治疗用肽体的冻干制剂的制作方法

专利名称：治疗用肽体的冻干制剂的制作方法
专利说明治疗用肽体的冻干制剂 发明领域
一般而言，本发明涉及治疗用肽体(peptibody)的冻干制剂以及制备包含治疗用肽体的冻干组合物的方法。

背景技术：

重组蛋白是一类新型治疗药。这类重组治疗药在蛋白质制剂和化学修饰方面已有进展。认为修饰主要通过阻止其接触蛋白水解酶而保护治疗用蛋白质。蛋白质修饰也可增加治疗用蛋白质的稳定性、延长循环时间和提高生物活性。一篇描述蛋白质修饰和融合蛋白的综述性文章是Francis(1992)，Focus on Growth Factors 34-10(Mediscript，London)，其通过引用结合到本文中。

一种有用的修饰是将多肽与抗体的“Fc”结构域结合起来。抗体包含两个功能独立的部分，一个是可结合抗原的可变区，称为“Fab”，一个是与这类效应物结合而起到补体激活作用并受巨噬细胞攻击的恒定区，称为“Fc”。Fc的血清半衰期较长，而Fab的半衰期却很短。Capon等(1989)，Nature 337525-31。另见例如美国专利号5,428,130。当与治疗用肽体或蛋白质构建在一起时，Fc区可提供更长的半衰期或者掺入Fc受体结合、A蛋白结合、补体结合和也许甚至是胎盘转运等功能(出处同上)。表1概述了Fc与本领域已知的治疗用蛋白质的融合体的用途。
表1-Fc与治疗用蛋白质的融合体

也已研究了聚乙二醇(“PEG”)缀合或融合的蛋白质和肽，用于药物、人工移植物和生物相容性尤为重要的其它用途。已经提出了多种PEG衍生物具有活性部分，以允许将PEG与药物和移植物连接起来，并且一般连接在分子和表面上。例如，已经提出用PEG衍生物将PEG偶联到表面上以控制增湿、静态组合，以及将其它类型的分子与包括蛋白质或蛋白质残基在内的表面连接起来。

在其它研究中，已知PEG的偶联(“PEG化”)在克服生物活性分子临床使用上所遇到的障碍方面是需要的。已公布的PCT公布号WO 92/16221提出，已发现例如许多潜在的治疗用蛋白质在血清中的半衰期都很短。

PEG化通过增加分子的表观分子量降低了从血流中清除的速率。在一定尺寸内，蛋白质的肾小球滤过率与蛋白质大小成反比。因此，PEG化降低清除率的能力通常不是与蛋白质连接的PEG基团数量的函数，而是缀合蛋白质的总体分子量的函数。与非PEG化材料相比，清除率的降低可导致功效提高。参见例如Conforti等，Pharm.Research Commun.第19卷，第287页(1987)和Katre et.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.第84卷，第1487页(1987)。

另外，PEG化可减少蛋白质聚集，(Suzuki等，Biochem.Biophys.Acta.第788卷，第248页(1984))，改变(即)蛋白质免疫原性(Abuchowski等，J.Biol.Chem.第252卷，第3582页(1977))并增加蛋白质溶解度，例如可参见PCT公布号WO 92/16221。

一般而言，蛋白质配体与其受体间的相互作用通常发生在相当大的界面上。然而，正如与其受体结合的人生长激素的实例所证实，在界面上仅少数几个关键性残基实际给出大部分结合能。Clackson，T.等，Science 267383-386(1995)。根据这一观察结果，以及大体积剩余蛋白质配体仅起到按照正确拓扑结构来展示结合表位的作用的这一事实，使我们可以去寻找尺寸小得多的活性配体。因此，本文所定义的仅有“肽”长度的分子可与给定的大蛋白质配体的受体蛋白结合。这类肽可模拟大蛋白质配体的生物活性(“肽激动剂”)，或者通过竞争性结合而抑制大蛋白质配体的生物活性(“肽拮抗剂”)。

在鉴定这类肽激动剂和拮抗剂中，噬菌体展示肽文库是十分有效的方法。参见例如Scott等(1990)，Science 249386；Devlin等(1990)，Science 249404；美国专利号5,223,409，1993年6月29日授予专利权；美国专利号5,733,731，1998年3月31日授予专利权；美国专利号5,498,530，1996年3月12日授予专利权；美国专利号5,432,018，1995年7月11日授予专利权；美国专利号5,338,665，1994年8月16日授予专利权；美国专利号5,922,545，1999年7月13日授予专利权；WO 96/40987，1996年12月19日公布；和WO 98/15833，1998年4月16日公布，所述各文献通过引用结合到本文中。在这类文库中，通过与丝状噬菌体的外壳蛋白融合而展示随机肽序列。通常，针对抗体-固定化的受体胞外结构域而亲和洗脱所展示的肽。可通过连续多轮亲和纯化和复制来富集所保留的噬菌体，并对最佳结合肽进行测序，以鉴定肽的结构相关的一个或多个家族内关键性残基。参见例如Cwirla等(1997)，Science 2761696-9，其中鉴定出了2个不同家族。通过丙氨酸扫描或DNA水平上的诱变，肽序列也可显示哪些残基可以被安全地取代。可产生诱变文库并进行筛选，以进一步优化最佳结合物(binder)的序列。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24。

其它方法与噬菌体展示一样，也可用于肽研究。肽文库可融合到lac阻遏子的羧基端，并在大肠杆菌中表达。另一种基于大肠杆菌的方法允许展示在细胞外膜上，即通过与肽聚糖结合的脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein，PAL)融合。这些以及相关方法统称为“大肠杆菌展示”。筛选可溶性肽混合物的另一生物学方法使用酵母进行表达和分泌。参见Smith等(1993)，Mol.Pharmacol.43741-8。Smith等人的方法及其相关方法称为“基于酵母的筛选”。在另一种方法中，随机RNA翻译在核糖体释放前暂停，使多肽文库具有仍然连接在其上的缔合RNA。该方法及其相关方法统称为“核糖体展示”。其它方法采用肽与RNA的化学连接；参见例如Roberts&Szostak(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412297-303。该方法及其相关方法统称为“RNA-肽筛选”。已经开发了化学衍生的肽文库，其中肽固定在稳定的非生物材料上，例如聚乙烯棒或溶剂可渗透的树脂。另一个化学衍生的肽文库采用光版印刷，以扫描固定在载玻片上的肽。这些及其相关方法统称为“化学-肽筛选”。化学-肽筛选在允许使用D-氨基酸和其它非天然类似物、以及非肽元件方面具有优势。生物和化学方法的综述可参见Wells & Lowman(1992)，Curr.Opin.Biotechnol.3355-62。

在已知生物活性肽的情况下，可以进行具有良好治疗特性的肽配体的合理设计(rational design)。在这类方法中，对肽序列进行逐步改造，并确定取代对肽的生物活性或预测生物物理性质(例如溶液结构)的影响。这些技术统称为“合理设计”。在一项这样的技术中，制备一系列肽，其中用丙氨酸一次取代一个残基。该技术通常称为“丙氨酸步查”或“丙氨酸扫描”。当2个残基(连续或间隔开)被置换时，称为“双丙氨酸步查”。所得氨基酸取代可单用或联用，以得到具有良好治疗特性的新型肽实体。

蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析也可用于揭示模拟大蛋白质配体结合活性的肽。在这类分析中，晶体结构可显示出大蛋白质配体的关键性残基名称和相对方向，可据此来设计肽。参见例如Takasaki等(1997)，Nature Biotech.151266-70。这些以及相关方法称为“蛋白质结构分析”。这些分析方法也可用于研究受体蛋白质与经噬菌体展示而选择的肽之间的相互作用，这可显示出对肽的进一步修饰，以增加结合亲和性。

从概念上说，可以使用噬菌体展示和上述其它方法鉴定任何蛋白质的肽模拟物。这些方法也已用于表位作图，用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用中的关键性氨基酸，并可指导开发新型治疗药。例如Cortese等(1996)，Curr.Opin.Biotech.7616-21。目前，肽文库最常用于免疫学研究，例如表位作图。Kreeger(1996)，TheScientist10(13)19-20。

特别感兴趣的是，使用肽文库和其它技术来开发药理学活性肽。本领域已鉴定出大量的这类肽，概述于下表2。在所列出版物中描述了肽，所述各出版物通过引用结合到本文中。描述了肽的药理学活性，在许多情况下在其后的括号中还有简写术语。这些肽中的一些已经修饰(例如以形成C-端交联的二聚体)。通常，筛选肽文库以筛选与药理学活性蛋白质的受体(例如EPO受体)的结合。在至少一种情况下(CTLA4)，用肽文库筛选与单克隆抗体的结合。
表2-药理学活性肽








通过肽文库筛选而鉴定的肽被认为是开发治疗药的先导药物，而非本身直接用作治疗药。正如其它蛋白质和肽，它们可通过肾过滤、网状内皮系统中的细胞清除机制或蛋白酶降解而从体内快速排出。(Francis(1992)，Focus on Growth Factors 34-11)。因此，本领域目前使用经鉴定的肽，以证实药物靶标或作为设计有机化合物的框架，所述化合物不能容易而快速地通过化学文库筛选而鉴定。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24；Kay等(1998)，Drugs Disc.Today 3370-8。

通常，纯化肽仅在含水状态下还算稳定，而在加工和贮存期间会经历化学和物理降解而丧失生物活性。另外，呈水溶液形式的肽组合物会经历水解，例如脱酰胺作用和肽键断裂。这些影响对于预期将会按照预定剂量、根据生物活性而给予人的治疗活性肽而言，是严重问题。

给予纯化肽对于影响人群的许多疾病而言仍然是有希望的治疗策略。然而，治疗用肽体在不同贮存条件下、在一段时间内维持稳定的药物组合物、并有效用于患者体内的能力，尚未进行研究。因此，本领域需要提供治疗用肽体的稳定的制剂，用作治疗疾病和障碍的治疗药。
发明概述
本发明提供用于冻干治疗用肽体的制剂，得到高度稳定的治疗用肽体产品。稳定的治疗用肽体产品可用作治疗患病个体的治疗药，这些患者因给予治疗用肽体而受益。

一方面，本发明提供冻干治疗用肽体组合物，其包含缓冲剂、填充剂、稳定剂和任选的表面活性剂；其中缓冲剂由范围为约5mM至约20mM的pH缓冲剂组成并且其中pH范围为约3.0至约8.0；其中填充剂的浓度为约0％至约4.5％(重量体积比)；其中稳定剂的浓度为约0.1％至约20％(重量体积比)；其中表面活性剂浓度为约0.004％至约0.4％(重量体积比)；和其中治疗用肽体包含下式I所给出的结构 式I[(X1)a-F1-(X2)b]-(L1)c-WSPd 其中 F1为Fc区； X1选自 P1-(L2)e- P2-(L3)f-P1-(L2)e- P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e-和 P4-(L5)h-P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e- X2选自 -(L2)e-P1， -(L2)e-P1-(L3)f-P2， -(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3和 -(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3-(L5)h-P4 其中P1、P2、P3和P4各自独立地为药理学活性肽序列； L1、L2、L3、L4和L5各自独立为接头； a、b、c、e、f、g和h各自独立地为0或1， 前提条件是a和b中至少有一个为1； d为0、1或大于1；和 WSP为水溶性聚合物，其连接在F1的任何活性部分上。

在另一个实施方案中，治疗用肽体包含下式II所给出的结构 式II[X1-F1]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在X1的C-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在又一个实施方案中，治疗用肽体包含下式III所给出的结构 式III[F1-X2]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在X2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在又一个实施方案中，治疗用肽体包含下式IV所给出的结构 式IV[F1-(L1)e-P1]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在-(L1)c-P1的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在另一个实施方案中，治疗用肽体包含下式V所给出的结构 式V[F1-(L1)e-P1-(L2)f-P2]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在-L1-P1-L2-P2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在另一个实施方案中，治疗用肽体是多聚体或二聚体。在另一个实施方案中，提供上述组合物，其中P1、P2、P3和/或P4独立选自下表4-38中任一个所给出的肽。在一个相关实施方案中，P1、P2、P3和/或P4的氨基酸序列相同。在另一个实施方案中，Fc区如SEQ ID NO1所示。在另一个实施方案中，WSP为PEG。在又一个实施方案中，Fc区如SEQ ID NO1所示并且WSP为PEG。在另一个实施方案中，PEG的分子量介于约2kDa和100kDa之间，或介于6kDa和25kDa之间。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少50％、75％、85％、90％或95％PEG化治疗用肽体。

在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中pH缓冲剂选自甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸、磷酸、乙酸和天冬氨酸。在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中填充剂选自甘露醇、甘氨酸、蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。

在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中稳定剂选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、精氨酸HCl、多羟基化合物(包括多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷(N-methylpyrollidene)、纤维素和透明质酸)、氯化钠。

在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠、二辛基磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、去氧胆酸钠、脱氧甘胆酸钠盐、苯扎氯铵或苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓一水合物、溴化十六烷基三甲基铵、CHAPS、CHAPSO、SB3-10、SB3-12、洋地黄皂苷、曲通X-100、曲通X-114、聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、大豆卵磷脂、DOPC、DMPG、DMPC和DOPG；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中治疗用肽体浓度介于约0.25mg/mL和250mg/mL之间。

在本发明的另一个实施方案中，提供上述组合物，其中pH缓冲剂是10mM组氨酸，其中pH为5.0；其中填充剂为4％(重量体积比)甘露醇；其中稳定剂为2％(重量体积比)蔗糖；和其中表面活性剂为0.004％(重量体积比)聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述组合物，其中P1包括下表6所给出的序列。在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中治疗用肽体浓度为0.5mg/mL。在另一个实施方案中，治疗用肽体是SEQ ID NO993、SEQID NO994、SEQ ID NO995、SEQ ID NO996、SEQ ID NO997、SEQ ID NO998、SEQ ID NO999、SEQ ID NO1000、SEQ IDNO1001、SEQ ID NO1002、SEQ ID NO1003、SEQ ID NO1004、SEQ ID NO1005、SEQ ID NO1006、SEQ ID NO1007、SEQ IDNO1008、SEQ ID NO1009、SEQ ID NO1010、SEQ ID NO1011、SEQ ID NO1012、SEQ ID NO1013、SEQ ID NO1014、SEQ IDNO1015、SEQ ID NO1016或SEQ ID NO1017中的任一个。

在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为7.0；其中填充剂为4％(重量体积比)甘露醇；其中稳定剂为2％(重量体积比)蔗糖；和其中表面活性剂为0.01％(重量体积比)聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述组合物，其中P1包括下表32所给出的序列。在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中治疗用肽体浓度为30mg/mL。

在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中pH缓冲剂为20mM组氨酸，其中pH为5.0；其中填充剂为3.3％(重量体积比)甘露醇；其中稳定剂为2％(重量体积比)蔗糖；和其中表面活性剂为0.01％(重量体积比)聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述组合物，其中P1包括下表4所给出的序列。在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中治疗用肽体浓度为100mg/mL。

在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为5.0；其中填充剂为2.5％(重量体积比)甘露醇；和其中稳定剂为3.5％(重量体积比)蔗糖。在另一个实施方案中，提供上述组合物，其中P1包括下表31所给出的序列。在本发明的又一个实施方案中，提供上述组合物，其中治疗用肽体浓度为30mg/mL。

在本发明的另一个实施方案中，提供上述组合物，其中组合物选自a)10mM组氨酸，pH4.7，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；b)10mM组氨酸，pH5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；c)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；d)10mM琥珀酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；e)10mM谷氨酸，pH4.5，9％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；f)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％蔗糖，1％羟乙基淀粉，0.004％聚山梨酯-20；g)5mM谷氨酸，pH4.5，2％甘露醇，1％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；和h)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％海藻糖，0.004％聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述组合物，其中P1包括下表21-24所给出的序列。在又一个实施方案中，提供上述组合物，其中治疗用肽体浓度选自1mg/mL、30mg/mL、85mg/mL和100mg/mL。

本发明也包括制备本发明冻干治疗用肽体的方法。在一个实施方案中，本发明提供制备冻干治疗用肽体的方法，其包括以下步骤a)制备缓冲剂、填充剂、稳定剂和任选表面活性剂的溶液；其中缓冲剂由范围为约5mM至约20mM的pH缓冲剂组成，其中pH范围为约3.0至约8.0；其中填充剂的浓度为约2.5％至约4％(重量体积比)；其中稳定剂的浓度为约0.1％至约5％(重量体积比)；其中表面活性剂的浓度为约0.004％至约0.04％(重量体积比)；和b)将治疗用肽体冻干；其中治疗用肽体包含下式I所给出的结构 式I[(X1)a-F1-(X2)b]-(L1)c-WSPd 其中 F1为Fc区； X1选自 P1-(L2)e- P2-(L3)f-P1-(L2)e- P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e-和 P4-(L5)h-P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e- X2选自 -(L2)e-P1， -(L2)e-P1-(L3)f-P2， -(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3和 -(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3-(L5)h-P4 其中P1、P2、P3和P4各自独立地为药理学活性肽序列； L1、L2、L3、L4和L5各自独立地为接头； a、b、c、e、f、g和h各自独立地为0或1， 前提条件是a和b中至少有一个为1； d为0、1或大于1；和 WSP为水溶性聚合物，其连接在F1的任何活性部分上。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体包含下式II所给出的结构 式II[X1-F1]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在X1的C-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体包含下式III所给出的结构 式III[F1-X2]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在X2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体包含下式IV所给出的结构 式IV[F1-(L1)e-P1]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在-(L1)c-P1的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体包含下式V所给出的结构 式V[F1-(L1)e-P1-(L2)f-P2]-(L1)c-WSPd 其中Fc区连接在-L1-P1-L2-P2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体是多聚体或二聚体。在另一个实施方案中，P1、P2、P3和/或P4独立选自下表4-38中任一个所给出的肽。在另一个实施方案中，P1、P2、P3和/或P4的氨基酸序列相同。在另一个实施方案中，Fc区如SEQ ID NO1所示。在另一个实施方案中，WSP为PEG。在另一个实施方案中，Fc区如SEQ ID NO1所示，WSP为PEG。在另一个实施方案中，PEG的分子量介于约2kDa和100kDa之间，或介于6kDa和25kDa之间。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中组合物包含至少50％、75％、85％、90％或95％PEG化治疗用肽体。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中pH缓冲剂选自甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸、磷酸、乙酸和天冬氨酸。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中填充剂选自甘露醇、甘氨酸、蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中稳定剂选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、精氨酸HCl、多羟基化合物(包括多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷(N-methylpyrollidene)、纤维素和透明质酸)、氯化钠。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠、二辛基磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、去氧胆酸钠、脱氧甘胆酸钠盐、苯扎氯铵或苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓一水合物、溴化十六烷基三甲基铵、CHAPS、CHAPSO、SB3-10、SB3-12、洋地黄皂苷、曲通X-100、曲通X-114、聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、大豆卵磷脂、DOPC、DMPG、DMPC和DOPG；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体浓度介于约0.25mg/mL和250mg/mL之间。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为5.0；其中填充剂为4％(重量体积比)甘露醇；其中稳定剂为2％(重量体积比)蔗糖；和其中表面活性剂为0.004％(重量体积比)聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中P1包括下表6所给出的序列。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体浓度为0.5mg/mL。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为7.0；其中填充剂为4％(重量体积比)甘露醇；其中稳定剂为2％(重量体积比)蔗糖；和其中表面活性剂为0.01％(重量体积比)聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中P1包括下表32所给出的序列。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体浓度为30mg/mL。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中pH缓冲剂为20mM组氨酸，其中pH为5.0；其中填充剂为3.3％(重量体积比)甘露醇；其中稳定剂为2％(重量体积比)蔗糖；和其中表面活性剂为0.01％(重量体积比)聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中P1包括下表4所给出的序列。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体浓度为100mg/mL。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为5.0；其中填充剂为2.5％(重量体积比)甘露醇；和其中稳定剂为3.5％(重量体积比)蔗糖。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中P1包括下表31所给出的序列。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体浓度为30mg/mL。

在本发明的另一个实施方案中，提供上述方法，其中组合物选自a)10mM组氨酸，pH4.7，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；b)10mM组氨酸，pH5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；c)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；d)10mM琥珀酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；e)10mM谷氨酸，pH4.5，9％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；f)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％蔗糖，1％羟乙基淀粉，0.004％聚山梨酯-20；g)5mM谷氨酸，pH4.5，2％甘露醇，1％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；和h)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％海藻糖，0.004％聚山梨酯-20。在另一个实施方案中，提供上述方法，其中P1包括下表21-24所给出的序列。在又一个实施方案中，提供上述方法，其中治疗用肽体浓度选自1mg/mL、30mg/mL、85mg/mL和100mg/mL。

在另一个实施方案中，提供上述方法，所述方法在冻干之前还包括以下步骤b)调节溶液pH至pH为约4.0至约8.0；c)制备含有治疗用肽体的溶液；d)将步骤(c)的溶液缓冲交换为步骤(b)的溶液；e)加入适量的表面活性剂；和f)将步骤(e)的混合物冻干。

在另一个实施方案中，提供上述方法，其中提供用于制备重配治疗用肽体组合物的方法，该方法包括以下步骤a)将上述治疗用肽体组合物冻干；和b)重配冻干治疗用肽体组合物。

在另一个实施方案中，提供用于制备含水药物组合物的试剂盒，其包括装有上述冻干治疗用肽体组合物的第一容器和装有用于冻干组合物的生理上可接受的溶剂的第二容器。
发明详述 术语定义
术语“包含”用于肽化合物时，是指在给定序列的氨基端或羧基端或两端可包含额外氨基酸的化合物。当然，这些额外氨基酸不应明显干扰化合物的活性。对于本发明的组合物，术语“包含”是指组合物可包含额外成分。这些额外成分不应明显干扰组合物的活性。

术语“肽体(peptibody)”是指包含肽直接或间接与其它分子(例如抗体Fc区)融合的分子，其中肽部分与所需靶标特异性结合。肽可与Fc区融合或插入到Fc-环(一种修饰的Fc分子)。美国专利申请公布号US2006/0140934中描述了Fc-环，通过引用全部结合到本文中。本发明含有经修饰而包含肽作为Fc区内部序列(优选在环区内)的Fc区的这类分子。Fc内肽分子在特定内部区域中可包含不止一个串联的肽序列，并且它们在其它内部区域中还可包含其它肽。尽管推定环区作为例子，认为插入到Fc的任何其它非末端区，也是本发明的组成部分。术语“肽体”不包括Fc-融合蛋白(例如与Fc区融合的全长蛋白。

术语“载体”是指能阻止治疗用蛋白降解和/或延长其半衰期、降低其毒性、降低其免疫原性或增加其生物活性的分子。示例性的载体包括美国专利号5,428,130(Capon等，1995年6月27日授予专利权)中介绍的Fc区。

术语“天然Fc”是指包含由完整抗体消化而产生的非抗原-结合片段序列的分子或序列，其呈单体或多聚体形式。通常，天然F包含CH2区和CH3区。一方面，天然Fc的原始免疫球蛋白来源是来自人，可以是任何免疫球蛋白。天然Fc是单体多肽，其可通过共价结合(即二硫键)、非共价结合或其组合而连接成二聚体或多聚体形式。根据不同种类(例如IgG、IgA、IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)，天然Fc分子单体亚基之间的分子间二硫键的数量范围为1-4个。天然Fc的一个实例是IgG经木瓜蛋白酶消化而产生的二硫键连接的二聚体。Ellison等(1982)，Nucleic AcidRes.104071-9。本文所用的术语“天然Fc”泛指单体、二聚体和多聚体形式。

