专利名称：：通过修饰异常或反常表达基因的表达来治疗性干预个体的遗传病的制作方法通过修饰异常或反常表达基因的表达来治疗性干预个体的遗传病本发明涉及遗传病领域。具体地说，本发明涉及通过在个体中矫正遗传病的继发效应来改善遗传病的治疗。遗传病是由个体的遗传物质的异常所引起的疾病。疾病在个体中的表达不仅取决于遗传因素，环境因素也起作用。遗传病(遗传障碍，geneticdisorder)的一种可能的分类是分为两种不同的类型单基因病或多基因病。单基因遗传病是由发生在一种基因的DNA序列中的突变所引起。存在6,000种以上的已知单基因病(人基因组计划4言息(HumanGenomeProjectInformation))。实例是嚢性纤纟1M匕、镰状细胞贫血、马凡综合征、亨廷顿病、以及遗传性血色素沉着病。单基因病以可识别模式进行遗传常染色体显性、常染色体隐性、以及X连锁。多基因遗传病是由多基因中的突变所引起。在遗传病组内可以区分的两种类型是染色体病和线粒体病。染色体遗传病是由染色体结构异常所引起。染色体结构异常如缺少或额外拷贝或严重断裂(grossbreak)以及再连4妄(易位)，可以导致疾病。可以通过显微检查来检测某些类型的较大染色体异常。唐氏综合征或第21号染色体三体性(trisomy21)是当人具有第21号染色体的三个拷贝时发生的常见病症。线粒体遗传病是相对罕见类型的遗传病。这种类型的病症是由线粒体的非染色体DNA中的突变所引起。每个线粒体可以包含6DNA的5至10个环状片(circularpiece)。染色体以及线粒体遗传病可以是单基因疾病或多基因疾病。其中已发生突变的基因的鉴定提供了一种可能性来开发特异性疗法。在过去的十年中，已积极研究了基因的鉴定，其涉及各种遗传病。人基因组计划，其实际上已鉴定人DNA中的所有基因，在这种类型研究的进展中具有重要作用。许多遗传病是由关键基因中的缺损所引起。经常，缺损导致受影响基因的产物没有功能或降低量的功能。利用上述遗传缺损的潜在原因的分子知识进行的疗法通常目的在于向受影响细胞提供(部分地)功能基因产物。在本发明中，已发现，不同于受影响基因的其它基因在所述个体的细胞中可以^皮脱调节(下调，deregulate)，以及所述脱调节可以增加疾病的严重性和/或症状。意想不到地，甚至当受作为遗传缺损的基础的异常表达并不直接涉及受遗传缺损影响的蛋白质的功能时，发现了这种脱调节(异常表达)。因此本发明的一个目的是，通过调节所述异常表达基因的表达来矫正所述遗传缺损在所述患者中的至少一种继发性、潜在疾病恶化效应。因此，似乎是，除可以被确定为遗传病的原因因素的突变基因之外，还存在其它异常表达的基因，虽然那些基因似乎并不直4妄受到所述突变基因或其正常配对物的影响。本发明鉴定了若干所述异常表达基因。脱调节基因(异常表达基因)的表达不同于健康个体中的正常情况。上述脱调节表达、异常表达不是所希望的。在由分化细胞中的缺损引起的遗传病中进行了本发明的观测。已发现，甚至当受突变(遗传缺损的原因)影响的基因在所述前体细胞中并不正常表达时，在所述分化细胞的前体中基因已经可以-故脱调节。换言之，在不同于分化细胞(其通常被认为表达所述遗传病的表型)的其它细胞中发现了所述异常表达基因。本发明为遗传病的治疗，尤其为由所述个体的分化细胞中(部分)缺乏基因产物的功能或没有基因产物所引起的遗传病的治疗，提供了新的理解。在本发明中，在所述分化细胞的前体细胞的培养中或直4妄在患者中，对所述异常表达基因的表达进4i^修饰(modify)。当用于所述前体细胞的培养时，在所述前体细胞移植到患者以后，它可以增强所述前体细力包形成新分化细胞的能力，乂人而改善所述细胞移才直治疗的成功。当直接应用于患者时，本发明才是供了一种方法，用于在个体中减轻遗传病的恶化症状，其中所述症状优选为所述前体细胞分化成所述分化细胞的能力下降，其中所述疾病是所述个体的分化细胞中功能失常(功能不良)基因的结果，所述方法包括在所述前体细胞中修饰至少一种异常表达基因的表达，其中所述异常表达基因不是所述功能失常基因。功能失常基因和由其缺损引起的直4妄岁丈应通常牙尔"f乍原、发岁文应(#刀士台岁文应，primaryeffect),而随后由于细胞功能失常(包括所述遗传缺损)而发生的间接效应经常称作继发效应。这些继发效应通常并不是基因功能失常的直4妄结果。本发明进一步提供了一种化合物在用于修饰至少一种基因的表达、用于制备减轻个体中遗传病的症状的药剂中的应用，其中所述疾病是所述个体的分化细胞中遗传缺损的结果，其中所述基因在涉及作为所述遗传缺损(功能失常基因)的基础的突变。遗传缺损通常影响基因或其产物的至少部分功能。这可以由各种各样的突变引起。例如，突变可以是在基因的编码区中，从而导致缺损蛋白质/RNA的生产。另一方面，突变还可以是在一个或多个控制基因产物的表达的调节序列中。当在细胞中基因产物的水平、或在细月包中的表达时间发生变4匕时，这才羊的突变还可以导致所述基因的基因产物的(部分)功能的丧失。突变的类型也可以变化。突变可以是例如缺失、插入、倒位或点突变。还存在这样的突变，其是所谓的沉默突变，即，其并不显著影响个体的健康。上述突变的实例是密码子中的点突变，由于编码潜力的丰余，其并不改变^皮加入蛋白质中的氨基酸。很显然，沉默突变并不在本发明的范围内。突变基因(作为遗传病的原因，如在本发明中所使用的)是具有非沉默突变的基因。体内细l包通常具有有限的生命期(寿命)。许多这些细胞是由所谓的前体细月包加以补充。例如，前体(干)细胞连续补充死皮月夫细胞。所谓的干细胞类似地补充肠内层的细胞。通常通过与前体细胞(称作成肌细胞)的融合来(再)产生肌细胞；用前体细胞(其最终来自个体的骨髓中)来补充血细胞。仅当前体细胞在称作分化的过程中中止其原始状态时，才可以发生再生。前体细胞本身还可以具有有限的生命期和/或活性，并且如果是如此，则用具有更长生命期和/或再生潜力的其它前体细力包来更换它们。具有有限生命期和有限自我更新潜力的端细胞称作分化细胞，而经常具有更大自我更新潜力的前体称作非分化细胞。后者经常起因于以下事实分化细胞呈现前体并不呈现的功能。在一种优选的实施方式中，所述前体细胞是成肌细胞和/或其前体。在一种优选的实施方式中，所述分化细月包是力几细月包。'患有遗传病的个体可以呈现许多症状。当才是及减轻疾病的症状时，是指至少降4氐症状的严重性。在力几萎缩的情况下，例如，该疾病的症状尤其包括肌力随年龄而降低、肌质量随年龄而降低、有限的生命期以及生活质量随年龄而降低(例如，不能4于走、依赖于护理和药疗法)。在月几萎缩的实例中，当和未治疗个体(其具有和经治疗个体没有进;f亍治疗所相同的预后)相比时，减轻症状通常可以改善"几力、生命期和/或改善生活质量。在患有所述遗传病的个体中异常表达的基因，和在健康个体中生理上表达相同的基因相比，可以表达太〗氐或太高。在才艮据本发明的方法或应用中，修饰表达包括当低于正常状态下的所述基因表达时，提高所述异常表达基因的表达；或当高于所述正常状态下的9所述基因表达时，降低所述异常表达基因的表达。当表达太低时提高表达或当表达太高时降低表达可矫正原发性遗传缺损的继发性变化并减轻遗传病的症状。在这种情况下，所述异常表达基因的表达净皮带回到生理上更可^妄受的、更可行的和/或更通常的水平。在本发明的一种优选的实施方式中，所述异常表达基因的表达基本上被正常化。生理上可4妻受的、更可行的和/或更通常的水平将经常是为大约正常水平的水平。正常水平是在相同年龄和体质的健康个体中可以发J见的水平。生理上可4姿受的、更可4于的和/或更通常的水平可以落在正常范围之外，但仍然为个体提供足够的功能。在一种优选的实施方式中，本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中修饰所述表达包括々妄近正常状态的水平。可以以许多方式来实现^,饰表达。可以例如通过施加反义疗法或通过给予阻抑蛋白(其结合于所述异常表达基因的启动子)来实现降低异常表达基因的表达。例如通过加入转基因(其表达所述异常表达基因)、通过加入和/或活化转录因子(其刺激所述异常表达基因的表达)和/或通过活化所述异常表达基因的启动子和/或增强子序列来实现提高异常表达基因的表达。在本发明的一种优选的实饰表达。目前有许多不同的反义方式来下调节(down-regulate)基因产物的生产。借助于Watson-Crick杂交，反义4支术采用寡核苷酸类似物来结合于把RNA。在结合以后，反义制剂使靶RNA不能降解或诱导耙RNA的降解。反义制剂还可以改变剪接。在过去的十年中，已获悉许多关于反义的基本机制，医药化学，以及反义分子的药理性能、药物动力学性能、以及毒理性能。已证明反义技术在基因功能4t(functionalisation)和輩巴i正实(革巴确i人，targetvalidation)方面是有价值的。借助于一种销售药物，福米韦生，以及大约20种处于临床开发中的反义药物，反义药物在治疗各种各样疾病方面是重要药物(关于综述，参见[l])。某些更新的反义方式的非限制性实例是干扰RNA(RNAi)、樣么小RNA以及剪接干扰技术如外显子跳跃。优选作为单链分子或作为一部分发夹型分子给予反义序列。可以直接给予反义序列或借助于(病毒转导的)表达盒在细胞中产生反义序列。优选作为基因递送载体的一部分向细胞提供反义寡核苷酸。这样的载体优选为脂质体或病毒基因递送载体。脂质体在本领域中是众所周知的并且许多变体可用于基因转移目的。各种病毒基因递送目前用来将基因转移到靶细胞中。在本发明中，优选使用那些病毒载体，其并不表达它们自己的基因而仅表达转移的基因。因而反义分子可以存在于基因递送载体中。在病毒载体中，优选作为表达盒提供反义分子，其中表达盒编码包含所述反义寡核苷酸的转录物。优选的病毒递送载体是腺病毒载体并且更优选腺相关病毒载体。因此本发明还提供上述表达盒、载体以及基因递送载体。