用于再生软骨组织的培养基和药物组合物、相关方法、用途和产品的制作方法

专利名称：：用于再生软骨组织的培养基和药物组合物、相关方法、用途和产品的制作方法用于再生软骨组织的培养基和药物组合物、相关方法、用途和产品本发明涉及用于刺激软骨组织生长的培养基、药物组合物、医疗设备，相关方法以及相关用途和产品。特别地，本发明的目的是通过诱导从天然和非天然多能干细胞再生软骨细胞来刺激多能干细胞分化成软骨组织，再生软骨组织以及改善关节软骨的生存力，甚至是在受损部位中。软骨组织或软骨是结締组织的特化形式，其特征在于起支持作用以及抵抗摩擦力或外部应力。所述组织是由称为软骨细胞的细胞构成，其被具有浸入到无定形的、致密的胶相基质中的纤维的细胞间质所包围。软骨既没有血管，也不受神经支配，它以三种不同的类型存在-透明软骨，-纤维软骨，-弹性软骨。软骨被致密的、有血管的结締组织即软骨膜覆盖，透明关节或"硬壳"软骨以及纤维软骨中都没有软骨膜。软骨膜由两层组成外层构成了实际上的结締组织包被嚢(致密的、纤维状的结締组织)，更内层由包括在网状结締组织网孔里的细胞所形成；这些细胞被称为软骨发生细胞，因为它们能分裂，产生新的软骨细胞。关节软骨围绕在活动关节(动关节)的骨周围，帮助骨表面的运动，并且缺乏可能阻碍这种运动的软骨膜。由滑膜产生的滑液将营养携带给关节软骨。滑液也起到润滑剂的作用。透明软骨因半透明的玻璃状外观而得名，它是体内最丰富的形式。在成人体内，在诸如胸锁关节的位置、骨的关节表面、长骨的生长软骨、气管环、大支气管上、鼻和部分喉部软骨的软骨结构中都发现了它。和所有结締组织一样，透明软骨是由浸入到胞外基质中的细胞所构成的，该胞外基质是由纤维和无定形的基本物质组成的。纤维软骨和弹性软骨是透明软骨的变体，其中分别是胶原纤维或弹性蛋白纤维占优势。纤维软骨存在于腱和韧带附着物附近；它和致密的纤维状締结组织相似，但是含有软骨细胞而不是成纤维细胞。弹性软骨存在于鼻和喉部(会厌)软骨以及耳廓中。软骨基质是致密的凝胶，但是由于它不像骨组织那样被矿化，这使得来自存在于软骨自身边缘的血管的营养物能够扩散。软骨细胞是成软骨细胞和软骨细胞。。P这些物质通常由胶原、、蛋白聚糖(作为参考，参见US-A國2004/0082623)、氨基酸(如WO國A-03/050250;US誦B-6596274;US國A画2004/0151709中所描述的)、维生素(参见WO-A-03/024463;US-A-2001/0012965;US-B-6365405)、透明质酸、糖(例如US-A-2003/0026786;US-A-2004/0235165)、亚麻酸/花生四烯酸(参见US-A-2005/0118714;US-A-2003/0175964),以及生长因子例如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、转化生长因子P(TGF-P)和其他因子(如WO-A-97/18299;WO-A-00/17321;EP-A-1077253;US-A-5962325;US-A陽6150163;US-A-2002/0115647;WO画A画2004/083415;WO-A-2004/093934;US-A-2004/0137612;US-A-2005/0090002中所描述的)或者肽或各种蛋白质(作为参考，参见EP-A-1441028;US-B-6464983;US-B-6610656)所构成。将干细胞？I入各种基质和组合物中分化为软骨细胞、然后复制具有确定三维结构的软骨细胞，这种用途也是公知的。通常使用的基质是由各种聚合物(层，而不是小球)和各种组合物(诸如海藻酸盐，羟磷灰石，胶原结构，聚乙醇酸为基础的聚合物等等)组成。引入专利US-B-6637437和US-A-2004/0214322作为例子。软骨组织病理学扭无述骨关节障碍影响了超过17%的意大利人(数据来源于ISTAT2001),预期这个数字在将来还会增长，这是与意大利、欧洲和总体上工业化国家的人口不断增长的预期寿命同时存在的(美国65岁以上人口的70%以及欧洲42%的人口)。关节障碍影响运动，无论是骶-髂关节或者是胫-股关节或者是脊柱；因此它们对于社会和家庭生活，特别是对老年个体有严重的影响。然而关节障碍在工作年纪也经常发生，包括关节炎(幼年类风湿关节炎，反应性关节炎，感染关节炎)和由于工作或道路造成的外伤。关节障碍改变了运动能力和身体形态(畸形，膨大)，并且在任何情况下都会影响个人和社会生活。关节软骨障碍可以影响任何年龄的个体，但是当它们发生在过着积极生活的年轻患者身上时特别重要。众所周知，透明软骨和骨组织不一样，骨组织具有极大的再生能力，透明软骨的特点是没有组织修复所必需的血液、淋巴和神经支持。事实上，只有少量损失被纤维软骨所替换，而较大的损失很少被填充一定深度的损伤(C^eAn^e等级III-IV)没有自发愈合的可能性，并且朝着关节表面的退化长期进展。风湿病的病理可以分为三大类炎性风湿、关节外风湿和退化性风湿。后一类是最常见的(关节病)。类风湿性多关节炎经常被简称为关节炎，强直性脊柱关节炎和胶原病都属于炎性风湿病或关节炎。关节外风湿病不会影响到关节。这包括例如腱炎和纤维肌痛。后者是慢性疾病，特点为全身性的分布广泛的疼痛，并伴随着深度疲劳。术语"退化性风湿病"或关节病意指一种非炎性障碍，是在一个或多个关节的退化中产生的，并且影响膝关节、髋关节、手指和脊柱。所述障碍是由围绕骨末端的软骨的渐变产生的。起着减震垫作用的软骨使得关节能够自由移动，在关节炎中软骨退化了，因此表面变得粗糙了。一旦退化，软骨就不能完全再生，因此减弱移动所产生的冲击。随着时间的过去，骨末端日益变得更不光滑。可能发生关节变形，并且骨可能呈现不正确的位置。在这种情况下，腱和肌肉将经受不寻常的应力，引起过负荷、疼痛、僵硬以及降低的可动性。间歇性炎症(即具有急性阶段)也可能发生这是由关节腔内的软骨碎片引起的，产生了过量的流体和关节内渗出。软骨病是软骨组织的损坏(当存在正在进行的退化过程时，它被称为软骨软化)。复发性多软骨炎是短暂的破坏性的炎性障碍，影响软骨和其它结締组织，包括耳、关节、鼻、喉、气管、眼、心脏瓣膜、肾和血管。软骨瘤是起源于软骨组织的良性肿瘤。它开始于骨节上，当它深入发展到骨里面的时候就被称为内生软骨瘤，当它向外发展的时候就被称为外生软骨瘤。软骨瘤病(chondromatosis)是一种不知道起源的疾病，其特点是在骨内存在软骨块。经过生长，这些块可以形成肿瘤，它们可能是不同的大小，可能进一步使受影响的骨节的生长受到干扰。另一个软骨组织病理是多软骨瘤病。最常受影响的部位是手和脚的管状骨以及长骨的干骺端。它们是在骨内部发展的软骨瘤。其它病理包括奥利埃氏病或内生软骨瘤病(这是一种遗传性变形病，大约在两岁左右出现，有各种大小的软骨肺瘤并且渐进性生长，位于许多骨中)和软骨肉瘤(起源于软骨组织的恶性肿瘤，经常位于骨盆、股骨或肱骨)。软骨组织病理的治疗处理关节软骨损伤是常发事件，它们可能引起慢性疼痛、关节限制和进行性关节退化。软骨不是血管化组织(也就是说不含血管)。其蛋白质、糖蛋白(软骨素和蛋白聚糖)组分和水之间存在着精确的平衡。在关节运动期间，软骨结合它所需要的水和营养。通过保护关节并让关节正确(并持续)运动，可以在一定限度内防止软骨的磨损并保证再生。但是，为了促进这个过程，有必要提供带有必需营养的软骨组织。迄今为止，可获得的治疗关节病的外科方法是多种多样的，但是会根据损伤的类型以及患者的年龄而不同。在这种情况下再次表明，适应症是决定性因素。目前使用的外科方法包括不植入材料的技术，诸如清创术、磨削软骨成形术和/或软骨下骨钻孔或微裂紋，目的在于刺激修复组织的形成。这种组织包含应答修复刺激的纤维软骨。特别地，纤维软骨具有不同于透明软骨的力学特征，特别是关节处较低的荷载强度，因此该技术可用于轻微的软骨病或者没有其它类型治疗可能性的严重退化的临床状况。对于软骨物质的更多实质性损失，就使用植入材料相关的技术，诸如软骨膜或骨膜植入物、自体软骨组织嵌合移植物、自体软骨细胞移植物，直到骨和软骨都从关节表面损失情况下的大块自体或同源骨软骨移植物。自体软骨细胞移植是用于治疗大量软骨组织损失的首选疗法。带有透明质酸的自体软骨细胞的移植提供了简化的方式来将细胞应用到缺损处，同时避免了骨膜瓣的使用，当软骨细胞是在水性悬浮液中产生的时候，必须使用骨膜瓣以便能够通过关节镜进行手术。此外，已经显示三维支持结构("支架，，)的使用促进了体外和体内培养条件下软骨细胞表型的维持和软骨胞外基质的产生。三维支持结构("支架，，)术语"支架，，将被理解为是指由生物相容的且生物可侵蚀的材料制成的多孔的三维支持物，细胞最初粘附在它上面，随后继续生长直到形成组织，这样它就以与继续生长相类似的速度进行生物降解。在各种研究过程中，鉴别到了能够确定上述支持物的主要特征的许多材料[5]。1.胶原；这是哺乳动物组织的天然组分，当聚合为三维支持物时，通过其重叠层的方式模拟原始组织，促进并维持了体外的细胞贴壁。2.纤维蛋白；这是参与血凝块形成过程的基本蛋白质。当聚合为三维支持物时，纤维蛋白促进了体外的细胞贴壁。3.海藻酸盐；它们是源自海藻的多糖。它们形成水凝胶溶液，具有能够均匀分布接种细胞的优点，提供了细胞三维生长的支持物。4.透明质酸；这是硫酸糖胺聚糖，构成了支持软骨细胞移植物的软骨基质的一部分。5.聚乙醇酸(PGA);这是大量用于软骨组织重建工程中的聚合物支持物。6.羟磷灰石；这是化学性质上类似于哺乳动物骨的矿物组分的生物陶瓷。外科治疗迄今为止，所使用的外科治疗的目的是通过软骨成形术/软骨磨削技术来诱导缺损部位的修复组织的生长，带有或不带有软骨下骨穿孔或微裂紋。在每种情况下，所形成的纤维软骨修复组织都具有不同于透明软骨的生化和生物弹性特征。通过这些方法获得的结果仅仅是延迟了进行性关节炎过程的发展。因为这些原因，研究又转到了替代解决方案的方向。最近，细胞培养领域的创新已经使得能够离体操作自体细胞并能够将它们用于整形外科，而不会改变它们的天然表型和功能。证明了移植自体人软骨细胞用于反复外伤或病理诸如剥脱性骨软骨炎和髌骨软骨软化症之后的退化软骨的重建的可能性。所获得的结果显示了新软骨的形成，具有完全类似于透明软骨的特征，其表达II型胶原。