术语“Fc变异体”是指天然Fc经修饰而得、但依然包含补救受体(FcRn)的结合位点的分子或序列。国际申请WO 97/34631(1997年9月25日公布)和WO 96/32478介绍了示例性的Fc变异体，及其与补救受体的相互作用，所述文献通过引用结合到本文中。一方面，术语“Fc变异体”包含非人天然Fc经过人源化的分子或序列。另一方面，天然Fc包含可去掉的位点，因为它们具有本发明融合分子所不需要的结构特性或生物活性。因此，术语“Fc变异体”包含缺乏一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，这些位点或残基可影响或参与(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞不相容，(3)在所选宿主细胞中表达时的N-端异质性，(4)糖基化，(5)与补体相互作用，(6)与Fc受体、而非补救受体结合，或(7)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。下面进一步详细介绍了Fc变异体。

术语“Fc区”包含如上定义的天然Fc和Fc变异体分子和序列。当用于Fc变异体和天然Fc，术语“Fc区”包含无论是完整抗体消化产生还是通过其它方法产生的单体或多聚体形式的分子。在一个实施方案中，例如，Fc区可以是 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K(SEQ ID NO1)。

另外的Fc序列是本领域已知的并包括在本发明的用途之内。例如Fc IgG1(GenBank检索号P01857)、Fc IgG2(GenBank检索号P01859)、Fc IgG3(GenBank检索号P01860)、Fc IgG4(GenBank检索号P01861)、Fc IgA1(GenBank检索号P01876)、Fc IgA2(GenBank检索号P01877)、Fc IgD(GenBank检索号P01880)、Fc IgM(GenBank检索号P01871)和Fc IgE(GenBank检索号P01854)是包含在本文用途之内的若干额外Fc序列。

任选N-端氨基酸序列可加到上述序列(例如当在细菌中表达时)。

术语“多聚体”当用于Fc区或含有Fc区的分子时，是指具有共价、非共价或者同时具有共价和非共价结合的两条或更多条多肽链的分子。IgG分子通常形成二聚体；IgM分子通常形成五聚体；IgD分子通常形成二聚体；而IgA分子通常形成单体、二聚体、三聚体或四聚体。可通过利用序列并得到Fc的天然Ig来源的活性或通过衍生(如下定义)这类天然Fc，而形成多聚体。

术语“衍生”、“衍生物”或“衍生化”是指这样的方法及所得化合物其中例如但不限于(1)化合物具有环状部分；例如化合物内半胱氨酰残基之间的交联；(2)化合物是交联的或具有交联位点；例如化合物具有半胱氨酰残基并因此在培养中或在体内形成交联二聚体；(3)一种或多种肽键被非肽键置换；(4)N-端被以下基团置换-NRR1、NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR、琥珀酰亚胺基、或取代或未取代的苄氧基羰基-NH-，其中R和R1和环取代基如下文定义；(5)C-端被-C(O)R2或-NR3R4置换，其中R2、R3和R4如下文定义；和(6)各个氨基酸部分通过用能够与所选侧链或末端残基反应的试剂处理而得以修饰的化合物。衍生物在下文有进一步描述。

本文所用的术语“肽”是指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸通过肽键连接起来的分子。肽通常含有随机和/或柔性构象，例如无规卷曲；并且通常缺乏稳定构象，例如在较大蛋白质/多肽中所观察的那样，通常通过二级和三级结构。在具体的实施方案中，各种尺寸范围的肽包括在本文中，其长度范围约为3-90、3-80、3-70、3-60、3-50；5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30；10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30；10-20个氨基酸；等等。在其它实施方案中，本文所用的肽的长度不超过100、90、80、70、60、50、40、30或20个氨基酸。可通过本文提出的任何方法产生示例性的肽，例如在肽文库(例如噬菌体展示文库)中进行，通过化学合成而产生，通过蛋白质消化而衍生，或者采用重组DNA技术而产生。肽包括D和L形式，既可是纯化的又可以是两种形式的混合物。

另外，本发明化合物的生理上可接受的盐也包括在内。“生理上可接受的盐”是指已知或后来知道是药学上可接受的任何盐。一些具体实例为乙酸盐；三氟乙酸盐；氢卤酸盐，例如盐酸盐和氢溴酸盐；硫酸盐；柠檬酸盐；酒石酸盐；羟乙酸盐；和草酸盐。

所用的术语“随机化”当用于肽序列时，是指完全随机序列(例如通过噬菌体展示方法而选择)和天然存在的分子的一个或多个残基被并非天然分子的该位置所出现的氨基酸残基所置换的序列。肽的示例性的鉴定方法包括噬菌体展示、大肠杆菌展示、核糖体展示、基于酵母的筛选、RNA-肽筛选、化学筛选、合理设计、蛋白质结构分析等。

术语“药理学活性”是指确定所描述的物质具有影响医学参数(例如但不限于血压、血细胞计数、胆固醇水平)或疾病状态(例如但不限于癌症、自身免疫病)的活性。因此，药理学活性肽包括如下文定义的激动剂肽或模拟肽和拮抗剂肽。

术语“-模拟肽”和“-激动剂肽”是指其生物活性与某一种蛋白质(例如但不限于EPO、TPO、G-CSF和本文所述的其它蛋白质)相当并与目标蛋白相互作用的肽。这些术语还包括间接模拟目标蛋白活性的肽，例如通过加强目标蛋白天然配体的效果；参见例如表2和表7所列举的G-CSF-模拟肽。作为实例，术语“EPO-模拟肽”包括可按以下文献所述而鉴定或衍生的任何肽Wrighton等(1996)，Science 273458-63，Naranda等(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA967569-74；或表2的任何其它参考文献中鉴定为具有EPO-模拟主题的肽。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

作为另一个实例，术语“TPO-模拟肽”或“TMP”是指可按以下文献所述而鉴定或衍生的任何肽Cwirla等(1997)，Science2761696-9，美国专利号5,869,451和5,932,946和表2的任何其它参考文献中鉴定为具有TPO-模拟主题的任何肽，以及国际申请WO00/24770(2000年5月4日公布)，通过引用结合到本文中。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

作为另一个实例，术语“G-CSF-模拟肽”是指可按以下文献鉴定或描述的任何肽Paukovits等(1984)，Hoppe-Seylers Z.Physiol.Chem.365303-11或表2的参考文献中鉴定为具有G-CSF-模拟主题的任何肽。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

术语“CTLA4-模拟肽”是指可按以下文献所述而鉴定或衍生的任何肽Fukumoto等(1998)，Nature Biotech.16267-70。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

术语“-拮抗剂肽”或“抑制剂肽”是指能阻断或以某些方式干扰所结合目标蛋白的生物活性的肽，或者其生物活性与相关的目标蛋白的已知拮抗剂或抑制剂相当的肽。因此，术语“TNF-拮抗剂肽”包括可按以下文献所述而鉴定或衍生的肽Takasaki等(1997)，Nature Biotech.151266-70或表2的参考文献中鉴定为具有TNF-拮抗剂主题的任何肽。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

术语“IL-1拮抗剂”和“IL-1ra-模拟肽”是指能抑制或下调IL-1导致的IL-1受体激活的肽。IL-1受体激活是由IL-1、IL-1受体和IL-1受体辅助蛋白复合物的形成而导致的。IL-1拮抗剂或IL-1ra-模拟肽与IL-1、IL-1受体或IL-1受体辅助蛋白结合并阻碍复合物中的任两种或三种组分间形成复合物。示例性的IL-1拮抗剂或IL-1ra-模拟肽可按以下文献所述而鉴定或衍生美国专利号5,608,035；5,786,331、5,880,096；或按表2的参考文献中鉴定为具有IL-1ra-模拟或IL-1拮抗剂主题。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

术语“VEGF-拮抗剂肽”是指可按以下文献所述而鉴定或衍生的肽Fairbrother(1998)，Biochem.3717754-64以及表2的任何参考文献中鉴定为具有VEGF-拮抗剂主题的肽。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

术语“MMP抑制剂肽”是指可按以下文献所述而鉴定或衍生的肽Koivunen(1999)，Nature Biotech.17768-74以及表2的任何参考文献中鉴定为具有MMP抑制剂主题的肽。本领域普通技术人员知道，这些参考文献各自可使我们能够通过以下公开的方法、使用不同肽文库，来选择不同的肽、而非其中实际公开的肽。

术语“肌肉生长抑素(myostatin)抑制剂肽”是指根据其降低或阻断肌肉生长抑素活性或信号转导的能力而鉴定的肽，这样的肽能力可经体外测定(例如pMARE C2C12基于细胞的肌肉生长抑素活性测定)或通过以下文献所述的体内动物试验而检测美国专利申请公布号US20040181033A1和PCT申请公布号WO2004/058988。示例性的肌肉生长抑素抑制剂肽见下表21-24。

术语“整联蛋白/粘附拮抗剂”是指能抑制或下调整联蛋白、选择蛋白、细胞粘附分子、整联蛋白受体、选择蛋白受体或细胞粘附分子受体的活性的肽。示例性的整联蛋白/粘附拮抗剂包含层粘连蛋白、锯鳞蝰素、表25-28所述的肽。

术语“骨吸收抑制剂”是指通过WO 97/23614实施例4和11的测定法所确定的一类分子，所述文献通过引用全部结合到本文中。示例性的骨吸收抑制剂包含WO 97/23614和WO98/46751分别描述的OPG和OPG-L抗体，所述文献通过引用全部结合到本文中。

术语“神经生长因子抑制剂”或“神经生长因子激动剂”是指可与神经生长因子(NGF)结合并抑制其活性或信号转导的肽。示例性的这类肽见下表29。

术语“TALL-1调节结构域”是指可与TALL-1结合并包含天然序列或随机序列的任何氨基酸序列。示例性的TALL-1调节结构域可通过噬菌体展示或本文所述的其它方法来鉴定或衍生。示例性的这类肽见下表30和31。

术语“TALL-1拮抗剂”是指能与TALL-1结合、并且与全长天然TALL-1的参数相比能增加或降低一种或多种测定参数的分子。这样的活性可通过例如以下文献的测定法来确定WO00/47740，专利申请的名称为“TNF-RELATED PROTEINS(TNF相关蛋白)”，Materials & Methods(材料与方法)部分中的小标题为“Biological Activity of AGP-3(AGP-3的生物活性)”，2000年8月17日公布。

术语“Ang 2-拮抗剂肽”是指可鉴定或衍生为具有Ang-2-拮抗剂特征的肽。示例性的这类肽见下表32-38。

术语“WSP”是指能阻止肽、蛋白质或其它化合物在含水环境(例如生理环境)中因结合而不沉淀的水溶性聚合物。本发明所涵盖的各种WSP的实施方案的详述如下。
冻干和给药
治疗用肽体可用于药物制剂，以治疗本文所述的人类疾病。在一个实施方案中，治疗用肽体组合物是冻干的。用本领域常用技术进行冻干，并且应当对所开发的组合物的冻干过程进行优化[Tang等，Pharm Res.21191-200，(2004)和Chang等，Pharm Res.13243-9(1996)]。

一方面，冻干循环包括3步冷冻、初次干燥和二次干燥[A.P.Mackenzie，Phil Trans R Soc London，Ser B，Biol 278167(1977)]。在冷冻步骤中，将溶液冷却至开始结冰。而且，该步骤引起填充剂结晶。在初次干燥步骤中，采用真空并导入热量以促进升华，通过将室压降至冰的蒸汽压之下而使冰升华。最后在二次干燥步骤中，在降低室压和升高架温(shelf temperature)下除去吸收水或结合水。该过程得到的物质称为冻干饼(cake)。以后，该饼可用无菌水或合适的稀释剂重配，用于注射。

冻干循环不仅决定赋形剂的最终物理状态，而且影响其它参数，例如重配时间、外观、稳定性和最终含水量。冷冻状态的组合物结构经历几次转变(例如玻璃化转变、润湿和结晶)，这些转变发生在特定温度下，并且可用于理解并优化冻干过程。玻璃化转变温度(Tg和/或Tg’)可提供有关溶质物理状态的信息并可通过差示扫描量热法(DSC)来测定。Tg和Tg’是设计冻干循环中必须考虑的重要参数。例如，Tg’对初次干燥而言是重要的。此外，在干燥状态下，玻璃化转变温度提供终产物贮存温度的信息。

常用赋形剂
赋形剂是制剂中含有的添加剂，因为它们可赋予或增强药品的稳定性、递送性和工艺性。无论含有赋形剂的原因如何，赋形剂都是药物产品的构成成分，因此必须是安全的而且患者对其具有良好耐受性。对于蛋白质药物，赋形剂的选择尤为重要，因为它们会影响药物的功效和免疫原性。因此，必须适当选用具有合适稳定性、安全性和可销售性的赋形剂来开发蛋白质制剂。

冻干制剂通常包含缓冲剂、填充剂和稳定剂。在冻干步骤中或重配期间发生聚集的情况下，可评价和选择表面活性剂的用途。在冻干期间，含有合适缓冲剂以维持制剂稳定的pH范围。对液态和冻干蛋白质制剂中赋形剂成分的比较见下表A。
表A冻干蛋白质制剂的赋形剂成分
在治疗用蛋白质制剂开发中的主要挑战是针对制造、运输和贮存应力而使产品稳定。制剂赋形剂的作用是针对这些应力而提供稳定性。赋形剂也可用于降低高浓度蛋白质制剂的粘度，从而方便地递送给患者。一般而言，根据赋形剂针对各种理化应力而稳定蛋白质的机制，可将其分类。一些赋形剂用于减少具体应力的效应或调节特定蛋白质的具体敏感性。其它赋形剂对蛋白质的物理和共价稳定性具有更普遍的效应。本文所述的赋形剂按其化学种类或制剂中的功能性作用而组合。当讨论各种赋形剂种类时，提供稳定方式的简短描述。

根据本文所提供的说明和指南，本领域技术人员将会知道任何具体制剂中含有的赋形剂的数量或范围，以得到本发明生物药物制剂，其能促进保留生物药物的稳定性。例如，可以根据终溶液所含盐的所需摩尔渗透压浓度(即等渗、低渗或高渗)以及制剂所含其它成分的数量和摩尔渗透压浓度，选择本发明生物药物制剂中含有的盐的数量和种类。同样，以制剂含有多元醇或糖的种类为例，这类赋形剂的数量将取决于其摩尔渗透压浓度。

例如，含有约5％山梨醇可达到等渗，而需要约9％蔗糖赋形剂可达到等渗。本发明生物药物制剂所含的一种或多种赋形剂的浓度值或范围的选择可以以上述盐、多元醇和糖为例。然而，本领域技术人员将会知道，本文所述的考虑和具体赋形剂的更多实例同样可用于所有类型的赋形剂及其组合，包括例如盐、氨基酸、其它张力调节剂、表面活性剂、稳定剂、填充剂、冷冻防护剂、冻干防护剂、抗氧化剂、金属离子、螯合剂和/或防腐剂。

此外，尽管已报道了制剂中具体赋形剂的百分比(％)(重量体积比)，本领域技术人员将会知道，也包括赋形剂的当量摩尔浓度。

当然，本领域技术人员将会知道，在具体制剂中的上述赋形剂的浓度是互相依存的。举例来说，当例如具有高蛋白/肽浓度或者当例如具有高稳定剂浓度时，可以降低填充剂浓度。另外，本领域普通技术人员将会知道，为了维持无填充剂的具体制剂的等渗性，稳定剂的浓度可随之调整(即可使用“张力调节量(tonicifyingamount)”的稳定剂)。其它赋形剂是本领域已知的并可参见Powell等，Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations(1998)，PDA J.Pharm.Sci.Technology，52238-311。

缓冲剂
通常观察到蛋白质药物的稳定性在窄的pH范围内达到最大。在研究制剂之前的早期就需要评定最佳稳定性的pH范围。加速稳定性研究和量热筛选研究等若干方法已经证明可用于这类研究(Remmele R.L.Jr.等，Biochemistry，38(16)5241-7(1999))。一旦确定制剂，必须在整个货架期内在预定规格型号内生产和保存药品。因此，几乎总要用缓冲剂来控制制剂的pH。

常规使用有机酸、磷酸盐和Tris作为蛋白质制剂的缓冲剂(表B)。缓冲剂的缓冲能力在pH等于pKa时最大，而当pH上升时缓冲能力则比该值要下降或减少。在其pKa的一个pH单位内存在90％的缓冲能力。缓冲能力也随缓冲剂浓度增加而按比例增加。

选择缓冲剂时需要考虑一些因素。第一和最重要的是，缓冲剂的种类及其浓度按其pKa和所需制剂pH而限定。同样重要的是要确保缓冲剂与蛋白质药物、其它制剂赋形剂相容，而且不催化任何降解反应。目前，已经知道聚阴离子型羧酸缓冲剂(例如柠檬酸和琥珀酸)能与蛋白质侧链残基形成共价加合物。第三个要考虑的重要方面是缓冲剂可能引起的针刺感和刺激性。例如，已知柠檬酸在注射时可引起针刺感(Laursen T.等，Basic Clin Pharmacol Toxicol.，98(2)218-21(2006))。比起通过IV途径给药而言，通过SC或IM途径给药的药物的针刺感和刺激性更大，因为药物溶液在注射部位停留更长时间，而在IV途径中当给药后，制剂会快速稀释到血液中。对于通过直接IV输注的制剂而言，需要监测缓冲剂的总量(和任何其它制剂成分)。必须特别留意以磷酸钾缓冲剂形式给予的钾离子，它可引起患者的心血管效应(Hollander-Rodriguez JC等，Am.Fam.Physician.，73(2)283-90(2006))。

冻干制剂的缓冲剂需要额外的考虑。一些缓冲剂例如磷酸钠在冻干期间在蛋白质非晶相中会结晶析出，导致大的pH变化。应当避免其它常用缓冲剂例如乙酸和咪唑，因为它们在冻干过程中会升华或蒸发，因而在冻干期间或重配后改变制剂的pH。
表B常用缓冲剂及其pKa值
选择组合物中存在的缓冲体系为生理相容的并在重配溶液以及在冻干后的溶液中能维持所需pH。在一个实施方案中，冻干前的溶液pH介于pH2.0和pH12.0之间。例如，在一个实施方案中，冻干前的溶液pH为2.0、2.3.、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7、4.0、4.3、4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.7、8.0、8.3、8.5、8.7、9.0、9.3、9.5、9.7、10.0、10.3、10.5、10.7、11.0、11.3、11.5、11.7或12.0。在另一个实施方案中，重配溶液的pH介于4.5和9.0之间。在一个实施方案中，重配溶液的pH为4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.7、8.0、8.3、8.5、8.7或9.0。

在一个实施方案中，制剂所用的pH缓冲剂是氨基酸或氨基酸混合物。一方面，pH缓冲剂是组氨酸或其中一种氨基酸为组氨酸的氨基酸混合物。

pH缓冲化合物的含量可以是适于将制剂pH维持在预定水平上的任何量。在一个实施方案中，当pH缓冲剂为氨基酸时，氨基酸浓度介于0.1mM和1000mM(1M)之间。在一个实施方案中，pH缓冲剂为至少0.1mM、0.5mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.5mM、1.7mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、500mM、700mM或900mM。在另一个实施方案中，pH缓冲剂的浓度介于1mM、1.2mM、1.5mM、1.7mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM和100mM之间。在又一个实施方案中，pH缓冲剂的浓度介于5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM或40mM和50mM之间。在又一个实施方案中，pH缓冲剂的浓度为10mM。

本文所提出的用于缓冲制剂的其它示例性pH缓冲剂包含但不限于甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸、磷酸、乙酸和天冬氨酸。

稳定剂和填充剂
填充剂通常用于冻干制剂，以增强产品的美观并防止爆裂。通常设计制剂条件，使得填充剂在冷冻非晶相中结晶析出(在冷冻或从Tg’以上退火期间)，得到饼结构和松散结构。甘露醇和甘氨酸是常用填充剂的实例。

稳定剂包含一类可作为冷冻防护剂、冻干防护剂和玻璃形成剂的化合物。冷冻防护剂用于在冷冻期间或在低温冷冻状态下使蛋白质稳定(P.Cameron编著，Good Pharmaceutical Freeze-Drying Practice，Interpharm Press，Inc.，Buffalo Grove，IL，(1997))。冻干防护剂在冻干固体剂型中使蛋白质稳定，即通过在冻干的脱水期间保持蛋白质天然样构象特性。玻璃态特性因其取决于温度的松弛特性而分为“硬”或“脆”。重要的是，冷冻防护剂、冻干防护剂和玻璃形成剂与蛋白质保持在同一相内，以赋予稳定性。糖、聚合物和多元醇都落入该目录中，有时可以起到所有3种作用。

多元醇包括一类赋形剂，包括糖(例如甘露醇、蔗糖、山梨醇)和其它多羟基醇(例如甘油和丙二醇)。该目录下包括聚合物聚乙二醇(PEG)。多元醇在液体和冻干胃肠外蛋白质制剂中常用作稳定赋形剂和/或等渗剂。对于感胶离子序列(Hofmeister series)，多元醇是离液序列低的(kosmotropic)，优先排除在蛋白质表面外。多元醇可保护蛋白质避免理化降解途径。优先排除在外的共溶剂在蛋白质界面上增加溶剂的有效表面张力，因此在能量上最有利的蛋白质构象就是具有最小表面积的那些。

甘露醇在冻干制剂中是常用的填充剂，因为它在冻干期间在非晶形蛋白质相中结晶析出，导致饼的结构稳定性(例如


－Lyo，

)。它常与冷冻防护剂和/或冻干防护剂如蔗糖组合使用。因为甘露醇在冷冻条件下有结晶的趋势，所以山梨醇和蔗糖在液体制剂中是优选的张力调节剂/稳定剂，以保护产品避免在运输期间或生产前冷冻时遭受冻融伤害。山梨醇和蔗糖对结晶具有很强的抵抗性，因此很少有蛋白质的相分离。令人感兴趣地注意到，尽管在一些市售液体制剂例如


和

中使用了张力调节量的甘露醇，但是这些药物的产品标签上带有“不要冷冻”的警号。应避免使用还原糖(含游离醛基或酮基)例如葡萄糖和乳糖，因为它们可通过醛和伯胺的美拉德反应(Maillardreaction)反应并使蛋白质的表面赖氨酸和精氨酸残基糖化(Chevalier F.等，Nahrung，46(2)58-63(2002)；Humeny A.等，J Agric Food Chem.50(7)2153-60(2002))。在酸性条件下蔗糖可水解成果糖和葡萄糖(Kautz C.F.和Robinson A.L.，JACS，50(4)1022-30(1928))，因而可引起糖化。

聚合物聚乙二醇(PEG)可通过两种不同温度依赖性机制而使蛋白质稳定。在较低温度时，它优先排除在蛋白质表面之外，但在达到其两亲性的较高温度下却显示出与蛋白质未折叠状态的相互作用(Lee LL和Lee J.C.，Biochemistry，26(24)7813-9(1987))。因此在较低温度时，它可通过优先排阻机制保护蛋白质，但在较高温度时可能通过减少未折叠分子间重复碰撞次数而保护蛋白质。PEG也是冷冻防护剂，已用于

(一种重组抗血友病因子的冻干制剂，其使用的PEG 3350浓度为1.5mg/mL)。低分子量液体PEG(PEG 300-600)可污染过氧化物，引起蛋白质氧化。如果使用的话，必须尽量降低原料中的过氧化物含量并在整个货架期控制其含量。这对聚山梨酯同样有效。

