专利名称：：基于六氢异α酸蛋白激酶调节的癌症治疗的制作方法
技术领域：
：信号转导提供一个重要的保持正常稳态的总体调控机制，或者若受到扰动，便作为一种与众多疾病病理和病况相关的诱发或协助机制。在细胞级上，信号转导是指信号或信号基从细胞外部运动到细胞内部。到达受体目标的信号可激活许多细胞活动需要的配体-受体相互作用，其中一些细胞活动还可作为后续信号。这种相互作用不仅作为一系列级联，而且作为一种复杂的相互作用网络或信号事件网络，该网络能对稳态过程提供精调控制。但是，此网络一旦失去控制，会引发细胞活动的改变，并引起反应细胞内基因表达程序的改变。参见图1，它显示了对胰岛素敏感性和抵抗进行调节的相互作用激酶网络的简化图。004信号转导受体一般分为三类。第一类受体是渗入质膜并具有某些内在酶活性的受体。这类受体的典型代表包括酪氨酸激酶(例如PDGF、胰岛素、EGF和FGF受体)、酪氨酸磷酸酶(例如T细胞和巨噬细胞的CD45[集束行列式-45]蛋白质)、鸟苷酸环化酶(例如钠尿肽受体)和丝氨酸/苏氨酸激酶(例如活化素和TGF-P受体)。具有内在酪氨酸激酶活性的受体自身可发生磷酸化作用，还可磷酸化其它底物。SH2域中的蛋白质与RTK或受体相关酪氨酸激酶相互作用会使该蛋白质酪氨酸磷酸化。由此引起的磷酸化会(积极地或消极地)改变活性。SH2中具有内在酶活性的若干蛋白质包括磷脂酶C-y(PLC-力、原癌基因c-Ras相关的GTP酶激活蛋白(rasGAP)、磷脂酰环己六醇_3-激酶(PI-3K)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1C(PTP1C)以及其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)Src家族成员。虽然对人类RA的病因和发病机理仍知之甚少，但其发展过程可分为三个阶段。在启始阶段，树突状细胞对自身反应性T细胞表现出自体抗原性。T细胞通过细胞因子激活自身反应性B细胞，产生自身抗体，反过来又在关节中形成免疫复合物。效应阶段，免疫复合物结合巨噬细胞和肥大细胞上的Fcf受体，从而释放细胞因子、趋化因子、炎症和疼痛。最后阶段，细胞因子和趋化因子激活并募集滑膜细胞、破骨细胞和中性粒细胞，它们可释放蛋白酶、氨基酸和诸如02-的ROS，从而对软骨和骨造成不可逆转的破坏。在胶原诱导的RA动物模型中，需要T细胞和B细胞的参与来诱发该疾病。通过脾酪氨酸激酶(Syk)和磷脂肌醇3激酶(PI3K)，抗原受体触发后，B细胞激活信号[WardSG，FinanP.将异构体特异性磷脂肌醇3激酶抑制剂作为治疗剂；CurrOpinPharaiaco1,8月;3(4):426-34，(2003)]。参与B细胞上的抗原受体后，Syk对三种酪氨酸进行磷酸化作用。Syk是一种72-kDa蛋白质酪氨酸激酶，它在将免疫识别受体耦连到若干下游信号传导通路中发挥重要作用。此作用的特性就是催化活性以及与含有SH2域的效应蛋白发生相互作用的能力。Tyr-317、Tyr-342和Tyr-346的磷酸化作用为含蛋白质的若干SH2域产生停泊位点。[Hutchcroft,J.E.、Harrison,M.L.与Geahlen，R.L.(1992):72-kDa蛋白质酪氨酸激酶Ptk72与B细胞抗原受体结合。J.Biol.Chem.267:8613-8619，(1992)以及Yamada，T.、Taniguchi，T.、Yang，C.、Yasue，S.、Saito，H.禾卩Yamamura，H.与带有蛋白质酪氨酸激酶P72(Syk)的B细胞抗原细胞抗原受体结合并通过膜IgM激活，Eur.J.Biochem.213:455459,(1993)]。0018]已证明Syk用来激活响应大量信号的PI3K，其中B细胞抗原受体(BCR)和巨噬细胞或中性粒细胞Fc受体参与此激活。[参见Crowley,M.T.等人JMW.1027-1039，(1997);Raeder,E.M.等人，《//附w"w/.163，6785—6793，(1999):和Jiang,K.等人，祝ooiHOl，236—244，(2003)]。在B细胞中，可以通过接头蛋白(例如BCAP、CD19或Gabl)的磷化作用激活BCR刺激的6PI3K，该激活产生用于PI3K调节亚基P85的结合位点。由许多IgG受体传递的信号需要Syk和PI3K的参与活动，并需要募集它们的集群受体点。在中性粒细胞和单核细胞中，有人建议将PI3K与FcgRIIA上磷酸化的免疫受体酪氨酸活化基序序列直接结合，作为受体的PI3K募集机理。而最近一篇文章报道了Syk和PI3K之间的分子直接相互作用[MoonKD，等「乂，Syk蛋白质酪氨酸激酶和磷脂肌醇3激酶间直接相互作用的分子基础J.Biol.Chem.280,No.2,IssueofJanuary14，pp.1543-1551,(2005)]。0019大量研究表明COX-2活性抑制剂可减少PGE2的生成，并能有效缓解慢性关节炎(例如RA)患者的疼痛。既然COX-1和COX-2参与组织(胃肠和心血管系统)的重要修复工作，COX抑制酶活性制剂的副作用就更令人担忧。所以，必须设计一个安全的、长期的治疗方法以缓解患者的疼痛。既然通过Syk、PI3K、p38、ERK1/2禾QNF-kB依赖性通路，COX-2禾QiNOS合成信号诱导剂，那么这些通路抑制剂会对自身免疫疾病尤其对RA患者关节发炎和变形病症产生疗效。0020]在RAW264.7老鼠巨噬细胞炎症模型内抑制PGE2生成的筛选过程中，发现酒花衍生物p异a酸(RIAA)。在本发明中，我们对RIAA能否直接抑制COX酶活性和/或它能否抑制COX-2和iNOS的诱导作用进行研究。我们发现RIAA并不直接抑制COX酶活性，而是抑制NF-kB驱动的酶诱导，这引导我们对RIAA是否是一种激酶抑制剂进行研究。