针对上述方法的评判标准之一涉及软骨细胞原位移植方法，该方法是通过在骨膜盘下注射。该方法围绕软骨重建可被骨膜间充质细胞诱导而不被所注射的自体软骨细胞诱导的这一事实提出了疑问。在带有标记软骨细胞的动物中进行的研究已经证实组织生长也是移植细胞的结果。发明描述本发明的目标在于找到确实和有效的解决办法来刺激软骨组织的生长并改善关节软骨的生存力，甚至是在受损部位，其通过诱导现有软骨细胞的再生以及诱导天然和非天然的多能干细胞分化成软骨细胞。根据本发明，所述目标是通过下面的权利要求书所特别要求保护的方案来实现的。权利要求书形成了本文所提供的与发明有关的技术教导的組成部分。发明涉及能够促进和刺激多能干细胞分化为软骨细胞以及软骨细胞自身增殖或者软骨组织生长的组合物，它能够改善由此产生的软骨的生存力。本发明是基于某些蛋白水解试剂将特定的增殖刺激施加于软骨细胞和多能千细胞的观察结果。这些观察结果导致了体外用作培养基或者体内用作药物组合物的组合物的配制，它能够诱导多能干细胞分化成软骨组织，能够刺激软骨组织的生长并改善软骨组织和关节软骨的生存力。受损的软骨细胞恢复了生存力并活跃地沉积基质，甚至是在体外培养3个月后也是如此。本研究证实了用于自体软骨细胞的培养方法的有效性。用本发明的培养基培养6个月后获得的体外组织学结果证实了透明软骨的形成，它在形态上与体内的完好软骨相当，带有最佳的组织功能特征。发明详述仅仅是作为非限制性的例子，现在将根据某些特定的优选实施方案来详细描述发明。本发明的不同培养基(例如表1和2中所示的C-BASE和C-BASEPLUS)和药物组合物(例如表4中所示的C-BASEINFUS)都被证明可有效诱导源自骨髓的间充质细胞以及分离自滑液和膜的细胞向功能正常的软骨细胞表型的分化，以及诱导分离自外周血的多能单核细胞和单核细胞样细胞系向功能正常的软骨细胞表型的分化。对于这个目的来说，使用了具有多能干细胞表型的单核细胞样细胞系PSC-THP1(保藏号ICLCPDNo.05005;2005年10月18日保藏；描述于意大利专利申请TO2005A000819中)以及具有稳定诱导的软骨细胞表型的PSC-THPl-cartilagine(保藏号ICLCPDNo.06001;2006年3月21日保藏)》所有被溯'J试的软骨组织活检样品都对本发明培养基的使用产生阳性应答，在1个月的体外培养期间保持生存、沉积基质并显示有序的三维分布。应当注意的是，体外培养这些组织1个月后，要将它们冷冻在-80。C(10%DMSO+50%血清+40。/o培养基)，然后正常解冻并在培养中再重新活化1个月，再次确定正常的组织功能性。萎缩软骨细胞的生存力在处理15天后看起来明显改善了。不希望受到与此有关的任何特定理论的束縛，本发明人相信用本发明的培养基所获得的结果证明了退化过程中产生的软骨萎缩状态是可恢复的。更详细地说，本发明的组合物包括在生理学可接受的栽体或稀释剂中组合的至少一种蛋白水解酶，以及糖、维生素、维生素因子、氨基酸、核普酸和核苷中的至少一种物质。组合物可另外包括作为生长刺激因子的副交感神经阻滞剂(优选东莨菪碱)和/或皮质类固醇(优选地塞米松)和/或下文进一步详细描述的其它成分。本发明的组合物可以是培养基或药物组合物的形式。本发明的组合物已经显示了具有正常体外组织功能特征的软骨组织极好生长和发育的证据。这是通过软骨组织活检物和软骨细胞的培养物；通过在分离自外周血的单核细胞和单核细胞样细胞系(优选THP-1系，更优选具有多能干细胞表型的细胞系PSC-THP1(ICLCPDNo.05005,2005年10月18日保藏)，还更优选具有稳定诱导的软骨细胞表型的细胞系PSC-THP1—cartilagine(ICLCPDNo.06001,2006年3月21日保藏))谦导正常功能的软骨细胞表型；以及通过在源自骨髓的间充质细胞和分离自滑液和膜的细胞中诱导正常功能的软骨细胞表型来证明的。备选地，本发明的组合物是如上限定的组合物，但是不含任何蛋白水解酶或生长因子，并且意欲将它施用于以产生蛋白水解酶的促炎细胞的存在为特征的病理部位。在所施用的组合物成分的帮助下,由促炎细胞的存在为特征的病理部位。在所施用的组合物成分的帮助下，由促炎细胞原位产生的蛋白水解酶能够对如上所述的软骨细胞和多能干细胞施加增殖刺激。根据该备选实施方案的组合物适合用作医疗设备。表3显示了根据该实施方案的组合物，被命名为C-BASE-INFUS-MD。由本发明组合物所行使的功能主要如下-培养基C-BASE形式的组合物具有通过直接作用到软骨细胞上来刺激软骨组织的生长的特征和能力，伴随恢复萎缩组织。在体外经处理的所有萎缩软骨组织活检物看起来都恢复活力，并显示出基质沉积，这是之前所缺乏的。特定组合物形式的C-BASE溶液适用于治疗用途，用于关节镜检查中的渗入(C-BASE-INFUS)或关节内输注，能够使得中度受损的软骨恢复。画药物组合物C-BASE画INFUS、医疗设备C-BASE-INFUS國MD和培养基C-BASEPLUS、C-BASE溶液的变型增强了多能干细胞向软骨细胞和正常组织功能软骨组织的分化。-根据本发明的培养基和药物组合物可有利地和纤维蛋白海绵、胶原膜、透明质酸支持物或者前述任一支持物一起使用。-通过使用根据本发明的培养基而被诱导分化为软骨细胞的多能干细胞悬浮液可被用于关节镜检查辅助的移植。本研究的创新性体现在培养基、药物组合物和相关的方法中，其中第一次将营养物(例如葡萄糖、透明质酸、氨基酸、维生素)和某些生长因子和蛋白水解试剂(例如木瓜蛋白酶和/或内源蛋白水解酶)与生长因子、皮质类固醇和/或副交感神经阻滞剂一起使用，用于萎缩软骨细胞的恢复以及将多能干细胞诱导成软骨细胞。根据上文所述，本发明的方法、培养基和药物组合物可有利地用于例如整形外科学、风湿病学、耳鼻喉学、颌面外科学、齿和口腔科学、心脏病学、皮肤病学、整形和美容外科学。材料与方法
技术领域：
：本发明的培养基和药物组合物的制备使用下列物质，但不限于此1.氨基酸..曱石充氨酸，胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，亮氨酸,异亮氨酸，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，谷氨酸，组氨酸，组氨酸-HCl，赖氨酸，赖氨酸-HCl,苯丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，酪氨酸二钠盐，缬氨酸，脯氨酸，羟脯氨酸，含有所有非必需氨基酸的溶液。2.肽谷胱甘肽，胶原，弹性蛋白，小麦提取物，具有营养功能的多肽。3.维生素视黄酸，视黄醇，抗坏血酸，泛酸，D-泛酸钙，吡哆醇，吡哆醇-HCl,叶酸，烟酰胺，核黄素，钴胺素，对氨基苯甲酸和生物素。4.维生素因子环己六醇，肌醇，氯化胆碱，丙酮酸，丙酮酸钠，腐胺和腐胺-HCl。5.生长因子TGF-P(转化生长因子P),LIF(白血病抑制因子)，ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)，胰岛素，M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)，IL-2(白细胞介素-2),PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯)，自体血清，皮质类固醇(例如地塞米松)，副交感神经阻滞剂(例如东莨菪碱)，胰高血糖素。6.盐葡糖酸钓，磷酸钙，碳酸氢钠，氯化钙，氯化镁，硫酸镁，氯化钾，磷酸钾，氯化钠，硝酸钙，氯化锌，硝酸铁，丙酮酸钠，D-泛酸钙，酪氨酸二钠盐。7.蛋白水解酶木瓜蛋白酶，胶原酶(优选Ia型、II型、IV型)，沙雷肽酶(sermtiopeptidase),肝素酶，DNA酶，弹性蛋白酶，菠萝蛋白酶，緩激肽酶，梭菌肽酶，由嗜酸乳杆菌表达的酶，由曲霉属表达的酶，蛋白酶，蒜氨酸酶，纤维蛋白溶酶。8.粘多糖透明质酸，硫酸软骨素。9.糖，由其衍生的醇及其混合物葡萄糖，蔗糖，葡聚糖，甘露聚糖，葡甘露聚糖，岩藻糖，果糖，疏酸乙酰肝素，果胶，淀粉，由其衍生的醇。10.细胞培养溶液RPMI1640(细胞培养基)，DMEM-LG(细胞培养基)，FBS(用于细胞培养的胎牛血清)，F12(含有完全氨基酸来源的细胞培养溶液)，HANK氏溶液(含有碳酸氢钠的细胞培养溶液)。11.血液衍生物从来自组织、细胞和培养基供体和受体的外周血制备的自体血清。培养基和药物组合物使用表1到4中所述量的物质制备用于体外用途的本发明的培养基以及用于体内用途的药物组合物或医疗设备。对于下文所列举的所有制剂来说，按照配方所需称出物质，得到1升的最终溶液。表1、培养基C-BASE物质浓度mg/L曱硫氨酸4.94胱氨酸5.12N-乙酰半胱氨酸201.00半胱氨酸3.51甘氨酸4.37亮氨酸15.90脯氨酸4.67谷胺酰胺45.00生物素0.055泛酸0.25抗坏血酸515.00视黄醇0.0015木瓜蛋白酶0.20葡糖酸钙100透明质酸0.50葡萄糖2000.00溶液L/so1.<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2、培养基C-BASEPLUS<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表4、药物组合物C-BASE-INFUS<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>药物组合物C-BASE-INFUS:操作流程为防止关节内输注疗法之后的过敏性休克，在施用C-BASE-INFUS之前用抗组胺药和/或可的松进行预防性治疗，例如可以施用诸如联苯羟胺、I型组胺受体拮抗剂、西替利溱、氯雷他定、甲美芳铵、倍他米松磷酸二钠、氢化可的松、曱基氢化泼尼松。细胞培养来自软骨组织的软骨细胞的分离和天然组织的体外重建将来自同一患者的软骨和外周血样品新鲜处理(在分离的2小时之内)。将来自三只管的外周血在EDTA抗凝剂的存在下于室温160g离心IO分钟。除去上清液，保存为lmL的小份(保存在-20。C)。