在本组合物的一个具体的实施方案中，将稳定剂(或稳定剂组合)加到冻干制剂中，以防止或减少冻干引起的或贮存引起的聚集和化学降解。重配时的浑浊溶液表明蛋白质已发生沉淀。术语“稳定剂”是指在含水和固体状态下能够阻止聚集或其它物理降解及化学降解(例如自溶、脱氨基、氧化等)的赋形剂。常用于药物组合物的稳定剂包含但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、精氨酸HCl、多羟基化合物(包括多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷(N-methyl pyrollidene)、纤维素和透明质酸)、氯化钠[Carpenter等，Develop.Biol.Standard 74225，(1991)]。在一个实施方案中，掺入的稳定剂浓度为约0％至约40％(重量体积比)。在另一个实施方案中，掺入的稳定剂浓度为至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％或40％(重量体积比)。在另一个实施方案中，掺入的稳定剂浓度为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％至约10％(重量体积比)。在又一个实施方案中，掺入的稳定剂浓度为约2％至约4％(重量体积比)。在又一个实施方案中，掺入的稳定剂浓度为约2％(重量体积比)。

如有必要，冻干组合物也包含适于形成冻干“饼”的适量填充剂和摩尔渗透压浓度调节剂。填充剂可以是晶形(例如甘露醇、甘氨酸)或非晶形(例如蔗糖，诸如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等聚合物)。其它示例性的填充剂包含乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。在一个实施方案中，填充剂是甘露醇。在另一个实施方案中，掺入的填充剂浓度为约0％至约10％(重量体积比)。在另一个实施方案中，掺入的填充剂浓度为至少0.2％、0.5％、0.7％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％或9.5％(重量体积比)。在又一个实施方案中，浓度为约1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％至5.0％(重量体积比)，以产生机械上和药学上稳定和美观的饼。在另一个实施方案中，甘露醇浓度为4％(重量体积比)。

表面活性剂
蛋白质分子高度倾向于与表面相互作用，使之在气-液、瓶-液和液-液(硅油)界面上易于吸附和变性。已经观察到这样的降解途径可因蛋白质浓度而逆转，导致形成可溶和不溶性蛋白质聚集物或通过吸附到表面而损失溶液的蛋白质。除了容器表面吸附之外，物理搅拌加剧了表面引起的降解，正如在运输和处理产品期间所经历的那样。

表面活性剂常用于蛋白质制剂，以防表面引起的降解。表面活性剂是两亲性分子，具有向外竞争(out-competing)蛋白质界面位置的能力。表面活性剂分子疏水部分占据界面位置(例如气/液)，而分子的亲水部分保持朝向大量溶剂的方向。在足够浓度(通常约为去垢剂临界胶束浓度)时，表面活性剂分子表层起到保护蛋白质分子以免吸附到界面上的作用。因此，表面引起的降解最小化。最常用的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯，即聚山梨酯20和聚山梨酯80(例如



)。这两种仅在脂族链长度上不同，分别赋予C-12和C-18分子不同的疏水性。因此，比起聚山梨酯-20，聚山梨酯-80更具有表面活性，并具有更低的临界胶束浓度。表面活性剂泊洛沙姆188也已用于几种市售液体产品，例如果纳芬注射剂(Gonal-

)、诺德人体生长激素

和

去垢剂也可影响蛋白质的热力学构象稳定性。在此，给定赋形剂的影响也具有蛋白质特异性。例如，已知聚山梨酯能降低某些蛋白质的稳定性并增加其它蛋白质的稳定性。去垢剂引起的蛋白质不稳定的原因可解释为去垢剂分子的疏水尾参与与部分或全部未折叠蛋白质态的特异性结合。这些相互作用类型可使构象平衡朝更扩展的蛋白质状态方向移动(即增加蛋白质分子疏水部分的暴露补充与聚山梨酯的结合)。或者，通过蛋白质天然状态展示一些疏水表面时，去垢剂与天然状态的结合可稳定其构象。

聚山梨酯的另一方面是它们对氧化降解天然敏感。通常，作为原料，它们含有足量的过氧化物，能引起蛋白质残基侧链、尤其是甲硫氨酸的氧化。因添加稳定剂而导致的氧化性损伤力，强调了以下观点制剂中应当使用最低有效浓度的赋形剂。对于表面活性剂，给定蛋白质的有效浓度将会取决于稳定机制。推测如果表面活性剂的稳定机制与阻止表面变性有关的话，有效浓度应当约为去垢剂的临界胶束浓度。相反，如果稳定机制与特定蛋白质-去垢剂相互作用有关的话，表面活性剂有效浓度将与蛋白质浓度和相互作用的化学计量相关(Randolph T.W.等，Pharm Biotechnol.，13159-75(2002))。

也可以加入适量的表面活性剂，以防冷冻和干燥期间的表面相关聚集现象[Chang，B，J.Pharm.Sci.851325，(1996)]。示例性的表面活性剂包含阴离子型、阳离子型、非离子型、两性离子型和兼性表面活性剂，包括来自天然氨基酸的表面活性剂。阴离子型表面活性剂包含但不限于十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和二辛基磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、去氧胆酸钠和脱氧甘胆酸钠盐。阳离子型表面活性剂包含但不限于苯扎氯铵或苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓一水合物和溴化十六烷基三甲基铵。两性离子型表面活性剂包含但不限于CHAPS、CHAPSO、SB3-10和SB3-12。非离子型表面活性剂包含但不限于洋地黄皂苷、曲通X-100、曲通X-114、吐温-20和吐温-80。在另一个实施方案中，表面活性剂包含聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯40、60、65和80、大豆卵磷脂和其它磷脂(例如DOPC、DMPG、DMPC和DOPG)；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。因此还提供包含这些表面活性剂的组合物，无论是单独的或不同比例的混合物。在一个实施方案中，掺入的表面活性剂浓度为约0％至约5％(重量体积比)。在另一个实施方案中，掺入的表面活性剂浓度为至少0.001％、0.002％、0.005％、0.007％、0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％或4.5％(重量体积比)。在另一个实施方案中，掺入的表面活性剂浓度为约0.001％至约0.5％(重量体积比)。在又一个实施方案中，掺入的表面活性剂浓度为约0.004％、0.005％、0.007％、0.01％、0.05％或0.1％(重量体积比)至约0.2％(重量体积比)。在又一个实施方案中，掺入的表面活性剂浓度为约0.01％至约0.1％(重量体积比)。

盐
通常添加盐以增加制剂的离子强度，这对蛋白质溶解度、物理稳定性和等渗性而言是重要的。盐可以多种方式影响蛋白酶的物理稳定性。离子可稳定蛋白质的天然状态，即通过与蛋白质表面带电荷的残基结合。或者，它们可稳定变性状态，即通过与沿蛋白质主链的肽基(-CONH-)结合。盐也可稳定蛋白质的天然构象，即通过掩蔽蛋白质分子内残基间相互排斥的静电作用。蛋白质制剂的电解质也能掩蔽蛋白质分子间相互吸引的静电作用，这样的作用会导致蛋白质聚集和不溶性。

盐对蛋白质稳定性和溶解度的影响因离子种类不同而明显不同。源于1880年代的感胶离子序列作为电解质根据其沉淀蛋白质的能力而分类的一种方式(Cacace M.G.等，Quarterly Reviews ofBiophysics.，30(3)241-277(1997))。在该报告中，感胶离子序列用于说明离子型和非离子型共溶质影响蛋白质稳定性的程度。在表C中，按照共溶质对溶液态蛋白质的一般性影响将其分类排列，从稳定(离液序列低的(kosmotropic))到不稳定(离液序列高的(chaotropic))。一般而言，阴离子型中的效果差异远远大于阳离子型中的差异，并且对于这两类而言，在高于胃肠外制剂可接受浓度时效果最明显。高浓度的减溶剂(kosmotrope)(例如>1摩尔浓度的硫酸铵)常用于使蛋白质从溶液中沉淀出来，即通过“盐析”工艺，其中减溶剂优先排除在蛋白质表面之外，降低了天然(折叠)构象蛋白质的溶解度。去除或稀释盐，将会使蛋白质恢复成溶液。术语“盐溶”是指使用去稳定离子(例如胍和氯离子)来增加蛋白质溶解度，即通过使蛋白质主链肽键溶剂化。增加离液剂(chaotrope)的浓度有利于蛋白质的变性(未折叠)状态构象，因为肽链溶解度增加。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了它们在感胶离子序列中的位置。

为了维持胃肠外制剂的等渗性，对于单价离子组合，盐浓度通常限制在小于150mM。在该浓度范围内，盐稳定机制可能是因为屏蔽分子内的静电排斥力或分子间的静电吸引力(Debye-Huckel屏蔽)。有趣的是，通过该机制，比起同样浓度的减溶剂，离液盐(chaotropic salt)表现出对稳定蛋白质结构表现出更有效。认为离液序列高的(chaotropic)阴离子比离液序列低的(kosmotropic)离子具有更强的结合。对于共价蛋白质降解，离子强度对该机制的不同效应预期通过Debye-Huckel理论。因此，有关氯化钠使蛋白质稳定的已公开的报告都伴有氯化钠加速的共价降解。盐影响蛋白质稳定性的机制是蛋白质特异性的，可因溶液pH的不同而有显著不同。赋形剂用于有效递送蛋白质药物的实例是一些高浓度抗体制剂的那些。目前，盐已经显示出能有效降低这类制剂的粘度(Liu J.等，J.Pharm Sci.，94(9)1928-40(2005)；Erratum inJ Pharm Sci.，95(1)234-5.(2006))。
表C盐的感胶离子序列

氨基酸
已经发现氨基酸在蛋白质制剂中作为缓冲剂、填充剂、稳定剂和抗氧化剂的多方面用途。组氨酸和谷氨酸在蛋白质制剂中分别用于将pH范围缓冲在5.5-6.5和4.0-5.5之间。组氨酸咪唑基的pKa＝6.0，而谷氨酸侧链羧基的pKa为4.3，使它们适用于缓冲各自的pH范围。乙酸是酸性pH范围为4.0-5.5的最常用缓冲剂，在冻干期间会升华，因而不应用于冻干制剂。谷氨酸在这些情况下特别有用(例如

组氨酸常用于市售蛋白质制剂(例如



)。它是柠檬酸的良好替代物，已知柠檬酸是在注射中具有针刺感的缓冲剂。有趣的是，也有报道称，当在液体和冻干形式中高浓度使用时会聚集的情况下，组氨酸对ABX-IL8(一种IgG2抗体)具有稳定效应(Chen B等，Pharm Res.，20(12)1952-60(2003))。也观察到组氨酸(至多60mM)能降低该抗体的高浓度制剂的粘度。然而，在同样的研究中，在不锈钢容器中进行含组氨酸制剂的抗体冻-融研究期间，作者观察到聚集增多和变色。作者将其归结于从不锈钢容器腐蚀中逸出的铁离子的作用。对于组氨酸，另一个要注意的是，当存在金属离子时它经历光氧化(Tomita M等，Biochemistry，8(12)5149-60(1969))。在制剂中用甲硫氨酸作抗氧化剂看来很有前途；已观察到它能有效针对各种氧化问题(Lam XM等，JPharm Sci.，86(11)1250-5(1997))。

已知氨基酸甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可通过优先排阻机制来稳定蛋白质，甘氨酸在冻干制剂(例如



)中也是常用的填充剂。它从冷冻的非晶相中结晶析出，得到饼结构和松散结构。已知精氨酸在抑制聚集中是一种有效试剂，已用于液体和冻干制剂(例如



液体)。此外，在精氨酸存在下某些蛋白质的重折叠效率增加，这已归结于它对重折叠期间的竞争性聚集反应的抑制。

抗氧化剂
蛋白质残基的氧化来自各种来源。除了添加特定抗氧化剂之外，对蛋白质的氧化性损伤的预防涉及到对整个产品制造工艺和贮存期间各种因素的谨慎控制，例如大气氧、温度、光照和化学污染。最常用的药用抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂或螯合剂。治疗用蛋白质制剂中的抗氧化剂必须是水溶性的，在整个产品货架期都保持活性。还原剂和氧/自由基清除剂是通过去除溶液中的活性氧而起作用的。螯合剂例如EDTA通过与促进自由基形成的痕量金属污染物结合而起作用。例如，EDTA用于酸性成纤维细胞生长因子的液体制剂，以抑制金属离子催化的半胱氨酸残基的氧化。EDTA已经用于市售产品，例如

和

除了评价各种赋形剂对阻止蛋白质氧化的有效性之外，制剂科学家必须注意抗氧化剂本身引起蛋白质的其它共价或物理变化的潜力。文献中已报道各种这类情况。还原剂(例如谷胱甘肽)可引起分子内二硫键断裂，从而引起二硫键破坏(disulfideshuffling)。在过渡金属离子存在下，已知抗坏血酸和EDTA能促进各种蛋白质和肽中的甲硫氨酸氧化(Akers MJ和Defelippis MR.Peptides and Proteins as Parenteral Solutions.载于PharmaceuticalFormulation Development of Peptides and Proteins.Sven Frokjaer，LarsHovgaard主编.Pharmaceutical Science.Taylor and Francis，UK(1999))；Fransson J.R.，J.Pharm.Sci.86(9)4046-1050(1997)；Yin J等，Pharm Res.，21(12)2377-83(2004))。已经报道在rhuMab HER2中，硫代硫酸钠能降低光照和温度引起的甲硫氨酸-氧化水平；然而，在该项研究中也报道了硫代硫酸酯-蛋白质加合物的形成(LamXM，Yang JY等，J Pharm Sci.86(11)1250-5(1997))。按照蛋白质的具体情况和敏感性来选择合适的抗氧化剂。

金属离子
一般而言，在蛋白质制剂中不希望含有过渡金属离子，因为它们可催化蛋白质的理化降解反应。然而，当特定金属离子是蛋白质的辅因子时，制剂中可含有它们；而且当它们形成配位化合物(例如胰岛素的锌混悬液)时，蛋白质的混悬制剂中也可含有它们。目前，已经报道使用镁离子(10-120mM)能抑制天冬氨酸异构化而形成异天冬氨酸(WO 2004039337)。

金属离子赋予蛋白质稳定性或增加活性的两个实例是人脱氧核糖核酸酶(rhDNase，

)和因子VIII。就rhDNase而言，Ca+2离子(至多100mM)通过特异性结合位点增加酶的稳定性(Chen B等，JPharm Sci.，88(4)477-82(1999))。事实上，从含有EGTA的溶液中去除钙离子，会增加脱氨基作用和聚集。然而，仅在Ca+2离子的情况下观察到该作用；观察到其它二价阳离子-Mg+2、Mn+2和Zn+2使rhDNase不稳定。在因子VIII中也观察到同样作用。Ca+2和Sr+2离子使蛋白质稳定，而Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2等其它离子却使酶不稳定(Fatouros，A.等，Int.J.Pharm.，155，121-131(1997)。在用因子VIII的一项独立研究中，当存在Al+3离子时观察到聚集率明显增加(Derrick TS等，J.Pharm.Sci.，93(10)2549-57(2004))。作者注意到其它赋形剂例如缓冲盐常受到Al+3离子污染，表明在制剂产品中需要使用合适质量的赋形剂。

防腐剂
当开发多次使用的胃肠外制剂时需要使用防腐剂，因为这样使用会从同一容器中不止一次地取出制剂。其基本作用是抑制微生物生长并确保药物产品在整个货架期或药物产品使用期内是无菌的。常用防腐剂包含苯甲醇、苯酚和间甲苯酚。尽管防腐剂使用历史很长，但是开发含防腐剂的蛋白质制剂仍是一个挑战。防腐剂对蛋白质通常具有去稳定效应(聚集)，这是限制其在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素(Roy S等，J Pharm Sci.，94(2)382-96(2005))。

迄今为止，大多数蛋白质药物都配制成仅供单次使用。然而，当需要多剂量制剂时，它们具有可增加患者的方便性并提高可销售性的优势。一个良好实例就是人生长激素(hGH)，其可保存制剂的开发导致更方便的多次使用注射笔的商品化。这些含hGH的可保存制剂的至少4类笔装置目前市场上有售。诺德人体生长激素

(液体制剂，Novo Nordisk)、Nutropin

(液体制剂，Genentech)& Genotropin(冻干-双室针筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而

(Eli Lilly)含有间甲苯酚。

在可保存剂型的制剂开发过程中要考虑若干方面。药品中有效的防腐剂浓度必须优化。这需要检测给定防腐剂在剂型中的浓度范围，既要赋予抗微生物的有效性，又不降低蛋白质稳定性。例如，在开发白介素-1受体(I型)液体制剂中，采用差示扫描量热法(DSC)成功筛选出3种防腐剂。按照防腐剂在市售产品中常用浓度时对稳定性的影响，将其分类(Remmele RL Jr.等，Pharm Res.，15(2)200-8(1998))。

正如所预期的，开发含防腐剂的液体制剂比开发冻干制剂更具挑战性。冻干产品可在不含防腐剂时冻干，使用时再用含防腐剂的稀释剂重配。这明显缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，并使相关的稳定性风险降至最低。对于液体制剂，必须在整个产品货架期(～18-24个月)维持防腐剂的有效性和稳定性。要注意的一个要点是，必须在含有活性药物和所有赋形剂成分的终制剂中证明防腐剂的有效性。

一些防腐剂可引起注射部位的反应，这是选择防腐剂时必须考虑的另一因素。在集中评价诺德人体生长激素中的防腐剂和缓冲剂的临床试验中，与含间甲苯酚的制剂相比，在含苯酚和苯甲醇的制剂中观察到痛感较低(Kappelgaard A.M.，Horm Res.62Suppl398-103(2004))。有趣的是，在常用防腐剂中，苯甲醇具有麻醉性(Minogue SC和Sun DA.，Anesth Analg.，100(3)683-6(2005))。

根据本文所提供的说明和指南，本领域技术人员将会知道任何具体制剂中含有的赋形剂的数量或范围，以得到本发明生物药物制剂，其能促进保留生物药物的稳定性。例如，可以根据终溶液所含盐的所需摩尔渗透压浓度(即等渗、低渗或高渗)以及制剂所含其它成分的数量和摩尔渗透压浓度，选择本发明生物药物制剂中含有的盐的数量和种类。同样，以制剂含有多元醇或糖的种类为例，这类赋形剂的数量将取决于其摩尔渗透压浓度。

举例来说，含有约5％山梨醇可达到等渗，而需要约9％蔗糖赋形剂可达到等渗。本发明生物药物制剂所含的一种或多种赋形剂的浓度值或范围的选择可以以上述盐、多元醇和糖为例。然而，本领域技术人员将会知道，本文所述的考虑和具体赋形剂的更多实例同样可用于所有类型的赋形剂及其组合，包括例如盐、氨基酸、其它张力调节剂、表面活性剂、稳定剂、填充剂、冷冻防护剂、冻干防护剂、抗氧化剂、金属离子、螯合剂和/或防腐剂。

此外，尽管已报道了制剂中具体赋形剂的百分比(％)(重量体积比)，本领域技术人员将会知道，也包括赋形剂的当量摩尔浓度。

当然，本领域普通技术人员将会知道，在具体制剂中的上述赋形剂的浓度是互相依存的。举例来说，当例如具有高蛋白/肽浓度或者当例如具有高稳定剂浓度时，可以降低填充剂浓度。另外，本领域技术人员将会知道，为了维持无填充剂的具体制剂的等渗性，稳定剂的浓度可随之调整(即可使用“张力调节量”的稳定剂)。

组合物在2℃至8℃的冻干状态下、在至少2年内是稳定的。这种长期稳定性对延长药品货架期是有利的。

制备方法
本发明还包括治疗用蛋白质制剂的制备方法。一方面，冻干治疗用肽体制剂的制备方法包括将在缓冲液中的治疗用肽体组合物冻干的步骤，该缓冲液包含缓冲剂、填充剂、稳定剂和表面活性剂；
本发明的方法还包括一个或多个以下步骤冻干之前将稳定剂加到所述混合物中，冻干之前将至少一种选自填充剂、摩尔渗透压浓度调节剂和表面活性剂的试剂加到所述混合物中。填充剂可以是本文所述的任何填充剂。一方面，填充剂是甘露醇。在另一个实施方案中，稳定剂是蔗糖。表面活性剂可以是本文所述的任何表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯-20。

冻干材料的标准重配实践是用纯水或无菌注射用水(WFI)加回到原体积(通常等于冻干期间除去的体积)，尽管抗细菌药物的稀释液有时用于制备供胃肠外给药的药物[Chen，DrugDevelopment and Industrial Pharmacy，181311-1354(1992)]。因此，提供重配的治疗用肽体的制备方法，包括将稀释剂加到本发明冻干治疗用肽体组合物中的步骤。

冻干治疗用肽体组合物可重配为含水溶液剂。无菌注射用水、用于多剂量使用的含防腐剂的水、或含适量表面活性剂(例如聚山梨酯-20)的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等各种含水载体或含水混悬剂可含有活性化合物以及适于制备含水混悬剂的赋形剂。在各方面，这类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧乙烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚环氧乙烷硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七烷乙烯氧十六烷醇(heptadecaethyl-eneoxy cetanol))、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。含水混悬剂也可含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

一方面，为了将组合物给予人或试验动物，组合物应当包含一种或多种药学上可接受的载体。术语“药学上”或“药理学上可接受的”是指当用下述本领域众所周知的途径给予时，能抑制蛋白质降解例如聚集和裂解产物、而且不产生过敏或其它不良反应的稳定的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床使用的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等，包括以上公开的那些试剂。

治疗用肽体组合物可经口服、局部、经皮、胃肠外、吸入喷雾、阴道、直肠或颅内注射给药。本文所用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。经静脉内、真皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射给药和/或手术植入特定部位给药都包括在内。一般而言，组合物必须不含热源和对受体有害的其它杂质。

可单次或多次给予组合物，由主治医师选择剂量水平和模式。对于预防或治疗疾病而言，合适剂量将取决于如上定义的所治疗疾病的种类、疾病的严重程度和进程、给予药物是用于预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者临床史和对药物的反应，以及主治医师的判断。

药盒
作为额外方面，本发明包括含一种或多种冻干化合物或组合物的药盒，其包装方式便于给予患者。在一个实施方案中，这类药盒含有本文所述的化合物或组合物(例如含治疗用蛋白质或肽的组合物)，其包装在密封瓶或管等容器中，描述在实施方法时化合物或组合物的用途的标签贴在容器上或放在包装内。在一个实施方案中，药盒包含装有冻干治疗用蛋白质或肽组合物的第一容器和装有用于冻干组合物的生理上可接受的重配溶液的第二容器。一方面，化合物或组合物按单位剂型包装。药盒还可包含适于按照特定给药途径给予组合物的装置。优选药盒含有描述治疗用蛋白质或肽组合物用途的标签。

剂量
由主治医师考虑改变药物活性的各种因素，来确定治疗本文所述疾病的方法所涉及到的剂量方案，所述因素例如患者年龄、状况、体重、性别和饮食、感染的严重程度、给药时间和其它临床因素。在各方面，每日方案的范围为0.1-1000μg制剂/千克体重(只计算蛋白质量，不计化学修饰)或0.1-150μg/kg。在本发明的一些实施方案中，剂量可超过1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg。

可通过先推注、然后连续输注的方式给予本发明制剂，以维持药物的治疗性循环水平。作为另一个实例，可以一次剂量给予本发明化合物。按照良好医学实践和各患者的临床情况，本领域普通技术人员容易优化有效剂量和给药方案。给药频率取决于药物的药代动力学参数和给药途径。本领域技术人员将根据给药途径和所需剂量确定最佳药物制剂。参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)第1435-1712页，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。这类制剂可影响所给予药物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。根据给药途径，可按照体重、体表面积或器官大小计算合适剂量。对于涉及上述各制剂的治疗而言，本领域普通技术人员无需过多实验，就可常规进行确定合适剂量所需的更精细计算，尤其是根据本文所公开的剂量信息和测定、以及以上讨论的人体临床试验中所观察到的药代动力学数据。可以通过使用已知测定，测定血液水平剂量以及合适的剂量反应数据，来确定合适剂量。最终剂量方案将由主治医师在考虑改变药物作用的各因素后做出决定，所述因素例如药物的比活、损伤的严重程度和患者的反应性、患者年龄、状况、体重、性别和饮食、感染的严重程度、给药时间和其它临床因素。随着研究的进行，将会出现有关对各种疾病和病症的合适剂量水平和治疗持续时间的更多信息。