本领域」技术人员能够i殳计适宜的转录物。对于本发明来i兌，优选的是PolIII驱动的转录物。优选以与Ul或U7转录物的融合转录物的形式。如参考文献[2-4]所述，可以产生这样的融合。在本发明中，寡核苷酸是DNA或RNA核苷酸的多聚体(通常在5和300个核苦酸之间)。可以体外或体内合成寡核苦酸。在后面的范围中，它们有时还称作反义分子/序列、siRNA、miRNA等。在一种优选的实施方式中，寡核普酸包含5-300个之间的核苦酸，更优选15-100个之间的核苷酸，更优选15-40个之间的核苷酸以及更优选15与25个之间的核普酸。对于所述寡核香酸或其功能等效物的互补性区来说，所述长度是优选的。15与40个之间的核苷酸的寡核苦酸或其功能等效物可以与所述寡核苷酸或功能等效物与其互补的区具有一个或两个4晉配。在所述一个或两个4晉配的情况下，互补性区优选包含至少15个核苦酸的连续的一,炎序列(stretch)。即，互补于15个核苷酸的任何一段序列的寡核苷酸或其功能等效物可以具有一个或两个错配。优选所述寡核苷酸或其功能等效物具有一个或更优选没有与它与其互补的区的错配。如果寡核香酸具有15个以上的核苦酸，则它可以具有高达15%的4晉配。如果基于百分比规则计算的错配数目是两个整数之间的数目，则错配的最大容许数目是更高的整数数目。例如，具有16个核苷酸互补性的连续的一革殳序列的寡核苦酸可以具有16*0.15=2.4个核苦酸错配。因此，在此寡核苷酸中容许的错配的最大数目是3。在一种优选的实施方式中，产生的寡核苷酸互补于15与50个之间的核苷酸的连续部分，并且更伊乙选所述寡核苦酸包含RNA以及甚至更伊乙选所述寡核苷酸是2'-0-甲基RNA并具有全长石危代磷酸主链(full-lengthphosphorothioatebackbone)。2'0-甲基RNA是核酉吏类似、物，其特征在于良好的杂交性能(它赋予互补(complimentary)的DNA或RNA)以及与天然核酸相比，抵抗酶促降解的增加的稳定性。目前临床开发中的大多数反义寡核苷酸掺入好u代磷酸主链4奮饰，以促进对核酸酶的抗性同时保存通过核糖核酸酶(RNase)H刺激切割mRNA把的能力。互补寡核苷酸优选互补于所述外显子RNA的13与50个之间的核苦酸的连续部分。在另一种实施方式中，互4卜寡4t苷酸互^卜于所述外显子RNA的16与50个之间的4亥苷酸的连续部分。优选地，寡核苷酸互补于所述外显子RNA的13-25个之间的核苷酸的连续部分，优选所述外显子RNA的14与25个之间的核香酸。不同类型的核酸可以用来产生寡核苷酸。优选地，寡核普酸包含RNA，因为RNA/RNA杂交体是非常稳定的。因为外显子跳跃技术的目的之一是指导在主体(受治疗者)中的剪接，所以优选的是，寡核苦酸RNA包括一种》务饰，其向RNA^是供另外的性能，例如，对内切核酸酶和RNaseH(核糖核酸酶H)的抗性、另外的杂交强度、增加的稳定性(例如在体液中)、增加或降低的柔性、降低的毒性、增加的胞内运输、组织特异性等等。优选地，所述修饰包括2'-0-曱基-硫代磷酸寡核糖核香酸修饰。优选地，所述修饰包括2'-0-甲基-硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸修饰，锁核酸、PNA、或吗啉代修饰，或它们的组合。在一种实施方式中，本发明提供了一种杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含寡核苷酸，其包含2'-0-曱基陽硫代磷酸寡(脱氧)核糖核香酸修饰和锁核酸。这种特定组合包括更好的序列特异性(和由锁核酸构成的等效物相比)，以及当和由2'-0曱基-硫代磷酸寡(脱氧)核糖核苷酸修饰构成的寡核苷酸相比时包括改善的效力。随着核酸才莫拟4支术的出现，已可以产生这样的分子，其具有和核酸本身类似的、优选相同的杂交特性(在种类上，不一定在量上)。这样的等效物当然也是本发明的一部分。上述才莫拟等效物的实例是肽核酸、锁核酸和/或吗啉代磷酰二胺(morpholinophosphorodiamidate)。本发明的寡冲亥香f臾等岁文斗勿的适宜的^f旦非限定性实例可以参见(Wahlestedt,C.etal.(2000)，Elayadi,A.N.&Corey,D.R.(2001)，Larsen，H丄，Bentin，T.&Nielsen,P.E.(1999)，Braasch,D.A.&Corey,D.R.(2002),Summerton，J.&Weller,D.(1997)。一种或多种等效物4皮此之间和/或连同核酸的杂交体当然也是本发明的一部分。在一种优选的实施方式中，一种等效物包含锁核酸，因为锁核酸呈现更高的靶亲和性和降低的毒性，因而显示出更高的外显子跳;夭的效率。本发明的反义寡核苷酸可以包含一种或多种核苷酸类似物。目前开发了新的核苷酸类似物，作为用于治疗4氐抗病毒感染的方法。这些核苷酸类似物通常(虽然并不一定)具有与它们代替的核苷酸类似的结合特性。本发明的反义寡核苷酸可以掺入这样的核香酸类似物。本发明的反义寡核苷酸优选并不包含20%以上的上述核苦酸类似物。优选地，本发明的反义寡核苷酸优选并不包含10%以上的上述核苦酸类似物。本发明的反义寡核苷酸优选并不包含3%以上的上述核苷酸类似物。本发明的反义寡核苷酸优选并不包含1%以上的上述核普酸类似物。寡核苷酸或其功能等效物可以进一步包含另外的本体以向获得的分子提供另外的功能。可以将荧光标记或免疫调节化合物如CpG岛加入所述寡核苷酸或其功能等效物中。可以体内或体外递送反义序列，即，进入前体细月包中(我将对此不加描述，因为代替地也可以将反义体内递送到内源性前体细胞)。在一种优选的实施方式中，包含反义序列的前体细胞用于细胞移植治疗。在一种优选的实施方式中，所述化合物包括反义分子或其功能等效物。本发明的反义分子的功能等效物具有和所述反义分子相同的表达抑制效应(在种类上，不一定在量上)。反义分子或其功能等效物可以以各种方式加以设计。关于反义分子设计的细节参考[l]以及其中的参考文献。因此此参考文献以及其中的参考文献以引用方式结合于本文。降低或下调节异常表达基因的表达通常导致降低水平的基因产物，其由所述细胞中的所述基因编码。所述基因产物优选为由所述基因生产的RNA,例如微小RNA。在另一种优选的实施方式中，所述化合物包括能够抑制和/或拮抗所述异常表达基因的功能的蛋白质。在一种优选的实施方式中，所述化合物包括头蛋白或其功能部分、衍生物和/或类似物。头蛋白能够抑制和/或拮抗BMP-4的功能[5]。BMP-4拮抗剂抑制BMP-4的功能。本发明的其它BMP-4抑制剂/拮抗剂是神经诱导蛋白质(chordin)、ventroptin、4丑專争原肠胚形成(twistedgastrulation)、高血并唐"i秀导基因(gremlin)或BMP44吉4元剂的DAN家力矣的其它成员、PRDC、骨硬化素(scl画tin)、CTGF以及卵泡抑素(卵泡素抑制素，follistatin)。因此，在一种优选的实施方式中，本发明4是供了减轻个体中遗传性肌营养不良(肌肉营养不良)的症状的药剂中的应用。优选地，所述拮抗剂包括头蛋白、神经诱导蛋白质、ventroptin、扭转原肠胚形成、高血糖诱导基因或BMP4拮抗剂的DAN家族的其它成员、PRDC、骨硬化素、CTGF和/或卵泡4卬素或所述蛋白质的功能部分、衍生物和/或类似物。所述拮抗剂可以作为蛋白质或作为核酸(其包含用于在细胞中表达所述拮抗剂的表达盒)来提供。在此后面的实施方式中，本发明的化合物优选包含用于在细胞中表14达所述拮抗剂的所述表达盒。进一步提供了一种用于刺激成肌细胞(myoblastcell)分化的方法，包括向所述成肌细胞提供BMP-4拮抗剂和/或使所述成肌细胞与BMP-4拮抗剂接触。进一步提供了一种用于刺激成月几细/炮分化的方法，包括向所述成月几细胞提供核酸，其包含用于在所述细胞中表达所述拮抗剂的表达盒。向邻近细胞提供上述表达盒被认为是向邻近成肌细胞提供所述BMP-4拮抗剂(即，蛋白质)和/或使邻近成肌细胞与所述BMP-4拮抗剂(即，蛋白质)接触。在一种优选的实施方式中，所述邻近细胞是肌细胞。有许多方式来增加(异常表达)基因在细胞中的表达。非限制寸生实例是引入表达构成体(表达重纟且体，expressionconstruct),其包含用于所述基因的编码序列，表达转录因子，该转录因子激活或衍生物和/或部分的表达。还可以在所述细胞中直接转染由所述基因编码的蛋白质或RNA。在本文中这些方法共同称作基因疗法。在一种实施方式中，本发明因此提供了一种应用或方法，其中修饰所述表达包括基因疗法。可以以体外方法或以体内方法进行所述基因疗法。在细胞中增加基因产物的表达优选导致在所述细胞中增加水平的基因产物。起始水平可以是不可才企测的。肌障碍是一种疾病，其通常对个体的生活具有显著影响。因此可以采耳又的以减轻肌障碍后果的任何措施可以是指緩解患有所述月几障石寻的个体。因为可以通过成月几前体细月包(myoblastprecursorcell)来补充和/或再生分化的肌细胞，所以本发明特别适用于治疗肌障碍。本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中，除在所述个体中分化肌细胞的功能失常(当和健康个体相比时)之外，至少一部分由所述患有所述遗传病的个体所呈现的症状是起因于月几前体细胞的异常分化。肌障碍可以具有遗传性原因或非遗传性原因。具有遗传性原因的疾病的一个优选实例是遗传性月几营养不良。遗传性肌营养不良构成一组遗传病，其特征在于进行性肌萎缩和虚弱。许多这些病症是由用于肌蛋白的基因中的缺损所引起。不同形式的遗传性肌营养不良经常在涉及的蛋白质上不同。在这些病症中的大多数受影响基因编码蛋白质，该蛋白质似乎在支持肌纤维结构方面起作用，可替换地某些蛋白质可以与发生在肌纤维中的生化过程有关。