我们发现RIAA同时抑制Syk和PI3K，这使我们可测定针对各种自身免疫性疾病患者进行的试点研究的疗效。目前正在研究的与疾病症状相关的其它激酶包括Aurora、FGFB、MSK、RSE和SYK。。越来越多的证据证实GSK-3在调节骨骼肌葡萄糖转运活动中存在副作用。例如，使用选择性GSK-3抑制剂，针对抗胰岛素的啮齿类动物进行的急性治疗，可提高全身胰岛素敏感度，并可增强作用在肌肉葡萄糖转运上的胰岛素效应。使用特定GSK-3抑制剂，针对抗胰岛素、前期糖尿病肥胖的Zucker大鼠进行的慢性治疗，可提高口服耐药量和全身胰岛素敏感度，改善血脂异常并增强骨骼肌中IRS-1依赖性胰岛素信号传导。这些结果有力地证明在肌肉中选择性使用GSK-3可对肥胖相关的胰岛素抵抗进行有效干预治疗。Syk为一种非受体酪氨酸激酶，它和参与来自B细胞受体以及IgE受体信号传导的ZAP-70有关。Syk在这些受体内与ITAM基序结合，并通过Ras、PI3激酶和PLCg信号传导通路启动信号传导。Syk在胞内信号传导中发挥重要作用，因而它是炎症性疾病和呼吸障碍研究的重要靶点。图1描绘了调节胰岛素敏感度和胰岛素抵抗的部分激酶网络。0035图2描绘了MgRIAA(mgRho)对五种选择性激酶的抑制作用。00361图3描绘了五种酒花组分和一种金^Jt^y^罗提取物对PI3K亚型的抑制作用。0037]图4描绘了RIAA(图表A)禾卩IAA(图表B)剂量相关的生物合成PGE2的抑制作用，其中白色柱表示在加入COX-2表达的LPS刺激，灰色柱表示加入测试材料之前隔夜的LPS刺激。图5描绘了塞来昔布(图A)和MgRIAA(图B)对RAW264.7细胞中分析得到的LPS诱导的COX-2介导的PGE2生成的直接酶抑制作用。PGE2的测量单位用pg/ml表示。误差带表示标准偏差(n=8)。图10给出了评估金会^t富样品#4909提取物对生长中和成熟脂肪细胞的脂肪性效应的测定流程。使用3T3-L1小鼠成纤维细胞模型来研究测试化合物对脂肪细胞脂肪生成的潜在影响。0044图11示意性描绘了相对于溶剂对照，利用会^^t霉样品#4909提取物或作为阳性对照的吲哚美辛和曲格列酮处理3T3-L1脂肪细胞的非极性脂肪含量。误差带表示95%的置信区间(单尾)。0045图12示意性给出了金合^t脣样品糾909水提取物的二甲基亚砜可溶部分对抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞的脂联素分泌物评估效应的测试流程。图17用图表描述了通过各种会合Jt^乂L茶提取物诱发的脂联素分泌相对最大值。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95%的置信区间。图20描述了p异a酸、异a酸、四氢异a酸、六氢异a酸、黄腐酚、酒花残留物、六氢(3酸和阳性对照曲格列酮的Hofstee图。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算脂联素分泌半最大值处测试材料所需的浓度。00541图21给出两个条形图，分别表示通过异a酸和p异a酸(图A)以及六氢异a酸和四氢异a酸(图B)诱发TNFa处理过的成熟3T3-L1细胞的相对脂联素分泌情况。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95%的置信区间。*与仅用TNFa处理的结果有着显著性差异(p<0.05)。图26图示了不同浓度的THIAA或还原异a酸(RIAA)对SW480细胞系细胞增值的作用。计算空腹胰岛素和血糖的HOMA分数。图39给出THIAA或塞来昔布姜黄素(1:3)对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞的抑制百分比。0073图40给出朋IAA和塞来昔布姜黄素(1:3)对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞的抑制百分比。。所以，这显示Aktl在确定尺寸大小方面发挥重要作用，而Akt2参与胰岛素信号传导。激酶数据和我们自己的结果结合，其中我们发现酒花化合物可抑制cPLA2蛋白表达(免疫印迹法，数据未给出)而非mRNA,这表明酒花化合物作用的抗炎模式可能是通过降低cPLA2蛋白质水平，或许是更具体地通过抑制TOPmRNA翻译的活性来抑制PI3K通路，从而降低底物对COX2的可用性。半数抑制浓度可随意分成以下四类(1)IC5。值在0.1-0.3吗/ral范围内的试剂具有最强抗炎反应；(2)IC5。值在0.7-1.0(ig/ml的试剂具有高度抗炎反应；(3)IC5(,值在2-7pg/ml的试剂具有中度抗炎反应；(4)IC5。值大于12^g/ml(所测最大浓度)的试剂具有低抗炎反应。00161]—阿司匹林和塞来昔布的阳性对照证明了它们在此模型体系中各自的环氧合酶选择性(表9)。阿司匹林对C0X-1的选择性接近1000倍，而塞来昔布对C0X-2的选择性也达114倍。所有酒花原料都具有C0X-2选择性，其中P-异a酸和异a酸已证实对C0X-2具有最高选择性，分别为363倍和138倍。在低的半数抑制浓度下具有如此高的C0X-2选择性，这在其它资源获得的天然产物的有关报道中还从未出现过。在剩余的酒花衍生物中，只有香型酒花精油呈现出微弱的C0X-2选择性，仅为3倍。为了推测临床疗效的#^/数据，通常假设当C0X-2的选择性达到5倍或以上时，就表明具有显著保护胃粘膜层的临床应用潜力。基于这种标准，P酸，C02酒花提取物，酒花残留C02/乙醇，四氢化异a酸和六氢化异a酸都显示出在临床上潜在的C0X-2相关选择性。