化合物的结构
概述。在本发明的制备中，通过肽的N-端、肽的C-端或这两者将肽与载体连接起来，所得结构还可用共价连接的WSP进一步修饰，该WSP与载体-肽产物上的载体部分相连接。因此，本发明的治疗用肽体分子可用下式I来描述 I[(X1)a-F1-(X2)b]-(L1)c-WSPd 其中 F1为载体； X1选自 P1-(L2)e- P2-(L3)f-P1-(L2)e- P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e-和 P4-(L5)h-P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e- X2选自 -(L2)e-P1， -(L2)e-P1-(L3)f-P2， -(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3和 -(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3-(L5)h-P4 其中P1、P2、P3和P4各自独立为药理学活性肽序列； L1、L2、L3、L4和L5各自独立地为接头； a、b、c、e、f、g和h各自独立地为0或1， 前提条件是a和b中至少有一个为1； d为0、1或大于1；和 WSP为水溶性聚合物，其连接在F1的任何活性部分上。

因此，化合物I包含下式化合物及其多聚体 II[X1-F1]-(L1)c-WSPd 其中F1为Fc区，连接在X1的C-端，而一个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1； III[F1-X2]-(L1)c-WSPd 其中F1为Fc区，连接在X2的N-端，而一个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1； IV[F1-(L1)c-P1]-(L1)c-WSPd 其中F1为Fc区，连接在-(L1)c-P1的N-端，而一个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1；和 V[F1-(L1)e-P1-(L2)f-P2]-(L1)c-WSPd 其中F1为Fc区，连接在-L1-P1-L2-P2的N-端，而一个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。

在一个实施方案中，F1为Fc区，并连接在肽的N-端或C-端。在一个相关实施方案中，Fc连接成本文所述的二聚体形式，其上连接2个(或更多个)肽。肽可以是同型二聚体(即相同氨基酸序列)或异型动力学结构(即不同氨基酸序列结合同一靶标或结合不同靶标)。

在另一个实施方案中，提供含Fc-环的肽。在以下过程中制备含有Fc-环的肽其中掺入至少一种生物活性肽作为Fc区的内部序列。可通过插入(即在先前存在的Fc区的氨基酸之间)或通过替代先前存在的Fc区的氨基酸(即除去先前存在的Fc区的氨基酸并给肽添加氨基酸)而添加这类内部序列。在后一种情况下，所添加的肽的氨基酸数量不必相当于从先前存在的Fc区去除的氨基酸数量。例如，一方面，提供除去10个氨基酸并添加15个氨基酸的分子。通过包含以下的步骤制备所提供的药理学活性化合物a)选择能调节目标蛋白活性的至少一种肽；和b)制备药理学药物，其包含所选肽的氨基酸序列作为Fc区的内部序列。该方法可用于修饰Fc区，该区已通过N-端或C-端或侧链与肽连接，例如参见美国专利申请号2003/0195156、2003/0176352、2003/0229023和2003/0236193和国际公布号WO 00/24770和WO 04/026329。美国专利申请公布号US2006/0140934中描述的方法也可用于修饰作为抗体组成部分的Fc区。这样，可产生具有额外功能性的不同分子，例如结合结构域连接不同表位或额外结合结构域连接前体分子已有表位。包含内部肽序列的分子也称为“Fc内部肽体”或“Fc内部肽分子”。

Fc内部肽分子可包含在一个特定内部区串联的不止一个肽序列，而且它们在其它内部区还可包含更多肽。尽管优选推定的环区，但任何其它Fc非末端结构域中的插入也包括在本发明的组成部分中。上述化合物的变异体和衍生物(如下所述)也包括在本发明中。

可通过标准合成方法、重组DNA技术或制备肽和融合蛋白的任何其它方法制备本发明化合物。

包括Fc内部肽分子的用途是作为治疗药或预防药。一个所选肽可具有与肽所模拟的天然配体相当或甚至高于天然配体的活性。另外，某些基于天然配体的治疗药可诱导针对患者本身内源性配体的抗体。相比之下，连接载体的肽的独特序列避免了该缺陷，即通过与天然配体几乎没有或通常没有序列同一性。此外，Fc内部肽体在重折叠和纯化N-端或C-端连接的Fc分子上具有优势。再者，Fc内部肽体在热力学和化学上可更稳定，前者因为嵌合结构域的稳定化，而后者因为增加对氨肽酶和羧肽酶的蛋白酶降解的抵抗性。Fc内部肽体也可表现出改善的药代动力学特性。

肽。任何数量的肽都可与本发明联用。特别感兴趣的是模拟以下物质活性的肽EPO、TPO、生长激素、G-CSF、GM-CSF、IL-1ra、CTLA4、TRAIL、TNF、VEGF、MMP、肌肉生长抑素、整联蛋白、OPG、OPG-L、NGF、TALL-1、Ang-2结合配偶体、TGF-α和TGF-β。肽拮抗剂也令人感兴趣，尤其是对TNF、任一种白介素(IL-1、2、3、...)和参与补体激活的蛋白质(例如C3b)的活性具有拮抗作用的那些。目标肽也令人感兴趣，包括肿瘤归巢肽、膜转运肽等。所有这些类型的肽都可通过本说明书中引用的参考文献和其它参考文献中描述的方法来发现。

具体地讲，噬菌体展示可用于产生肽，用于本发明。据称从随机肽文库进行亲和性选择可用于鉴定肽配体，用于任何基因产物的任何位点。Dedman等(1993)，J.Biol.Chem.26823025-30。噬菌体展示特别适于鉴定能结合这类作为细胞表面受体的目标蛋白或具有线状表位的任何蛋白质的肽。Wilson等(1998)，Can.J.Microbiol.44313-29；Kay等(1998)，Drug Disc.Today3370-8。这类蛋白质的一般性综述可参见Herz等(1997)，J.Receptor & SignalTransduction Res.17(5)671-776，所述文献通过引用结合到本文中。这类目标蛋白优选用于本发明。

提供了例如但不限于能结合细胞因子受体的一组肽。目前，细胞因子按其受体编码来分类。参见Inglot(1997)，Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45353-7，其通过引用结合到本文中。这些受体是CKR(下表3中的家族I)。受体分类见下表3。
表3-按受体编码分类的细胞因子受体

1IL-17R属于CKR家族，但未归类到4个指定的亚家族中。
2其它IFN I型的各亚型仍未归类。造血细胞因子、IL-10配体和干扰素没有功能性固有的蛋白激酶。细胞因子的信号转导分子是JAK’s、STAT和相关非受体分子。IL-14、IL-16和IL-18已经克隆，但根据受体编码，它们仍未归类。
3TNF受体用多个不同的胞内分子，用于信号转导，包括FAS R的“死亡结构域”和参与其细胞毒效应的55kDa的TNF-R。NGF/TNF R可结合NGF和相关因子以及TNF配体。趋化因子受体是7个跨膜(7TM，蛇根碱(serpentine))结构域受体。它们是G蛋白偶联的。
4Duffy血型抗原(DARC)是红细胞受体，其可结合一些不同的趋化因子。IL-1R属于免疫球蛋白超家族，但它们的信号转导事件特征尚不清楚。
5神经营养性细胞因子与NGF/TNF受体有关 6STKS可包括许多其它未归类的TGF-β相关因子。蛋白激酶是受体激酶家族(RKF)的胞内结构域的固有部分。这些酶参与通过受体的信号传递。

作为本发明肽产生的靶标的其它目标蛋白包括以下 αvβ3 αVβ1 Ang-2 B7 B7RP1 CRP1 降钙素 CD28 CETP cMet 补体因子B C4b CTLA4 高血糖素 高血糖素受体 LIPG MPL 在肿瘤细胞上优先表达的分子的剪接变异体；例如CD44、CD30 粘蛋白和路易斯(Lewis)Y表面糖蛋白的未糖基化变异体 CD19、CD20、CD33、CD45 前列腺特异性膜抗原和前列腺特异性细胞抗原 基质金属蛋白质酶(MMP)，分泌型和膜结合型(例如MMP-9) 组织蛋白酶 TIE-2受体 乙酰肝素酶 尿激酶纤溶酶原激活物(UPA)、UPA受体 甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、PTH-RI、PTH-RII Her2 Her3 胰岛素 肌肉生长抑素 TALL-1 神经生长因子 整联蛋白和受体 选择蛋白及其受体 细胞粘附分子及其受体。

示例性的肽见下表4-38。这些肽可通过本领域公开的任何方法来制备，本文已讨论了许多这样的方法。在大多数以下表格中，使用单字母氨基酸缩写。这些序列(和本说明书全文，除非在具体情况下另有说明)中的“X”是指可存在任何20种天然氨基酸残基。任何这些肽可串联(即序贯)，有或没有接头，而且表中提供了少数串联实例。接头表示为“Λ”并且可以是任何本文所述的接头。串联重复序列和接头为了清楚起见用虚线分开。含半胱氨酰残基的任何肽都可与另一含Cys的肽交联，这两个肽中的一个或两者都与载体连接。表格中提供了少数交联实例。任何含有不止一个Cys残基的肽也可形成肽内二硫键；参见例如下表5中的EPO-模拟肽。肽内二硫键连接的肽的少量实例见下表。任何这些肽都可按照本文所述而衍生，下表中提供了少量衍生实例。下表中的衍生肽是示例性而非限制性的，因为结合的未衍生肽也可用于本发明。对于羧基端被氨基封端的衍生物而言，封端氨基如-NH2所示。对于氨基酸残基被非氨基酸残基部分取代的衍生物而言，取代表示为σ，这表示以下文献所述的任何部分Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9和Cuthbertson等(1997)，J.Med.Chem.402876-82，所述文献通过引用结合到本文中。J取代基和Z取代基(Z5、Z6、...Z40)如美国专利号5,608,035、5,786,331和5,880,096所定义，所述文献通过引用结合到本文中。对于EPO-模拟序列(表5)，取代基X2-X11和整数“n”如WO 96/40772所定义，所述文献通过引用结合到本文中。对于EPO-模拟序列，取代基Xna、X1a、X2a、X3a、X4a、X5a和Xca分别遵循WO99/47151中对Xn、X1、X2、X3、X4、X5和Xc的定义，所述文献也通过引用结合到本文中。取代基“Ψ”、“Θ”和“+”如以下文献所定义Sparks等(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.931540-4，所述文献通过引用结合到本文中。X4、X5、X6和X7如美国专利号5,773,569所定义，所述文献通过引用结合到本文中，例外的是对于整联蛋白-结合肽，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8如国际申请WO95/14714(1995年6月1日公布)和WO 97/08203(1997年3月6日公布)所定义，所述文献也通过引用结合到本文中；和对于VIP-模拟肽，X1、X1′、X1＂、X2、X3、X4、X5、X6和Z和整数m和n如WO97/40070(1997年10月30日公布)所定义，所述文献也通过引用结合到本文中。以下Xaa和Yaa如WO 98/09985(1998年3月12日公布)所定义，所述文献通过引用结合到本文中。AA1、AA2、AB1、AB2和AC如国际申请WO 98/53842(1998年12月3日公布)所定义，所述文献通过引用结合到本文中。仅在表17中的X1、X2、X3和X4如欧洲申请EP 0 911 393(1999年4月28日公布)所定义。黑体形式的残基是D-氨基酸。所有肽都通过肽键连接，除非另有说明。缩略语见本说明书结尾处。在“SEQ ID NO.”栏中，“NR”是指对给定序列不需要序列表。
表4-IL-1拮抗剂肽序列 表5-EPO-模拟肽序列

表6-TPO-模拟肽序列

表7-G-CSF-模拟肽序列 表8-TNF-拮抗剂肽序列
表9-整联蛋白-结合肽序列 表10-选择蛋白拮抗剂肽序列 表11-抗病原性肽序列 表12-VIP-模拟肽序列


表13-Mdm/hdm拮抗剂肽序列 表14-钙调蛋白拮抗剂肽序列 表15-肥大细胞拮抗剂/肥大细胞蛋白酶抑制剂肽序列 表16-SH3拮抗剂肽序列 表17-生长抑素或皮质抑素模拟肽序列 表18-UKR拮抗剂肽序列 表19-巨噬细胞和/或T细胞抑制肽序列 表20-另外的示例性药理学活性肽 表21-肌肉生长抑素抑制剂肽 表22-肌肉生长抑素抑制剂肽 表23-肌肉生长抑素抑制剂肽 表24-肌肉生长抑素抑制剂肽 表25-整联蛋白-拮抗剂肽序列 表26-选择蛋白拮抗剂肽序列 表27-粘着斑蛋白结合肽 表28-层粘连蛋白相关肽序列 表29-NGF调节肽 表30-TALL调节肽 表31-TALL-1抑制性肽体 表32-ANG-2抑制剂肽 表33-ANG-2抑制剂肽 表34-ANG-2抑制剂肽 表35-ANG-2抑制剂肽 表36-Ang-2结合肽 表37-Ang-2结合肽 表38-Ang-2结合肽
除了表6所示的TMP化合物之外，本发明还提供许多其它的TMP化合物。一方面，TMP化合物包含以下通用结构 TMP1-(L1)n-TMP2 其中TMP1和TMP2各自独立选自含有以下核心结构的化合物及其生理上可接受的盐 X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10， 其中， X2选自Glu、Asp、Lys和Val； X3选自Gly和Ala； X4为Pro； X5选自Thr和Ser； X6选自Leu、Ile、Val、Ala和Phe； X7选自Arg和Lys； X8选自Gln、Asn和Glu； X9选自Trp、Tyr和Phe； X10选自Leu、Ile、Val、Ala、Phe、Met和Lys； L1为本文所述的接头；和 n为0或1。

在一个实施方案中，L1包含(Gly)n，其中n为1-20，而且当n大于1时，至多一半的Gly残基可被选自剩余19种天然氨基酸或其立体异构体的另一种氨基酸取代。

除了以上TMP1和TMP2所提出的核心结构X2-X10之外，其它相关结构也有可能，其中一个或多个以下基团加到TMP1和/或TMP2核心结构中X1连接到N-端和/或X11、X12、X13和/或X14连接到C-端，其中X1、X12、X13和X14定义如下 X1选自Ile、Ala、Val、Leu、Ser和Arg； X11选自Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Ser、Thr、Lys、His和Glu； X12选自Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Gly、Ser和Gln； X13选自Arg、Lys、Thr、Val、Asn、Gln和Gly；and X14选自Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Thr、Arg、Glu和Gly。

本发明的TMP化合物包含至少9个亚基(X2-X10)或由这9个亚基组成，其中X2-X10包含核心结构。X2-X14亚基是独立选自20种天然氨基酸的氨基酸，然而，本发明包含这样的化合物其中X2-X14独立选自本领域众所周知的非典型、非天然氨基酸。每个位置上鉴定具体氨基酸。例如，X2可以是Glu、Asp、Lys或Val。本文采用氨基酸的三字母缩写和单字母缩写；在各种情况下，对20种天然氨基酸或其熟知的变形而言，使用标准缩写。这些氨基酸可具有L或D型立体化学结构(除了Gly之外，该氨基酸既不是L型也不是D型)，而TMP(以及本发明所有其它化合物)可包含立体化学组合。本发明还提供反向TMP分子(以及本文所公开的所有其它肽)，其中氨基酸从氨基端至羧基端的序列是反向的。例如，分子具有正常序列X1-X2-X3的反向分子就是X3-X2-X1。本发明还提供逆反向(retro-reverse)TMP分子(以及本文所述的本发明所有其它分子)，其中，与反向TMP相同，氨基酸从氨基端至羧基端的序列是反向的，而在TMP中通常为“L”对映体的残基变成“D”立体异构体形式。

因此，本发明示例性TMP化合物包括但不限于下列化合物 IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ.ID NO993)
IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA(线状) (SEQ.ID NO995) IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA(SEQ.ID NO996) IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO997) IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ.ID NO998) IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO999) IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAA RA (SEQ.ID NO1000) IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAA RA (SEQ.ID NO1001) IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1002) IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA | |IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1003) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ.ID NO1004) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1005) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ.ID NO1006) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc(SEQ.ID NO1007) Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ.ID NO1008) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1009) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA(线状)(SEQ.IDNO1011) Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA(SEQ.ID NO1012) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1013) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.IDNO1014) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1015)
Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA | Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1016) Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ.ID NO1017)
衍生物
本发明也包含将肽和/或化合物的载体部分进行衍生(如下文所讨论的)。这些衍生物可改进化合物的溶解度、吸收、生物半衰期等。这些部分还可消除或减少化合物的任何不良副作用等。示例性的衍生物包括下列化合物，其中 1.化合物或其某些部分为环状。例如，肽部分可修饰成含有两个或更多个Cys残基(例如在接头中)，其可因二硫键形成而环化。对于有关环状衍生物制备的参考文献的引用，参见表2。
2.化合物是交联的或赋予分子间交联能力。例如，肽部分可修饰成含有一个Cys残基，因此能够与类似分子形成分子间二硫键。化合物也可通过其C-端交联，正如以下所示分子那样。

3.一个或多个肽酰[-C(O)NR-]键被非肽酰键置换。示例性的非肽酰键是-CH2-氨基甲酸酯[-CH2-OC(O)NR-]、膦酸酯、-CH2-磺酰胺[-CH2-S(O)2NR-]、脲[-NHC(O)NH-]、-CH2-仲胺和烷基化肽[-C(O)NR6-，其中R6为低级烷基]。
4.N-端是衍生的。通常，N-端可以酰化或修饰成取代胺。示例性的N-端衍生基团包括-NRR1(而非-NH2)、-NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR1、琥珀酰亚胺或苄氧基羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R1各自独立地为氢或低级烷基，而其中苯环可以被1-3个选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氯和溴的取代基取代。
5.游离C-端是衍生的。通常，C-端被酯化或酰胺化。例如，可采用本领域所述方法将(NH-CH2-CH2-NH2)2加到本发明化合物上。同样，也可以采用本领域所述方法将-NH2加到本发明化合物上。示例性的C-端衍生基团包括例如-C(O)R2或-NR3R4，其中R2为低级烷氧基，R3和R4独立地为氢或C1-C8烷基(优选C1-C4烷基)。
6.一个二硫键被另一个、优选更稳定的交联部分(例如亚烷基)置换。参见例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9；Alberts等(1993)Thirteenth Am.Pep.Symp.，357-9。
7.一个或多个单个氨基酸残基被修饰。已知各种衍生剂能与所选侧链或末端残基发生特异性反应，如下文所详述。
8.杂双官能聚合物通常用于连接蛋白质。一个实例就是SMCC或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯。NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)用伯胺结束反应，其在pH～7时缀合是最佳的。一旦形成复合物，SMCC的马来酰亚胺部分可以与含有游离巯基的另一蛋白质/肽发生反应，其反应速度比起始反应中酰胺形成速度要快得多。结果是将两种蛋白质连接起来，例如抗体-酶缀合物。一个应用方法以制备交联Fab’片段与辣根过氧化物酶为例(Ishikwa等，1983a，b；Yoshitake等，1982a，b；Imagawa等，1982；Uto等，1991)。使用Sulfo SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯)可具有水溶性，这样就不需要有机增溶步骤，在与蛋白质的反应中允许更大的灵活性和较少破坏活性。

赖氨酰残基和氨基末端残基可以与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应，这可中和赖氨酰残基的电荷。用于衍生含α-氨基残基的其它合适试剂包含亚氨酸酯例如甲基吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氢硼化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊烷二酮；和氨基转移酶催化的与乙醛酸的反应。

精氨酰残基可以通过与任何一种常规试剂或若干种常规试剂的组合反应而修饰，所述试剂包含苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团具有高pKa。此外，这些试剂还可与赖氨酸以及精氨酸ε-氨基反应。

已经充分研究了酪氨酰残基的具体修饰，特别感兴趣的是向酪氨酰残基中引入光谱标记，即通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应。最常见的是N-乙酰咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰化合物和3-硝基衍生物。

羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰)可被选择性修饰，即通过与碳二亚胺(R＇-N＝C＝N-R′)反应，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰残基和谷氨酰残基可通过与铵离子反应转变为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基可以脱去酰氨基变为相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。或者，这些残基可以在温和的酸性条件下脱去酰氨基。这些残基的各种形式都落入本发明的范围之内。

半胱氨酰残基可以被氨基酸残基或其它部分置换，以消除二硫键或相反，以稳定交联。参见例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9。

用双官能剂进行的衍生可用于将肽或其官能性衍生物与水不溶性支持基质或与其它大分子载体交联。常用交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同型双官能型亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯(例如丙酸3，3＇-二硫双(琥珀酰亚胺基酯))和双官能性马来酰亚胺(例如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷)。衍生剂例如3-[(对叠氮苯基)二硫]亚氨丙酸甲酯产生光活化中间体，它能够在光照下形成交联。或者，活性水不溶性基质例如溴化氰-活化的碳水化合物和以下文献描述的活性物质都可用于蛋白质固定化美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440。

碳水化合物(寡糖)基团可方便地连接在蛋白质的已知糖基化位点上。一般而言，O-联低聚糖连接在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上，而N-联低聚糖连接在天冬酰胺(Asn)残基上，当它们作为序列Asn-X-Ser/Thr的组成部分时，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。X优选为除脯氨酸以外的19种天然氨基酸之一。N-联低聚糖和O-联低聚糖以及这两类糖残基的结构是不同的。这两类糖中常见的一种糖是N-乙酰基神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-联低聚糖和O-联低聚糖的末端残基，而且因其带有负电荷，可赋予糖基化化合物酸性。这类位点可以结合到本发明化合物的接头中，并且优选在重组产生多肽化合物期间由细胞进行糖基化(例如在哺乳动物细胞例如CHO、BHK、COS中)。然而，这类位点还可通过本领域已知的合成或半合成方法进一步糖基化。

其它可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，Cys硫原子的氧化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化。Creighton，ProteinsStructure andMolecule Properties(W.H.Freeman & Co.，San Francisco)，第79-86页(1983)。

也可在DNA水平上改变本发明的化合物。化合物任何部分的DNA序列都可改变成与所选宿主细胞更相容的密码子。对于优选的宿主细胞大肠杆菌而言，优化密码子是本领域已知的。可以替代密码子，以消除限制位点或包含沉默限制位点，这可有助于DNA在所选宿主细胞内的加工。载体、接头和肽DNA序列都可经修饰，以包含任何前述序列改变。

同位素-和毒素-缀合的衍生物。另一组有用的衍生物是将上述分子与毒素、示踪剂或放射性同位素缀合。这类缀合对于包含能与肿瘤细胞或病原体结合的肽序列的分子而言特别有用。这类分子可用作治疗药或用于辅助手术(例如放免导向的手术即RIGS)或作为诊断试剂(例如放免诊断即RID)。

作为治疗药，这些缀合的衍生物具有许多优势。它们促进了毒素和放射性同位素的使用，这些物质在未与肽序列特异性结合时就给予，是有毒的。它们也可减少在放疗和化疗中使用时的副作用，即通过使用更低有效剂量的缀合配偶体。

有用的缀合配偶体包括 ·放射性同位素，例如90钇、131碘、225锕和213铋； ·蓖麻毒蛋白A毒素、微生物源毒素例如假单胞菌内毒素(例如PE38、PE40)等； ·捕获系统中的配偶体分子(参见下文)； ·生物素、链霉抗生物素(在捕获系统中用作配偶体分子或作为示踪剂，尤其是用于诊断用途)；和 ·细胞毒剂(例如多柔比星)。