将用消毒(在酒精中，然后在火焰中)镊子取出的软骨活检物放在100mm直径的平板(Falcon,BectonDickinsonLabwareEurope,米兰，意大利)中，力。入10mL的无添加物的RPMI1640培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)。在消毒(在酒精中,然后在火焰中)镊子和剪刀的辅助下，将样品进一步切碎成小碎片，在平板中漂洗两次。将样品转移到100mm直径的平板(Falcon,BectonDickinsonLabwareEur叩e,米兰，意大利)中，其中有制备好的10mL的RPMI1640培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)、200juL庆大霉素和1mg/mL的胶原酶。在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中温育所有样品2小时。温育之后，加入4mL的FBS(胎牛血清)到样品中以淬灭胶原酶活性。收集未溶解的碎片和所有溶液，悬浮液中带有细胞，在室温下160g离心10分钟。将沉淀重悬浮在无添加物的RPMI1640培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中，通过室温下160g离心10分钟漂洗两次。将沉淀重悬浮在5mL的DMEM-LG培养基(Gibco,GrandIsland,NY),其中补充F12溶液(最终体积的10%)、患者血清(最终体积的2%)以及FBS(最终体积的10%)，其中补充lOmL的C-BASE溶液。将细胞生长在75cm2的瓶中15天，置于具有5。/oC02和37。C温度的培养箱中。温育2天之后，将培养基替换为15mL的C-BASE溶液。当细胞达到80%汇合时，使用胰蛋白酶-EDTA将它们分离下来(37。C的温度下温育5分钟)；当温育结束时，加入5mL纯的FBS和5mL无添加物的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY);收获悬浮液中的脱离细胞，通过在单独的无添加物的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY)中37°C、160g离心7分钟漂洗两次。将由此获得的沉淀中含有的细胞以lxl()S浓度重悬浮在C-BASE溶液中。软骨细胞使用下文描述的爱萏蓝比色法测试样品和对照，以证明第7、10、15、30、45、60、75和90天的培养时产生活性软骨的软骨细胞的存在。外周血单核细胞的分离抽取40mL的外周血(六支7mLEDTA管)，按如下制备淋巴细胞-单核细胞群。将全血分成20mL的小份，将每一'卜份逐滴铺在50mL管(Lab國Tek,Nunc,Kamstrup,丹麦)中的25mLFicoll-Paque(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)上。将制剂在1800rpm再次离心25分钟，将上清液去除留下1cm,收集最后的离心之后形成的单核细胞透明环。将由此获得的透明环在10mL的RPMI1640(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)中稀释，在1300rpm离心10分钟。然后去除上清液，通过在1000rpm离心IO分钟将剩余物再漂洗两次，最后将沉淀重悬浮在带有10%FBS(胎牛血清)的10mL的RPMI1640中。通过Burker室对由此获得的细胞进行计数，以便获得5xl(^个细胞/mL的最终悬浮液。此时将细胞接种到培养皿，即一种100mm直径的平泽反(Falcon,BectonDickinson,LabwareEurope,米兰，意大利)中。将样品在37°C、5%。02时温育30分钟。所获得的单核细胞贴壁到平板上所需的时间是三十分钟。不要让细胞维持更长的时间周期以免淋巴细胞也贴壁。按照下面的详细描述漂洗、重悬浮和生长细胞。从外周血分离的单核细胞样细胞系和单核细胞通过在RPMI1640培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY，USA)中室温下160g离心10分钟将细胞漂洗3次，重悬浮在15cm平板(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstrup，丹麦)中的如下组成的培养基中，终浓度为1X1()S个细胞/mL:100单位/mL青霉素100|ug/mL链霉素W0mg/L庆大霉素(Schering-Plough,米兰，意大利)2mML-谷胺酰胺(LifeTechnologies;生长培养基)50ng/mLM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子，PeprotechInc.,NJ,USA)1000单位/mLLIF(白血病抑制因子，SantaCruzBiotechnology,CA,USA)1000单位/mLIL-2(人类重组白细胞介素2)3nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA,SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。称出组合物所需的物质，将其稀释在C-BASE组合物中，得到l升的最终溶液。制备两种类型的对照未处理细胞的一种阴性对照(l)以及用LIF(抗白血病因子，白血病抑制因子)、用M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子，PeprotechInc.,NJ,USA)、用PMA(3nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯，SantaCruzBiotechnology,CA,USA)和用IL-2(重组人类白细胞介素2)处理的细胞的一种对照(2);在下文和意大利专利申请TO2005A000819中详细描述。1.通过在RPMI1640培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)中室温下160g离心10分钟将对照细胞漂洗3次，重悬浮在15cm平板(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstr邵，丹麦)中的RPMI1640培养基，终浓度为1X1()S个细胞/mL,所述培养基中补充了腦FBS(Celbio,米兰，意大利)100单位/mL青霉素100ing/mL链霉素160mg/L庆大霉素(Schering-Plough,米兰，意大利)2mML-谷胺酰胺(LifeTechnologies;生长培养基)。2.通过在RPMI1640培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)中室温下160g离心10分钟将细胞漂洗3次，重悬浮在15cm平板(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstrup,丹麦)中的RPMI1640培养基中，终浓度为1X1()S个细胞/mL,所述培养基中补充了10%FBS(Celbio,米兰，意大利)100单位/mL青霉素100|ug/mL链霉素160mg/L庆大霉素(Schering-Plough,米兰，意大利)2mML-谷胺酰胺(LifeTechnologies;生长培养基)50ng/mLM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子，PeprotechInc.,NJ,USA)1000单位/mLLIF(白血病抑制因子，SantaCruzBiotechnology,CA,USA)1000单位/mLIL-2(人类重组白细胞介素2)3nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA,SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中温育所有样品15天。在所有样品中，每7天定期更换培养基，保留20%的培养基以便不会去除细胞所产生的所有生长必需的细胞因子。通过在37。C下160g离心10分钟对研究中的所有细胞的样品漂洗三次，用缀合到R-藻红蛋白(PE)或异硫氰酸荧光素(FITC)上的下述抗人的小鼠单克隆抗体(Mab)标记后进行细胞荧光光度分析(EpicsProfileII,Coulter,Hialeath,FL，USA):抗人CD14(SantaCruzBiotechnology,CA,USA),抗人CD34(SantaCruzBiotechnology,CA,USA),抗CD45(SantaCruzBiotechnology,CA,USA),抗c-Kit(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)和抗c-Met(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。在用细胞荧光光度法(FACS)测试时，细胞显示了干细胞表达的所有标志(CD14,CD34,CD45,c-Kit,c-Met)的明显阳性。在温育期之后，细胞似乎处于半贴壁/悬浮的状态，具有混合的卵形和成纤维细胞样形态。使用2%利多卡因(SigmaAldrich,米兰，意大利)的PBS溶液收获细胞[3,4],通过在RPMI1640(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中37。C下160g离心10分钟漂洗3次，根据下面的描述进行第二次温育。