表9酒花馏分及其衍生物在RAff264.7细胞中对C0X-2和C0X-1的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>e酸0.542954co2酒花提取物0.226.329a酸0.266,224酒花残留C(V乙醇0.882124四氢化异a酸0.204.020六氢化异a酸0.293.010香型酒花精油1.64.13.0阳性对照阿司匹林1.160.00090.0008塞来昔布0.0050.57114实施例5由受LPS刺激的RAW264.7细胞中还原异构a酸或异构化a酸所导致的PGE2直接抑制不足测试材料一本实验使用表12中所示的酒花衍生物还原异构a酸和异构化a酸。阿司匹林，从Sig脇(St.Louis.MO)公司购得，其将作为COX-l选择性的阳性对照。—使用CalSyn(BI0S0FT,Ferguson,M0)软件包，根据0.10、1.0、10和10(Hig/ml四种浓度测得的相关数据，得出剂量反应曲线并计算置信区间为95%时的半数抑制浓度(IC50s)。001681结果一受LPS刺激的RAW264.7细胞中PGE2的产量与未受刺激的细胞相比，比值为1.4-2.1倍。阿司匹林阳性对照计算出的8.7叫/ml的半数抑制浓度(95%置信区间=3.9-19)与已报道的C0X-2直接抑制值1.4到50Hg/ml[Warner,T.D.等乂[非甾体类药物对环氧化酶-1而非环氧化酶-2的选择性与人胃肠毒性有关尔W全面分析尸roc.Afef人//cW.〃5X96:7563-7568，(1999)]以及该实验室关于A549细胞系历史数据3.2pg/ml(95%置信区间=0.55-0.19)相一致。进行，未作任何修改，该流程也称WHMA-C0X-2方案。简而言之，在植入A549细胞24小时后，加入白细胞介素-lIJ(10ng/ml)以诱导C0X-2的表达。24小时后，用不含血清的RPMI1640培养液出冲洗细胞。随后，将溶于二甲亚砜和不含血清的RPMI中的测试材料加入孔中以获得25、5.0、0.5和0.05pg/ml的最终浓度。每个浓度重复两次。向对照孔中加入与测试孔中液体等体积的二甲亚砜。60分钟后，将A23187(50^M)加入孔中以释放花生四烯酸。30分钟后从孔中取出25^培养基进行PGE2测定。53,智^i,^^/7必潘一将人气管上皮细胞系A549细胞系(美国组织细胞培养收集中心，Bethesda,MD)按实施例6所述进行培养和处理。将螨尘过敏原加入到培养基中并达到1000ng/ml的最终浓度。18小时后，对培养基取样并进行PGE2测定。—待测化合物在二甲亚砜(DMSO)中配制，并在-20°C温度下贮存。MgRIAA购自Metagenics公司(圣克莱门特，美国加州)。小白菊内酯购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美国密苏里州)。PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002购自EMDBiosciences公司(圣地亚哥，美国加州)。对应COX-2和iNOS的抗体购自CaymanChemical公司(安娜堡，美国密西根州)。对应GAPDH的抗体购自NovusBiological公司(利特尔顿，美国科罗拉多州)。与辣根过氧化物酶发生结合的二级抗体购自AmershamBiosciences公司(皮斯卡塔韦，美国新泽西州)。通过MgRIAA对RAW264.7细胞的核提取物进行处理，再用LPS刺激4小时后分析NF-kB对DNA的结合情况。。简单来讲，先将细胞用冷PBS液润洗两次，然后加入缓冲液A(10mMHEPES,pH7.0;1.5mMMgCl2;10mMKC1;0.1%NP-40;抑肽酶5吗/ml;胃酶抑素A1吗/ml;亮肽酶素5pg/ml;氟化磺酰甲苯1mM)并逬行15分钟的冰浴。然后将细胞刮入一个干净的试管中，并循环冷冻与解冻三次。在4°C下10000xg加速度下离心5min所得上清液层即为细胞质的组分。将剩余物重新悬浮在缓冲液C(20mM服PES，pH7.0;1.5mMKC1;420mMKC1;25%甘油；0.2MEDTA;抑肽酶5吗/ml;胃酶抑素Alpg/ml;亮肽酶素5)ag/nil;氟化磺酰甲苯ImM)中，并进行15分钟的冰浴。在4°C下10000xg加速度下离心5min后收集上层核提取物组分。细胞核提取物的NF-kBDNA结合分析使用ActiveMotif公司(卡尔斯巴德，美国加州)的TransAMNF-kB试剂盒并按照生产商的使用说明来完成。如图8所示，TransAM测试盒检测96孔细胞板上结合到共有序列上的NF-kB的p50亚基。然后测定蛋白质浓度(Bio-Radassay公司)并重复分析10吗核蛋白提取物。重复进行核提取物(10蛋白质)的分析并将结果以图9所示的图形表现出来。LPS(1pg/ml)的刺激会使NF-kB基因结合率增加两倍。用LY294002(—种PI3激酶抑制剂)进行处理会导致NF-kB结合率降低，这和以往文献的报道相符。小白菊内酯也能导致NF-kB结合率显著降低，这点和我们的预期是一致的。使用MgRIAA时也能观察到NF-kB的结合率大幅降低。以剂量反应的方式也能观察到这一影响。NF-kB结合力的降低可能导致包括COX-2、iNOS以及TNFa在内的目标基因翻译活性降低。,人们还能对试剂的胰岛素增敏和甘油三酸脂沉降能力进行研究。。噻唑烷二酮类，如曲格列酮和吡格列酮这类药物，已显示出在脂肪细胞中能选择性刺激脂肪生成活性，从而得到更大的脂肪分解胰岛素抑制或将脂肪酸释放到血浆中[Yamauchi,T.,J.Kamon，寧义.杂合过氧化物酶体增殖激活受体y(PPARy)缺乏和PPARy激动剂提高胰岛素抵抗性的机制jBiolCh柳276(44):41245-54，(2001);0akes，N.D.，P.G.Thalen,寧乂.噻唑垸二酮类药物增加血浆-脂肪组织FFA交换容量并增强胰岛素介导游离脂肪酸体系控制的有效性。Diabetes50(5):1158-65，(2001)].