这些缀合的衍生物的一个有用的用途就是用于捕获系统。在这类系统中，本发明的分子可包含良性捕获分子。该捕获分子可以与单独的效应物分子(例如毒素或放射性同位素)特异性结合。载体-缀合的分子和效应物分子都给予患者。在这类系统中，效应物分子的半衰期较短，除非与载体-缀合的捕获分子结合，因此使任何毒性副作用降至最低。载体缀合的分子的半衰期相对较长，但可以是良性而非毒性的。这两类分子的特异性结合部分可以是已知特异性结合对(例如生物素、链霉抗生物素)的组成部分或者可以来自肽的制备方法，例如本文所述的那些方法。

可通过本领域已知方法制备这类缀合的衍生物。就蛋白质效应物分子(例如假单胞菌内毒素)而言，这类分子可以自相应的DNA构建体而表达为融合蛋白。可以制备放射性同位素缀合的衍生物，例如按照BEXA抗体(Coulter)所述的方法。可以制备含有细胞毒剂或微生物毒素的衍生物，例如按照BR96抗体(Bristol-MyersSquibb)所述的方法。可以制备捕获系统所用的分子，例如按照NeoRx的专利、专利申请和出版物所述的方法。可以制备RIGS和RID所用的分子，例如按照NeoProbe的专利、专利申请和出版物所述的方法。

载体
本发明需要存在通过一个氨基酸残基的N-端、C-端或侧链与肽连接的至少一种载体。也可使用多种载体。一方面，Fc区是载体。Fc区可与肽的N端或C端融合或者与其N端和C端融合。

在本发明的各种实施方案中，Fc组分可以是天然Fc或Fc变异体。一方面，天然Fc的免疫球蛋白来源是人，而在替代实施方案中，可以是任何类型的免疫球蛋白。天然Fc区由单体多肽组成，单体多肽可通过共价(即二硫键)和/或非共价结合连接成二聚体或多聚体形式。根据不同种类(例如IgG、IgA、IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)，天然Fc分子单体亚基之间的分子间二硫键的数量范围为1-4个。天然Fc的一个实例是IgG经木瓜蛋白酶消化而产生的二硫键连接的二聚体(参见Ellison等(1982)，Nucleic Acid Res.104071-9)。

应当注意，当存在合适半胱氨酸残基时，Fc单体将会自发地二聚体化，除非有特定条件阻止通过二硫键形成的二聚体化。甚至当在Fc二聚体中正常形成二硫键的半胱氨酸残基被除掉，或者被其它残基置换时，单体链通常还会通过非共价相互作用而形成二聚体。本文所用的术语“Fc”是指任何这样的形式天然单体、天然二聚体(二硫键连接的)、修饰二聚体(二硫键和/或非共价连接的)和修饰单体(即衍生物)。

要注意的是，Fc变异体是本发明范围之内的合适载体。天然Fc可以进行多种修饰，以形成Fc变异体，如果保留与补救受体结合的话；参见例如WO 97/34631和WO 96/32478。在这类Fc变异体中，可以除去天然Fc的一个或多个位点(其提供结构特性或功能性活性)，而无需通过本发明的融合分子。可以通过例如取代或缺失残基、将残基插入这些位点，或截短含有这些位点的部分，而除去这些位点。插入或取代的残基也可以是改变的氨基酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。因为各种原因需要Fc变异体，一些原因如本文所述。示例性的Fc变异体包括以下分子和序列，其中 1.参与二硫键形成的位点被除去。这样除去后可避免与用于产生本发明分子的宿主细胞中存在的其它含半胱氨酸的蛋白质发生反应。为了该目的，N-端含半胱氨酸的区段可以被截短，或者半胱氨酸残基可以缺失或用其它氨基酸(例如丙氨酰、丝氨酰)取代。甚至当半胱氨酸残基除去后，单链Fc区仍然能形成二聚体Fc区，其通过非共价作用而结合在一起。
2.天然Fc经修饰后与所选宿主细胞更相容。例如，可以除去典型天然Fc的N-端附近的PA序列，该序列可被大肠杆菌消化酶(例如脯氨酸亚氨基肽酶)识别。也可添加N-端甲硫氨酸残基，尤其是当分子在大肠杆菌等细菌细胞中重组表达时。
3.天然Fc的N-端部分被除去，以阻止N-端异质性，当在所选宿主细胞中表达时。为了该目的，可以缺失N-端最初20个氨基酸残基中的任一个，尤其是在位置1、2、3、4和5上的残基。
4.一个或多个糖基化位点被除去。通常糖基化的残基(例如天冬酰胺)可赋予细胞溶解反应。这类残基可以缺失或被非糖基化残基(例如丙氨酸)取代。
5.参与补体相互作用的位点(例如C1q结合位点)被除去。例如，可以缺失或取代人IgG1的EKK序列。对于本发明分子而言，补体募集没有好处，所以可以用这类Fc变异体予以避免。
6.影响与Fc受体、而非补救受体结合的位点被除去。天然Fc具有与某些白细胞相互作用的位点，这对本发明的融合分子而言是不需要的，所以可以除去。
7.ADCC位点被除去。ADCC位点是本领域已知的；参见例如Molec.Immunol.29(5)633-9(1992)中有关IgG1的ADCC位点。这些位点对本发明的融合分子而言也是不需要的，所以可以除去。
8.当天然Fc是由非人类抗体衍生时，天然Fc可以是人源化的。通常为了使天然Fc人源化，可以用人天然Fc中并非正常存在的残基来取代非人天然Fc中的所选残基。抗体人源化的技术是本领域众所周知的。

一种替代载体可以是能够与补救受体结合的蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段或小分子(例如肽模拟化合物)。例如，可以使用作为载体的多肽，参见美国专利号5,739,277、1998年4月14日授予专利权(Presta等)。也可通过噬菌体展示来选择肽与FcRn补救受体的结合。这类补救受体-结合化合物也包括在“载体”的含义之内，并包括在本发明范围之内。应当选择这类载体，其半衰期延长(例如通过避免被蛋白酶识别的序列)和免疫原性减少(例如通过促进非免疫原性序列，正如抗体人源化中所讨论的)。

可以通过例如制备残基或序列的各种替代物，来构建Fc部分的变异体、类似物或衍生物。

变异体(或类似物)多肽包括插入变异体，其中一个或多个氨基酸残基补充Fc氨基酸序列。插入可以位于蛋白质的一端或两端，或者可以位于Fc氨基酸序列内部区。在一端或两端具有额外残基的插入变异体可包括例如融合蛋白和含氨基酸标签或标记的蛋白质。例如，Fc分子可任选含有N-端Met，尤其是当分子在大肠杆菌等细菌细胞中重组表达时。

在Fc缺失变异体中，Fc多肽的一个或多个氨基酸残基被除去。可以在Fc多肽的一端或两端造成缺失，或在Fc氨基酸序列内除去一个或多个残基。因此，缺失变异体包括Fc多肽序列的所有片段。

在Fc取代变异体中，Fc多肽的一个或多个氨基酸残基被除去并被替代残基置换。一方面，取代在本质上是保守的，这类保守取代是本领域众所周知的。或者，本发明包括非保守的取代。示例性的保守取代可参见Lehninger，[Biochemistry，第2版；Worth Publishers，Inc.New York(1975)，第71-77页]和下文马上就要给出的那些。
保守取代I
或者，示例性的保守取代如下。
保守取代II
例如，半胱氨酸残基可以缺失或被其它氨基酸置换，以阻止形成Fc序列的一些或全部二硫键交联。每个半胱氨酸残基都可除去和/或被其它氨基酸(例如Ala或Ser)取代。作为另一个实例，也可进行修饰，以引入氨基酸取代，从而(1)除去Fc受体结合位点；(2)除去补体(C1q)结合位点；和/或(3)除去抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。这类位点是本领域已知的，任何已知取代都在本文所用的Fc的范围之内。例如，参见Molecular Immunology，第29卷，第5期，633-639(1992)中有关IgG1中的ADCC位点。

同样，一个或多个酪氨酸残基可以被苯丙氨酸残基置换。另外，其它变异氨基酸插入、缺失和/或取代都包括在本发明的范围之内。通常优选保守氨基酸取代。此外，改变可以呈改变氨基酸的形式，例如肽模拟物或D-氨基酸。

化合物的Fc序列也可按照本文对肽的描述而进行衍生，即携带修饰，而不是插入、缺失或取代氨基酸残基。优选的修饰在本质上是共价的，包括例如与聚合物、脂质、其它有机及无机部分的化学结合。可制备本发明的衍生物，以增加循环半衰期，或者可设计本发明衍生物，以改善将多肽靶向所需细胞、组织或器官的能力。

也可使用完整Fc分子的补救受体结合结构域，作为本发明化合物的Fc部分，例如参见WO 96/32478，名称“AlteredPolypeptides with Increased Half-Life”。在本文中称为Fc类分子的其它成员是以下文献所描述的那些WO 97/34631，名称“Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives”。本段落引用的这两篇已公布的PCT申请都通过引用结合到本文中。

WSP成分
本发明的化合物还可包含至少一个WSP。分子的WPS部分可以是分枝或不分枝的。对于终产物制剂的治疗用途而言，聚合物是药学上可接受的。一般而言，根据以下考虑来选择所需聚合物聚合物缀合物是否用于治疗，如果是，则需要考虑所需剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性和其它考虑。在各方面，每个水溶性聚合物的平均分子量介于约2kDa和约100kDa之间、介于约5kDa和约50kDa之间、介于约12kDa和约40kDa之间、介于约20kDa和约35kDa之间。在又一方面，每个聚合物的分子量介于约6kDa和约25kDa之间。本文所用的术语“约”是指在水溶性聚合物的制备中，某些分子可能大于、某些可能小于所标称的分子量。一般而言，分子量越大或分枝越多，则聚合物/蛋白质比率越高。其它大小也可采用，这取决于所需治疗特性，包括例如持续释放时间；对生物活性的影响，如果有的话；处理的简易性；抗原性程度或缺乏抗原性和水溶性聚合物对治疗用蛋白质的其它已知影响。

考虑到对多肽或肽的功能性或抗原性结构域的影响，WSP应与多肽或肽连接。一般而言，可以在使蛋白质与活性聚合物分子反应的任何合适条件下进行化学衍生。可将水溶性聚合物与一个或多个蛋白质连接的活性基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸盐、三氟乙磺酸盐(tresylate)、吖丙啶(azidirine)、环氧乙烷和5-吡啶基。如果通过还原性烷基化与肽连接，所选聚合物应当具有单个活性醛，使聚合反应程度可以受控。

合适临床上可接受的水溶性聚合物包括但不限于PEG、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛类、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧杂环戊烷、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(可以是均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚物(PPG)和其它聚环氧乙烷、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(POG)(例如甘油)和其它聚氧乙烯多元醇、聚氧乙烯山梨醇或聚氧乙烯葡萄糖、结肠酸(colonicacid)或其它碳水化合物聚合物、菲可(Ficoll)或葡聚糖及其混合物。

也可制备具有热敏性的水溶性聚合物，在形成反向热凝胶(reverse thermal gel)中。实例包括具有四臂主链的Tetronics和PEG-PLGA共聚物。聚合物的亲水性可因聚合物链中的取代疏水部分而异。其实例是在制备PLGA的过程中增加乳酸/乙醇酸的比率，使水溶性较低。在某些应用中最好使用较低水溶性的聚合物，例如增加与细胞膜相互作用的能力。一旦重配后，合适比率的磷脂可用于在溶液中诱导形成胶束或脂质体。这类体系的优势是能够将一些蛋白质掺入胶束中，具有延长递送的潜在益处。能形成脂质体或胶束的磷脂包括DMPG、DMPC、DOPC、DOPG和合适的二级脂质体加固成分例如胆固醇。某些赋形剂，例如DEA oleth-10 phosphate和oleth10-phosphate，在溶液中能够形成胶束。

多糖聚合物是另一类水溶性聚合物，其可用于蛋白质或肽修饰。通过添加多糖(例如糖基化)来修饰蛋白质或肽，可延长半衰期、减低抗原性、增加稳定性和减少蛋白水解。葡聚糖是主要以α1-6键连接的单个葡萄糖亚单位的多糖聚合物。许多分子量范围的葡聚糖本身是可得的，容易得到的分子量约1kD至约70kD。葡聚糖是合适的水溶性聚合物，其本身在本发明中可用作载体，或与另一载体(例如Fc)一起在本发明中用作载体。参见例如WO 96/11953和WO96/05309。已经报道了使用与治疗性或诊断性免疫球蛋白缀合的葡聚糖；参见例如欧洲专利公布号0315456，所述文献通过引用结合到本文中。当葡聚糖用作本发明的载体时，优选约1kD至约20kD的葡聚糖。

在一个实施方案中，WSP是PEG，本发明包括这样的制剂其中化合物经修饰包含任何形式的PEG，其已用于衍生其它蛋白质，例如但不限于一-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。聚乙二醇丙醛在制备中具有优势，因其在水中具有稳定性。PEG基团可具有任何方便的分子量，可以是线状或分枝状。本发明范围所使用的PEG的平均分子量为约2kDa至约100kDa，约5kDa至约50kDa，约5kDa至约10kDa。另一方面，PEG部分的分子量为约6kDa至约25kDa。PEG基团通常通过酰化或还原性烷基化与肽或蛋白质连接，即通过PEG部分上的活性基团(例如醛、氨基、巯基或酯基)与靶肽或蛋白质上的活性基团(例如醛、氨基或酯基)连接。使用本文所述的方法，可以制备聚合物/肽缀合分子的混合物，本文所提供的优势是能够选择混合物中聚合物/肽缀合物的比例。因此，如有必要，可以按照聚合物/蛋白质缀合物的预定比例，制备肽与所连接的各种数量的聚合物部分(即0、1或2)的混合物。

合成肽的PEG化的有用策略(其它方法如本文详述)包括通过在溶液中形成缀合键，将各自携带可彼此反应的特定官能团的肽和PEG部分结合起来。用常规固相合成可以容易地制备肽。用合适的官能团在特定位点“预先活化”肽。纯化前体并充分表征，然后与PEG部分反应。肽与PEG的连接通常发生在水相，可容易地通过反相分析型HPLC来监测。可容易地通过制备型HPLC纯化PEG化肽，并通过分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱来表征。

接头
任何“接头”基团是任选的，其位置可以在肽之间、肽和载体之间或载体和WSP之间。如果有的话，其化学结构不是关键，因为它主要起到间隔基团的作用。接头优选由氨基酸通过肽键连接而成。因此，在优选的实施方案中，接头由1-20种氨基酸经肽键连接而成，其中氨基酸选自20种天然氨基酸。这些氨基酸中的某些可糖基化，本领域技术人员可以理解这一点。在一个更优选的实施方案中，1-20种氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。甚至更优选的接头是由大多数在空间不受阻的氨基酸(例如甘氨酸和丙氨酸)组成。因此，优选的接头是多聚甘氨酸(尤其是(Gly)4、(Gly)5、(Gly)8、多聚(Gly-Ala)和多聚丙氨酸。其它具体的接头实例是 (Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO1018)； (Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO1019)； (Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO1020)；和 GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO1021)。

为了解释以上命名，例如(Gly)3Lys(Gly)4是指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。Gly和Ala的组合也是优选的。本文所示接头是示例性的；本发明范围内的接头可以长得多并和可包含其它残基。

非肽接头也是可行的。例如，烷基接头例如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中可以使用s＝2-20。这些烷基接头还可被任何非空间阻碍的基团(例如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等)取代。一个示例性的非肽接头是PEG接头，
其中n使得接头的分子量为100-5000kD，优选100-500kD。按照如上所述的类似方式，可以改变肽接头以形成衍生物。

多肽和肽的产生
已被鉴定的肽可以用重组DNA技术在转化宿主细胞中制备。如果载体组分是多肽，多肽-或肽-载体融合产物可以表达为一体。为了做到这一点，先用本领域众所周知的方法，制备编码肽的重组DNA分子。例如，可用合适限制酶，从DNA上切下编码肽的序列。或者，可以使用化学合成技术(例如氨基磷酸酯方法)合成DNA分子。另外也可采用这些技术的组合。因此，本发明提供编码本发明化合物的多核苷酸。

本发明还提供在合适宿主中编码本发明化合物的载体。载体包含与合适表达控制序列有效连接并编码化合物的多核苷酸。在多核苷酸插入到载体之前或之后完成这种有效连接的方法，是众所周知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、帽子信号、聚腺苷酸化信号和参与转录或翻译控制的其它信号。

用具有所述多核苷酸的所得载体来转化合适宿主。可以用本领域众所周知的方法完成这样的转化。

任何大量可行的和众所周知的宿主细胞都可用于本发明的实践。选择具体的宿主要取决于本领域所知道的各因素。这些包括例如与所选表达载体的相容性，DNA分子所编码的肽的毒性，转化率，肽回收的简便性，表达特征，生物安全性和成本。平衡这些因素，还必须考虑到并非所有宿主都能等效地表达特定DNA序列。在这些通用指南中，有用的微生物宿主包括细菌(例如大肠杆菌)、酵母(例如酵母属(Saccharomyces))和其它真菌、昆虫、植物、培养的哺乳动物(包括人)细胞或本领域已知的其它宿主。

其次，培养转化宿主并纯化。可以在常规发酵条件下培养宿主细胞，使其表达所需化合物。这类发酵条件是本领域众所周知的。最后，通过本领域众所周知的方法，从培养物中纯化肽。

根据表达本发明化合物所用的宿主细胞，碳水化合物(寡糖)基团可方便地连接在蛋白质的已知糖基化位点上。一般而言，O-联低聚糖连接在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上，而N-联低聚糖连接在天冬酰胺(Asn)残基上，当它们作为序列Asn-X-Ser/Thr的组成部分时，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。X优选为除脯氨酸以外的19种天然氨基酸之一。N-联低聚糖和O-联低聚糖以及这两类糖残基的结构是不同的。这两类糖中常见的一种糖是N-乙酰基神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-联低聚糖和O-联低聚糖的末端残基，而且因其带有负电荷，可赋予糖基化化合物酸性。这类位点可以结合到本发明化合物的接头中，并且优选在重组产生多肽化合物期间由细胞进行糖基化(例如在哺乳动物细胞例如CHO、BHK、COS中)。然而，这类位点还可通过本领域已知的合成或半合成方法进一步糖基化。

或者，可通过合成方法制备化合物。例如，可使用固相合成技术。合适的技术是本领域众所周知的，包括以下文献所述的方法Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，第335-61页(Katsoyannis和Panayotis主编)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.852149；Davis等(1985)，Biochem.Intl.10394-414；Stewart和Young(1969)，Solid Phase Peptide Synthesis；美国专利号3,941,763；Finn等(1976)，The Protein(第3版)2105-253；和Erickson等(1976)，The Protein(第3版)2257-527。固相合成是制备各种肽的优选技术，因为它是制备小肽的最划算的方法。

含有衍生肽或含有非肽基团的化合物特别适于通过众所周知的有机化学技术来合成。

WSP修饰
为了得到与WSP共价连接的化合物，本文所述的任何方法或本领域已知的其它方法均可采用。制备多肽或肽的化学衍生物的方法通常包括以下步骤(a)在使多肽与一个或多个聚合物分子连接的条件下，使肽与活化聚合物分子(例如聚合物分子的活化酯或醛衍生物)反应，和(b)得到反应产物。根据已知参数和所需结果确定最佳反应条件。例如，聚合物分子蛋白质的比率越大，连接聚合物分子的百分比也越大。

采用本领域众所周知的标准方法，可将生物活性分子通过任何可用的官能团与聚合物连接。聚合物或生物活性分子上可用于形成这类键的官能团的实例包括氨基和羧基、硫醇基(例如半胱氨酸残基中)、醛和酮以及羟基，这些基团存在于丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸和羟基赖氨酸残基中。

可通过偶联以下活性基团来活化聚合物例如三氯-均三嗪[Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.2523582-3586，通过引用全部结合到本文中]、羰基咪唑[Beauchamp等，(1983)，Anal.Biochem.13125-33，通过引用全部结合到本文中]或琥珀酸琥珀酰亚胺基酯[Abuchowski等，(1984)，Cancer Biochem.Biophys.7175-186，通过引用全部结合到本文中]，以便与生物活性分子上的胺官能团反应。另一个偶联方法包括在一个分子上形成乙醛酰，而在有待缀合的其它分子上形成arninooxy、酰肼或氨基脲基[Fields和Dixon(1968)，Biochem.J.108883-887；Gaertner等(1992)，Bioconjugate Chem.3262-268；Geoghegan和Stroh(1992)，Bioconjugate Chem.3138-146；Gaertner等(1994)，J.Biol.Chem.2697224-7230，其各自通过引用全部结合到本文中]。其它方法包括使用氯甲酸酯或碳酸二琥珀酰亚胺基酯，在有待缀合的第一分子的游离醇基上形成活性酯，然后与有待偶联的其它分子上的胺基缀合[Veronese等，(1985)，Biochem.and Biotech.11141-152；Nitecki等，美国专利号5,089,261；Nitecki，美国专利号5,281,698，其各自通过引用全部结合到本文中]。可以通过游离醇基连接的其它活性基团可参见Wright，EP 0539167A2(通过引用全部结合到本文中)，该文献也描述了使用亚氨酸酯(imidate)通过游离胺基进行偶联。

另一个化学方法包括靶标的伯胺的酰化，使用甲氧基-PEG的NHS-酯(O-[(N-琥珀酰亚胺基氧基羰基)-甲基]-O＇-甲基聚乙二醇)。用甲氧基-PEG-NHS酰化，产生酰胺键，这可消除自原始伯胺的变化。其它方法采用在选择靶向倒数第二个糖基单位唾液酸的悬垂二醇的条件下，温和氧化靶标，将所述二醇氧化为醛。再将所得糖醛(glycoaldehyde)与甲氧基-PEG-酰肼(O-(肼基羰基甲基)-O＇-甲基聚乙二醇)反应，在PEG与靶标之间形成半稳定的腙。然后，所得腙用氰基硼氢化钠还原，得到稳定的PEG缀合物。参见例如美国专利号6,586,398(Kinstler等，2003年7月1日)，通过引用全部结合到本文中。

在化学修饰技术的具体应用中，例如美国专利号4,002,531(通过引用全部结合到本文中)描述了还原性烷基化用于将聚乙二醇分子与酶连接。美国专利号4,179,337(通过引用全部结合到本文中)公开了涉及例如酶和胰岛素的PEG蛋白质缀合物。美国专利号4,904,584(通过引用全部结合到本文中)公开了蛋白质中大量赖氨酸残基的修饰，用于通过活性胺基连接聚乙二醇分子。美国专利号5,834,594(通过引用全部结合到本文中)公开了基本上非免疫原性水溶性PEG蛋白质缀合物，涉及例如蛋白质IL-2、干扰素α和IL-1ra。Hakimi等人的方法包括使用独特接头，将蛋白质中的各种游离氨基与PEG连接。美国专利号5,824,784和5,985,265(各自通过引用全部结合到本文中)描述了允许选择性N-末端化学修饰的蛋白质及其类似物的方法，包括G-CSF和共有干扰素。重要的是，这些修饰蛋白质具有优势，例如蛋白质稳定性，并提供加工优势。