将肯定会保持未分化多能干细胞的处理对照(例如PSC-THP1，ICLCPDNo.05005,2005年10月18日保藏)以每mLlX105个细胞的终浓度重悬浮在每孔0.5mL最终溶液的6孔平板(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstrup，丹麦)上，最终溶液由RPMI1640培养基组成，该培养基补充了腦FBS(Celbio,米兰，意大利)100单位/mL青霉素100|Lig/mL链霉素160mg/L庆大霉素(Schering-Plough,米兰，意大利)2mML-谷胺酰胺(LifeTechnologies;生长培养基)50ng/mLM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子，PeprotechInc.,NJ，USA)1000单位/mLLIF(白血病抑制因子，SantaCruzBiotechnology,CA,USA)1000单位/mLIL-2(人类重组白细胞介素2)3nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA,SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中温育细胞15天，每7天替换0.25mL的培养基。将肯定会被刺激朝向软骨细胞特化的单核细胞和单核细胞样细胞样品重悬浮在50mL管(Lab-Tek,Nunc,Kamstrup,丹麦)中如下组成的最终溶液中，终浓度为每mL2xl(^个细胞100单位/mL青霉素100|ng/mL链霉素l60mg/L庆大霉素(Schering-Plough,米兰，意大利)2mML-谷胺酰胺(LifeTechnologies;生长培养基)50ng/mLM-CSF(巨嗟细胞集落刺激因子，PeprotechInc.,NJ,USA)1000单位/mLLIF(白血病抑制因子，SantaCruzBiotechnology,CA,USA)1000单位/mLIL-2(人类重组白细胞介素2)3nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA,(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。称出组合物所需的物质，将其稀释在C-BASEPLUS组合物中，得到1升的最终溶液。在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中温育细胞15天，每7天替换2mL的培养基(PSC-THP1-CHONDROCYTE-LIKE细胞系，保藏号为ICLCPDNo.06001的软骨细胞样细胞系)。特别地，用C-BASEPLUS溶液处理PSC-THP-1细胞15天(PSC画THPl國CHONDROCYTE國LIKE细胞系，保藏号ICLCPDNo.06001,2006年3月21日保藏，其源自2005年10月18日保藏的保藏号ICLCPDNo.05005的单核细胞样干细胞系PSC-THP-1)。应当注意到，被诱导向软骨细胞表型分化的细胞沉积基质并可用爱茜蓝染色。此外，将细胞接种到可活跃产生包封在纤维蛋白海绵片段(DentalGreenS.r丄，Baxter,都灵，意大利)中的基质的营养软骨组织培养物上。接种的发生是通过将5mL的含有2X106个细胞/mL终浓度的上述溶液力口入5'J60mm直4圣平才反(Falcon,BectonDickinsonLabwareEurope,米兰，意大利)上，这些平板预先用包封在纤维蛋白海绵片段(DentalGreenS.r丄，Baxter,都灵，意大利)中的软骨组织制备的。在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中温育细胞15天，每7天替换2mL的培养基。在15天培养周期的最后可见到三维的软骨组织结构。#:诱导朝向软骨细胞表型分化的细胞似乎是三维顺序排列的并活跃沉积基质，这可用爱茜蓝染色。间充质多能干细胞的分离和培养从全髋置换手术期间的股骨头(海绵组织和骨髓)中获取骨髓(BM)样品，从中提取间充质多能干细胞(MSC,间充质干细胞)。通过密度梯度(FicollPaque,Amersham)分离有核细胞，重悬浮在低葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM-LG,Gibco,GrandIsland,NY,USA)中，该培养基补充了10%胎牛血清(FBS,Sigma)、10U/mL青霉素G和40ng/mL庆大霉素。培养24小时之后，将培养基连同悬浮液中的任何细胞通过吸出去除，在贴壁细胞上添加新鲜培养基。将细胞生长在75cn^的瓶中，置于具有5。/oC02和37。C温度的培养箱中。当细胞达到80%汇合时，使用胰蛋白酶-EDTA将它们分离下来(37。C温育5分钟，接着加入5mL纯的FBS和5mL无添加物的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY)，收获悬浮液中的脱离细胞)，通过在单独的无添加物的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY,USA)中37°C、160g离心7分钟漂洗两次。将由此获得的沉淀中的细胞以lxl(^浓度重悬浮在新蛑的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY,USA)中，该培养基补充了10%胎牛血清(FBS，Sigma)、10U/mL青霉素G和40ng/mL庆大霉素。将l:4稀释后的细胞(终浓度2.5x104)重新接种。在该研究中，使用连续培养的第三次传代后的细胞。将如上所述获得的、肯定会被刺激朝向软骨细胞特化的MSC样品在60mm直径平板(Falcon,BectonDickinsonLabwareEurope,米兰，意大利)上的2mL原始培养基(如上所述)、8mL如下组成的最终溶液中生长15天补充10%胎牛血清(FBS,Sigma)、10U/mL青霉素G和40pg/mL庆大霉素的DMEM-LG(Gibco;GrandIsland,NY)，称出组合物所需的物质，将其稀释在C-BASEPLUS组合物中，得到l升的最终溶液。将细胞在带有人软骨片段(取自用于MSC的骨髓的相同供体)和纤维蛋白海绵片段(DentalGreenS.r丄，Baxter,都灵，意大利)的在60mm直径的平板中温育。在60mm直径平板(Falcon，BectonDickinsonLabwareEurope,米兰，意大利)中的10mL原始培养基(新鲜的DMEM-LG培养基Gibco;GrandIsland,NY,USA,其中补充10%胎牛血清Sigma，10U/mL青霉素G和40pg/mL庆大霉素)的中生长肯定会保持未分化多能干细胞的对照15天。在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中温育所有细胞15天，每7天替换2mL的培养基。滑膜细胞的分离和培养从股骨-胫骨关节腔内部的滑膜切除和刮除术期间的患者身上获取滑膜细胞(SynC)。将新鲜的滑膜组织切片在胶原酶(lmg/mL，每mL培养基，Sigma)中于37。C分解两小时。将沉淀在不含有任何添加物的DMEM-LG(Gibco;GrandIsland,NY，USA)中通过160g离心10分钟漂洗两次，然后将沉淀重悬浮在完全的4氐葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基([DMEM-LG]GIBCO;GrandIsland,NY,USA)中，该培养基补充了10。/o胎牛血清([FBS]Sigma)、10U/mL青霉素G和40pg/mL庆大霉素，最后接种在75cm2的烧瓶中，在5。/。C02和37。C温度下温育。24小时后，将培养基连同悬浮液中的细胞吸出，在贴壁细胞上添加新鲜培养基(DMEM-LG,Gibco;GrandIsland,NY,USA，其中补充10%FBS，Sigma,10U/mL青霉素G和40pg/mL庆大霉素)。将细胞在75cm2的烧瓶中，置于具有5。/oC02和37。C温度的培养箱中生长。当细胞达到80%汇合时，使用胰蛋白酶-EDTA将它们分离下来(37。C温育5分钟，接着加入5mL纯的FBS和5mL无添加物的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY)，收获悬浮液中的脱离细胞)，通过在单独的无添加物的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY,USA)中37°C、160g离心7分钟漂洗两次。将由此获得的沉淀中的细胞以lxlO6浓度重悬浮在新鲜的DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY,USA)中，该培养基中补充了10%胎牛血清([FBS]Sigma)、10U/mL青霉素G和40pg/mL庆大霉素。将l:4稀释后的细胞(终浓度2.5x104)重新接种。在该研究中，使用连续培养的二次传代后的细胞。将如上所述获得的、肯定会被刺激朝向软骨细胞特化的SynC样品在60mm直径平板(Falcon,BectonDickinsonLabwareEurope,米兰，意大利)中的2mL的原始培养基(如上所述)、8mL如下组成的最终溶液中生长15天补充10%胎牛血清(FBS,Sigma)、10U/mL青霉素G和40pg/mL庆大霉素的DMEM-LG(Gibco;GrandIsland,NY),称出组合物所需的物质，将其稀释在C-BASEPLUS组合物中，得到l升的最终溶液。将细胞在带有人类软骨片段(取自SynC的同一供体)和纤维蛋白海绵片段(DentalGreenS.r丄，Baxter,都灵，意大利)的60mm直径平板(Falcon,BectonDickinsonLabwareEurope,米兰，意大利)上温育。在60mm直径平板(Falcon，BectonDickinsonLabwareEurope,米兰，意大利)中的10mL原始培养基(新鲜的DMEM-LG培养基Gibco,GrandIsland,NY，USA,其中补充10%胎牛血清Sigma，10U/mL青霉素G和40ng/mL庆大霉素)中生长肯定会保持未分化多能干细胞的对照15天。