该行为使其他组织可利用的游离脂肪酸更少[Yang，W.60S.，W.J.Lee，等乂.体重减轻会增加脂源型抗炎性蛋白质、脂联素的血浆水平。JClinEndocrinolMetab86(8):3815-9，(2001)]。因此，肌肉和肝脏中游离脂肪酸的胰岛素减感效应将由于噻唑烷二酮处理的结果而减弱。这些錄^/结果已在临床上得到证实[Boden，G.不饱和脂肪酸在胰岛素抵抗和非胰岛素依赖型糖尿病发病机理中的作用。Diabetes46(1):3-10，(1997);Stumvoll,M.与H.U.HaringGlitazones:临床效果与分子机制,AnnMed34(3):217-24，(2002)]。002031gr^Z/辨一曲格列酮购自Cayman化学制剂公司(安娜堡，美国密歇根州)，甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、茚甲新、油红0以及胰岛素购自Sigma公司(圣路易斯，美国密苏里州)。测试材料为一种深褐色粉末，购自Bayir化学制剂公司(南十字星路68号，Basavanagudi，印度)，它是从会会^t顰植物树胶脂第4909号样品的50:50(体积比)水/酒精的提取物中制得的。提取物中儿茶酚含量标准需不低于20%。本例中所用批号为ACat/2304的提取物经紫外分析儿茶酚含量达20.8%。青霉素、链霉素、杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)购自Mediatech(美国弗吉尼亚州赫顿市)公司，而10%FBS-HI(热灭活胎牛血清)购自MediatechandHyclone(Logan，UT)公司。所有其它标准试剂，除非另行说明，均购自Sigma公司。将AcE部分溶解于二甲亚砜(DMSO)中，在分化0天时加入培养基中使其浓度达到50pg/ml，并在整个成熟期内保持这一浓度(直到第6天或第7天，D6/7)。无论何时加入新鲜培养基，都需要加入新的实验材料。选择DMSO是因为它的极性并且它容易与液态细胞培养基混合的特性。分别加入吲哚美辛和曲格列酮作为阳性对照，二者最终浓度分别为5.0pg/ml和4.4pg/ml。用0.36%的油红0或0.001%氟硼二吡咯对分化后的D6/D73T3-Ll细胞进行染色。使用实验材料对细胞进行分化和处理的完整流程概述于图10中。002071浙iZ^染经一D6/D7-分化的3T3-Ll细胞中甘油三酯含量的估算所用到的油红0染色是根据Ka5t"n'/〃/m/j'游方兹[Kasturi，R.andJoshi，V.C.3T3-Ll细胞脂肪转化过程中十八酰基辅酶A脱饱和酶活性和脂肪生成的激素调节.JBiolChem，257:12224-12230,1982]。用PBS(磷酸盐缓冲液，Mediatech)润洗单层细胞，然后用10%甲醛固定10min。将三份0.6%油红0/异丙醇原液与两份水混合得到油红0工作液，并将已固定的细胞在其中染色1小时，然后水洗一次去除过量的染料。用异丙醇从细胞中提取出染色油滴，并使用光谱光度测量技术在540nm波长下对其进行定量分析(MEL312eBIO-KINETICSREADER,Bio-TekInstruments公司，文奴斯基，美国佛蒙特州)。实验材料和作为阳性对照的吲哚美辛以及曲格列酮的实验结果，以540rai下溶剂的相对吸光度表示。濕/试^"弃一曲格列酮购自CaymanChemical(AnnArbor,MI)公司，而甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素购自Sigma(St.Louis,M0)公司。测试材料为一种黑褐色粉末，以50:50(体积比)水/酒精从金合欢属样品#4909的树胶脂提取而来，该材料购自Bayir化学制剂(No.68,SouthCrossRoad,Basavanagudi，印度)公司。提取物中儿茶酚含量标准需不低于20%。本实施例中所用批号为ACat/2304的提取物经紫外分析儿茶酚含量达20.8%。青霉素、链霉素、杜尔贝科改良的伊格尔培养基(MEM)购自Mediatech(美国弗吉尼亚州赫顿市)公司，而10%FBS-HI(热灭活胎牛血清)购自MediatechandHyclone(Logan,UT)公司。所有其它的标准试剂，除非另有说明，均购自Sigma公司。002151一智應i芗^^/7必潘一小鼠成纤维细胞系3T3-L1培养第6日脂肪细胞开始分化，如实施例10所述。在96孔细胞板中接种3T3-L1细胞，接种密度为lxl04个细胞/cm。经过两天的生长，细胞实现融合。融合后，加入分化培养基迫使细胞向脂肪细胞分化；培养基组成(1)10%的FBS/DMEM(高糖)；(2)0.5mM甲基异丁基黄嘌呤；(3)0.5M地塞米松；(4)10g/ml的胰岛素(MDI培养基)。从第3日到第5日，将培养基换成10%FBS/DMEM中含有10pg/ml胰岛素的后分化培养基。。简而g之，第6日，将细胞在含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)无血清的培养基中培养三个小时，接着利用1胰岛素/ml加溶剂或1吗胰岛素/ml加测试材料进行处理。将曲格列酮溶解在二甲基亚砜中以获得5、2.5、1.25和0.625)ng/ml的浓度。.会合^t霉提取物测试浓度为50、25、12.5和6.25|ng/ml。24小时后，对培养基上清液取样以进行脂联素测定。利用测试材料对细胞进行分化和处理的完整流程概述于图12中。以确定表观米氏常数和最大速度。利用自变量v/[S]替换{相对脂联素分泌/[浓度]}，而利用应变量&}替换{相对脂联素分泌}，生成一个y=rax+b的关系式。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算测试材料必要的半最大值处的脂联素分泌浓度。