本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中所述遗传病包括遗传性肌营养不良。肌营养不良通常被遗传，虽然存在一些病例，其中不存在家族病史。不同形式的遗传性肌营养不良的临床表现尤其在下述方面不同首先和最经常受影响的月几肉、症状发展的速率以及发作年龄。可利用多种i貪断方法来i貪断遗传性月几营养不良和它们之间的差异。几种方法的组合最经常用来进^f于i貪断。i貪断通常以评估患者的病史和体检开始。可获得的诊断试验的实例是血酶试验(例如用于月几酸激酶，CK)、月几组织学评估、DNA试-验、》兹共4展(MR)、月几电图(EMG)以及神经传导速度研究(NCV)。本发明披露了根据本发明的应用或方法，其中所述遗传性月几营养不良是以下疾病之一贝克型肌营养不良(BMD)、先天性肌营养不良(CMD)、远端肌营养不良(DD)、杜兴氏肌营养不良(DMD)、艾-德肌营养不良(EDMD)、面肩肱型力几营养不良(FSH)、月支带型力几营养不良(LGMD)、强直性力几营养不良(MMD)、目艮咽型月几营养不良(OPMD)。下面简短描述上述遗传性肌营养不良的原因。贝克型肌营养不良(BMD)，功能抗肌萎缩蛋白(一种帮助肌细胞保持完整(原样)的蛋白质)的生产不足够。先天性肌营养不良(CMD)，影响对肌肉以及有时对眼和/或脑所必需的某些蛋白质的基因突变。远端肌营养不良(DD)，在影响对月几肉功能所必需的蛋白质的至少7种基因中的4壬4可一种中的突变。杜兴氏肌营养不良(DMD)，没有抗肌萎缩蛋白，一种帮助肌细胞保持完整的蛋白质。艾-德肌营养不良(EDMD)，在产生伊默菌素(emerin)、核纤层蛋白A或核纤层蛋白C、包围每个肌细胞的细胞核的膜中的蛋白质的基因中的突变。面肩肱型肌营养不良(FSH)，在第4号染色体上失去一片DNA。肢带型肌营养不良(LGMD)，在影响对肌功能所必需的蛋白质的至少15种不同基因中的任何一种的突变。强直性肌营养不良(MMD),在第19号染色体或第3号染色体上DNA的重复切片。目艮咽型肌营养不良(OPMD)，用于多聚腺苷酸结合蛋白l(PABPNl)的错误基因，其被怀疑将RNA和蛋白质聚集在肌细胞的细月包冲亥中。在杜兴氏肌营养不良和贝克型肌营养不良中，肌蛋白抗肌萎缩蛋白均受到影响。在杜兴氏肌营养不良中，缺少抗肌萎缩蛋白，而在贝克型肌营养不良中，存在某些抗肌萎缩蛋白但其生产最经常不足和/或存在的抗肌萎缩蛋白被反常形成。两种疾病均与隐性X连锁遗传有关。DMD起源于DMD基因中的移码突变[6;7]。在DMD基因中的移码导致截短的非功能抗月几萎缩蛋白的生产[8]。由于在DMD基因中的多突变的结果而发生BMD。如在贝克型肌营养不良中，存在一些抗月几萎缩蛋白，这与其中不存在抗肌萎缩蛋白的杜兴氏肌营养不良相反，贝克型肌营养不良具有比杜兴氏肌营养不良较少严重的症状。DMD的发作早于BMD。DMD自身通常出现在幼年(儿童早期)，而BMD通常出现在青少年时期或成年早期。和杜兴氏肌营养不良相比，贝克型肌营养不良的发展更慢以及更少可预测。患有BMD的患者可以存活到成年中期至成年后期。患有杜兴氏肌营养不良的患者很少活到超过他们30岁。抗肌萎缩蛋白在肌纤维中起重要的结构作用，连接细胞外基质和细胞骨架。N端区结合肌动蛋白，而C末端是抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物(DGC)的一部分，其5争越月几膜[9]。在没有抗肌萎缩蛋白的情况下，机械应力导致肌膜破裂，这引起钙不受控流入肌纤维内部，从而触发4丐激活蛋白酶和纤维坏死[l0]。分化细胞的前体具有特定特性，其使它分化成具有特定功能的细胞。这些特定特性包括涉及细胞分化控制的基因类型的存在和活化状态。在本发明中，已发现，当异常表达在前体细胞中时，特定控制基因会增加遗传缺损的症状。在一种优选的实施方式中，所述异常表达基因包括骨形态发生蛋白4(骨形成蛋白4，BMP4)。骨形态发生蛋白(BMP)是调节因子，其是蛋白质的转化生长因子-P超家族的成员。它们被合成为大前体分子，其被蛋白酶切割。活性形式可以由两个相同蛋白质的二聚体或两种相关骨形态发生蛋白的异二聚体构成。骨形态发生蛋白和各种各样的细胞过程有关[12]。BMP涉及某些细胞类型(包括"几源性细胞)的分化。在一种优选的实施方式中，本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中所述转化生长因子-(3是骨形态发生蛋白(BMP)或其功能部分、衍生物和/或类似物，^尤选BMP4或其功能部分、书f生物和/或类合乂物。在另一个方面，本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中所述异常表达基因是所述前体细胞分化成所述分化细胞的控制因子(控制因素)。控制因子是这样的因子，其单独地、或连同其它控制因子来控制前体细胞分化成分化细胞中的至少一个步骤。分化中所述至少一个步骤的控制可以是刺激性的或抑制性的。所述控制因子通过为4言号專争导级联(signal-transductioncascade)的一部分来实现这种控制。所述控制因子优选设置于所述信号转导级联的开始，接收来自例如细胞(所述级联设置于其中)外的信号。在本发明的另一种优选的实施方式中，所述控制因子设置于所述信号转导级联的末端，产生由所述级联转导的信号。控制因子是例如生长因子或转录因子。生长因子是小蛋白，其附着于细胞表面上的特定受体并促进这些细胞的增殖、生长、分化和/或成熟。生长因子的实例是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、月几肉生长抑制素(GDF-8)和/或成纤维细月包生长因子2(FGF-2)。在一种优选的实施方式中，本发明4是供了4艮据本发明的应用或方法，其中所述控制因子包括生长因子或其功能部分、衍生物和/或类似物，优选成纤维细胞生长因子(FGF2)或胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP3)、BMP4、或其功能部分、衍生物和/或类似物。成纤维细胞生长因子2(FGF2)是单链多肽生长因子，其在伤口愈合过程中起到重要作用并且是血管发生的有效诱导物。由于在fgf-2基因内4吏用了可一齐才灸的起始^f立点(alternativestartsite)，因》匕存在若干不同形式的人蛋白，其大小范围为18-24kDa。它与成纤维细月包生长因子1具有55%的氨基酸残基同一性并具有有效的肝素结合活性。在来自中胚层和神经外胚层谱系的各种细胞类型中，生长因子是DNA合成的极有效的诱导物。胰岛素样生长因子II是刺激细胞增殖因子(multiplication-stimulatingfactor)。它是4艮好表4正的中性肽，其#皮i人为由肝分泌并在血液中循环。它具有生长调节、月夷岛素才羊和有丝19分裂活性(细月包增殖活性，mitogenicactivity)。月夷岛素冲羊生长因子结合蛋白3(IGFBP3)是6种同源可溶蛋白质之一，其中同源可溶蛋白质结合胰岛素样生长因子(生长调节素)并在细胞水平调节它们的有丝分裂作用和代谢作用。转化生长因子(TGF)是在自然界存在的许多已表征的生长因子之一。转化生长因子是激素活性多肽，当加入正常的、非转化细胞时，其可以诱导转化的表型。它们的转化活性起因于两种另外不相关因子(转化生长因子oc和转化生长因子P)的同时作用。在一种优选的实施方式中，本发明提供了才艮据本发明的应用或方法，其中所述生长因子属于转化生长因子-B(TGF13)超家族或是其功能部分、衍生物和/或类似物。TGF13是在各种各样组织中合成的因子。它在i秀导表型转化时与TGF-ot协同作用并且还可以作为负自分泌生长因子。TGF-P在胚胎发育(embryonaldevelopment)、细月包分化、激素分泌、以及免疫功能中具有作用。TGF-p大多数作为分开的基因产物TGF-pi、TGF-P2或TGF-卩3的同二聚体(同源二聚体)形式被发现。已分离了由TGF-pi和2(TGF-pi.2)或由TGF-(32和3(TGF-卩2.3)组成的异二聚体(同源二聚体)。TGF-P蛋白质被合成为前体蛋白。转化生长因子ot是一种因子，其已在各种各样的组织(包括上皮组织)、以及母体蜕膜中被分离。它紧密相关于表皮生长因子并结合于EGF受体。TGF-a在诱导表型转化时与TGF-(3协同作用，但其生理作用并不清楚。肌肉生长抑制素(还称作生长和分化因子8)是一种生长因子，其限制肌组织生长，即，体内更高浓度的肌肉生长抑制素引起个体具有更少发育的月几肉。月几肉生长抑制蛋白(myostatinprotein)在月几细胞中产生，在血液中循环并作用于肌组织，显然通过放慢肌干细胞的发育[ll]。肌肉生长抑制素是蛋白质的TGF-P超家族的成员。在一种优选的实施方式中，本发明提供了根据本发明的应用和方法，其中所述控制因子包括肌肉生长抑制素。调节细胞分化的机制还涉及转录因子。在一种实施方式中，本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中所述控制因子包括转录因子。转录因子是开始基因转录所需要的蛋白质。转录因子可以是组织特异的，其意味着那些因子仅在一种或几种特异基因的转录中具有功能。可替换地，转录因子可以是通用的，涉及许多不同基因转录的起始。在一种特别优选的实施方式中，本发明的方法或应用与遗传缺损的另一种疗法结合。作为第一个实例，在其是分化细胞中缺少的或功能异常的基因产物的结果的遗传缺损中，本发明的方法或应用优选与用于增强缺少的或功能异常的基因产物在分化细胞中的表达的一种方法结合。