在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中温育细胞15天，每7天替换2mL的培养基。初歩的细胞悬浮液在如上所述温育和刺激假定的软骨细胞表型之后，从所有研究样品中获取细胞悬浮液。通过将悬浮液在孔中上下吸取，用含2。/。利多卡因(SigmaAldrich,米兰，意大利)的PBS温育单核细胞样细胞系和半贴壁的外周血单核细胞5-8分钟，收集由此获得的溶液，如参考文献[3,4]中所述。用无添加物的RPMI1640(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)37。C下160g离心10分钟将细胞漂洗三次。在上述温育完成时，使用胰蛋白酶-EDTA分离汇合的MSC和SynC细胞(37。C下5分钟；接着加入5mL的纯FBS,收获悬浮液中的脱离细胞)，在单独的无添加物DMEM-LG培养基(Gibco;GrandIsland,NY)中37。C下160g离心7分钟漂洗两次。将获自样品沉淀的细胞和相应对照重悬浮在15mL管(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstrup,丹麦)中，终浓度5x105细胞/mL,用于随后的表型分析(蛋白质印迹，直接免疫荧光和FACS)。蛋白质印迹蛋白质印迹首先采用变性电泳(SDS-PAGE)以便通过消除氨基酸上可能影响迁移的电荷而根据分子量分开不同蛋白质。将悬浮在溶胞緩冲液(iy。SDS、30mMTrispH6.8、5%甘油)中的细胞样品在4°C下温育30分钟，该緩冲液中加入了蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，Calbiochem,SanDiego,CA,USA)。由此获得的溶胞产物在4°C下12,000rpm离心20分钟，收集上清液；使用Bio-Rad方法(BenchmarkPlus分析法，Bio-Rad)测定样品的蛋白质浓度。在电泳之前，在，-巯基乙醇和溴酚蓝存在时将样品煮沸5分钟。在12%凝胶(SDS-PAGE)上对样品进行电泳，然后转移到PVDF膜(PerkinElmerInc.)上。在室温下用甲醇浸透膜，随后在4。C下温育过夜，使用下面的在有5%脱脂奶粉的PBS中1:500稀释的第一抗体抗-CD34(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD14(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD44(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗國CD45(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD71(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD卯(SantaCmzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD29(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗曙CD105(SantaCmzBiotechnology,CA,USA)、抗CD117/c-KIT(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-内皮糖蛋白(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗II型胶原(SantaCmzBiotechnology,CA,USA)、抗-聚集蛋白聚糖(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-THY-l(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。漂洗五次之后，用缀合到辣根过氧化物酶(HRP,SantaCruzBiotechnologiesInc.,SantaCmz,CA，USA)上的相应二抗(1:1000)在室温下温育膜1小时。使用化学发光液体(SuperSignalWesternPico溶液,PierceBiotechnologyInc.,Rockford,IL,USA)显示相应条带，使用照相胶片捕获。免疫荧光流程用0.2mMMitoTrackerRed在37°C下温育细胞悬浮液10分钟。在室温下于PBS(pH7.4)中160g离心漂洗三次之后，将细胞沉淀在室温下重悬浮在固定液中l小时，固定液为含有4%低聚曱醛的RPMI1640、pH7.4。在PBS中漂洗三次之后，将细胞在4。C下重悬浮在PBS和0.1。/0Triton的溶液中1小时。在PBS中漂洗三次之后，将细胞接种到盖玻片上，让液体在空气中蒸发掉。用20%正常山羊血清封闭细胞1小时，用下面的缀合了R-藻红蛋白(PE)或异硫氰酸荧光素(FITC)的抗人单克隆抗体温育30分钟抗-CD34(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗体陽CD14(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD44(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗國CD45(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗画CD71(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD90(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD29(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD105(SantaCmzBiotechnology,CA,USA)、抗CD117/c-KIT(SantaCmzBiotechnology,CA,USA)、4元内皮斗唐蛋白(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗II型胶原(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗聚集蛋白聚糖(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗THY國l(SantaCmzBiotechnology,CA,USA)。对每种单克隆抗体都设计了带有相应同种型的特定对照(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。使用聚乙烯醇(moviol)将盖玻片封固在载玻片上，通过光学显微镜进行检查[l-2]。活才企和原型溶液所有样品都在含有抗生素(100单位/mL青霉素+100jLig/mL链霉素+160mg/L庆大霉素)的等渗盐水中室温下漂洗10分钟，共三次。然后将活检物切成三部分(对于每个患者，两份对照，一份待处理的才羊品),悬浮在15cm;f反(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstrup，丹麦)中的1xC-BASE溶液中。制备两种类型的对照一种阴性对照(l),只用等渗盐水和抗生素(如上所述)处理，一种阴性对照(2),用细胞培养基处理1.将对照活;险样品悬浮在15cm板(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstrup,丹麦)中的等渗盐水中。2.然后将对照活检样品置于15cm板(Lab-Tekchamberslides,Nunc,Kamstrup,丹麦)中的RPMI1640培养基中，所述培养基中补充了10%FBS(Celbio,米兰，意大利)100单位/mL青霉素100|ng/mL链霉素160mg/L庆大霉素(Schering-Plough,米兰，意大利)2mML-谷氨酰胺(LifeTechnologies;生长培养基)所有样品在Heraeus恒温控制的培养箱中37。C温度下、在含有5%C02(v/v空气中)的恒定气流的气氛中进行温育。培养中使用的所有活检组织构成了用于所研究细胞样品的三维生长的潜在共调节支持物。软骨基质染色流程在室温下用PBS(pH7.4)漂洗10分钟共三次后，将样品重悬浮在室温下的固定液中一小时，固定液为含有4%低聚甲醛的RPMI1640、pH7.4。用爱萏蓝色剂染处理样品。该染色剂由一组水溶性碱性多价染料组成。蓝色是由于分子中铜的存在。将PBS(pH7.4)中的P/。w/v爱茜蓝染色剂加入到3%乙酸溶液(pH2.5)中。在室温温育2小时之后，通过结合到磺化的和羧化的酸性粘多糖和糖蛋白(存在于基质中)上，该组合物永久地染色。对每个样品都制备特定对照。所有样品都在室温下用PBS(pH7.4)漂洗5分钟3次，然后在光学显微镜下观察。注意到软骨细胞中组成基质的类粘蛋白物质(蛋白聚糖、粘多糖、胶原(10型和2型))-故染成蓝色[5]。结果使用爱茜蓝比色法染色软骨基质國用C-BASE-INFUS溶液处理纤维蛋白海绵7天，该海绵带有获自活检组织并体外重建的软骨细胞。观察到了软骨细胞正在沉积基质，用爱萏蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。-用C-BASE溶液处理纤维蛋白海绵15天，该海绵带有获自活检组织并体外重建的软骨细胞。观察到了软骨细胞正在沉积基质，用爱茜蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。