WSP修饰在以下文献中也有描述Francis等，载于Stability of protein pharmaceuticalsin vivo pathways of degradation andstrategies for protein stabilization(Ahern.，T.和Manning，M.C.编著)Plenum，N.Y.，1991(通过引用全部结合到本文中)。在又一方面，方法描述于以下文献Delgado等，＂Coupling of PEG to Protein ByActivation With Tresyl Chloride，Applications In Immunoaffinity CellPreparation＂，载于Fisher等主编，Separations Using Aqueous PhaseSystems，Applications In Cell Biology and Biotechnology，Plenum Press，N.Y.，N.Y.，1989第211-213页(通过引用全部结合到本文中)，其包括使用三氟乙磺酰氯(tresyl chloride)，导致WSP部分与多肽部分之间没有连接基团。在其它方面，正如本领域众所周知的，通过使用羧基甲基甲氧基聚乙二醇的N-羟基琥珀酰亚胺基酯，完成WSP的连接。

对于用WSP修饰靶标的其它描述，可参见例如美国专利申请号20030096400；EP 0 442724A2；EP 0154316；EP0401384；WO 94/13322；美国专利号5,362,852；5,089,261；5,281,698；6,423,685；6,635,646；6,433,135；国际申请WO90/07938；Gaertner和Offord，(1996)，Bioconjugate Chem.738-44；Greenwald等，Crit Rev Therap Drug Carrier Syst.2000；17101-161；Kopecek等，J Controlled Release.，74147-158，2001；Harris等，ClinPharmacokinet.2001；40(7)539-51；Zalipsky等，Bioconjug Chem.1997；8111-118；Nathan等，Macromolecules.1992；254476-4484；Nathan等，Bioconj Chem.1993；454-62；和Francis等，Focus onGrowth Factors，34-10(1992)，所述文献通过引用全部结合到本文中。

还原性烷基化
一方面，通过本文所述的还原性烷基化化学修饰方法选择性修饰N-端α-氨基，进行WSP的共价连接，并测试所得产物的所需生物特征，例如本文所述的生物活性测定。

用于将WSP与蛋白质或肽连接的还原性烷基化反应，利用了具体蛋白质中可用于衍生的不同类型的伯氨基(例如赖氨酸与N-端)的不同反应性。在合适反应条件下，用含羰基的聚合物对蛋白质在N-端进行基本选择性衍生。

对于还原性烷基化，所选聚合物具有单一的活性醛基。活性醛是例如聚乙二醇丙醛(其是水溶性的)或其一C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见美国专利号5,252,714，通过引用全部结合到本文中)。在一种方法中，还原性烷基化用于将PEG-醛(O-(3-氧代丙基)-O＇-甲基聚乙二醇)与伯胺缀合。在合适条件下，该方法已经证明可得到主要通过蛋白质N-端α-胺修饰的PEG缀合物。

用于缀合生物活性分子的醛官能团可由具有相邻氨基和醇基的官能团来产生。在多肽中，例如N-端丝氨酸、苏氨酸或羟基赖氨酸可用于产生醛官能团，即使用高碘酸盐，通过在温和条件下氧化裂解。这些残基或其等同物可正常存在于例如多肽的N-端，可通过化学或酶促消化而暴露，或可通过重组或化学方法而引入。产生醛的反应条件通常包括添加摩尔浓度过量的偏高碘酸钠(sodium meta periodate)并在温和条件下避免在蛋白质其它位置上氧化。pH优选为约7.0。典型的反应包括添加1.5倍摩尔浓度过量的偏高碘酸钠，然后在室温下于暗处保温10分钟。

醛官能团可与含酰肼或氨基脲官能团的活化聚合物偶联，形成腙或缩氨基脲键。含酰肼的聚合物是市售的，必要时也可采用标准技术合成之。本发明所用的PEG酰肼可得自ShearwaterPolymers，Inc.，2307 Spring Branch Road，Huntsville，Ala.35801(目前隶属于Nektar Therapeutics，150 Industrial Road，San Carlos，CA 94070-6256)。通过将两种组分的溶液混合并加热至约37℃直到反应基本完成，使醛与聚合物偶联。过量的聚合物酰肼通常用于增加所得缀合物的数量。通常反应时间为26小时。根据反应物的热稳定性的不同，可以改变反应温度和时间以提供合适结果。对于氧化和偶联的具体反应条件的确定可参见Geoghegan和Stroh，(1992)，BioconjugatesChem.3138-146和Geoghegan，美国专利号5,362,852，所述各文献通过引用全部结合到本文中。

采用还原性烷基化，还原剂在含水溶液中应当是稳定的，优选仅能还原在还原性烷基化的起始过程中形成的席夫碱(Schiff base)。还原剂选自而不限于硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼酸盐、三甲胺硼酸盐和吡啶硼酸盐。

反应pH影响所用的聚合物/蛋白质的比率。一般而言，如果反应pH低于目标活性基团的pKa，就需要更多过量的聚合物/蛋白质。如果pH比目标pKa更高，则聚合物蛋白质的比率不必这样大(即可用的反应基团越多，则需要的聚合物分子较少)。

因此，一方面，在允许利用赖氨酸残基ε-氨基和蛋白质N-端残基的α-氨基之间的pKa差异的pH中进行反应。对于这类选择性衍生，水溶性聚合物与蛋白质的连接是受控的；与聚合物的缀合主要发生在蛋白质的N-端，而其它活性基团(例如赖氨酸侧链氨基)则没有发生明显修饰。

因此，一方面，提供方法用于将WSP与目标化合物共价结合，并在不需要使用其它化学修饰技术而进一步进行纯化的条件下，提供基本均质的WSP/蛋白质缀合分子制剂。更具体地讲，如果使用聚乙二醇，所述方法允许制备N-端PEG化蛋白质，其缺乏可能的抗原性连接基团，即聚乙二醇部分与蛋白质部分直接偶联，而没有潜在毒性副产物。

根据所选的WSP连接方法的不同，与目标肽或蛋白质分子连接的WSP分子的比例不同，它们在反应混合物中的浓度也不同。一般而言，最佳比率(根据没有过量未反应蛋白质或聚合物的反应的效率)是根据所选WSP的分子量而定。另外，当使用包括非特异性连接方法并随后纯化所需产物时，比率取决于可用的活性基团(通常是氨基)数量。

纯化
一方面，获取基本同源的WSP-修饰制剂的方法是通过从混合物中纯化出主要为单一种类的修饰化合物。举例来说，基本同源的物质首先通过离子交换色谱分离，得到具有单一种类的电荷特征的物质(尽管可能存在具有相同表观电荷的其它种类)，然后用大小排阻色谱分离所需种类。本发明报道并考虑了其它方法，包括例如PCT WO 90/04606，1990年5月3日公布，该文献描述了用于PEG-蛋白质加合物的混合物的分级分离方法，包括在含PEG含水两相体系中分配PEG/蛋白质加合物。

因此，本发明一方面是用于制备WSP-修饰的化合物缀合物的方法，包括以下步骤(a)在还原性烷基化条件下，在适于选择性活化蛋白质部分氨基端α-氨基的pH中，使具有不止一个氨基的化合物与水溶性聚合物部分反应，使所述水溶性聚合物与所述α-氨基选择性连接；和(b)获取反应产物。任选和尤其是对于治疗用产品，将反应产物与未反应部分分离开。

按照肽作图和N-端测序而确定，提供这样的制剂其在PEG化肽与未反应肽的混合物中包含至少50％PEG化肽。在其它实施方案中，提供这样的制剂其在PEG化肽与未反应肽的混合物中包含至少75％PEG化肽；在PEG化肽与未反应肽的混合物中包含至少85％PEG化肽；在PEG化肽与未反应肽的混合物中包含至少90％PEG化肽；在PEG化肽与未反应肽的混合物中包含至少95％PEG化肽；和在PEG化肽与未反应肽的混合物中包含至少99％PEG化肽。

以下实施例并非限制性的，而仅是示例性说明本发明的具体实施方案。
实施例1 mFc-TMP表达构建体装配
通过将各自编码鼠Fc和TMP的核苷酸序列(描述于EP01124961A2)组合在一起，构建了编码包含鼠Fc区的TMP融合蛋白(mFc-TMP)的多核苷酸。在第一轮PCR中，编码鼠Fc的组分用PCR引物3155-58(SEQ ID NO1022)和1388-00(SEQ ID NO1023)扩增。
3155-58CCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGA(SEQ ID NO1024) 3155-59CCACCTCCACCTTTACCCGGAGAGTGGGAG(SEQ ID NO1025)
在独立的反应中，编码TMP的多核苷酸用引物 1209-85(SEQ ID NO1026)和3155-59(SEQ ID NO1027)扩增。
1209-85CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG(SEQ ID NO1028) 1388-00CTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO1029)
所得PCR片段通过凝胶纯化并合并到一个管中，用于第二轮PCR，用引物1209-85(SEQ ID NO1030)和1388-00(SEQ ID NO1031)。第二轮扩增的PCR产物通过凝胶纯化，再用限制酶NdeI和XhoI消化。消化片段通过纯化后，与事先已用相同酶消化的载体pAMG21连接。该连接混合物通过电穿孔转化大肠杆菌，然后接种LB+卡那霉素培养基平板。通过PCR和DNA测序筛选菌落。鉴定出具有编码mFc-TMP融合蛋白(SEQ ID NO1033)的核苷酸序列(SEQ ID NO1032)的阳性克隆，称为6397。

编码鼠Fc-TMP融合蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO1034) 1GATTTGATTC TAGATTTGTT TTAACTAATT AAAGGAGGAA TAACAT 可读框 ATGGTCGACGGTTG TAAGCCATGC ATTTGTACAG TCCCAGAAGT ATCATCTGTC 101 TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG CTCACCATTA CTCTGACTCC 151 TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG CAAGGATGAT CCCGAGGTCC 201 AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG TGCACACAGC TCAGACGCAA 251 CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC CGCTCAGTCA GTGAACTTCC 301 CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA 351 ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAACCAAA 401 GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC ATTCCACCTC CCAAGGAGCA 451 GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG CATGATAACA GACTTCTTCC 501 CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC 551 TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA GATGGCTCTT ACTTCGTCTA 601 CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG GGAGGCAGGA AATACTTTCA 651 CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA ACCACCATAC TGAGAAGAGC 701 CTCTCCCACT CTCCGGGTAA AGGTGGAGGT GGTGGTATCG AAGGTCCGAC 751 TCTGCGTCAG TGGCTGGCTG CTCGTGCTGG TGGTGGAGGT GGCGGCGGAG 801 GTATTGAGGG CCCAACCCTT CGCCAATGGC TTGCAGCACG CGCATAA 3＇序列 TCTCGAGGATCCG CGGAAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAAGCCCG AAAGG
鼠Fc-TMP蛋白质序列(SEQ ID NO1035) 1 MVDGCKPCIC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT ITLTPKVTCV VVDISKDDPE51 VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS VSELPIMHQD WLNGKEFKCR 101 VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP PPKEQMAKDK VSLTCMITDF 151 FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG SYFVYSKLNV QKSNWEAGNT 201 FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGKGGGGG IEGPTLRQWL AARAGGGGGG 251 GGIEGPTLRQ WLAARA★ 实施例2 菌株6397的发酵
用菌株6397的种子培养物接种装有500mL无菌Luria肉汤的摇瓶，开始进行该菌株的发酵。当细胞密度达到0.9(在600nm处)时，将内容物接种15L发酵罐，其中装有10L复合基础生长培养基(800g甘油、500g胰酶解酪蛋白、3g柠檬酸钠、40gKH2PO4、20g(NH4)2SO4、5ml Fluka P-2000消泡剂、10ml痕量金属(氯化铁27.0g/L、氯化锌2.00g/L、氯化钴2.00g/L、钼酸钠2.00g/L、氯化钙1.00g/L、硫酸铜1.90g/L、硼酸0.50g/L、氯化锰1.60g/L、柠檬酸钠二水合物73.5g/L)、10ml维生素(生物素0.060g/L、叶酸0.040g/L、核黄素0.42g/L、吡哆醇HCl 1.40g/L、尼克酸6.10g/L、泛酸5.40g/L、氢氧化钠5.30ml/L)，加水至10L)。将发酵罐维持在37℃和pH7，溶氧水平维持在最少30％饱和度。当细胞密度达到13.1 OD值(在600nm处)时，加入10ml 0.5mg/ml N-(3-氧代-己酰)高丝氨酸内酯，诱导培养物。在诱导后6小时，将肉汤冷却至10℃，在4550g于5℃离心60分钟收获细胞。再将细胞膏状物(cellpaste)贮存于-80℃。
实施例3 蛋白质重折叠
将表达mFc-TMP的大肠杆菌菌株6397的细胞膏状物(300g)溶于2250ml裂解缓冲液(50mM Tris HCl，5mM EDTA，pH8.0)并2次通过冷却的微观流体器(13,000PSI)。均质物再在11,300g于4℃离心60分钟。弃去上清液，用组织研磨器将沉淀物重悬于2400ml水中。均质物再在11,300g于4℃离心60分钟。弃去上清液，用组织研磨器将沉淀物重悬于200ml体积的水中。均质物再在27,200g于4℃离心30分钟，弃去上清液。用组织研磨器将约12.5％沉淀物重悬于28ml 20mM Tris HCl，pH8.0，含35mg鸡卵清溶菌酶(Sigma，St Louis，MO)，在37℃孵育20分钟。孵育后，将悬液在27,200g于22℃离心30分钟，弃去上清液。将沉淀物重悬于35ml8M胍HCl，50mM Tris HCl，pH8.0，然后加入350μl 1M DTT(Sigma，St Louis，MO)，并将材料在37℃孵育30分钟。然后，将溶液在27,200g于22℃离心30分钟。将上清液移至3.5L重折叠缓冲液(50mM Tris碱，160mM精氨酸HCl，3M尿素，20％甘油，pH9.5，1mM半胱氨酸，1mM盐酸胱胺)并轻轻搅拌(1ml/min，4℃)。
实施例4 构建体纯化
实施例3所述的重折叠溶液在4℃孵育约40小时并轻轻搅拌之后，将其浓缩至500μl，即通过使用切向流超滤设备，用30kDa滤芯(cartridge)(Satorius，Goettingen，Germany)，然后再针对3L Q-Buffer A(20mM Tris HCl，pH8.0)进行渗滤。通过WhatmanGF/A滤器并装载在86ml Q-Sepharose快速流动柱(2.6cm ID)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，以15ml/min的速率过滤浓缩材料。用几倍于柱体积的Q-Buffer A洗涤树脂后，以10ml/min的速率，用20倍柱体积的线性梯度至60％ Q-Buffer B(20mM Tris HCl，1M NaCl，pH8.0)洗脱蛋白质。合并峰值部分，合并液以1ml/min的速率通过Mustang E针筒式滤器(Pall Corporation，East Hills，NY)。过滤的材料再通过0.22μm醋酸纤维素滤器进行二次过滤，然后贮存于-80℃。
实施例5 蛋白质PEG化
向mFc-TMP(3.5ml，0.8mg/ml)的100mM乙酸钠缓冲液(pH5，含20mM NaCNBH3)的冷却(4℃)搅拌溶液中，加入3.8倍摩尔浓度过量的甲氧基聚乙二醇醛(MPEG)(平均分子量20kDa)(Nektar)。在相同温度下继续搅拌反应混合物。通过SEC HPLC、使用Superose 6 HR 10/30柱(Amersham Biosciences)，用0.05M磷酸缓冲液(含0.15M NaCl，pH 7.0)以0.4ml/min的速率洗脱，来监测反应进程中蛋白质的修饰程度。16小时后，SEC HPLC分析表明，大部分蛋白质已与MPEG缀合。此时，将反应混合物的缓冲液交换成20mM Tris/HCl缓冲液，pH 8.12。通过离子交换色谱，用经20mMTris/HCl缓冲液(pH8.12)平衡的1ml Hi Trap HP Q柱(AmershamBiosciences)，分离MPEG-mFc-AMP2缀合物。以0.5ml/min的流速，将反应混合物上样到柱上，用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未反应MPEG醛。用20倍柱体积的线性梯度(0％至100％ 20mMTris/HCl缓冲液，pH8.12，含有0.5M NaCl)洗脱蛋白质-聚合物缀合物。在离子交换色谱分离期间收集的流分(2ml)通过如上所述的HPLC SEC进行分析。将含一-MPEG-mFc-TMP缀合物和二-MPEG-mFc-TMP缀合物的流分(比率约为2.3:1(经SEC HPLC测定))浓缩，并进行过滤除菌。
实施例6 体内测试
将BDF1小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，Massachusetts)分为10组，在第0、21和42天通过皮下注射各稀释剂(Dulbecco’s PBS，含0.1％牛血清白蛋白)或者含50μg试验一-MPEG-mFc-TMP缀合物和二-MPEG-mFc-TMP缀合物(如上所述)/kg动物的稀释剂。各组分出一半，在交替时间点(第0、3、5、7、10、12、14、19、24、26、28、31、33、40、45、47、49、52和59天)从眼眶窦后(retro-orbital sinus)放血(140μl)。在第59天，用异氟烷麻醉小鼠，然后放血。用ADVIA 120自动血液分析仪和鼠软件(Bayer Diagnostics，New York，NY)，对收集的血液进行全计数和分类计数。
实施例7 冻干人Fc-TMP
起始冻干制剂筛选研究 实施例7所述的人Fc-TMP肽体对应于SEQ ID NO1017的二聚体形式，其中人Fc是SEQ ID NO1，其在N-端具有起始甲硫氨酸。

用反相HPLC、阳离子-交换HPLC、大小排阻HPLC和SDS-PAGE等色谱技术，来评价Fc-TMP的稳定性，在升高温度下所有这些技术都表明是稳定的。在加速、冷藏和冷冻温度下，检查了0.1-40mg/ml的制剂浓度范围的化学降解和物理降解。对不同pH和作为制饼剂(cake-forming agent)的甘露醇或甘氨酸的含量以及作为冻干防护剂的蔗糖的含量，评价了Fc-TMP的稳定性。在其它候选物(甘氨酸)之后，对实际选择的甘露醇和蔗糖进行进一步优化后表明，在蛋白质稳定性方面没有改进。吐温-20(聚山梨酯-20)也表明，在0.002-0.1％的浓度范围内冻干时能抑制聚集。在筛选研究中在4-8的pH范围内检查了以下缓冲剂甘氨酸、琥珀酸、组氨酸、磷酸和Tris。根据这些筛选研究中，配制成组氨酸缓冲液(pH5，并添加少量吐温-20(0.004％)的Fc-TMP显示出对稳定性更优化。

蔗糖和吐温-20在Fc-TMP制剂中的验证
随后的开发工作集中在验证蔗糖、甘露醇和吐温-20在蛋白质浓度约0.5mg/ml(以适合预期的临床剂量要求)的制剂中的水平。在这些研究中证明了蔗糖、甘露醇和吐温-20在优化稳定性中的作用。也开始后续研究，目的是预期的制造问题和考虑。

蔗糖在升高的温度下对减少化学降解是有利的
测试了不同蔗糖和甘露醇浓度对Fc-TMP稳定性的影响。蛋白质配制成0.3mg/ml和2mg/ml，以便包括临床上预定的浓度范围。另外，用或不用0.004％吐温-20制备样品。通过改变蔗糖的用量并在各种不同蔗糖浓度下调节甘露醇水平以维持等渗性，从而改变蔗糖:甘露醇的比率。检查了以下蔗糖:甘露醇的比率(表示为单位体积的重量百分比)0.2:5.1；0.5:4.8；1:4.5；1.5:4.3和2:4。

通过阳离子-交换和反相HPLC的监测，更高的蔗糖:甘露醇比率显示出能使化学降解降至最低。如表39所示，比较了在开始时和升高温度下将Fc-TMP在37℃贮存18周的％主峰。阳离子-交换主峰的最大损失发生在液体制剂(Fc-TMP配制成10mM乙酸，5％山梨醇，pH5)，其次是冻干制剂(分别为0.2％、0.5％和1.0％蔗糖)。通过对升高温度中贮存的样品的反相HPLC分析，也观察到蔗糖对减少化学降解的保护作用(表39)。％主峰(通过对Fc-TMP的反相HPLC分析测定)在低蔗糖水平时明显下降，而在蔗糖浓度大于1％的制剂中却没有明显变化。综上所述，这些结果表明维持蔗糖水平在1.5％以上，在冻干时，对Fc-TMP的稳定性至关重要。
表39 Fc-TMP在含吐温-20的10mM乙酸(缓冲至pH5)中37℃18周后，PR-HPLC和CEX-HPLC主峰的损失

尽管在液体对照(10mM乙酸，5％山梨醇，pH5制剂)中Fc-TMP的主峰面积在前后具有明显增长，但对蔗糖含量较低的冻干样品进行分析时，蛋白质在主峰区后显示更多降解。在液体稳定性的前期工作中，样品(在升高温度贮存后)显示出由蛋白质中的谷氨酰胺和精氨酸脱酰胺作用，这归结于液体样品中峰区前的增加。

在冷冻温度下，通过阳离子-交换和反相HPLC对长期贮存的冻干制剂的测定，未观察到化学降解。例如，阳离子-交换色谱表明，在不同温度(-80℃、4℃和受控室温达6个月)下没有明显变化。因为冻干制剂在受控室温和更低温度下过一段时间没有化学降解，所以大部分制剂的开发工作集中在如何降低冻干相关的物理聚集。

吐温-20降低冻干引起的聚集
需要含低浓度的吐温-20(0.004％)，以降低冻干后发生的少量聚集。对评价添加或不添加吐温-20的样品稳定性的几次稳定性研究的相关结果进行检查，就可证明这一点。

先采用更高的Fc-TMP蛋白质浓度，用宽范围的吐温-20，以便研究减少聚集所需的用量。在该研究中，Fc-TMP浓度为20mg/ml，吐温-20水平设置在0.002％、0.004％、0.006％和0.01％。在4℃贮存一年后，在所有含吐温-20的制剂中，聚集局限在<0.1％。6个月的结果也表明没有明显聚集。选用0.004％的吐温-20进行本文所述的制剂研究的进一步工作，指定Fc-TMP为0.5mg/ml。

表40表明在4℃贮存0、3和11个月后监测到的Fc-TMP中的聚集量。在该研究中，将0.5mg/ml Fc-TMP的上述制剂和含有不同蔗糖:甘露醇比率且未添加吐温-20的0.5mg/ml Fc-TMP的制剂冻干。另外，在不含吐温-20且缓冲在pH4.5、5和5.5的当前制剂中研究稳定性。结果表明，仅上述制剂在pH5具有最少聚集。在不含吐温-20的制剂中，聚集为0.5％至约5％。与pH5时检测的聚集相比，在pH4.5和pH5.5时的聚集更多。较低的蔗糖:甘露醇比率(0.2％、0.5％和1％蔗糖制剂)具有较多聚集，水平通常约5％。在1年时间点，在上述制剂和不含吐温-20的制剂中，聚集水平随时间变化而维持稳定。
表40 Fc-TMP在10mM组氨酸、不同制剂(0.5mg/ml)中，SEC-HPLC测定的％聚集 1选择最佳制剂样品，用于评价11个月时间点
设计了其它制剂研究，以证实吐温-20对减少聚集的有益效果。这些研究中的所有样品都配制成pH5，含有或不含0.004％吐温-20。表41列出了在4℃贮存0、18周和1年后的％聚集。在0时立即冻干，在含0.004％吐温-20的所有样品中聚集最少。在不含吐温-20的样品中观察到少量聚集，而在含0.2％蔗糖的制剂中观察到最高量的聚集。吐温-20对降低聚集的有效性也可延长到18周时间点，而更高的％聚集发生在缺乏吐温-20和低蔗糖:甘露醇比率的样品中。在4℃贮存1年后，在含吐温-20的样品中，聚集也维持在低水平。
表41 Fc-TMP在10mM组氨酸、不同制剂(0.3mg/ml，pH5)中，在4℃贮存后，SEC-HPLC测定的％聚集 1选择含吐温-20的样品进行1年时间点的评价。