00220兹菜一在抗胰岛素3T3-Ll细胞中，利用2.5吗/ml的浓度，相对溶剂对照2.44倍的最大刺激，作为阳性对照的曲格列酮所有测试浓度增加了脂联素分泌(图13)。50和25^g/ml浓度的—会合Jt慮增加了脂联素分泌，分别为溶剂对照的1.76倍和1.70倍。虽然合^^t慮的两个浓度均不等于利用曲格列酮测定的脂联素分泌最大值，但是它们可与浓度为1.25和0.625|ag/ml曲格列酮作用相当。002211源自修正的Hofsteeplots脂联素分泌最大估算值，表明脂联素分泌的相对增加与半最大刺激处的浓度存在巨大差异。利用Y截距方法估算的曲格列酮和儿茶对脂联素分泌最大值分别为溶剂对照的2.29倍和1.88倍。而剌激抗胰岛素3T3-Ll细胞中脂联素分泌的半最大值处曲格列酮和金合欢属浓度分别为0.085^tg/ml和5.38pg/ml。根据最小的儿茶酚含量20%计算，金合欢属大约为1.0ng/ml。脂联素指数卞10ngTNFa/ml±95%CI-1.00±0.10溶剂对照一1.54*吲哚美辛5.01.67*曲格列酮0.6251.51*金^欢虜乂乙,#4909树皮(甲醇提取物)501.41*—会会欢^fy^罗貼639心材(二甲亚砜提取物)501.26*金伶欢虜yg罗#5659树皮(甲醇提取物)251.12*^^欢虜乂"芬#5667树皮(甲醇提取物)50L26*—会^^ti7Zz芬貼668树皮(树脂胶)501.30*金会^bfy^罗#5640树皮(二甲亚砜提取物)501.17*会斧Jt^乂Z茶#5669心材(二甲亚砜提取物)501.脂联素指数—=[脂联素][脂联素]w。m*来自TNFa溶剂反应的显著增加(p〈0.05)。7000238实验观察到不同.会会Jt富样品或制剂会在这种代谢综合征的第二模型中引发相似的响应，这进一步证实—会^^t犀植物中存在多种能正向改变脂肪细胞生理机能以增强胰岛素作用的化合物。实施例16极性和非极性溶剂从金会^t^乂L茶对能在TNFa/3T3-Ll脂肪细胞模型中增加脂联素分泌的化合物中进行提取。00239这些实验中用到的是实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。实验所用标准化学药品如实施例11和13所述。将3T3-L1脂肪细胞用浓度为10ng/ml的TNFa按实施例13所述方法进行处理。如实施例13详述在第6天时取出培养基上清液并对脂联素进行分析。一使用5/8"金属钻头在标准功率下对大片」会会^t^乂L芬心材样品#5669(每片重量在5-10克之间)进行低速钻孔。然后将刨花收集到研钵中，在液氮冷冻下研磨至细粉状。然后将粉末通过一个250微米的筛网进行筛分以得到大约10g的自由流动精细粉末。表14用于3T3-L1脂联素分析的金^^t^7L芬提取物样品描述<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>1胃液组成为2.90gNaCl、7.0ml浓縮HC1水溶液、3.2g胃蛋白酶(800-2500活性单位/mg)，并加入1000ml水进行稀释。最终pH为1.2。对于本提取操作，胃液-心材悬浮液要在40°C下保温一小时，随后在^^"，^移除胃液。然后将剩余残留物溶解在甲醇中，通过0.45微米聚四氟乙烯注射式过滤器进行过滤并在真空中浓缩。#^〃一这些实验中用到的是实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。实验所用的标准化学药品如实施例11和13所述。将3T3-L1脂肪细胞用浓度为10ng/ml的TNFa按实施例13所述方法进行处理。如实施例13详述在第6天取出培养基上清液并对脂联素进行分析。002451濕^f/Y/V—.会^^^f乂乙齐样品#5669根据以下流程进行提取将碱性异丙醇溶液，(含有1.5NNaOH的1%(体积比)异丙醇溶液，)加入到装有约50mg干燥A^^t^乂L芬心材粉末#5669的50ml试管中。然后将样品简单混合处理，超声降解30分钟，再离心分离一个小时使剩余固体材料成粒。随后将上清液用0.45微米滤纸进行过滤。实验中用到的碱性异丙醇pH为8.0，收集液的pH为7.0。将过滤后的清液部分在^^"5V^进行干燥后得到白色固体。该样品称为干燥碱性提取物。T,对照卞卞值>1.11与TNFa对照(p<0.05)存在显著性差异。实施例18通过金^^t處样品水提取物的二甲亚砜可溶部分诱导TNFa-处理的3T3-L1脂肪细胞内白细胞介素-6分泌的减少。00248白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞激素，在宿主防御、急性期反应、免疫反应、神经细胞功能、造血作用以及代谢综合征方面均发挥重要作用。它可被多种正常和变异淋巴细胞及诸如脂肪细胞的非淋巴细胞表达。IL-6的产量可通过诸如细胞分裂激素或抗原刺激、脂多糖、钙离子载体、细胞激素以及病毒等多种信号进行上调[Hibi,M.，Nakajima,K.,HiranoT.IL-6细胞激素族和信号转导细胞激素系统模型。JMolMed.74(1):1-12,(Jan1996)]。人们已经在包括细菌和病毒感染、外伤、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及代谢综合征等若干病理状态中观察到这种血清浓度水平的提高[Amer，P.II型糖尿病中的胰岛素抵抗——脂肪素的作用。CurrMolMed.;5(3):333-9，(May2005)]。碧^菜一正如前述实施例中所示，TNFa能显著降低脂联素分泌，而吲哚美辛和金^^t^7乙芬提取物会在TNFa存在条件下增加脂联素分泌。尽管吲哚美辛阳性对照和金会Jt^f乂Az芬提取物证明了脂联素分泌剂量相关增加，但是这两种材料均无法将脂联素水平恢复到含TNFa的二甲亚砜对照中所示的浓度(表17)。