因此本发明进一步提供了根据本发明的应用或方法，进一步包括向所述个体提供药剂，该药剂用于向所述分化细胞提供至少部分的所述突变基因的正常功能。作为第二个实例，在其是分化细胞中缺少的或功能异常的基因产物的结果的遗传缺损中，本发明的方法或应用优选与一种方法结合，该方法采用将用于所述分化细胞的前体细胞移植到患者以便产生新的和功能分化细胞。前体细胞可以来自健康供体，但在这种情况下，排斥的危险较高[13]。因此，来自患者的前体细胞是优选的。在体外基因上改变所述前体细胞以表达受突变影响的基因的功能拷贝。本发明提供了强所述前体细胞的体内分化能力。在一种另外的实施方式中，本发明l是供了才艮据本发明的应用或方法，其中，通过将患有遗传缺损的个体的所述前体细胞的表达图i普与健康个体的相应前体细胞进行比较来确定所述异常表达基因。21当与所述#:康个体中的所述相应前体细胞相比基因至少2倍差异(不同，differentially)表达时，该基因被认为是异常表达的。在本发明的一个实施例中，利用原(初级，primary)人成月几细胞培养进行了大规模基因表达时间历程研究，其中监测了在DMD细月包中的月几细胞生成以及分化细胞对缺少抗月几萎缩蛋白的首次反应。结果显示在月几细月包生成中不同阶革史的清楚定相(clearphasing)。在成肌细胞阶段已经出现差异并且虽然在健康和DMD培养中似乎同时开始分化，但这表明DMD细胞较少有效地进行分化。先前已进行了研究，其使用基因表达图i普(profiling)来发现涉及疾病才几制的途径[14-16]。然而，这些研究并没有在前体细力包(成肌细胞)水平上分析分子差异，而是全集中于分化细胞(肌细胞)本身。作为本发明的一个优选的实施例，已^L测到^:康和DMD细胞培养之间在基因表达方面的显著差异。将不会预期这种观测，因为全长抗月几萎缩蛋白还未在成月几细月包中表达以及Dp71成月几细胞表达不应受到突变的阻碍，因为它们位于翻译起始位点(转录起始位点，translationinitiationsite)的上游[17]。差异表达基因之一，成纤维细胞生长因子2(FGF2)在DMD成肌细胞中显著更低地表达。体外和体内研究表明了FGF2在募集卫星细胞进入增殖方面的重要作用。加入重组FGF2可增加增殖成月几细胞的lt目两倍并且并不抑制分化的开始[18画20]。it匕外，Doukas等证明，FGF2和FGF6基因的革巴向转基因递送导致骨骼肌修复的增强，这表明FGF基因在再生中的重要性[21]。这些观测结果表明，在本发明的实施例中观测到的更低DMD成肌细胞FGF2表达可以说明在先前报道的DMD培养中降低的成力几细力包增殖[22-24〗。虽然在DMD细胞培养中增殖能力很可能会降低并且分化受到抑制，但本发明的实施例的结果表明，不同过程的定时(timing)是类似的。在健康和DMD细胞培养(MCM6、CCNB2、CDC28、CKS2以及RPA3，图5,'细胞生长和维持，组)中融合诱导以后，同时下调节涉及增殖的基因。然而，在成肌细胞实际融合成肌管的过程中，在健康和DMD细胞培养之间出现基因表达差异，这再次指示DMD细胞的受到损伤的融合潜力。在本发明的一个实施例中，已发现基因被异常表达，其与健康成肌细胞的融合有关，但其很可能并不参与DMD成肌细胞融合。其中，膜金属内肽酶(MME)和Adlican(DKFZp56411922)被J人为与细胞粘着和细月包间发信号(cell-cellsignalling)有关，它们对于细胞融合是重要的[25]。在基因表达研究中，层粘连蛋白a2(LAMA2)在DMD细胞培养中连续更低表达，这使它们为更少粘着活性的。这说明缺少层粘连蛋白a2相关粘着力，其先前已由Angoli等加以报道[26]。意想不到地，线粒体肿瘤抑制剂l(MTUSl)和内皮素受体A型(EDNRA),两者均被，￡设与发信号(signalling)有关，在分化开始以后在DMD细胞中仅被上调节。由于缺少抗肌萎缩蛋白这些基因可能是可替换信号通路的一部分。在时间历程研究中，原代人成肌细胞分化和融合成肌管需要大约4天。其后，几乎看不到表达变化并且基因被稳定表达[27]。一种惊人的现象是在健康和DMD细胞培养中分化开始以后肌节基因表达的上调节以及随后的显著降j氐，在笫6天开始，4又在DMD月几管中可检测到。抗肌萎缩蛋白的缺少会引起肌节不稳定，导致继发反应，其开始结构基因的下调节。在成肌细胞分化过程中同时4皮上调节或下调节的其它功能类型的蛋白质在以后的时间点并没有显示出差异，这表明在DMD培养中这种负反馈是肌节蛋白的独特特性。两种目前有希望的基因疗法是基于在DGC复合物中抗肌萎缩蛋白的再构建，其中通过AAV介导引入微DMD基因或通过跳跃外显子以恢复基因的读码区(读码框，readingframe)[28-36]。本发明的一个实施例的结果表明，这些疗法的效力可能不能满足目前的期望。到现在为止，研究集中于抗肌萎缩蛋白以及它的局部化，但没有特别地考察治疗后肌肉的再生能力。抗月几萎缩蛋白的存在仅矫正肌节不稳定性并且可能仅减轻(暂时地)而不是治愈患者，因为没有恢复再生信号通路。从这个观点考虑，关键的是，在这些变化已经发生以前，在生命早期(年轻时)开始治疗。可替换地，应当寻求另外的(药物)干涉以再获得正常M^再生能力。根据本发明的应用或方法可以与有希望的基因疗法结合加以应用。在一种实施方式中，本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中所述遗传性肌营养不良是贝克型肌营养不良(BMD)或杜兴氏肌营养不良(DMD)。在一种优选的实施方式中，本发明提供了根据本发明的应用或方法，包括跳跃抗肌萎缩蛋白基因的外显子。本发明的一个实施例显示在肌细胞生成过程中健康和DMD成肌细胞之间的分子差异。在DMD成肌细胞中降低的FGF2水平和BMP4的提高的表达会降低增殖能力并使它们为较少分化活性的。此夕卜，观测到在DMD肌管中肌节蛋白的更低表达。DMD肌管的降低的增殖、受到损伤的融合以及受到损伤的维持的这种组合可导致不足的肌再生并促^f吏DMD患者的严重表型。将体外扩展的(expanded)成肌细胞移植到DMD患者是一种可替换的和有希望的疗法[37]。有至少两种选4奪用来自健康主体的成肌细胞或用自体细胞移植来进行治疗。在第一种情况下，宿主对细胞的排斥(起因于免疫应答的诱导)是主要关心的问题[13]。免疫相容供体，优选家族成员[37;38],或免疫抑制剂[39;40]用来控制这种免疫应答。自体细月包移才直具有以下优点减小免疫系统排斥的可能性。在自体移植以前，必须通过引入功能转基因[41]或表达盒(其产生外显子跳跃反义序列[4])来矫正基因缺损。在本发明的一种实施例中，利用重组AAV来引入《鼓DMD基因。在一种实施方24式中，本发明提供了根据本发明的应用或方法，其中相对于BMP4的反义寡核苷S臾或siRNA用来降低BMP4在自体成肌细胞中的表达，以及增强所述自体成肌细胞在患者中的再生潜力。本发明进一步提供了一种化合物在用于修饰基因的表达、用于制备减轻个体中遗传病的症状的药剂中的应用，其中所述疾病是所述个体的分化细胞中遗传缺损的结果，其中所述基因在所述分化细述遗传缺损的基础的突变。在一种优选的实施方式中，作为所述遗传缺损的基础的所述突变与一种基因有关并且是从所述基因(突变基因)没有蛋白质合成或缺损蛋白质合成的结果。在一种进一步优选的实施方式中，》务饰所述表达包括当所述异常表达基因在所迷前体细胞中表达不足时提高表达。在一种优选的实施方式中，所述异选地，所述控制因子包括生长因子或其功能部分、衍生物和/或类似物。优选地，所述生长因子属于转化生长因子-13(TGFi3)超家族或是其功能部分、4汙生物和/或类似物。优选地，属于转化生长因子-P超家族的所述生长因子是骨形态发生蛋白4(BMP4)或其功能部分、衍生物和/或类似物。优选地，所述控制因子包括(转录)因子，其影响所述异常表达基因的表达。本发明进一步提供了一种用于刺激成肌细胞分化的方法，包括向所述成肌细胞提供一种化合物，用于在所述成肌细胞中抑制生长因子的表达。4尤选;也，所述抑制包括抑制BMP-4mRNA在所述成肌细胞中的表达。优选地，所述方法进一步包括使所述成肌细胞与成熟肌细胞接触。优选地，所述成熟肌细胞获自患有遗传性肌营养不良的主体。优选地，通过将所述成肌细胞移植到所述个体中来进行所述接触。优选地，所述移植成肌细胞来自配对供体。优选地，成月几细力包是自体成力几细力包。优选地，抑制BMP-4mRNA在所述成肌细胞中的表达包括向所述成肌细胞或其前体提供互补于所述BMP-4基因的BMP-4寡核普酸(反义)。优选地，向所述成肌细胞或其前体体外提供所述BMP-4反义寡核苷酸。本发明进一步4是供了成肌细胞或其前体的集合，其包括BMP-4反义寡核苷酸。进一步4是供了本发明的应用或方法，其中所述前体是成肌细胞或其前体。优选地，^f昔助于病毒转导DNA序列来抑制所述表达。优选地，所述遗传病包纟舌遗传性力几营养不良。优选地，所述遗传性肌营养不良包括以下疾病之一杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克型肌营养不良(BMD)、先天性肌营养不良(CMD)、远端肌营养不良(DD)、艾-德肌营养不良(EDMD)、面肩肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良(LGMD)、强直性肌营养不良(MMD)、眼咽型"几营养不良(OPMD)。优选地，所述化合物包括蛋白抑制剂。优选地，其中所述蛋白抑制剂包括生长因子抑制剂或拮抗剂，优选BMP-4抑制剂或拮抗剂，优选地，其中所述抑制剂或拮抗剂包括头蛋白、神经诱导蛋白质、ventroptin、扭转原肠胚形成、高血糖诱导基因或BMP4拮抗剂的DAN家族的其它成员、PRDC、骨硬化素、CTGF和/或卵泡抑素或其功能部分、衍生物和/或类似物。