另一稳定性研究，设计用于检测抗氧化剂对减少化学降解、对增强吐温-20的保护作用的有效性。在升高温度贮存时，抗氧化剂对降低化学降解没有影响。然而，含0.004％吐温-20和Fc-TMP浓度为0.2mg/ml的上述制剂在零时具有<0.1％聚集，而在4℃贮存5月后具有0.1％聚集。不含吐温-20的同样制剂在零时具有0.4％聚集，而贮存5月后具有1％聚集。

稳定性研究结果见表II、III，上述研究说明吐温-20对降低冻干时的聚集具有保护作用。聚集随时间延长而增加很少，因为在含有0.004％吐温-20的样品中在4℃长达1年也没有明显增加聚集。根据添加吐温-20能降低冻干时的聚集的这些稳定性研究结果，用推荐制剂开始进行大规模工作。

大规模研究
聚集是浓度依赖性的
设计初始的大规模研究，以模拟生产条件并检查制剂在运输时的耐受性和重配时的稳定性。Fc-TMP经过缓冲液交换成制剂缓冲液，用切向流过滤装置，类似于较大规模的工艺。然后将蛋白质稀释为浓度0.5mg/ml和0.1mg/ml，也加入吐温-20，然后进行最后过滤步骤。充填样品后进行冻干。示例性的冻干工艺如下热处理步骤 冷冻温度 -50℃ 另外的冷冻0分钟 冷凝器设定点 -60℃ 真空设定点100毫托 初步干燥步骤

在低Fc-TMP浓度(0.1mg/ml)下，在4℃静置(passive)贮存导致更多聚集。在零时，在0.1mg/ml制剂中，通过SEC-HPLC测定聚集为0.4％，而在0.5mg/ml蛋白质制剂中聚集为0.1％。在冷冻温度下贮存6个月后，对于两种浓度的Fc-TMP，聚集都保持在与零时样品的同样水平，这与前期稳定性研究结果是一致的。因为在最低浓度(0.1mg/ml)观察到更大量的聚集，所以确定0.5mg/ml是对额外大规模工作的最适合的选择浓度。

在模拟剪切应力时聚集不增加
最初大规模研究的冻干样品(未重配)也经历模拟陆地和航空运输，并借助于应力模拟仪器。简而言之，按照ASTM(American Society of Testing Methods)所述方案，方法#D-4728。用电动振动台(Electrodynamic Vibration Table，S202型)和功率放大器(Power Amplifier，#TA240型(Unholtz-Dickie Corporation，Wallingford，CT))，模拟陆地和航空运输。按照运输应力，将冻干饼的物理外观与静置对照进行比较，结果饼没有明显形态学变化。化学和物理稳定性是可接受的，在受应力的样品和静置对照中的聚集是一致的(在0.5mg/ml样品中为<0.1％，而在0.1mg/ml样品中为0.4％)。

在该研究中，通过制备新鲜重配样品并孵育3、7和14天(静置、缓慢转动或强烈振荡)，检查重配后的稳定性。表42显示0.1和0.5mg/ml制剂的结果。不出所料，在0.5mg/ml制剂中，聚集量最低。将缓慢转动和非转动样品进行比较，在14天内聚集没有显著增加。在这些制剂(非转动和转动)中二聚体的量也是稳定的。有趣的是，振荡结果显示一种趋势；即在0.1mg/ml和0.5mg/ml样品中，在零时后，聚集下降到小于可检测水平。同时，在大多数振荡样品中，在各时间点，都观察到二聚体的量相应增加，表明在剪切应力处理的Fc-TMP中，聚集有时可逆地变为二聚体状态。
表42 Fc-TMP在10mM组氨酸、2％蔗糖、4％甘露醇和0.004％吐温-20(pH5)中，在4℃贮存后，SEC-HPLC测定的％聚集
在冻干循环中二次干燥12小时足以降低残留水分
进行了第二次大规模研究，其中Fc-TMP通过缓冲液-交换并稀释为0.5mg/ml的推荐制剂。在-50℃初次冷冻步骤，再在-13℃退火，达到冻干。将温度缓慢降至-50℃，维持1小时，在零下50℃用100毫托(mTorr)的真空设定值开始初次干燥。短期保持在零下50℃之后，在2小时内将温度缓慢升至-25℃，维持在-25℃达20小时，然后在约27小时内逐渐升至25℃，开始二次干燥。二次干燥在25℃至少持续12小时。冻干循环期间，在二次干燥12、18和24小时后取样，以便检查稳定性并比较残留水分含量。结果表明，通过卡尔·费休(Karl Fisher)滴定，所有所检查的样品的残留水分都在约0.6％以下(表43)。在缓冲液安慰剂饼中的水分同样低。根据该工作，冻干循环的二次干燥时间可缩短至12-18小时。
表43 Fc-TMP二次干燥时间持续12、18和24小时时的残留水分
该二次干燥时间范围的稳定性结果也相似，因为样品在化学或物理稳定性上没有区别。例如，所有所测样品的聚集量为<0.1％，而％二聚体也都是0.1％。这些结果证实二次干燥时间可缩短至少于24小时，而不影响蛋白质开始的稳定性。

进行了额外工作，以评价不同赋形剂浓度时制剂的强度。因为前期稳定性工作已经表明例如蔗糖可影响稳定性，所以有必要检查当赋形剂水平上少量改变时Fc-TMP的强度。

Fc-TMP的统计学研究
制剂的强度
设计了一个起始统计学研究，用E芯片软件包检查制剂变量的少量变化，例如制剂pH、组氨酸缓冲液强度和蔗糖:甘露醇比率。将这些样品冻干，但采用非优化冻干循环，导致比常见的更多聚集。研究是筛选研究，假定线性反应表面。稳定性评价结果显示，pH(4.7-5.3)和组氨酸缓冲液强度(5-15mM)对Fc-TMP稳定性几乎没有影响。为了证实吐温-20和蔗糖:甘露醇比率对Fc-TMP总体稳定性的影响，进行后续统计学设计研究，采用更优化的冻干循环。

二次统计学稳定性研究
第二次统计学设计研究检查吐温-20的改变(0.001％、0.0045％和0.008％)、蔗糖:甘露醇比率改变(1.7:4.2、2:4和2.3:3.8)和蛋白质浓度的变化(0.3mg/ml、0.65mg/ml和1mg/ml)。制剂的pH也调至4.7、5和5.3，而组氨酸缓冲液规格为7mM、10mM和13mM。制备样品，用Virtis冷冻干燥器(lyophilizer)(SP Industries，Inc.，Gardiner，NY)冻干，采用先前稳定性研究所用的优化保守循环。用E芯片(统计学设计软件包，Hockessin，DE)以两种方式解释稳定性结果在零时制剂变量对聚集量和二聚体量的影响，以及制剂变量对升高温度(37℃)的贮存稳定性的影响，正如通过自零时起的改变率而测定。

二次统计学研究的零时制剂结果
零时评价结果显示，不出所料，吐温-20降低冻干时聚集，然而蛋白质浓度对降低冻干时聚集的趋势也很明显。E芯片软件程序评价不同输入变量(制剂条件)对冻干期间Fc-TMP聚集和二聚化的影响。对于零时Fc-TMP二聚化，制剂中没有一种赋形剂(根据E芯片结果)具有明显影响。在冻干Fc-TMP时，一些制剂变量影响聚集量。根据E芯片提供的总体结果，Fc-TMP浓度对零时所观察到的聚集程度具有最大影响，其次是吐温-20水平。在零时，在低浓度样品中观察到聚集最大。同样，较高量的吐温-20对减少零时聚集具有更大的保护效果，尽管该趋势并不象蛋白质浓度效应那样明显。在该研究中，观察到比先前研究结果更高量的聚集，在较低蛋白质浓度并含有吐温-20的一些样品中观察到约0.5％聚集。

随蛋白质浓度增加，观察到聚集的变化下降。与0.3mg/ml以下的制剂的样品相比，在0.5mg/ml和更高浓度时，Fc-TMP的平均聚集更少。

0.004％吐温-20能有效减少在升高温度下贮存时的聚集
统计学设计研究也用于评价在升高温度下贮存的变化。在37℃过16天后的不同制剂条件下比较聚集率，即通过用起始(零时)结果减去升高温度的结果，再归一到一个月的时间。由此得到的负聚集率是指所测特性随时间变化而有明显损失。通过RP-HPLC(％主峰纯度和峰前％)、阳离子-交换HPLC(％主峰纯度)、大小排阻HPLC(聚集和二聚体形成)和NIR-水(经红外光谱测得的残留水分，在一些样品中该残留水分与卡尔·费休(Karl Fisher)滴定结果相关，以证实准确性)，测定响应变量(相对于测定结果)。

每次测定技术所得变化率的比较结果表明，聚集和RP-HPLC氧化的变化与Fc-TMP浓度和吐温-20浓度的平方在统计学上明显相关，在两个标准差之内。吐温-20的平方项很可能来自研究的二次性质(quadratic nature)，假定反应表面弯曲。在这种情况下，吐温-20的平方项更好地适应模型，此外也可能表明其本身与所影响的稳定性具有交互效果。其它所测反应，例如阳离子-交换HPLC主峰纯度或不同pH条件，都没有表现出明显影响蛋白质稳定性的反应。

在前述起始大规模研究的情况下(转动、不转动和振荡样品)，在高温贮存后聚集量较少。这些样品中的变化率用于根据统计学模型(二次研究)进行预测，以预测吐温-20的保护性作用。表44显示，随着吐温-20浓度从0升至0.008％，根据统计学设计模型对预计聚集量的预测。正如所示的，除0％吐温-20(在此情况下预测聚集将会上升)之外，聚集率(归一到37℃1个月)都是负数(表明在这些条件下聚集损失)。聚集损失率在吐温-20浓度为0.002％以上时达到平台，这表明低水平吐温-20(0.002-0.006％)足以降低物理降解。在这些条件下，二聚体的增长率也相似，与任何制剂赋形剂没有统计学相关性，如前所述。
表44 根据在37℃保温16天的统计二次模型预测，不同吐温-20和Fc-TMP浓度(归一到1个月)
在0.5mg/ml通过RP-HPLC所测氧化的变化率(假设这与各色谱的峰前区的变化相关的话)，与吐温-20平方项没有统计学上显著相关性。在这种情况下，模型(如表44所示)预测，随吐温-20浓度的变化，氧化率与预测区间的限制是一致的。蛋白质浓度影响氧化，随增长率从0.58升至2.69，蛋白质浓度从0.3mg/ml降至0.1mg/ml(同时保持吐温-20恒定在0.004％)。

这些结果表明，维持吐温-20浓度在0.002-0.006％，对稳定性而言是最好的。蛋白质含量也很重要，因为当浓度低于0.5mg/ml时，稳定性较差。

冷藏温度稳定性
鉴于上文，以下制剂用于评价冻干Fc-TMP的冷藏温度稳定性0.5mg/ml Fc-TMP的10mM组氨酸(缓冲在pH5)，2％蔗糖，4％甘露醇和0.004％吐温-20。

在1年时间内监测制剂的冷藏温度稳定性。表45显示该研究在零时、3月和1年的稳定性结果。正如所示，通过反相HPLC和阳离子-交换HPLC测得的％主峰纯度并不随时间变化而下降。主峰纯度随时间变化的微小差异是色谱柱分辨率的典型的正常差异，在冷冻标准品中也可观察到。％聚集是稳定的，在1年后并未增加。
表45

Fc-TMP配制成10mM组氨酸(缓冲在pH5.0，含2％蔗糖、4％甘露醇和0.004％吐温-20)。已经知道，pH5对稳定性而言更优化，而且蔗糖:甘露醇比率对降低该蛋白质体系在升高温度贮存时的化学降解而言，是至关重要的。需要低浓度的吐温-20，以降低冻干工艺造成的聚集量。对大规模应用的稳定性研究支持这些结论。也已设计出验证制剂中各种赋形剂水平的统计学研究，包括需要蛋白质浓度为0.5mg/ml。推荐制剂的冷藏温度稳定性在4℃贮存1年后未显示出明显降解。
实施例8 冻干Fc-Ang-2结合肽
为了确定冻干Fc-Ang-2结合肽的最佳制剂，进行分析，以评价在不同pH值、赋形剂浓度和蛋白质浓度时，Fc-Ang-2结合肽的聚集和稳定性。

Fc-Ang-2结合肽由连接在IgG1抗体分子Fc部分C-端上的两种药学活性多肽分子组成。该分子包含574个氨基酸残基，总分子量为63,511道尔顿。该分子的pI为5.45。每个活性多肽上有两个二硫键。整个分子共有20个半胱氨酸残基，其大多数都氧化为二硫桥。Fc-Ang-2结合肽序列如下 MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGKGGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPW TCEHMLE(SEQ ID NO2)
IgG1的Fc部分终止于K228。G229-G233构成接头序列。活性多肽始于A234并延伸到序列的其余部分。

冻干Fc-Ang-2结合肽的pH筛选
测定了对Fc-Ang-2结合肽的稳定性影响的pH范围为pH4.0、7.0和8.0。在pH4.0，所选缓冲剂包含谷氨酸、柠檬酸钠和琥珀酸钠，各自的浓度均为10mM。在pH7.0，所选缓冲剂为组氨酸和tris，两者的浓度均为10mM。也在pH8.0选择组氨酸和tris，两者的浓度均为10mM。各缓冲剂含有4％甘露醇作为冻干制饼剂和2％蔗糖作为赋形剂。另外，也测定了有或没有表面活性剂即0.01％吐温-20(w/w)时的组氨酸缓冲液(pH7.0)。用各制剂缓冲液将蛋白质稀释至5mg/ml。然后，采用排阻限为10,000Da分子量的透析管，将该溶液针对各制剂缓冲液透析，其中共更换6次，更换期间至少4小时平衡。透析之后，将蛋白质等分到3毫升玻璃管中，各装入1ml填充体积。然后，用实验室规模冻干仪器将这些小管冻干。冻干后，密封小管并贮存于4℃、29℃和37℃，其中在各时间点(从冻干后立即开始，一直持续到24个月)取出并分析各管。用合适体积的水重配样品，用大小排阻液体色谱和凝胶电泳(检测聚集、二聚化和蛋白质水解)以及阴离子交换液体色谱(检测氧化)，分析蛋白质稳定性。另外，也分析了饼的特性(例如重配时间和水分)和重配液体溶液特性(例如pH)。

冻干Fc-Ang-2结合肽赋形剂研究
在一种缓冲液即10mM组氨酸(pH7.0)中进行赋形剂的筛选。在该研究中比较的两种赋形剂为0.85％精氨酸和1％蔗糖。用精氨酸的制饼剂是4％甘露醇，而用蔗糖的制饼剂是2％甘氨酸。在蛋白质浓度为1mg/ml、30mg/ml和60mg/ml时测定各制剂。另外，测定了一种含甘露醇蔗糖组合的制剂(30mg/ml)。各制剂含有0.01％吐温-20。先将蛋白质浓缩至70mg/ml，然后用实验室规模的超滤/渗滤设备透析成合适的制剂。再用合适的制剂缓冲液将蛋白质稀释至3种不同浓度。然后将蛋白质等分到3毫升玻璃管中，各装入1ml填充体积。然后，用实验室规模的冻干仪器将这些小管冻干。冻干后，密封小管并贮存于4℃、29℃、37℃和52℃，其中在各时间点(从冻干后立即开始，一直持续到24个月)取出并分析各管。用大小排阻色谱、阴离子交换色谱和SDS-PAGE分析样品的蛋白质稳定性。也分析冻干饼的特性和重配液体溶液的特性。

冻干Fc-Ang-2结合肽浓度筛选
在10mM组氨酸(pH7.2，含4％甘露醇作为制饼剂和2％蔗糖作为赋形剂)进行浓度筛选。将蛋白质浓缩至约140mg/ml，然后用实验室规模的超滤/渗滤设备透析成制剂。再在制剂缓冲液中，将透析后的蛋白质稀释成30mg/ml、60mg/ml和120mg/ml。将溶液等分到3毫升玻璃管中，各装入1ml填充体积。用实验室规模的冻干仪器将这些小管冻干。冻干后，密封小管并贮存于4℃、29℃、37℃和52℃，其中在各时间点(从冻干后立即开始，一直持续到24个月)取出并分析各管。用大小排阻色谱、阴离子交换色谱和SDS-PAGE分析样品的蛋白质稳定性。也分析冻干饼的特性和重配液体溶液的特性。

结论
鉴于上文，最佳制剂包含10mM组氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖、0.01％吐温-20，pH7.0。
实施例9 冻干Fc-Agp-3结合肽
为了确定冻干Fc-Agp-3结合肽的最佳制剂，进行分析，以评价在不同pH值、赋形剂浓度和蛋白质浓度时，Fc-Agp-3结合肽的聚集和稳定性。

Fc-Agp-3结合肽是针对B细胞活化因子(BAFF)的N-联肽体，目的在于针对B细胞相关疾病。该肽体是由经二硫键连接的两个非糖基化的多肽构成，总分子量为～63.6kD。该肽体的等电点估计为pH7.36。

Fc序列(SEQ ID NO1696) V D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
Agp-3结合肽序列(SEQ ID NO1697) G C K W D L L I K Q W V C D P L G S G S A T G G S G S T A S S G S G S A T H M L P G C K W D L L I K Q W V C D P L G G G G G
因此，Fc-Agp-3结合肽结合肽序列如下 G C K W D L L I K Q W V C D P L G S G S A T G G S G S T A S S G S G S A T H M L P G C K W D L L I K Q W V C D P L G G G G G V D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO1698)
在10mg/ml，冻干Fc-Agp-3结合肽的宽pH筛选
主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)评价稳定性，这作为升高温度下的稳定性标志。为了评价在pH范围为3.85-7.6时对冻干Fc-Agp-3结合肽的稳定性和重配特性的影响，在各10mM缓冲液(含2.5％甘露醇和2.0％蔗糖)中配制10mg/mL Fc-Agp-3结合肽。以约0.5pH单位的增量，测定了以下缓冲液乙酸、琥珀酸、组氨酸、焦磷酸、磷酸和Tris。

对于制剂开发工作而言，在30mg/mL冷冻液体制剂中得到纯化的大量材料。将所得材料对合适的制剂缓冲液透析，并用保守循环在Virtis冷冻干燥器中冻干。退火步骤在-20℃进行并持续4小时，让甘露醇结晶。初次干燥在-25℃的架温进行20小时。初次干燥完成(-25℃)，因为当架温上升到0℃时，在真空中没有观察到峰值(spike)。未观察到大的塌陷(major collapse)，通过先在0℃、后在25℃进行二次干燥而成功处理样品。重配时，pH为7以上的制剂有轻微浑浊，而所有其它制剂都是澄清的。这是因为高pH制剂接近Fc-Agp-3结合肽的等电点(pI＝7.36)。SE-HPLC分析表明二聚体是主要的高分子量种类。观察到相对％二聚体极大地依赖于pH，最低累积在pH5以下。可溶性聚集物量也表明某种pH依赖性。在冻干前的样品中未见可溶性聚集物。相比之下，少量二聚体存在于冻干前的所有制剂中，在冻干后的重配样品中还会进一步增加。在所有制剂中未见明显的削峰(clipping)。最大量的完整单体是在乙酸、琥珀酸和组氨酸制剂(pH5以下)的情况下。

在30mg/ml，冻干Fc-Agp-3结合肽的宽pH筛选蔗糖和甘露醇的稳定效果
主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)评价稳定性，这作为稳定性标志。为了评价在pH范围为4.5-7.5时，2.5％甘露醇和3.5％蔗糖对冻干Fc-Agp-3结合肽的稳定性和重配特性的影响，在10mM琥珀酸、组氨酸和磷酸缓冲液中分别配制30mg/mL的Fc-Agp-3结合肽。该研究中没有用焦磷酸和Tris缓冲液，是因为在先前的宽pH筛选中表现不佳。也没有用乙酸缓冲液，是因为在重配样品中pH的变化有可能是冻干期间乙酸升华的结果。

对于制剂开发工作而言，在30mg/mL冷冻液体制剂中得到纯化的大量材料。将所得材料对合适的制剂缓冲液透析，并用保守循环在Virtis冷冻干燥器中冻干。退火步骤在-20℃进行并持续5小时，让更多甘露醇结晶。初次干燥在-25℃的架温进行20小时。初次干燥在-25℃无法达到完全，当架温上升到0℃时，在真空中可以观察到某些峰值。未观察到大的塌陷(major collapse)，通过先在0℃、后在25℃进行二次干燥而成功处理样品。重配时，pH约为7的制剂有轻微浑浊，而所有其它制剂都是澄清的。如前所述，这是因为高pH制剂接近Fc-Agp-3结合肽的等电点。SE-HPLC分析表明二聚体是主要的高分子量种类。此外，观察到相对％二聚体极大地依赖于pH，最低累积在pH5以下。可溶性聚集物量未显示出明显的pH依赖性。在冻干前的样品中未见可溶性聚集物。在配制前，在非GMP大量材料中观察到～0.6％二聚体，冻干前的高pH制剂的二聚体可增加到3.0％，这是缓冲液交换/浓缩的结果。

在特定pH下，无论缓冲液种类如何，相应量的二聚体的密切相关性也证实了二聚体累积的pH依赖性。％二聚体在冻干后没有明显增加，其证据是T＝0样品。唯一的例外是不含蔗糖和甘露醇的样品，在％二聚体方面显示出明显的～0.25-0.5％的增加。在含有蔗糖的情况下，对于琥珀酸和组氨酸制剂(pH分别为4.1和4.7)而言，主峰损失最小，甚至在缓冲液交换/冻干之后。与它们相比，在冻干前，所有磷酸制剂显示出主峰有～3％的损失。与含糖制剂相比，尽管在缺乏蔗糖和甘露醇的情况下形成饼，但相应的主峰下降0.5—0.7％。另外，非糖制剂的重配时间长得多(>2分钟)并需要搅拌。为了确保饼的强度，在所有随后的制剂中，都用甘露醇或甘氨酸作为填充剂，尽管单用蔗糖就显示出能赋予足够的蛋白质稳定性。

在30mg/ml，冻干Fc-Agp-3结合肽的窄pH筛选
主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)和反相HPLC(RP-HPLC)评价稳定性，这作为升高温度下的稳定性标志。因为％主峰回收率在pH5以下更高，所以在窄pH筛选时不用磷酸缓冲液。除了琥珀酸和组氨酸缓冲液(其在宽pH筛选中表现良好)之外，窄pH筛选包含10mM谷氨酸，pH4-6。以0.2pH单位的增量来测定制剂。蔗糖和甘露醇含量分别在3.5％和2.5％维持恒定，除了两种琥珀酸制剂(pH4.5)含有2.0％和5.0％蔗糖之外。另外，在各pH单位增量下，都测定6个通用冻干制剂，例如
1)20mM组氨酸，2.0％甘氨酸，1.0％蔗糖，pH5.0。

2)20mM组氨酸，2.0％甘氨酸，1.0％蔗糖，pH6.0。

3)20mM组氨酸，2.0％甘氨酸，1.0％蔗糖，pH7.0。

4)20mM组氨酸，4.0％甘露醇，2.0％蔗糖，pH5.0。

5)20mM组氨酸，4.0％甘露醇，2.0％蔗糖，pH6.0。

6)20mM组氨酸，4.0％甘露醇，2.0％蔗糖，pH7.0。

对于制剂开发工作而言，在30mg/mL冷冻液体制剂中得到纯化的大量材料。将所得材料对合适的制剂缓冲液透析，并用保守循环在Virtis冷冻干燥器中冻干。冻干循环被进一步修改。退火步骤在-15℃进行，让甘氨酸结晶并持续5小时。初次干燥先在-30℃进行短时间(4小时)。然后将架温升至-25℃并维持24小时。然而，初次干燥在-25℃无法达到完全，证据是当架温进一步上升到0℃时，在真空中可以观察到一个小峰。然而，未观察到大的塌陷，通过先在0℃、后在25℃进行二次干燥而成功处理样品。长达6个月的冻干状态，得到37℃时的稳定性数据，以评价Fc-Agp-3结合肽的长期稳定性。pH的增加导致所有组氨酸制剂的主峰损失。仅监测通用制剂达6个月，但对于1个月和3个月的时间点而言，当pH接近5.0时优势很明显。此外，通用制剂的6个月的数据表明，甘露醇+蔗糖制剂比甘氨酸+蔗糖制剂更稳定，尤其是在pH6以上时。