-未处理的外周血单核细胞对照(RPMI1640培养基，10%FBS，100单位/mL青霉素，100jug/mL链霉素，160mg/L庆大霉素，2mML國谷氨酰胺)。未观察到爱萏蓝染色。-来自外周血多能干细胞的未处理的对照单核细胞(CD14+,CD34+)(RPMI1640培养基，补充10%FBS,如意大利专利申请N。TO2005A000819中所述，并含有1000单位/mLLIF、50ng/mLM-CSF和3nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯，PMA)。未观察到爱茜蓝染色。國用C-BASE溶液处理与来自外周血多能干细胞的单核细胞共培养的软骨组织15天。这些细胞被诱导向软骨细胞表型分化，观察到了这些细胞是如何沉积基质的，用爱萏蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。誦用C-BASEPLUS溶液处理来自外周血多能干细胞的单核细胞15天。应当注意到，；故诱导向软骨细胞表型分化的细胞正在沉积基质并祐:爱茜蓝染色。國未处理的THP-1细胞(单核细胞样细胞系)对照(RPMI1640培养基，10%FBS，100单位/mL青霉素，100)ug/mL链霉素，160mg/L庆大霉素，2mML-谷氨酰胺)。未观察到爱萏蓝染色。國PSC-THP1细胞(单核细胞样干细胞系，其保藏号为ICLCPDNo.05005，于2005年10月18日保藏)(RPMI1640培养基，补充10%FBS,如意大利专利申请N。TO2005A000819中所述，并含有1000单位/mLLIF、50ng/mLM-CSF和3nM的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯，PMA)。未观察到爱茜蓝染色。-用C-BASE溶液处理与PSC-THP-1细胞共培养的软骨组织15天。这些细胞被谈导向软骨细胞表型分化，观察到了这些细胞是如何沉积基质的，用爱茜蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。-用C-BASEPLUS溶液处理PSC-THP-1细胞15天(PSC-THPl-CHONDROCYTE-LIKE软骨细胞系，其保藏号为ICLCPDNo.06001,源自单核细胞样干细胞系PSC-THP-1,其保藏号为ICLCPDNo.05005并于2005年10月18日保藏)。应当注意到，^L诱导向软骨细胞表型分化的细胞正在沉积基质并被爱萏蓝染色。國用C-BASE溶液和纤维蛋白海绵处理与MSC细胞(间充质干细胞)共培养的软骨组织15天。这些细胞被诱导向软骨细胞表型分化，观察到了这些细胞是如何沉积基质的，用爱茜蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。國未处理的对照MSC细胞(DMEM-LG,Gibco,GrandIsland,NY,USA),补充10%胎牛血清(Sigma,10U/mL青霉素G和40|Lig/mL庆大霉素)。未观察到爱茜蓝染色。-用C-BASEPLUS溶液处理MSC细胞15天。这些细胞被诱导向软骨细胞表型分化，观察到了这些细胞是如何沉积基质的，用爱茜蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。画用C-BASE溶液和纤维蛋白海绵处理与SynC细胞(滑膜干细胞)共培养的软骨组织15天。这些细胞被诱导向软骨细胞表型分化，观察到了这些细胞是如何沉积基质的，用爱茜蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。-未处理的对照SynC细胞(DMEM-LG,Gibco,GrandIsland,NY，USA),补充10%胎牛血清(Sigma,10U/mL青霉素G和40|ug/mL庆大霉素)。未观察到爱茜蓝染色。-用C-BASEPLUS溶液处理SybC细胞(滑膜干细胞)15天。这些细胞被诱导向软骨细胞表型分化，观察到了这些细胞是如何沉积基质的，用爱茜蓝可清晰地染色，以重叠层和三维的方式生长。蛋白质印迹通过蛋白质印迹针对下列标记物进行样品的表型分析抗-CD34(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD14(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗画CD29(SantaCruzBiotechnology,CA，USA)、抗國CD44(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD45(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD71(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗画CD90(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗画CD105(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD117/c-KIT(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-内皮糖蛋白(SantaCruzBiotechnology,CA:USA)、抗-II型胶原(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-聚集蛋白聚糖(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-THY-l(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。五次漂洗之后，用缀合了辣根过氧化物酶(HRP:SantaCruzBiotechnologiesInc.,SantaCruz,CA,USA)的相应二抗(1:1000)与膜在室温下温育1小时，如下面的表4到IO所报道的那样。免疫荧光流程通过直接免疫荧光和细胞荧光光度(FACS)技术针对以下标记物对样品进行表型分析30分钟与R-藻红蛋白(PE)或异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗誦CD34(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗誦CD14(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD44(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD45(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗画CD71(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗画CD卯(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD29(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD105(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-CD117/c-KIT(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-内皮糖蛋白(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-II型胶原(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、抗-聚集蛋白聚糖(SantaCmzBiotechnology,CA,USA)、抗-THY國l(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。对每种单克隆抗体都制备了带有相关同种型的特定对照(SantaCruzBiotechnology,CA,USA)。THP-1与PSC-THP1的表征将与CD34、CD14、CD45、CD90、CD117/c-KIT和c-MET的表达相关的结果以如下的定量等级方式表示表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>图例…-=没有任何荧光+=每个光场l-5个荧光细胞++=每个光场6-10个荧光细胞^+++每个光场10-20个荧光细胞++++=每个光场20-50个荧光细胞+++++=每个光场〉50个荧光细胞来自外周血的单核多能干细胞(MONO-PSC)的表征将与CD34、CD14、CD45、CD90、CDl17/c-KIT和c-MET的表达相关的结果以如下的定量等级方式表示表5<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>图例——=没有任何荧光+=每个光场1-5个荧光细胞++=每个光场6-10个荧光细胞+++=每个光场10-20个荧光细胞++++=每个光场20-50个荧光细胞+++++每个光场>50个荧光细胞间充质干细胞(MSC〗的表征将与CD34、CD14、CD44、CD45、CD29、CDl17/c-KIT、CD71、CD90和CD105的表达相关的结果以如下的定量等级方式表示表6<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>图例——=没有任何荧光+=每个光场1-5个荧光细月包++=每个光场6-10个荧光细胞+++=每个光场10-20个荧光细胞++++=每个光场20-50个焚光细胞2+++++每个光场〉50个焚光细胞滑膜细胞(SYN)的表征将与CD34、CD14、CD45、CD29、CD117/c画KIT、CD71、CD90和CD