在TNFa存在条件下，金合^t^乂Z茶提取物显示出对IL-6分泌的有效剂量相关抑制，而吲哚美辛则显示无抗炎效应。/[脂联素]，。对照1tIL-6指数=[IL-6测试-IL-6对照]/[IL-6,-IL-6对照]*这与TNFa对照有显著差异(p<0.05)。在TNFa/3T3-Ll脂肪细胞模型中，」会会^t^乂乙芬样品#4909呈现双重抗炎作用。金会Jt^乂L芬提取物的成分会增加脂联素分泌而减少IL-6分泌。金合^t^7/;^"的总体效果则会显示相对于TNFa对照的强效抗炎性。这些结论支持会^Jt^乂乙茶在改变脂肪细胞生理机能以降低胰岛素抵抗方面的应用，从而可治疗由胰岛素抵抗引起的体重增加、肥胖、心血管病以及癌症。实施例19金洽^t慮水提取物的二甲亚砜可溶成分对抗胰岛素3T3-Ll脂肪细胞中脂联素、IL-6以及抵抗素分泌的影响。/[脂联素]&卞卞IL-6指数=[IL-6测试]/[IL-6R岛素对照」卞卞卞抵抗素指数=[Resistin测试]/[Resistin胰岛素对照]*指数值表示平均值±95%置信区间，它是根据方差分析的剩余均方计算而来。大于或小于胰岛素对照±95%置信区间的数值与p<0.05时存在显著差异。实施例20使用源自酒花的植物化学成分增加脂肪细胞中的脂肪生成。002611^"孟y—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。所用的标准化学药品以及统计程序如实施例ll所述。00262一如表19中所述，测试中所用的酒花植物化学成分购自Betatech酒花产品公司(美国华盛顿特区)。表19酒花测试材料说明。酒花测试材料说明78a酸溶液82%a酸/2.7°/。卩酸/2.95%异构a酸(体积比)。a酸包括律草酮、聚律草酮和类律草酮。p异构a酸(RIAA)p-异律草酮、p-异聚律草酮和p-异类律草酮。异a酸(IAA)以体积比计算，异a酸占25.3%。包括/銜式^7^式异律草酮、/#_^//7i义异聚律草酮以及/,^C//7^_^异类律草酮。四氢异a酸(THIAA)酒花复合物一以体积比计算，THIAA为8.9%。包括/#式四氢异律草酮、/,式四氢异聚律草酮以及/#式四氢异类律草酮。六氢异a酸(HHIAA)以体积比计算，THIAA为3.9%，HHIAA为4.4%HHIAA异构体包括六氢异律草酮、六氢异聚律草酮和六氢异类律草酮。B酸溶液以体积比计算，P酸为10%;a酸含量<2%。B酸包括蛇麻酮、类蛇麻酮、聚蛇麻酮和前蛇麻酮。黄腐酚(XN)以质量比计算，黄腐酚含量>80%。包括黄腐酚、黄腐酚A、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚D、黄腐酚E、黄腐酚G、黄腐酚H、脱甲基黄腐酚、黄原酚、4'-0-甲基黄腐酚、3，-香叶基酮-4，5,7-三羟黄垸酮、3',5，-二异戊烯二基酮-4，5，7-三羟黄烷酮、5，-异戊二烯基黄腐酚、醉椒黄烷酮、脱二氢黄腐酚以及异脱氢环化水合物黄腐酚。酒花残留物黄腐酚A、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚D、黄腐酚E、黄腐酚G、黄腐酚H、反式羟基黄腐酚、l"O.2"-二羟基黄腐酚C,脱甲基黄腐酚B、脱甲基黄腐酚J、黄腐酚I、脱甲基黄腐酚、异黄腐酚、脱二氢黄腐酚、二异戊二烯基黄腐酚、5"-羟基黄腐酚、5'-异戊二烯基黄腐酚、6,8-二异戊二烯基柚皮素、8-异戊二烯-4,5，7—三羟黄垸酮、6-异戊二烯柚苷元、异黄腐酚、律草灵酮、副律草灵酮、4-羟基苯甲醛和谷甾醇-3-0-b-吡喃葡萄糖苷。六氢类蛇麻酮1%六氢类蛇麻酮(体积比，溶剂为KOH)。002651黄腐酚、a酸和J3酸和喷哚美辛及曲格列酮的脂肪生成反应相当，而酒花残留物和六氢类蛇麻酮则不能诱发比溶剂对照更大的脂肪生成反应。替换{相对脂联素分泌/[浓度]}，而利用应变量{v}替换{相对脂联素分泌}，生成一个y=mx+b的关系式。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算测试材料必要的半最大值处的脂联素分泌浓度。卞.数最高分泌量时测试材料的浓度[Hg/ml]异a酸3.170,49黄腐酚2.470.037P异a酸2.380.10曲格列酮[2]2.290.085酒花残留物2.212.8六氢异a酸[2]1.890.092六氢类蛇麻酮[2]1.833.2四氢异a酸1.600.11根据四种测试浓度的Hofstee点线性回归分析估算[2]忽略一个异常数据，使用其它ZI个浓度估计剂量反应800270如表20所示，由修正后的Hofstee的点(图20)估计最大脂联素分泌可有效支持上述观察结果。最高脂联素分泌的y轴截距估计大致分为三组(1)异a酸，(2)黄腐酚、p异a酸、曲格列酮和酒花残留物，以及(3)六氢异a酸、六氢类蛇麻酮和四氢异a酸。如表20所示，由修正后的Hofstee的点(图20)估计最大脂联素分泌可有效支持上述观察结果。最高脂联素分泌的y轴截距估计大致分为三组(1)异a酸，(2)黄腐酚、P异构d酸、曲格列酮和忽布残留物，以及(3)六氢异a酸、六氢类蛇麻酮和四氢异a酸。刺激抗胰岛素的3T3-L1细胞产生半数最大量脂联素分泌所需测试材料的浓度大约为0.1pg/ml，曲格列酮、P异构a酸、四氢异a酸和六氢异a酸在这点上类似。达到半数最大脂联素分泌时，异a酸的浓度为0.49pg/ml，接近前面的5倍。黄腐酚显示对半数最大脂联素分泌所需的剂量最低，约为0.037pg/ml。达到半数最大脂联素分泌时所需浓度最高的是酒花残留物及六氢类蛇麻酮，分别为2.8pg/ml和3.2)ig/ml。刺激抗胰岛素的3T3-L1细胞产生半数最大量脂联素分泌所需测试材料的浓度大约为0.1pg/ml，曲格列酮、p异a酸、四氢异a酸和六氢异a酸在这点上类似。