就谷氨酸和琥珀酸制剂而言，二聚体(主要降解产物)数量具有明显的pH依赖性增加，当pH变得更少酸性。对于聚集物而言，也观察到类似的pH依赖性。观察到主峰的最高回收率在pH5以下。对于T＝0，主峰的起始损失可以由缓冲液交换和浓缩期间的蛋白质降解来解释，其证据是冻干前制剂的类似损失。然而，3个月的稳定性数据表明，谷氨酸制剂比其琥珀酸对应物(同样的pH)具有更高的物理稳定性。在该研究中要注意的是，我们也测试了蔗糖浓度的增加对琥珀酸制剂稳定性的影响。除了3.5％蔗糖之外，我们比较了在琥珀酸(pH4.5)中2.0％和5.0％蔗糖制剂。蔗糖的增加在某种程度上降低了高分子量种类，但是没有明显影响主峰量。因此，认为3.5％蔗糖是最佳的，因为这类制剂与生理张力的匹配最密切。

在低pH时，通过RP-HPLC观察到一种微小物质种类(clip)在增加。冻干制剂中pH依赖性削峰(clipping)的明显部分发生在冻干前，是耗时的缓冲液交换和蛋白质浓缩步骤的结果。冻干后，甚至在37℃贮存3-6个月之后，都没有观察到微小物质种类的量明显增加。一般而言，数据表明，更高pH制剂减少了削峰(clipping)，因为在pH6以上未观察到。然而，在较高pH时二聚体的量很明显，在pH6以上时可高达2.5—4.5％。因此，当Fc-Agp-3结合肽配制成pH5时，发现可以兼顾，其中削峰中等，尤其是在谷氨酸和组氨酸缓冲液中，当二聚体形成仍然被完全遏制时。

结论
在37℃通过6个月的货架研究证实，2.5％甘露醇和3.5％蔗糖可提供足够的饼和蛋白质稳定性。因此，10mM组氨酸、2.5％甘露醇、3.5％蔗糖(pH5.0)和10mM谷氨酸、2.5％甘露醇、3.5％蔗糖(pH5.0)可用于配制30mg/mL Fc-Agp-3结合肽。另外，该研究显示，20mM组氨酸、4.0％甘露醇、2.0％蔗糖(pH5.0)也表现良好，被认为可作为可能的通用肽体冻干制剂。
实施例10 冻干Fc-Myo结合肽
为了确定冻干Fc-Myo结合肽的最佳制剂，进行分析，以评价在不同pH值、赋形剂浓度和蛋白质浓度时，Fc-Myo结合肽的聚集和稳定性。

Fc-Myo结合肽是针对肌肉生长抑素蛋白的C联肽体，目的在于针对肌肉消耗相关疾病。该肽体是由经二硫键连接的两个非糖基化的多肽构成，总分子量为～59.1kD。该肽体的等电点估计为pH6.88。

Fc序列(SEQ ID NO1699) M D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
肌肉生长抑素结合肽序列(SEQ ID NO1700) G G G G G A Q L A D H G Q C I R W P W M C P P E G W E
因此，Fc-Myo结合肽结合肽的序列如下 M D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K G G G G G A Q L A D H G Q C I R W P W M C P P E G W E(SEQ ID NO1701)
对冻干Fc-Myo结合肽，确定pH条件
主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)评价稳定性，这作为升高温度下的稳定性标志。设计并进行pH筛选研究，以确定冻干前处于液体状态的最佳制剂pH。用乙酸和组氨酸和蔗糖作为稳定剂(或冻干防护剂)的缓冲剂，将蛋白质配制成pH为4.5、4.75、5.0、5.5和6.0。将配制的小管贮存于29℃达1年。用SE-HPLC监测稳定性。对各制剂条件计算聚集率常数。发现pH4.5的聚集率最低，因此选择pH4.5作为优选的制剂pH条件。

30mg/mL冻干Fc-Myo结合肽的缓冲剂研究 主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)评价稳定性，这作为稳定性标志。用3种不同缓冲剂研究30mg/mL剂型10mM谷氨酸、10mM组氨酸和10mM琥珀酸(pH4.5)。所有制剂都含有0.004％聚山梨酯20。
对于制剂开发工作而言，在30mg/mL冷冻液体制剂中得到纯化的大量材料。将所得材料对合适的制剂缓冲液透析，并用保守循环在Virtis冷冻干燥器中冻干。冻干蛋白质制剂显示可接受的饼外观。在重配时制剂是澄清的。将冻干Fc-Myo结合肽贮存于4℃、29℃、37℃和52℃。在4℃进行实时稳定性研究，发现相当于这些制剂贮存3个月。然而在52℃贮存3个月时，含组氨酸的制剂比含谷氨酸的制剂稍微好一些。含琥珀酸的制剂比其它两种制剂稳定性明显更低。根据这些结果，认为组氨酸和谷氨酸对于Fc-Myo结合肽的最终制剂而言是优选的缓冲剂。

在30mg/ml，对冻干Fc-Myo结合肽赋形剂进行研究蔗糖、海藻糖和羟乙基淀粉的稳定性作用
主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)评价稳定性，这作为稳定性标志。为了评价海藻糖、羟乙基淀粉和蔗糖对冻干Fc-Myo结合肽的稳定性的影响，用含4％甘露醇的10mM谷氨酸缓冲液将Fc-Myo结合肽配制成30mg/mL。所用的海藻糖和蔗糖的浓度为2.0％，将1％羟乙基淀粉加入到蔗糖制剂中，制备10mM谷氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖、1％羟乙基淀粉的最终制剂。所有制剂都含有0.004％聚山梨酯20。

对于制剂开发工作而言，在30mg/mL冷冻液体制剂中得到纯化的大量材料。将所得材料对合适的制剂缓冲液透析，并用保守循环在Virtis冷冻干燥器中冻干。冻干蛋白质制剂显示可接受的饼外观。在重配时制剂是澄清的。

用SE-HPLC方法监测这些制剂的稳定性。

将冻干Fc-Myo结合肽贮存于4℃、29℃、37℃和52℃。发现实时货架期条件的稳定性(4℃)相当于这些制剂贮存3个月。然而在52℃贮存3个月时，含蔗糖的制剂比含海藻糖的制剂稍微好一些。添加羟乙基淀粉对稳定性没有任何不利影响。根据这些结果，认为蔗糖对于Fc-Myo结合肽的最终制剂而言是优选的稳定剂。

在30mg/ml，对冻干Fc-Myo结合肽赋形剂进行研究蔗糖和甘露醇的稳定性作用
主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)评价稳定性，这作为稳定性标志。为了评价不同含量的甘露醇和蔗糖(甘露醇范围为4.0-8％，蔗糖范围为1.0-4.0％)对冻干Fc-Myo结合肽的稳定性和重配特性的影响，用10mM谷氨酸缓冲液将Fc-Myo结合肽配制成30mg/mL。所有制剂都含有0.004％聚山梨酯20。

对于制剂开发工作而言，在30mg/mL冷冻液体制剂中得到纯化的大量材料。将所得材料对合适的制剂缓冲液透析，并用保守循环在Virtis冷冻干燥器中冻干。冻干蛋白质制剂显示可接受的饼外观。在重配时制剂是澄清的。

用SE-HPLC方法监测这些制剂的稳定性。将冻干Fc-Myo结合肽贮存于4℃、29℃、37℃和52℃。发现实时货架期条件的稳定性(4℃)相当于这些制剂贮存3个月。然而在52℃贮存3个月时，发现增加蔗糖用量能增加稳定性，避免聚集。因为考虑到要维持最终制剂的等渗条件，这限制了双糖总量，并且要维持甘露醇与蔗糖的适当比例以保护冻干饼的特性，所以4.0％甘露醇和2.0％蔗糖对于最终制剂而言是优选的赋形剂。

在1mg/mL、30mg/mL、85mg/mL，对冻干Fc-Myo结合肽赋形剂进行研究
主要通过大小排阻HPLC(SE-HPLC)评价稳定性，这作为稳定性标志。为了评价蛋白质浓度对冻干Fc-Myo结合肽的稳定性和重配特性的影响，用含4％甘露醇和2％蔗糖的10mM谷氨酸缓冲液将Fc-Myo结合肽配制成1mg/mL、30mg/mL、85mg/mL。所有制剂都含有0.004％聚山梨酯20。

对于制剂开发工作而言，在30mg/mL冷冻液体制剂中得到纯化的大量材料。用UF/DF将所得材料的缓冲液交换成为合适的制剂缓冲液，并用保守循环在Virtis冷冻干燥器中冻干。冻干蛋白质制剂显示可接受的饼外观。在重配时制剂是澄清的。

用SE-HPLC方法监测这些制剂的稳定性。将冻干Fc-Myo结合肽贮存于4℃、29℃、37℃。发现实时货架期条件的稳定性(4℃)相当于这些制剂贮存6个月。所研究的所有浓度的稳定性都可以接受，如同市售产品制剂一样。

结论
在4℃通过12个月的货架研究证实，4.0％甘露醇和2.0％蔗糖可提供足够的饼和蛋白质稳定性。因此，10mM组氨酸、4.0％甘露醇、2.0％蔗糖(pH4.5)和10mM谷氨酸、4.0％甘露醇、2.0％蔗糖(pH4.5)可用于配制1-100mg/mL Fc-Myo结合肽。

本发明已经描述了具体的实施方案或提出包括优选方式，用于本发明的实践。本领域普通技术人员将会知道，根据本说明书，在示例性的具体实施方案中可以做出大量修改和变动，只要不偏离本发明的预定范围。
权利要求
1.一种治疗用肽体的冻干组合物，所述组合物包含缓冲剂、填充剂、稳定剂和任选的表面活性剂；
其中所述缓冲剂由范围为约5mM至约20mM的pH缓冲剂组成，其中pH范围为约3.0至约8.0；
其中所述填充剂的浓度以重量体积比计为约0％至约4.5％；
其中所述稳定剂的浓度以重量体积比计为约0.1％至约20％；
其中所述表面活性剂的浓度以重量体积比计为约0.004％至约0.4％；和
其中所述治疗用肽体包含下式I所给出的结构
式I[(X1)a-F1-(X2)b]-(L1)c-WSPd
其中
F1为Fc区；
X1选自
P1-(L2)e-
P2-(L3)f-P1-(L2)e-
P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e-和
P4-(L5)h-P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e-
X2选自
-(L2)e-P1，
-(L2)e-P1-(L3)f-P2，
-(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3，和
-(L2)e-P1-(L3)f-P2(L4)g-P3-(L5)h-P4
其中P1、P2、P3和P4各自独立地为药理学活性肽序列；
L1、L2、L3、L4和L5各自独立地为接头；
a、b、c、e、f、g和h各自独立地为0或1，
前提条件是a和b中至少有一个为1；
d为0、1或大于1；和
WSP为水溶性聚合物，其连接在F1的任何活性部分上。
2.权利要求1的组合物，其中所述治疗用肽体包含下式II所给出的结构
式II[X1F1]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在X1的C-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
3.权利要求1的组合物，其中所述治疗用肽体包含下式III所给出的结构
式III[F1-X2]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在X2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
4.权利要求1的组合物，其中所述治疗用肽体包含下式IV所给出的结构
式IV[F1-(L1)e-P1]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在-(L1)c-P1的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
5.权利要求1的组合物，其中所述治疗用肽体包含下式V所给出的结构
式V[F1-(L1)e-P1-(L2)f-P2]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在-L1-P1-L2-P2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述治疗用肽体是多聚体。
7.权利要求6的组合物，其中所述治疗用肽体是二聚体。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中P1、P2、P3和/或P4独立选自表4-38中任一个所给出的肽。
9.权利要求8的组合物，其中P1、P2、P3和/或P4的氨基酸序列相同。
10.权利要求1-7中任一项的组合物，其中Fc区如SEQ ID NO1所示。
11.权利要求1-7中任一项的组合物，其中WSP为PEG。
12.权利要求1-7中任一项的组合物，其中Fc区如SEQ ID NO1所示，而WSP为PEG。
13.权利要求12的组合物，其中PEG的分子量介于约2kDa和100kDa之间。
14.权利要求13的组合物，其中所述PEG的分子量介于约6kDa和25kDa之间。
15.权利要求11的组合物，其中所述组合物包含至少50％PEG化治疗用肽体。
16.权利要求15的组合物，所述组合物包含至少75％PEG化治疗用肽体。
17.权利要求15的组合物，所述组合物包含至少85％PEG化治疗用肽体。
18.权利要求15的组合物，所述组合物包含至少90％PEG化治疗用肽体。
19.权利要求15的组合物，所述组合物包含至少95％PEG化治疗用肽体。
20.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述pH缓冲剂选自甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸、磷酸、乙酸和天冬氨酸。
21.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述填充剂选自甘露醇、甘氨酸、蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。
22.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、精氨酸HCl、多羟基化合物包括多糖例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷(N-methyl pyrollidene)、纤维素和透明质酸、氯化钠。
23.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠、二辛基磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、去氧胆酸钠、脱氧甘胆酸钠盐、苯扎氯铵或苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓一水合物、溴化十六烷基三甲基铵、CHAPS、CHAPSO、SB3-10、SB3-12、洋地黄皂苷、曲通X-100、曲通X-114、聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、大豆卵磷脂、DOPC、DMPG、DMPC和DOPG；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。
24.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述治疗用肽体浓度介于约0.25mg/mL和250mg/mL之间。
25.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为5.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为4％甘露醇；
其中所述稳定剂以重量体积比计为2％蔗糖；和
其中所述表面活性剂以重量体积比计为0.004％聚山梨酯-20。
26.权利要求25的组合物，其中P1包含表6所给出的序列。
27.权利要求26的组合物，其中所述治疗用肽体浓度为0.5mg/mL。
28.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为7.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为4％甘露醇；
其中所述稳定剂以重量体积比计为2％蔗糖；和
其中所述表面活性剂以重量体积比计为0.01％聚山梨酯-20。
29.权利要求28的组合物，其中P1包含表32所给出的序列。
30.权利要求29的组合物，其中所述治疗用肽体浓度为30mg/mL。
31.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述pH缓冲剂为20mM组氨酸，其中pH为5.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为3.3％甘露醇；
其中所述稳定剂以重量体积比计为2％蔗糖；和
其中所述表面活性剂以重量体积比计为0.01％聚山梨酯-20。
32.权利要求31的组合物，其中P1包含表4所给出的序列。
33.权利要求32的组合物，其中所述治疗用肽体浓度为100mg/mL。
34.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为5.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为2.5％甘露醇和
其中所述稳定剂以重量体积比计为3.5％蔗糖。
35.权利要求34的组合物，其中P1包含表31所给出的序列。
36.权利要求35的组合物，其中所述治疗用肽体浓度为30mg/mL。
37.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述组合物选自
a)10mM组氨酸，pH4.7，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；
b)10mM组氨酸，pH5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；
c)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；
d)10mM琥珀酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；
e)10mM谷氨酸，pH4.5，9％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；
f)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％蔗糖，1％羟乙基淀粉，0.004％聚山梨酯-20；
g)5mM谷氨酸，pH4.5，2％甘露醇，1％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；和
h)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％海藻糖，0.004％聚山梨酯-20。
38.权利要求37的组合物，其中P1包含表21-24所给出的序列。
39.权利要求38的组合物，其中所述治疗用肽体浓度选自1mg/mL、30mg/mL、85mg/mL和100mg/mL。
40.一种用于制备冻干治疗用肽体的方法，所述方法包括以下步骤
a)制备缓冲剂、填充剂、稳定剂和任选表面活性剂的溶液；
其中所述缓冲剂由范围为约5mM至约20mM的pH缓冲剂组成，其中pH范围为约3.0至约8.0；
其中所述填充剂的浓度以重量体积比计为约2.5％至约4％；
其中所述稳定剂的浓度以重量体积比计为约0.1％至约5％；
其中所述表面活性剂的浓度以重量体积比计为约0.004％至约0.04％；和
b)将所述治疗用肽体冻干；
其中所述治疗用肽体包含下式I所给出的结构
式I[(X1)a-F1-(X2)b]-(L1)c-WSPd
其中
F1为Fc区；
X1选自
P1-(L2)e-
P2-(L3)f-P1-(L2)e-
P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e-和
P4-(L5)h-P3-(L4)g-P2-(L3)f-P1-(L2)e-
X2选自
-(L2)e-P1，
-(L2)e-P1-(L3)f-P2，
-(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3，和
-(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3-(L5)h-P4
其中P1、P2、P3和P4各自独立地为药理学活性肽序列；
L1、L2、L3、L4和L5各自独立地为接头；
a、b、c、e、f、g和h各自独立地为0或1，
前提条件是a和b中至少有一个为1；
d为0、1或大于1；和
WSP为水溶性聚合物，其连接在F1的任何活性部分上。
41.权利要求40的方法，其中所述治疗用肽体包含下式II所给出的结构
式II[X1-F1]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在X1的C-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
42.权利要求40的方法，其中所述治疗用肽体包含下式III所给出的结构
式III[F1-X2]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在X2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
43.权利要求40的方法，其中所述治疗用肽体包含下式IV所给出的结构
式IV[F1-(L1)e-P1]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在-(L1)c-P1的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
44.权利要求40的方法，其中所述治疗用肽体包含下式V所给出的结构
式V[F1-(L1)e-P1-(L2)f-P2]-(L1)c-WSPd
其中Fc区连接在-L1-P1-L2-P2的N-端，而0个、1个或多个WSP连接在Fc区，任选通过接头L1。
45.权利要求40-44中任一项的方法，其中所述治疗用肽体是多聚体。
46.权利要求45的方法，其中所述治疗用肽体是二聚体。
47.权利要求40-46中任一项的方法，其中P1、P2、P3和/或P4独立选自表4-38中任一个所给出的肽。
48.权利要求8的方法，其中P1、P2、P3和/或P4的氨基酸序列相同。
49.权利要求40-46中任一项的方法，其中Fc区如SEQ ID NO1所示。
50.权利要求40-46中任一项的方法，其中WSP为PEG。
51.权利要求40-46中任一项的方法，其中Fc区如SEQ ID NO1所示，WSP为PEG。
52.权利要求51的方法，其中PEG的分子量介于约2kDa和100kDa之间。
53.权利要求52的方法，其中所述PEG的分子量介于约6kDa和25kDa之间。
54.权利要求53的方法，其中所述组合物包含至少50％PEG化治疗用肽体。
55.权利要求54的方法，包含至少75％PEG化治疗用肽体。
56.权利要求54的方法，包含至少85％PEG化治疗用肽体。
57.权利要求54的方法，包含至少90％PEG化治疗用肽体。
58.权利要求54的方法，包含至少95％PEG化治疗用肽体。
59.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述pH缓冲剂选自甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸、磷酸、乙酸和天冬氨酸。
60.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述填充剂选自甘露醇、甘氨酸、蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。
61.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、精氨酸HCl、多羟基化合物包括多糖例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷(N-methyl pyrollidene)、纤维素和透明质酸、氯化钠。
62.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠、二辛基磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、去氧胆酸钠、脱氧甘胆酸钠盐、苯扎氯铵或苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓一水合物、溴化十六烷基三甲基铵、CHAPS、CHAPSO、SB3-10、SB3-12、洋地黄皂苷、曲通X-100、曲通X-114、聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、大豆卵磷脂、DOPC、DMPG、DMPC和DOPG；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。
63.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述治疗用肽体浓度介于约0.25mg/mL和250mg/mL之间。
64.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为5.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为4％甘露醇；
其中所述稳定剂以重量体积比计为2％蔗糖；和
其中所述表面活性剂以重量体积比计为0.004％聚山梨酯-20。
65.权利要求64的方法，其中P1包含表6所给出的序列。
66.权利要求65的方法，其中所述治疗用肽体浓度为0.5mg/mL。
67.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为7.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为4％甘露醇；
其中所述稳定剂以重量体积比计为2％蔗糖；和
其中所述表面活性剂以重量体积比计为0.01％聚山梨酯-20。
68.权利要求67的方法，其中P1包含表32所给出的序列。
69.权利要求68的方法，其中所述治疗用肽体浓度为30mg/mL。
70.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述pH缓冲剂为20mM组氨酸，其中pH为5.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为3.3％甘露醇；
其中所述稳定剂以重量体积比计为2％蔗糖；和
其中所述表面活性剂以重量体积比计为0.01％聚山梨酯-20。
71.权利要求70的组合物，其中P1包含表4所给出的序列。
72.权利要求71的方法，其中所述治疗用肽体浓度为100mg/mL。
73.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述pH缓冲剂为10mM组氨酸，其中pH为5.0；
其中所述填充剂以重量体积比计为2.5％甘露醇；和
其中所述稳定剂以重量体积比计为3.5％蔗糖。
74.权利要求73的方法，其中P1包含表31所给出的序列。
75.权利要求74的方法，其中所述治疗用肽体浓度为30mg/mL。
76.权利要求40-58中任一项的方法，其中所述组合物选自
a)10mM组氨酸，pH4.7，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；
b)10mM组氨酸，pH5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；
c)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，含有或不含0.004％聚山梨酯-20；
d)10mM琥珀酸，pH4.5，4％甘露醇和2％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；
e)10mM谷氨酸，pH4.5，9％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；
f)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％蔗糖，1％羟乙基淀粉，0.004％聚山梨酯-20；
g)5mM谷氨酸，pH4.5，2％甘露醇，1％蔗糖，0.004％聚山梨酯-20；和
h)10mM谷氨酸，pH4.5，4％甘露醇，2％海藻糖，0.004％聚山梨酯-20。
77.权利要求76的方法，其中P1包含表21-24所给出的序列。
78.权利要求77的组合物，其中所述治疗用肽体浓度选自1mg/mL、30mg/mL、85mg/mL和100mg/mL。
79.权利要求40-75中任一项的方法，所述方法在冻干前还包括以下步骤
b)调节所述溶液pH至pH为约4.0至约8.0；
c)制备含有所述治疗用肽体的溶液；
d)将步骤(c)的溶液缓冲交换为步骤(b)的溶液；
e)加入适量的表面活性剂；和
f)将步骤(e)的混合物冻干。
80.一种用于制备重配治疗用肽体组合物的方法，所述方法包括以下步骤
a)将权利要求40-78中任一项的治疗用肽体组合物冻干；和
b)重配所述治疗用肽体的冻干组合物。
81.一种用于制备含水药物组合物的药盒，所述药盒包含装有权利要求1-36中任一项的治疗用肽体的冻干组合物的第一容器，以及装有用于所述冻干组合物的生理上可接受的溶剂的第二容器。
全文摘要
本发明提供长期稳定的治疗用肽体冻干制剂以及包含治疗用肽体的冻干组合物的制备方法。
文档编号A61K39/395GK101484185SQ200780022610
公开日2009年7月15日 申请日期2007年4月20日 优先权日2006年4月21日
发明者W·J·卡拉汉, R·L·小雷梅尔, G·拉特纳斯沃米, R·F·拉蒂波夫, D·刘 申请人:安姆根有限公司