优选地，本发明的方法或应用进一步包括第二种化合物在用于制备治疗所述个体的药剂中的应用，其中所述第二种化合物向所述分化细胞提供所述突变基因的至少部分正常功能。优选地，所述遗传性肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(DMD)或贝克型肌营养不良(BMD)。优选地，所述第二种化合物包括寡核苷酸、或其功能等效物，用于跳跃抗肌萎缩蛋白基因的外显子。优选地，所述第二种化合物包括寡核苷酸或其功能等效物，其互补于抗肌萎缩蛋白基因的外显子。在一个优选的方面，本发明提供了一种化合物在用于降低、抑制和/或拮抗骨形态发生蛋白4(BMP4)在细胞中的表达，用于制备减轻个体中遗传性肌营养不良的症状的药剂中的应用。优选地，所述细胞是成肌细胞或其前体。优选地，所述化合物包括反义RNA或其功能等效物。本发明进一步提供了一种用于刺激成肌细胞分化的方法，包括向所述成月几细月包4是供一种化合物用于降^f氐、抑制和/或拮抗BMP4在所述成肌细胞中的表达。优选地，所述化合物(能够降低和/或抑制)降低和/或抑制BMP4mRNA在所述成肌细胞中的表达。在另一种优选的实施方式中，所述化合物(能够拮抗)拮抗BMP-4的功能。根据本发明的应用和/或方法进一步包括使所述成肌细胞与成熟肌细胞接触。在一种优选的实施方式中，所述成熟肌细胞获自患有所述遗传性肌营养不良的主体。本发明的用于降低和/或抑制BMP4mRNA在所述成月几细胞中的表达的方法包4舌向所述成月几细胞或其前体提供互补于所述BMP4基因的BMP4寡核苦酸(反义)。优选地，向所述成肌细胞或其前体体外提供所述BMP-4反义寡核苷酸o本发明进一步提供了成肌细胞或其前体的集合，其包括BMP-4反义寡核苦酸。优选借助于病毒转导DNA序列来获得降低和/或抑制BMP4的表达。优选地，借助于病毒载体向所述细胞提供所述化合物。优选地，所述遗传性力几营养不良包括以下疾病之一杜兴氏月几营养不良(DMD)、贝克型肌营养不良(BMD)、先天性肌营养不良(CMD)、远端肌营养不良(DD)、艾-德肌营养不良(EDMD)、面肩肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良(LGMD)、强直性肌营养不良(MMD)、眼咽型肌营养不良(OPMD)。优选地，所述化合物包括蛋白抑制齐'J。优选地，所述化合物包4舌BMP4抑制剂或拮抗剂。优选地，所述抑制剂或拮抗剂包括头蛋白、神经诱导蛋白质、ventroptin、扭转原肠胚形成、高血糖诱导基因或BMP4拮抗剂的DAN家族的其它成员、PRDC、骨硬化素、CTGF和/或卵泡抑素或其功能部分、衍生物和/或类似物。优选地，本发明的方法或应用进一步包括第二种化合物在用于制备治疗所述个体的药剂中的应用，其中所述第二种化合物向所述个体的肌细胞提供与所述遗传性肌营养不良有关的基因(突变基因)的至少部分正常功能。优选地，所述遗传性肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(DMD)或贝克型肌营养不良(BMD)。优选地，所述第二种化合物包括寡核苷酸、或其功能等效物，用于跳跃抗肌萎缩蛋白基因的外显子。在另一个方面，本发明提供了一种方法，用于确定BMP4反义寡核苦酸或其功能等效物是否能够在包含外显子的BMP4前mRNA中诱导所述外显子的跳跃，所述方法包括向表达所述BMP4前mRNA的细月包4是供所述寡核苦酸并确定由所述前mRNA产生的成熟mRNA是否缺少所述外显子。优选地，在BMP4mRNA中外显子的跳跃可降低功能BMP4蛋白质水平的生产水平。在BMP4和DMD中的外显子跳跃具有不同的目的读码区破坏(或氨基酸的必需的一段序列的排除；BMP4)与读码区矫正(DMD)。如果在所述方法中起因于剪接所述前mRNA的5%以上并且优选10%以上的mRNA并不包含所述外显子，则寡核苷酸或其功能等效物^皮说成是可有效诱导所述外显子的跳跃，如体外借助于核酸扩增反应(优选聚合酶链反应，PCR)所测得的，其中在外显子中的引物在所述外显子(其#1所述反义寡核苷酸或其功能等效物所靶向)旁侧(flank)。优选地，所述反义寡核苷酸或其功能等效物互补于所述外显子。在一种特别优选的实施方式中，所述反义寡核苷酸或其功能等效物互补于所述外显子的外显子内部(exon-intemal)部分。在本文中所述外显子的外显子内部部分^皮定义为一部分，其互补于所述外显子并且其并不包括紧密在所述外显子旁侧的内含子序列。优选地，所述外显子内部的寡核苦酸或其功能等效物并不包括在所述外显子旁侧的两个外显子剪接接纳体(受体)和/或外显子剪接供体核苷酸中的一个或两个。优选;也，所述反义寡核苦酸或其功能等效物互补于BMP4的外显子4。某些BMP4專#录物开始于外显子-2。可^+4类的剪4妄变体也可以存在。在这些情况下，外显子的编号是从由AONhBMP4弁2鉴定的外显子进4于计lt,并且如果在外显子4之前包括在mRNA中的外显子实际数目小于或大于3，则也给予此外显子数目4。本发明进一步提供了具有AONhBMP4#2序列的寡核苷酸。本发明进一步提供了互补于BMP-4的外显子的反义寡核苷酸或其功能等效物的应用，用于在BMP4前mRNA中跳跃所述外显子。反义寡核苷酸或其功能等承文物互4卜于BMP-4的外显子，用于治疗遗传性力几营养不良。进一步4是供了互补于BMP-4的外显子的反义寡核苷酸或其功能等效物在用于制备治疗遗传性肌营养不良的药剂中的应用。可以通过若干不同方法将所述反义寡核苷酸或其功能等效物提供给所述细胞。一种优选的方法是在没有任何手段的情况下(withoutanymeans)来增强所述寡核苦酸或其功能等效物到所述细胞的转移。在体内给予所述寡核香酸或其功能等效物的情况下，这是特别优选的。在另一种优选的实施方式中，借助于病毒载体向所述细力包纟是供所述反义寡核香酸。在一种优选的实施方式中，所述病毒载体包括用于表达所述反义寡核苦酸的表达盒。实施例实施例1才才沐+和方法细應培券原代人成肌细胞分离自三位健康个体(KM109、KM108以及HPP4)和三位DMD患者(DL589.2[外显子51-55缺失]、DL470.2[外显子46-50缺失]以及50685.l[外显子48-50缺失])[42;43]的骨骼肌活检(活组织检查)[42]。活检时的年龄从2-14岁变化。培养物由存在于初始活才企中的成月几细月包和其它细胞类型构成。通过结蛋白染色和细胞计数(如[44]所描述的)对每个活4企确定成肌细胞比例。健康和DMD培养物在成肌细胞的平均百分比(57±20%)方面并没有差别。在月交原涂布培养瓶的增殖培养基中生长细胞。当细胞80%汇合时，通过用低血清培养基更换高血清培养基来开始分化[27]。所有用于实验的细胞培养具有4与IO之间的传代数。cZ)A^杂Jt<吏用了包含来自人序列证实的40KI.M.AGE.cDNA文库(ResearchGenetics)的4417个肌相关基因和EST(点才羊一式三^f分)的cDNA微阵列，并且如[27;45]所描述的，对这些微阵列进行PCR扩增、印刷以及预杂交。在第0、1、2、4、6、10以及14天，对来自6种不同细胞培养的总RNA进行分离，扩增、标记并用共同参比进行共杂交(如[27;45]所描述的)。借助于Bioanalyzer芯片实马全室RNA毫樣吏测定(BioanalyzerLab画on画a-ChipRNAnanoassay)(AgilentTechnologies)才全查了总RNA和cRNA的质量和^t量。用Agilent扫描仪(型号2565BA)扫描所有载玻片并用GenePixPro3.0程序(AxonInstruments)量化斑点强度。将原始强度文件输入RosettaResolverv4.0(RosettaBiosoftware)并用Axon/Genepix4晉误才莫型加以规一化。对于每种条件(健康或DMD),考虑对每种基因进行9次测量(3次生物平行测定，3次技术平行测定)并进行严格的数据分析程序。对规一化强度高于阴性阵列对照的平均值30+2标准偏差(SD)的基因进行分析。在一种条件(健康或DMD)和在至少一个时间点，这必须是一致的。进行错误加权双向ANOVA，其中时间、疾病4犬态以及时间和疾病一犬态之间的相互作用作为变量。当疾病状态的P值〈lxl0-5(Bonferron"乔正的)时，则i人为基因^皮差异表达。利用基因本体树状4义(GeneOntologyTreeMachine)[46],随着时间差异表达的基因(P<lxl0-5)在功能上#1分为几组。定量ir-尸cw通过反转录利用随机六聚体和0.5mg总RNA作为模板，从所有6个细胞培养物的总RNA制备cDNA。利用引物3设计了PCR引冲勿只于(http:〃www-genome.wi.mitedu/cgi画bin/primer/primer3.cgi/)。在此研究中用于每种基因的寡核苷酸引物对对应于以下核苷酸甘油醛-3-石粦酸脱氬酶、510-529和625-644(NM—002046);BMP4394-413和484-503(NM—001202)以及AQP11129-1148和1227-1246(NM_198098.1)。如所描述的，进行定量PCR(Lightcycler,Roche),其中退火温度为58°C(对于GAPDH和BMP4)或62°C(对于AQP1)[27]。利用每种基因的稀释系列，确定最佳cDNA稀度和相对浓度。将每种基因规一化到甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA的丰度(随时间在阵列上显现恒定表达)。按照[47]中所描述的准则设计MLPA探针。如在[48]中所描述的，用50ng总RNA进行反应，不同之处在于化学合成所有用作半探针的寡核苦酸(IlluminaInc,SanDiego)，并且在PCR反应过程中4吏用两种荧光团[49]。