达到半数最大脂联素分泌时，异a酸的浓度为0.49^g/ml，接近前面的5倍。黄腐酚显示对半数最大脂联素分泌所需的剂量最低，约为0.037pg/ml。达到半数最大脂联素分泌时所需浓度最高的是酒花残留物及六氢类蛇麻酮，分别为2.8pg/ml和3.2pg/ml。基于它们增强抗胰岛素的3T3-L1细胞中脂联素分泌的能力，本研究发现阳性酒花植物化学成分异a酸、p异a酸、四氢异a酸、六氢异a酸、黄腐酚、酒花残留物和六氢类蛇麻酮，预计对血浆脂联素降低的所有临床病症具有积极的影响。实施例22酒花植物化学成分通过增强抗胰岛素的3T3—L1脂肪细胞中脂联素的分泌以及抑制对白细胞介素-6的分泌而呈现抗炎活性。翁—菜一在高浓度胰岛素存在条件下，曲格列酮和所有测试过的酒花衍生物均能增加脂联素的分泌(表21)。在此模型中曲格列酮不会减少IL-6的分泌。事实上，曲格列酮和HHCL在两种浓度下显示增加IL-6分泌的能力，而THIAA和酒花残留物在最高浓度时可增加IL-6的分泌，在其它浓度下则不起作用。其它酒花衍生物对IL-6分泌的影响通常为双相的。在测试的最高浓度，除IAA夕卜，RIAA、HHIAA和XN均可增加IL-6的分泌。而RIAA、IAA、THIAA和XN会显著降低IL-6的分泌。表21酒花化合物对抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞中脂联素和白细胞介素-6分泌的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>将^^^(^fyZf测试材料或吲哚美辛同浓度为166nM的胰岛素一并加入到D53T3-Ll脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行脂联素、IL-6以及抵抗素测定。所有值都对胰岛素单一对照取指数。卞脂联素指数=[脂联素]/[脂联素]皿卞卞IL-6指数=[IL-6测试〗/[IL-6胰岛桑对照]*指数值是平均值±95%置信区间，它是根据方差分析的剩余均方计算而来。对脂联素或脂联素/IL-6来说，数值<0.7或>1.3与胰岛素对照有显著差异；而对IL-6来说，数值<0.77或〉1.23与胰岛素对照有显著差异。#与胰岛素对照pO.05有显著差异。以上数据说明酒花衍生物RIAA、IAA、HHIA、THIAA、XN、HHCL和酒花残留物可减弱脂肪细胞中由高胰岛素血症引起的促炎效应。总的来说，酒花衍生物在单纯由TNFa造成的高胰岛素血症条件下的抗炎效应要高于曲格列酮的抗炎效应。实施例23酒花植物化学成分增加TNFa处理后的3T3-L1脂肪细胞中脂联素的分泌。00277漠孟〃一在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。标准化学药品和酒花化合物IAA、RIAA、HHIAA和THIAA分别如实施例13和20所述。酒花衍生物分别在浓度为0.625、1.25、2.5和5.0吗/ml时进行测试。脂联素的分析如实施例12所述。混合在所有剂量下均显示协同作用，而金合欢属RIAA[10:1]在10和5.0pg/ml浓度下显示协同租用，并在其它任何测试浓度下均未发生拮抗。金合欢属IAA[10:1]混合物在两个中等浓度下也呈现协同作用，并且未发生拮抗。而金合欢属IAA[5:1]在浓度为50pg/ml时具有协同作用，在浓度为5.0(ag/ml时发生拮抗。00284类似地，所有混合物在一个或多个测试浓度下对增加脂联素分泌均显示协同作用(表23)。金合欢属IAA[10:1]混合在所有剂量下均显示协同作用，而金合欢属RIAA[5:1]和金合欢属RIAA[10:1]在三种剂量下显示协同作用，而在一种浓度下发生拮抗。金合欢属IAA[5:1]混合在浓度为1.0pg/ml时具有协同作用，在浓度高于10pg/ml时发生拮抗。表22抗胰岛素3T3-1模型中^^欢厲乂Z茶和酒花衍生物诱发的脂肪生成反应的观测值和预期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>卞脂肪生成指数呵OD]测a/[OD〗鹏对照。1)95%置信区间上限是1.03，最小显著性差值=0.03。2)95%置信区间上限是1.03，最小显著性差异=0.03。3)95%置信区间上限是1.07，最小显著性差值=0.07。4)95%置信区间上限是1.02，最小显著性差值=0.02。表23TNFa/3T3-1模型中i会欢^7Z茶和酒花衍生物诱发的脂联素分泌观测值和预期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>卞脂联素指数=[脂联素]自/[脂联素]TB对照1)95%置信区间上限是1.07，最小显著性差值=0.07。2)95%置信区间上限是1.03,最小显著性差异=0.03。漠產〃一在这些试验中，采用实施例11和13中所述的3T3-L1小鼠脂肪细胞模型。/[IL-6LPS-IL-6对照]*这与LPS对照有显著差异(p<0.05)。表25酒花衍生物和选用的非甾体抗炎药物对LPS/3T3-L1脂肪细胞中脂联素分泌的最大刺激。<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>卞脂联素指数=[脂联素]獄/[脂联素]LPS对照*数值大于1.07表示与LPS对照有显著差异(p<0，05)。NS=与LPS对照无明显差异。实施例26在TNFot/3T3-1模型中i合^t^/乙茶或酒花衍生物与姜黄素或黄腐酚混合时的协同效应。淑/[脂联素]T,对照1)95%置信区间从0.961到1.049，最小显著性差异=0.049。实施例27共轭亚油酸与酒花衍生物。异a酸混合在抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中对脂肪生成的体外协同作用。