105的表达相关的结果以如下的定量等级方式表示表7表面抗原SYNCD34---CD14---CD45---CD29—CD117/c-KIT---CD71+CD90+++CD105+++图例——=没有任何荧光+=每个光场1-5个荧光细胞++=每个光场6-10个荧光细月包+++=每个光场10-20个荧光细胞++++=每个光场20-50个荧光细胞+++++每个光场>50个荧光细胞来自软骨组织活检(软骨细胞)的软骨细胞的表征将与CD34、CD14、CD45、CD29、CD117/c國KIT、CD71、II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达相关的结果以如下的定量等级方式表示表8表面抗原软骨细胞CD34---CD14---CD45---CD29—CD117/c-KIT+CD71+II型胶原++++聚集蛋白聚糖+++++图例——=没有任何荧光+=每个光场1-5个荧光细胞++=每个光场6-10个荧光细胞+++=每个光场10-20个荧光细胞++++=每个光场20-50个荧光细胞+++++每个光场〉50个荧光细月包源自PSC-THP1的软骨细胞系PSC-THP1-CH0NDR0CYTE-LIKE的表征将与CD34、CD14、CD45、CD29、CD117/c-KIT、CD71、CD卯、II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达相关的结果以如下的定量等级方式表表9<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>图例—…=没有任何荧光+=每个光场1-5个荧光细胞++=每个光场6-10个焚光细月包+++=每个光场10-20个荧光细胞++++=每个光场20-50个荧光细胞+++++每个光场〉50个荧光细胞被处理细胞与未处理对照的表征将与II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达相关的结果以如下的定量等级方式表示表10<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>图例—=没有任何条带-/+=条带的微量存在+=存在细的条带++=存在中等的条带+++=存在宽的条带++++=存在高的条带+++++=存在丰富的条带当然，在不违背本发明原则的情况下，实施细节和具体实施方式可相对于本文仅仅由实施例所描述和例证说明的内容进行大量改变，即使如此，也不背离如下面权利要求所定义的本发明的范围。C-BASE-INFUS对狗的临床研究流程1.登记二十个病例(纯种狗，不同大小、体重、性别和年龄)2.入选标准关节变化。3.临床程序对所有^皮;险查的狗都将采用下面的程序。4.方法所接种溶液的量等于被抽出并分析的滑液的量。a.时间起点-收集病历信息，进行包括全血液化学测试在内的临床检查，包括乳酸盐以便评估代谢氧化；-对感兴趣的关节进行X-射线照射；-ROM(关节活动范围)；-关节镜检查；-排除任何关节内刮除术；-用抽吸进行关节穿刺术，对滑液进行细胞形态学和生化检查；-对关节软骨样品进行组织学检查；-关节内接种与所抽出滑液量相等量的测试量。每周一次，进行三/四次，这取决于初期疾病才莫式的严重性，进行滑液检查，将溶液重新注入到关节内。.b.处理周期结束-用抽吸进行关节穿刺术，对滑液进行细胞形态学和生化检查；-对关节软骨样品进行组织学检查；-对感兴趣的关节进行X-射线照射；曙ROM(关节活动范围)；-乳酸血症；-临床检查和报告。务^;f濕的每^细應夢检查^多遽凝l辦疾病付发'j,要^痊奮#^不,,力j^^遽/力^治^爽屑趟^。乂^类窗寧和^4A^;^r不谬以任^r才4'炎y5^以避义f挽潜果。摩逸举的,發皇^/9卯羊""经结果在20条属于不同品种且不同大小的狗身上进行的临床研究使用了称为"C-BASE-INFUS"的产品，该产品在所有受试者中显示了极好的耐受能力，没有任何明显的全身效应，与年龄、大小、性别和关节部位无关。在85%的病例中ROM(关节活动范围)都增加了，同时在87%的病例中观察到了行走的临床改善。在80%的病例中都减少了触痛。滑液粘度总是增加的，引起了增强的关节润滑，这表明了关节病理微环境的物理参数的明显改变。滑液本身显示出了积极发展才莫式，趋向于正常化的实验室数值。X-射线显示了DJD(退化性关节病)的减緩或者稳定化。有人指出，20条被处理狗的主人对于关节内接种是满意的，这是相对容易的。按照我们的看法，该制剂显然能够将关节的胞外微环境恢复到生理状况，这可能代表了有效创新的且有趣的替代治疗法。在大多数严重病例中不能排除FANS与产品"C-BASE-INFUS"的联合使用的设想，以便将镇痛药理活性与对关节微环境的正常化活性相结合，从而进一步改善预后。最后，再次强调，"CBASEINFUS"制剂的使用未显示任何种类的不耐受的信号，在所有的二十只被处理狗中都显示了极好的耐受性，没有明显的全身效应。讨论关节软骨疾病可影响到任何年龄的个体，但是当它们在引领积极生活的年轻患者中发生时是特别重要的。已知与显示强大再生能力的骨组织相反的是，透明软骨，有时也被认为是肌肉骨骼装置的惰性组织，其特征在于缺乏任何的血液、淋巴或神经支持，这些支持对于组织修复来说是必不可少的。事实上只有物质的少量损失才能由纤维软骨组织补充，而更大的损失4艮少被补充相当深的损伤(C^eAnge分级III-IV级)不会经历自愈过程，在长期的过程中它们将产生关节表面的退化。生理组织微环境的体外复原技^的发展[20-23]。'我们的研究证实了关节软骨损伤的治疗中生理组织微环境的体外和体内再生方法的有效性。生理微环境的复原迅速导致了功能正常的软骨基质的重建。C-BASE、C-BASEPLUS和C-BASE-INFUS溶液的胞外活性加上适于定居细胞的最佳微环境的复原，这使得细胞能够适当起作用地进行正常基质(透明软骨)的生理沉积以及被处理关节的功能恢复。透明软骨的被处理关节的外观与完好关节的外观是类似的，这表明了C-BASE-INFUS溶液的胞外活性，它使得定居细胞能够恢复它们的正常生理活动(正常软骨基质的沉积)。另一方面，用C-BASE、C-BASEPLUS和C-BASE-INFUS处理的关节中缺乏纤维软骨的任何沉积，而纤维软骨的沉积是针对病理性损伤的典型应答，这可能提供了反对胞内纤维组织修复活性普遍存在这一观点的证据。用C-BASE、C-BASEPLUS和C-BASE-INFUS溶液培养所获得的短期(7天)和两个月期间的体外和体内组织学结果证实了随时间持续存在的形态最佳的透明软骨的形成。所获得的结果似乎表明C-BASE-INFUS可被认为是最佳培养基，它高效的。'''参考文献1.TsuchiyaS,Wa/.Int.J.Cancer.1980;26:171176.2.Rabinovitch,M.andDeStefano,M.J.J.Exp.Med.1976;143:290304.3.McDermottAGP，"a/.Clin.Orthop.1985;197:96-101.4.GrandeDA,Wa/.J.Orthop.Res.1989;7:208-18.5.FrenchMM,Wa/.J.Cell.Biol.1999May31;145(5):1103-15.权利要求1.能够加速干细胞分化为具有软骨细胞表型的细胞的组合物，特征在于它包括在生理学可接受的载体或稀释剂中组合的至少一种生长因子、至少一种蛋白水解酶以及至少一种选自糖、氨基酸、维生素因子、维生素、核苷酸和核苷的物质。2.根据权利要求1的组合物，特征在于所述的至少一种蛋白水解酶选自木瓜蛋白酶、胶原酶(优选iA型、n型、iv型)、沙雷肽酶、乙酰肝素酶、DNA酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶、緩激酶、梭菌肽酶、由嗜酸乳杆菌表达的酶、由曲霉属表达的酶、蛋白酶、蒜氨酸酶、纤维蛋白溶酶。3.根据权利要求1或2的组合物，特征在于所述至少一种生长因子选自TGF-P(转化生长因子P)、LIF(白血病抑制因子)、ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、胰岛素、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、IL-2(白细胞介素-2)、PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯)、自体血清、皮质类固醇、副交感神经阻滞剂、胰高血糖素。4.根据权利要求1到3任一项的组合物，特征在于所述至少一种氨基酸选自曱硫氨酸、胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、组氨酸-HCl-H20、赖氨酸、赖氨酸-HCl、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、酪氨酸二钠盐、缬氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸。5.根据权利要求1到4任一项的组合物，特征在于它包括至少一种肽，优选寡肽，甚至更优选三肽。6.根据权利要求5的组合物，特征在于所述至少一种肽选自谷胱甘肽、胶原、弹性蛋白、小麦提取物。7.根据权利要求1到6任一项的组合物，特征在于所述至少一种糖选自单糖、多糖、其醇衍生物或其混合物。8.根据权利要求7的组合物，特征在于所述糖选自葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、岩藻糖、果糖、硫酸乙酰肝素、果胶、淀粉。9.根据权利要求1到8任一项的组合物，特征在于它进一步包括至少一种粘多糖。10.根据权利要求9的组合物，特征在于所述至少一种粘多糖选自透明质酸、錄u酸软骨素。11.根据权利要求1到IO任一项的组合物，特征在于所述至少一种维生素选自视黄酸、视黄醇、抗坏血酸、泛酸、D-泛酸钙、吡哆醇、吡喷醇-HCl、叶酸、烟酰胺、核黄素、钴胺素、对氨基苯曱酸和生物素。12.