2ml标记PCR产物与10ml甲酰胺和0.05mlROX500尺寸才示准物(sizestandard)进4亍'混合，然后用ABI3700毛细管测序4义(AppliedBiosystems)进4亍分离。因为存在相当大范围的峰高度，所以在必要的情况下加载1:10稀度以获得足够的非饱和信号。将数据输出到Excel，供进一步分析。对于每种探针，使用相对峰高度作为强度的度量。通过用两种对照探针(用相同的荧光团加以扩增)的峰高度的总和除以每种探针的相对峰高度来进行归一化。在阵列分析中，对照探针被靶向在表达水平上没有显示显著变化的基因(钙联蛋白(Calnexin)和蛋白质磷酸酶3调节亚基B)。基于6次测量结果(一式两份测得的3个培养物)来计算标准误差。为、化都;t^k^瘦邀织化在分化开始以后，以不同浓度(在0.3到30ng/ml之间)，将重组人BMP4(R&DSystemsInc.)力口入细月包。在培养基变4匕过禾呈中，力口入新的BMP4(每4天)。在血清除去后的第7或11天，用100%甲醇(-20。C)固定细胞。如先前所述[44;49],进行免疫组织化学染色。通过用结蛋白正细胞(=能够分化的肌源性细胞)的数目除以肌球蛋白正细胞的^t目x100%来计算分化指数。为了该分析，拟合广义线性回归模型来解释作为天数(7或11)、浓度(O、0.3、1、3、10和30ng/ml)以及细胞系(健康和DMD)的函数的分化差异。利用R2.0.1[50]进行计算。该模型包括表示细胞系与浓度之间的相互作用的一项，该项用来确定细月包系呈J见统计显著的分4匕比例的单独的浓度水平。概率分布与(模型)误差有关，并且计算了正规和二项式(binominal)误差分布。结果为了探索人DMD成肌细胞的分化潜力，已进行了大规才莫基因表达分析。借助于肌相关cDNA阵列分析了6位不同个体(3位健康的，3位DMD)的人原代骨骼肌细胞培养物。在成月几细胞阶,殳(第0天)和在分4匕的不同日期(第1、2、4、6、10以及14天)分离了RNA。为了发现差异表达的基因，进行了错误加权双向ANOVA，其中时间、疾病4犬态以及时间与疾病4犬态之间的相互作用作为变量。在存在于阵列上的4010种独特基因中，2423种在至少一个时间点在所有健康样品或所有DMD样品中给出显著信号。94种基因在<建康和DMDi咅养物之间差异表达(在DMD中，52种下调，42种上调，p(疾病状悉;kl'10-5)。意想不到地，已经在未分化细胞(t:0)中，7种基因在RNA表达水平上显示出2倍以上的差异(表1和附表la/b)。其中两种(AQP1和BMP4)在整个时间历程中在DMD中连续更高表达。借助于定量RT-PCR证实了这种差异(图1)。Dahlqvist等先前在无限增殖(immortalize)小鼠成月几细月包(C2C12)中证明，BMP4对肌分化具有抑制效应[51]。为了确定在原代人成肌细胞培养物中是否也适用以及为了查明健康和DMD细胞是否差异应答，将重组BMP4加入细胞。在t=0将重组BMP4加入融合培养基导致在健康和DMD细月包培养物中细月包融合的浓度相关减少(更少的多核的、肌球蛋白正细胞)(图2、3以及附图1)。DMD细胞对于BMP4显著更敏感(p0.05)，因为3倍更低浓度引起类似程度的分化抑制(表2和3)。提供的结果对应于利用正态分布作为误差分布(正A见和二项式误差分布均产生类似的结论)。连同在整个时间历程中在健康和DMD之间差异表达的基因，存在一'卜组基因，其表达才莫式在诱导分化以后开始偏离(p(疾病状态)<1.10-5)。图4表明，这些基因可以分为两组。首先，在健康细胞培养物中在融合期间被上调节的基因，其在DMD培养物(BF、Adlican以及MME)中仍然4交^f氐。其次，在健康细月包培养物中具有恒定<氐表达水平4旦在DMD细胞(MTUS1和EDNRA)融合期间4皮上调节的两种基因。借助于RT-MLPA证实了这些结果(附图2)。RT-MLPA是一种才支术，其可以在单反应中快速和同时量化多达4033种專争录物。选择这种才支术，因为它可以以比定量RT-PCR更快速和更便宜的测定来试验多个样品和转录物。双向ANOVA还揭示了这样的基因，其在健康和DMD培养的时间历程中表达变化相同(n=68，p(时间)〈l'10-5)。在先前的论文[27]中已讨论了这些基因在肌细胞生成中的作用。利用基因本体树状仪(GeneOntologyTreeMachine),功能上"i兌明了这些基因[46]。图5示出了健康和DMD细胞(包含^6个基因的功能基团)的平均表达模式。与健康细胞相比，肌节蛋白(11=10)在DMD中在以后的时间点显示出显著降低的表达(配对T检验，p<0.01)。在健康和DMD培养物中，其它功能类型显示出类似的表达模式变化。实施例2在杜兴氏肌营养不良成肌细胞中通过外显子跳跃AON下调节BMP4表达在6孔平皿中对分离自杜兴氏肌营养不良患者(DL589.2)的骨骼肌活检的人成肌细胞进行增殖至50%的汇合(详情参见实施例1)。转染前24小时，将细胞放置在低血清分化培养基上。用下文提及的AON(2'-0陽曱基石克代石粦酸)以100、200、或500nM的浓度来转染细力包，或未加处理。AON序列hBMP4-弁1:5'gcauggcuegcgecuecuageag3'hBMP4-弁2:5，ccagugcuguggaucugcucuu3，FAM陽AON:5，-FAM-cuuccacauccgguuguuu3'相只于于人BMP4外显子4中的外显子内部序列、寿争录物变体l(NM一001202)设计了开始的两个寡核苷酸。最后的寡核苷酸是对照寡核普酸，其应当不影响BMP4表达，并且包含5，FAM-标i己以可以荧光检测寡核苷酸摄取。用Exgen500转染试剂(MBIFermentas,2(^l/|LigAON)转染AON。在转染3小时时，洗掉转染复合物并将新鲜分化培养基加入纟田月包。在转染后6小时，FAM-AON转染成肌细胞的细胞核具有明亮荧光，这表明AON的高的核摄取。在转染后24小时，将细月包溶解于RNABee溶液(IsotexDiagnostics)并利用制造商提供的程序(protocol)分离RNA。通过在70。C下用在13ili1DEPC-水中的40ng无规(随机)六聚体引物温育200ng总RNA10分钟以将RNA转录到cDNA。在冰上冷却以后，加入4pi的5x第一链纟爰冲液(strandbuffer)、2|ul的10mMdNTP、以及1)ul的RevertaidRnaseH-反專争录酶(MBIFermentas)，然后在42。C下温育反应〉、昆合物2小时。通过在70°C下温育15分钟来灭活反转录酶。对获得的cDNA稀释5次。为了"i平估在BMP4中AON介导的外显子i^J夭，进4亍了以下PCR:PCR1:扩增BMP4基因的外显子3，以"i平估总BMP4mRNA水平。4吏用的引物序歹'J:BMP4夕卜显子3正向5，TGAGCCTTTCCAGCAAGTTTGTT3，；BMP4外显子3反向5，ATCAGCATTCGGTTACCAGG3，PCR2:通过用外显子3和外显子5中的引物进行扩增来评估夕卜显子4的淑bi夭BMP4夕卜显子3正向5，TGAGCCTTTCCAGCAAGTTTGTT3，；BMP4外显子5反向5，GGGATGCTGCTGAGGTTAAA3'PCR3:用GAPDH基因中的引物评估cDNA合成GAPDH正向5'GATCATCAGCAATGCCTCCT3';GAPDH反向5，CCATCCACAGTCTTCTGGGT3'进行PCR40个循环在94。C下变性30秒、在56°C下复性30秒以及在72。C下延伸30秒。在溴化乙锭(溴乙啶，菲啶溴红)染色琼脂糖凝胶上显示PCR片段。结果结果显示在图1中。所有三种PCR均产生所期望大小的片段。AONhBMP4#2在所试验的最高浓度(500nM)诱导外显子4的跳跃(图1;图片B)，可看到作为142bp的更短片段，其中外显子3被直接剪接到外显子5。用更低浓度的AONhBMP4#2(200nM)进行转染导致完全没有BMP4转录物。这通过BMP4基因的外显子3的外显子内部PCR加以证实(图片A)。相反，对照基因GAPDH仍然4皮稳定表达(图片C)，这表明BMP4转录物的选4奪性丧失。因为外显子4的跳跃会破坏BMP4转录物中的可读框，因此我们认为在这种AON浓度下的外显子跳跃是如此有效以致由于高效无义介导的衰变活性而引起转录物丧失。在两种浓度下，AONhBMP4#2会降低完整BMP4转录物的7JC平，因此矫正BMP4mRNA水平向着在来自健康主体的成月几细胞培养物中的正常水平。AONhBMP4#l和对照FAM-AON并不i秀导外显子逸W夭。有时，7见测到在外显子4中隐蔽剪接位点的活化。相对于在mdxx月几营养不良相关蛋白(utrophin)-/-小鼠中的BMP4和DMD外显子跳跃反义序列的反义；评估肌力、存活、蛋白质和RNA水平通过杂交雄性mdx+"utrn一.hDMD仏小鼠雌性mdx+:utm、hDMD仏('tHoen等，准备中的手稿)来产生抗肌萎缩蛋白和肌营养不良相关蛋白-缺少小鼠(mdx.utrn一小鼠)。将小鼠放置在标准实'验室条件下。供给动物普通饲^h(regularchow)并且动物可以随意获得^L用水。20-聚体(mer)2'-(9-曱基好u代磷酸核糖核酸是由Eurogentec合成。反义序列祐:輩巴向1.小鼠"wd基因的外显子23-内含子23界面，序列AON-l:GGCCAAACCUCGGCUUACCU。此AON的序列与由Mann等和Lu等在他们的w血小鼠实-验中所4吏用的AON相同，并且导致Z)md基因的突变外显子23的有效跳3夭，乂人而生产功能抗月几萎缩蛋白[31;52]。2.BMP4。