极性有机溶剂中，混合入pH6-8的磷酸盐缓冲液中；除去有机溶剂； 形成脂质体混悬液，匀化；加入等体积壳聚糖0-30份的溶液或者3) 按重量比取六甲蜜胺l份与磷脂5-80份及胆固醇0-20份，加入 pH6-8的磷酸盐缓冲液中，混合乳化，匀化；加入等体积壳聚糖0-30 份的溶液。
9、如权利要求l所述的六甲蜜胺脂质体的制备方法，其特征在于 1)按重量比取六甲蜜胺l份与磷脂20-60份及胆固醇5-10份，溶于氯 仿和/或甲醇溶剂中，加热除去溶剂；再加入pH7-8的磷酸盐缓冲液；形 成脂质体混悬液，匀化；加入等体积壳聚糖10-20份的溶液或者 2一)按重量比取六甲蜜胺1份与磷脂20-60份及胆固醇5-IO份，溶于乙醇和/乙醚中，混合入pH7-8的磷酸盐缓冲液中；减压除去有机溶剂；形成脂质体混悬液，匀化；加入等体积壳聚糖10-20份的溶液或者3)按重量比取六甲蜜胺1份与磷脂20-60份及胆固醇5-10份，加入pH7-8的磷酸盐缓冲液中，混合乳化，匀化；加入等体积壳聚糖10-20份的溶液。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了六甲蜜胺脂质体及其制备方法。六甲蜜胺与磷脂类物质的重量比为1∶5-80份，亦可加入1-20份的胆固醇，0-30份壳聚糖类物质。制备工艺如下取六甲蜜胺与磷脂及胆固醇，溶于溶剂中，除去溶剂；再加入磷酸盐缓冲液；形成脂质体混悬液；加入等体积壳聚糖的溶液；取六甲蜜胺与磷脂及胆固醇，溶于低极性有机溶剂中，混合入pH6-8的磷酸盐缓冲液中；形成脂质体混悬液；加入等体积壳聚糖的溶液；按重量比取六甲蜜胺与磷脂及胆固醇份，加入的磷酸盐缓冲液中，混合乳化；加入等体积壳聚糖份的溶液。将六甲蜜胺包裹入脂质体可降低其毒副作用，并具有肝被动靶向，有利于药物在肝代谢为活性药物。
文档编号A61K9/127GK101176721SQ20071015866
公开日2008年5月14日 申请日期2007年12月3日 优先权日2007年12月3日
发明者邓英杰, 高晓非 申请人:沈阳药科大学