根据权利要求1到11任一项的组合物，特征在于所述至少一种维生素因子选自环己六醇、肌醇、氯化胆碱、丙酮酸、丙酮酸钠、腐胺和腐胺-HCl。13.根据权利要求1到12任一项的组合物，特征在于它进一步包括盐。14.根据权利要求13的组合物，特征在于所述至少一种盐选自葡糖酸钓、磷酸钙、碳酸氪钠、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、磷酸钾、氯化钠、硝酸钓、氯化锌、硝酸铁、D-泛酸钓、丙酮酸钠、酪氨酸二钠盐。15.根据权利要求1到14任一项的组合物，特征在于所述至少一种蛋白水解酶是以这样的量存在的，即其表示为相对于总体积的重量/体积，包括1ng/L-2g/L,优选0.01mg/L-20.0mg/L。16.根据权利要求1到15任一项的组合物，特征在于所述至少一种氨基酸是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的体积百分比，包括0.001%-40%，优选0.01%-20%。17.根据权利要求1到16任一项的组合物，特征在于所述至少一种核苷酸或核苷是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的体积百分比，包括0.0001%-20%,优选0.01%-2%。18.根据权利要求5到17任一项的组合物，特征在于所述至少一种肽是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的体积百分比，包括0.001%—40%,优选0.01%-20%。19.根据权利要求1到18任一项的组合物，特征在于所述至少一种糖是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的体积百分比，包括0.001%-40%,优选0.01%-20%。20.根据权利要求9到19任一项的组合物，特征在于所述粘多糖是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的重量/体积，包括0.01mg/L-5g/L,优选0.1mg/L-200mg/L。21.根据权利要求1到20任一项的组合物，特征在于所述至少一种维生素或所述至少一种维生素因子是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的体积百分比，包括0.0001%-40%，优选0.001%_20%。22.根据权利要求1到21任一项的组合物，特征在于所述的生长因子是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的重量/体积，包括1ng/L-2g/L,优选1ug/L-20mg/L。23.根据权利要求2到22任一项的组合物，特征在于所述的皮质类固醇是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的体积百分比，包括0.0001%-20%，优选0.0001%-1%。24.根据权利要求13到23任一项的组合物，特征在于所述至少一种盐是以这样的量存在的，即其表示为相对于组合物总体积的重量/体积，包才舌0.01|ug/L—20g/L,优选10|ug/L—10g/L。25.根据权利要求1到24任一项的组合物，它是包括细胞培养溶液作为载体或稀释剂的细胞培养基。26.根据权利要求1到24任一项的组合物，它是用于人或兽医用途的包括药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物或医疗设备。27.权利要求1到24任一项所限定的组合物在用于体外刺激多能干细胞分化为具有软骨细胞表型的细胞，和/或恢复来自软骨组织的软骨细胞的原有营养性中的用途。28.权利要求1到24任一项所限定的组合物在制备能够刺激多能干细胞分化为具有软骨细胞表型的细胞，和/或恢复来自软骨组织的软骨细胞的原有营养性的药物中的用途。29.—种组合物在制备能够原位刺激多能干细胞分化为具有软骨细胞表型的细胞，和/或恢复来自软骨组织的软骨细胞的原有营养性的医疗设备中的用途，所述组合物包含在生理上可接受的载体或稀释剂中组合的至少一种糖、至少一种氨基酸和至少一种维生素因子或维生素，所述医疗设备意欲施用于病理部位，所述病理部位中存在产生蛋白水解酶的促炎细胞。30.用于使多能干细胞体外分化为具有软骨细胞表型的细胞的方法，包括步骤i)提供多能干细胞；ii)提供根据权利要求25的培养基；iii)在所述培养基中培养所述多能干细胞，以便获得具有软骨细胞表型的细胞。31.根据权利要求30的方法，特征在于所述培养基包括巨噬细胞集落刺激因子和白血病抑制因子中的至少一种。32.根据权利要求30或31的方法，特征在于所述培养基包括至少一种白细胞介素，优选白细胞介素-2或白细胞介素-6。33.根据权利要求30到32任一项的方法，特征在于所述培养基包括至少一种抗生素，优选庆大霉素、青霉素或链霉素。34.根据权利要求30到33任一项的方法，特征在于所述培养步骤iii)是在支架存在下进行的。35.根据权利要求34的方法，特征在于所述支架选自纤维蛋白、胶原、软骨片段、海藻酸盐、透明质酸、透明质酸盐、聚乙醇酸、羟磷灰石、在多聚链上用酰胺基团修饰的羧曱基纤维素。36.根据权利要求30到35任一项的方法，特征在于所述多能干细胞。37.根据权利要求30到35任一项的方法，特征在于所述多能干细胞是细胞系PSC-TP1,该细胞系于2005年10月18日保藏于高级生物技术中心，Interlab细胞系保藏中心，热那亚，意大利，保藏号为ICLCPDNo.5005。38.通过权利要求30到37任一项的方法获得的具有软骨细胞表型的衍生细胞系。39.根据权利要求38的衍生细胞系，特征在于所述衍生细胞系是细胞系PSC-THP1-CH0NDR0CYTE-LIKE,该细胞系于2006年3月21曰保藏于高级生物技术中心，Interlab细胞系保藏中心，热那亚，意大利，保藏号为ICLCPDN。06001。40.通过权利要求30到37任一项的方法在根据权利要求25的培养基中可获得的细胞在制备能够刺激具有软骨细胞表型的多能干细胞的体内分化，和/或恢复来自软骨组织的软骨细胞的原有营养性的药物中的用途。41.根据权利要求40的用途，其中所述培养基进一步包括软骨细胞基质。42.根据权利要求40或41的用途，其中所述药物能够通过关节内渗入进行施用。43.生产软骨细胞基质的方法，包括培养根据权利要求38或39的具有软骨细胞表型的衍生细胞系的步骤。44.根据权利要求43的方法，特征在于所述衍生细胞系是在生长因子存在下进行培养的。45.根据权利要求44的方法，特征在于所述生长因子是以这样的量使用的，即其表示为相对于组合物总体积的重量百分比，包括0.01ng/L-200g/L,优选1ng/L-200mg/L。46.试剂盒，包括用于在软骨再生治疗中同时、顺序或单独使用的至少一种蛋白水解酶、至少一种生长因子以及糖、氨基酸、维生素因子、维生素、核苷酸和核苷中的至少一种。47.根据权利要求46的试剂盒，特征在于所述至少一种蛋白水解酶选自木瓜蛋白酶、胶原酶(优选IA型、II型、IV型)、沙雷肽酶、乙酰肝素酶、DNA酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶、緩激酶、梭菌肽酶、由嗜酸乳杆菌表达的酶、由曲霉属表达的酶、蛋白酶、蒜氨酸酶、纤维蛋白溶酶。48.根据权利要求46或47的试剂盒，特征在于所述至少一种氨基酸选自曱硫氨酸、胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、组氨酸-HC1-H20、赖氨酸、赖氨酸-HCl、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、酪氨酸二钠盐、缬氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸。49.根据权利要求46到48任一项的试剂盒，特征在于所述至少一种生长因子选自转化生长因子P、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒、胰岛素、巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-2、佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯、自体血清。50.根据权利要求46到49任一项的试剂盒，特征在于所述生长因子是与糖和/或盐结合的。51.根据权利要求50的试剂盒，特征在于所述的糖选自葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、岩藻糖、果糖、硫酸乙酰肝素、果胶、淀粉。52.根据权利要求50或51的试剂盒，特征在于所述盐选自葡萄糖酸钙、磷酸4弓、碳酸氢钠、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、磷酸钾、氯化钠、硝酸钓、氯化锌、硝酸4失、D-泛酸4丐、丙酮酸钠、酪氨酸二钠。全文摘要描述了体外用作培养基或者体内用作药物组合物或医疗设备的组合物，它能够加速干细胞分化成具有软骨细胞表型的细胞并能够恢复软骨细胞的原有营养性(trophism)。组合物包括在生理学可接受的载体或稀释剂中组合的至少一种蛋白水解酶、至少一种生长因子以及糖、氨基酸、维生素因子、维生素、核苷酸和核苷中的至少一种物质。也描述了使干细胞分化成为具有软骨细胞表型的细胞的方法，由该方法获得的细胞及其用途，例如在人或动物细胞治疗中的用途，例如通过CBMP(基于细胞的药用产品)。文档编号A61L27/38GK101583710SQ200780022328公开日2009年11月18日申请日期2007年4月12日优先权日2006年4月14日发明者A·庞泽托,C·塞萨诺,E·德维沃,E·莫拉,G·P·佩斯卡莫纳,G·卡瓦洛,G·西塞罗,L·康图,L·格纳罗,M·A·鲁斯,M·萨拉,T·德尼森科申请人:都灵大学德利研究所