mRNA序列NM—007554的外显子2中的设计序列AON-2(AGACUGGAGCCGGUAA)和AON-3(UGGCUCGGCUGGCGGG)。注射前，在0.9%(w/v)NaCl中将AON稀释至50mg/ml的最终浓度。将小鼠随机分为三组。用5mg的AON-l静脉注射第一组，在21日龄开始，连续5天。除AON-l之外，第二组和第三组分别接受5x5mg的AON-2或AON-3。在首次注射以前，以及在首次注射以后的第1、2以及3周，获取血液样品，用于确定肌酸激酶活性(对肌损伤的很好建立的生物测定)。在这些相同的时间点，迫4吏动物在Rotarad装置上奔跑(run)并记录小鼠倒下之前的时间段(对月几力的生物测定)。在注射后的第三周，腹膜内给予伊文氏蓝(10mg/kg体重)以染色损伤肌。通过颈才,脱位(cercivaldislocation)处死小鼠，并分离朋一肠月几、四头肌、胫骨前力几、心力几和膈力几，然后在进一步处-里前快速冷冻在液氮中。如先前所述[53],测量矫正的抗肌萎缩蛋白mRNA转录物的水平。如所描述的[53],通过Western印迹来确定抗月几萎缩蛋白水平。对肌肉的10iam冷冻切片进行标准苏木素/伊红染色，以评估肌组织学。确定了平均纤维横截面积。测定了10个切片/肌肉中的伊文氏蓝阳性面积，作为月几损伤的度量。对切片进行具有NCL-DYS2和CD4抗体的免疫染色，以分析抗肌萎缩蛋白的存在和免疫浸润液的存在[53]。实施例4在mdx成月几细月包培养物中遗传《乔正基因缺损并连同BMP4抑制剂头蛋白将这些成月几细胞共注射到mdx小鼠。通过杂交雄性mdx佛.utm^.hDMD仏小鼠雌性mdx+/+.utm-A.hDMD+/-('tHoen等，准备中的手稿)来产生抗肌萎缩蛋白和肌营养不良相关蛋白-缺少小鼠(mdx.utrn一小鼠)。将小鼠放置在标准实,验室条件下。供给动物普通飼料并且动物可以随意获得々欠用水。通过标准力交原酶/分散酶处理和在力交原涂布平皿上标准增殖培养基中进行培养，从雄性mdx，utrn;小鼠的分离的后肢肌获得小鼠38成月几细月包[22]。用500nM的AON-l:GGCCAAACCUCGGCUUACCU(2'-(9-曱基硫代磷酸，Eurogentec)转染增殖的成月几细胞(lx106个细胞/小鼠)，与聚乙烯亚胺(Exgen500,MBIFermentas,3.5|al/)agAON)复合。在转染后的第二天，沉淀(pellet)细胞并溶解于7piHank平衡盐溶液，其包含或不包含头蛋白，一种众所周知的BMP4抑制剂(不同量0、10、50或100ng)。4昔助于50|um尖3皮璃吸管(tipglasspipette)，将细胞注入雌性mdx"+.utrn一小鼠的胫骨前肌。在注射以后的第3或10天，处死小鼠，并制备系列冷冻切片。用苏木素/伊红以及用抗肌萎缩蛋白和Y-染色体特异抗体对切片进行染色以分析细胞存活、迁移以及抗肌萎缩蛋白表达。附图简要i兌明图1:借助于寡核普酸微阵列(上部图片)或定量RT-PCR(下部图片)(Lightcycler，Roche)确定的v4g尸"A)和SM/M(B)的基因表达。x轴以天数表示时间。y轴表示1og2表达比率(归一化到健康的，t=0)或-A(Ct)(归一化到健康的，t=0)。Ct值与mRNA的初始量的4og成比例，因此可相比于4og表达比率。竖线表示不同培养物(n^3)的标准偏差。图2:用不同浓度的BMP4加以温育、在分4匕的第7天加以评估的健康和DMD肌管的免疫组织化学染色。用DAPI(蓝色)以及对于结蛋白(红色)和肌球蛋白(绿色)的抗体来染色细胞。图3:在加入不同浓度的重组BMP4以后，1建康和DMD成月几细胞的分化指数。在第7天固定细胞。回归才莫型，**p<0.01，*p<0.05。图4:在"i秀导分化以后在^:康和DMD成月几细月包之间差异表达基因的Log2基因表达比率；SF、AfME、^d/,'c"w、MH757、五DiV7L4。竖线表示所用不同线(n-3)的标准偏差。图5:在健康和DMD成肌细胞融合期间在不同功能类型中基因的平均1og2基因表达。肌节基因表现出在DMD肌细胞生成后期(第6、10以及14天)基因表达的降低。*配对1检验，p<0.01。在其它功能类型(细胞生长和维持、蛋白质结合、代谢上调和代谢下调)所涉及的基因在健康和DMD之间在任何时间点(r^6)并没有显示显著差异。图6:溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶说明在杜兴氏肌营养不良患者的成肌细胞中人BMP4的外显子4的反义寡核苷酸介导的跳跃(如实施例2描述的实-验)。图片A示出用PCR1获得的片4殳(BMP4mRNA的外显子3);图片B示出用PCR2获得的片段(BMP4mRNA的外显子3-5)。其中外显子4淵^夭的产物具有142个核苷酸的大小。图片C示出用PCR3获得的片段(GAPDHmRNA)。附图1:在加入不同浓度的重组BMP4以后1"建康和DMD成月几细月包的分4匕指凄t。在第ll天固定细月包。回归才莫型，*p<0.05。附图2:健康和DMD成肌细胞融合之间随着时间差异表达基因的基因表达水平(通过RT-MLPA进行试验)；5F、MME、^J//caw、MTOS7。竖线表示所用不同线(n-3)的标准误差。40表1:在健康和DMD成肌细胞之间显示差异基因表达(>2倍)的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表2:分化指数的广义线性回归^^型<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>截距健康细胞培养物的基线比例，其中在第7天BMP4为0.3ng/ml。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05表3:分化指数的广义线性回归模型，ANOVA表<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05附表2:分化指数的广义线性回归模型<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>***P<0.001,**P<0.01，*P<0.05附表3:分化指数的广义线性回归模型，ANOVA表<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>***P<0001,**P<0.01,*P<0.05附表la:在健康和DMD成肌细胞融合之间显示差异基因表达的基因(在DMD中被上调的基因)Log2表达差异(DMD-健康的)基因库名称序列描述p值012461014水通道蛋白l(通道形成整合蛋白，H24316AQP1*28kDa)*1.11E-162.703.272.923.122.442.801.99促分裂原活化蛋A-斜紘AI268273MAP3K5*曰/^^7汰啤双H^"1.11E-160.971.150.850.670.610.770.65L06622EDNRA*内皮素受体型A*1.11E-16-0.170.621.531.521.641.361.65骨形态发生蛋白AA463225BMP4*4*1.55E-151.621.081.531.621.171.360.70转录因子AA496896MTSG1*MTSGl*1.59E-140.270.971.362.001.221.391.35运动4申经元1的AA448194S画l*存活，端粒*9.14E-120.540.470.650.550.490.710.50长醇-磷酸甘露糖基转移酶多肽2，AA773333DPM2调节亚基3.86E-110.490.780.670.510.580.710.49AI359037STX3A突触融合蛋白3A1.13E-090.490.820.810.430.681.090.76AA404269PRICKLE1棘l-样(果蝇)1.16E-090.530.780.841.140.710.890.46衔接子相关蛋白质复合体1，a2AA437212AP1S2亚基1.81E-090.320.550.800.620.980.750.69MyoD家力臭4中制R44617MDFI剂1.89E-090.110.620.681.440.991.240.61神经纤毛蛋白(NRP)和金属蛋白酶(tolloid)AA456821NET02(TlX)-样23.86E-090.840.70.601.000.930.860.96BTB和CNC同源物1，碱性亮氨酸AI336948BACH1拉链转录因子16.46E-090.590.770.710.650.640.790.63主要组织相容性复合物，II类，DMH42679HLA-DMAa7.65E-090.931.190.921.020.490.600.56AA402874PUTP磷脂转移蛋白9.83E-090.170.420.551.470.981.290.59细胞骨架蛋白(肌动蛋白解聚因AA424824DSTN*子)*1.62E-080.750.950.680.770.690.520.59AA918646KIAA0830KIAA0830蛋白4.74E-080.730.870.950.270.280.460.20脂肪酸去饱和酶NM_004265FADS221.20E-070.300.621.221.220.110.710.17N35907KIAA0830KIAA0830蛋白2.07E-070.650.850.950.380.020.280.13与YRPW基序2有关的断裂的多AJ249545HEY2毛/增强子A各船石悉Jt63.62E-070.580.820.751.200.910.550.99赏曰盼私敬力拜吸酶，受体型，f多肽(PTPRF),相互作用蛋白(LIP相N51002PPFIA2关蛋白)，a23.77E-070.690.750.420.680.590.740.46LIM结构域结合H74106LDB224.64E-070.290.390.820.820.800.590.61P21(CDKN1A)-AA505056R26417AA449289AI129115AA458981AF091555AA699926AA677824H65596AI291262N63172AA282983AA485871R97066AA464736N70786AF176422H07920AA704226L07872PAK2STAT5BSMTNFLJ10151FKBP4CTBP1SNTA1*TEAD3SAP18ESTLOCI53222C6orfl29MYOICTGM2FLJ14525ASH1LAA122049FAM35AHEY1MAP2K6TNSRBPSUH转录的信号转导蛋白和激活子5B平滑肌细胞特异基因(smoothelin)CDNAFLJ10151倒转因子(fis)，克隆HEMBA1003402FK506结合蛋白4,59kDaC端结合蛋白1互生蛋白，al(抗肌萎缩蛋白相关蛋白Al,59kDa,酸性成分)*TEA结构域家族成员3sin3-相关多肽，18kDa智人，类似于透明同系物3(果蝇)，克隆IMAGE:5277415,mRNA4见网膜蛋白第6号染色体可读框129肌球蛋白IC转谷氨酰胺酶2(C多肽，蛋白质-谷氨酰胺-Y-谷氨酰转移酶)假定蛋白FLJ14525灰分(Ashl)(缺少、较小或同源异型)-样(果蝇)具有序列相似性35的家族，成员A与YRPW基序1有关的断裂的多4V增强子促分裂原活化蛋张力蛋白无发(hairless)(果蝇)的重组结合蛋白抑制因子5.53E-076.05E-079.74E-071.03E-061.41E-061.53E-061.99E-062.22E-062.94E-063.21E-063.28E-064.11E-064.45E-065.40E-067.96E-068.70E-060.860.430.400.800.330.630.790.470.710.440.530.710.910.230.160.860.440.290.360.750.361.02E-060.480.610.420.540.640.460.380.660.510.170.650.520.430.780.320.800.330.430.780.370.580.550.730.620.470.280.280.340.180.250.270.330.810.480.780.420.490.330.410.410.330.230.790.510.760.590.931.060.590.620.430.650.480.260.590.390.320.680.500.400.230.580.280.510.950.390.660.021.140.661.200.241.150.770.700.630.630.210.220.310.020.230.710.45.98E-060.340.640.450.530.540.400.146.60E-060.150.460.530.330.410.480.42'.92E-060.700.631.360.630.530.861.000.130.420.210.740.280.740.220.540.380.480.340.590.480.269.79E-060.700.510.310.820.750.530.94*通过测序力口以^正实44<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>权利要求1.一种化合物在用于降低、抑制和/或拮抗骨形态发生蛋白4(BMP4)在细胞中的表达，用于制备减轻个体中遗传性肌营养不良的症状的药剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述细胞是成肌细胞或其前体o3.根据权利要求1或权利要求2所述的应用，其中，所述化合物包括反义RNA或其功能等效物。4.一种用于刺激成肌细胞分化的方法，包括向所述成肌细胞提供一种化合物用于降〗氏、抑制和/或拮抗BMP4在所述成力几细胞中的表达。5.才艮据^又利要求4所述的方法，其中，所述化合物降^f氐和/或抑制BMP4mRNA在所述成月几细胞中的表达。6.才艮据4又利要求4或4又利要求5所述的方法，进一步包括4吏所述成月几细力包与成熟力几细力包4妄触。7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中，所述成熟肌细胞获自患有所述遗传性肌营养不良的主体。8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中，降低和/或抑制BMP4mRNA在所述成月几细胞中的表达包括向所述成月几细胞或其前体提供互补于所述BMP4基因的BMP4寡核苷酸(反义)。9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其中，向所述成肌细月包或其前体体外提供所述BMP-4反义寡核苷酸。10.—种包括BMP-4反义寡核苷酸的成肌细胞或其前体的集合。11.根据权利要求1-3中任一项所述的应用、或根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中，借助于病毒转导DNA序列来降低、抑制和/或拮抗表达。12.根据权利要求1-3中任一项所述的应用、或根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中，借助于病毒载体向所述细胞才是供所述化合物。13.根据权利要求1-12中任一项所述的应用或方法，其中，所述遗传性肌营养不良包括以下疾病之一杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克型月几营养不良(BMD)、先天性月几营养不良(CMD)、远端肌营养不良(DD)、艾-德肌营养不良(EDMD)、面肩肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良(LGMD)、强直性肌营养不良(MMD)、目艮咽型肌营养不良(OPMD)。14.根据权利要求1-13中任一项所述的应用或方法，其中，所述化合物包括蛋白抑制剂。15.根据权利要求1-14中任一项所述的应用或方法，其中，所述化合物包括BMP4抑制剂或拮抗剂。16.根据权利要求14或权利要求15所述的应用或方法，其中，所述抑制剂或拮抗剂包括头蛋白，神经诱导蛋白质，ventroptin，扭转原肠胚形成，高血糖诱导基因或BMP4拮抗剂的DAN家力臭的其它成员，PRDC，骨石更化素，CTGF和/或卵泡抑素或其功能部分、书t生物和/或类似物。17.根据权利要求1-16中任一项所述的应用或方法，进一步包括第二种化合物在用于制备治疗所述个体的药剂中的应用，其中所述第二种化合物向所述个体的力几细胞l是供与所述遗传性月几营养不良有关的基因(突变基因)的至少部分正常功能。18.根据权利要求1-17中任一项所述的应用或方法，其中，所迷遗传性肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(DMD)或贝克型肌营养不良(BMD)。19.根据权利要求18所述的应用，其中，所述第二种化合物包括寡核苦酸、或其功能等效物，用于跳跃抗肌萎缩蛋白基因的外显子。20.—种用于确定BMP4反义寡核苦酸或其功能等效物是否能够在包含外显子的BMP4前mRNA中诱导所述外显子的跳跃的方法，所述方法包括向表达所述BMP4前mRNA的细胞纟是供所述寡核苷酸并确定由所述前mRNA产生的成熟mRNA是否缺少所述外显子。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述反义寡核苷酸或其功能等效物互补于所述外显子。22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中，所述反义寡核苷酸或其功能等效物互补于所述外显子的外显子内部部分。23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述反义寡核苦酸或其功能等效物互补于BMP4的外显子4。24.互补于BMP-4的外显子的反义寡核苷酸或其功能等效物的应用，用于在BMP4前mRNA中跳5夭所述外显子。25.互补于BMP-4的外显子的反义寡核香酸或其功能等效物，用于治疗遗传性力几营养不良。26.互补于BMP-4的外显子的反义寡核苦酸或其功能等效物在用于制备治疗遗传性肌营养不良的药剂中的应用。27.根据权利要求20-26中任一项所述的应用或方法，其中，借助于病毒载体向所述细胞提供所述反义寡核苷酸。28.根据权利要求27所述的应用，其中，所述病毒载体包括用于表达所述反义寡核苷酸的表达盒。全文摘要本发明提供了用于减轻遗传病的方式和方法。在分化细胞中具有表型的遗传缺损可以导致在其前体细胞中的缺损。这些所谓的继发性缺损成为个体综合疾病的原因。在本发明中，目的在于减轻遗传病症状的基因干扰涉及分化细胞中的原发性遗传缺损和前体细胞中的继发性缺损。文档编号A61K38/18GK101472603SQ200780023059公开日2009年7月1日申请日期2007年4月20日优先权日2006年4月20日发明者加里-让·布德韦恩·范奥姆门,彼得·亚伯拉罕·克利斯蒂安·T霍恩,彼得罗妮拉·约翰娜·伊丽莎白·施特尔恩贝尔赫,约翰内斯·特奥多鲁斯·登邓恩内恩申请人:莱顿教学医院