1501.261.15协同作用101.161.06协同作用5.01.161.10协同作用1.01.171.06协同作用卞脂肪生成指数=[OD]测试/[OD]腦。对照。1)95%置信区间上限是1.05，最小显著性差异=0.05。实施例28酒花植物化学成分抑制TNFcc-处理后的3T3-L1脂肪细胞中NF-kB的活性。碧菜一经TPA处理的Jurkat核提取物显示出预期的NF_kBp65增加，这表明试剂盒中试剂的性能能够满足需要(图22)。用浓度为10ng/ml的TNFa分别对D403T3-L1脂肪细胞处理3小时(图22A)或24小时(图22B)，核NF-kBp65会增加2.1和2.2倍。正如预期，TNFa处理3小时或24小时后PPARy激动剂吡格列酮均未抑制核NF-kBp65的产量。TNFa处理3小时后，浓度为5.0和2.5pg/ml的RIAA对NF-kBp65核转位的抑制百分比分别为9.4%和25%。24小时后，只有经过5.0pg/mlRIAA处理的样品显示出NF-kBp65的核转位受到明显的抑制(p<0.05)。TNFa处理后的3小时，5.0叫/ml和2.5pg/ml的黄腐酚对NF-kBp65核转位的抑制分别为15.6%和6.9%,而24小时后分别为13.4%和8.0%。根据3T3-L1细胞中所显示的脂肪生成潜力，二甲双胍和金合^^f乂L芬提取物的1:1混合物有望在临床应用中呈现协同作用。这种混合物将用来增加二甲双胍疗法的正向效果范围，例如可降低血浆中甘油三酯含量或延长二甲双胍药物作用期。实施例30酒花衍生物和噻唑烷二酮类药物对抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中脂肪生成的沐《协同作用。003121^^孟〃一在这些实验中，采用实施例11和13所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。00313^f/試众^懲^必潘一实验中用到的标准化学药品如实施例11所述。为计算脂肪生成指数，3T3-L1脂肪细胞须在发生分化前按实施例ll中所述进行处理。曲格列酮购自Cayman化学制剂公司(美国伊利诺斯州芝加哥市)。吡格列酮为商品片剂(ACT0SE,Takeda制药公司，美国伊利诺斯州林肯郡)。将片剂粉碎，所得全部药粉均用于分析。根据活性成分含量计算所有结果。所用酒花衍生物p异ot酸和异a酸如实施例20所述。与RIAA和IAA混合的曲格列酮在4.0pg/ml浓度下进行测试，而效力更强的吡格列酮与RIAA和IAA以1:1混合后于2.5ng/ml浓度下进行测试。为计算实施例34中所述的脂肪生成指数，所有材料还在4.0pg/ml和2.5pg/ml两个浓度下分别进行测试。00314一当在4.0pg/ml和2.5pg/ml两个浓度下分别对曲格列酮和吡格列酮进行测试时，p异a酸和异a酸均能与抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中的噻唑烷二酮类药物协同促进甘油三酯的合成(表28)。00315酒花衍生物p异a酸和异a酸可协同增加噻唑垸二酮类药物的胰岛素增敏效应，这将带来剂量减少或良性反应的病人数量增加等一系列潜在临床优势。表2897酒花衍生物和噻唑烷二酮类药物在抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中的錄，/协同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>卞脂肪生成指数=[OD]淑/[OD]DMS。对照。1)95%置信区间上限是1.02，最小显著性差异=0.02。2)95%置信区间上限是1.05，最小显著性差异=0.05。实施例31P-异a酸和二甲双胍在TNFa/3T3-Ll脂肪细胞中的錤^/协同作用/[IL-6TNF。-IL-6对照]*数值小于0.93显著(pO.05)低于TNFa对照。实施例32测试化合物对癌症细胞錄》/增殖的影响混合物、XN:Acacia[1:10]混合物、Acacia:RIAA[5:1]混合物、黄腐酚、Acacia:IAA[5:1]混合物、异a酸和p-异a酸均可降低非空腹血糖，而对胰岛素无效果。Acacia:RIAA[10:1]混合物和Acacia:IAA[10:1]混合物对血糖和胰岛素均无效果(表30)。漠—:^一本实验使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠对测试材料降低空腹血糖或胰岛素浓度的能力进行分析。这一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受体而对瘦素产生抗性。血浆胰岛素从第10天到第14天这段时间开始升高，血糖从4到8周开始升高。在测试时(9周)动物体重显著增加50±5g，并呈现胰岛肥大的迹象。003301一阳性对照二甲双胍和罗格列酮连续三天每天分别按300mg/kg和1.0mg/kg的剂量给药。金^^t^y^罗样品#5659、酒花衍生物和它们的混合物如前文所述进行给药。碧—菜一相对于对照组，阳性对照二甲双胍和罗格列酮均可降低血糖和胰岛素浓度(表31)。仅RIAA和XN单独作为测试材料时显示出可接受的结果。RIAA降低血清胰岛素，而XN降低血糖，对胰岛素并无效果。在己测试的降低血清胰岛素含量的试剂中，金合欢属RIAA[5:1]混合物最有效，使血清胰岛素水平降低21%，而二甲双胍只能使胰岛素浓度降低17%，噻唑垸二酮类罗格列酮使其降低15%。金合欢属RIAA[5:1]混合物的反应要高于两者中的单独成分，从而可显示协同作用。单独使用会^^t^yg罗不能减少血清葡萄糖或血清胰岛素，而RIAA减少血清胰岛素的程度与二甲双胍相近。在剩余测试材料中，金合欢属IAA[10:1]混合物还可有效降低血清胰岛素浓度。00333在db/db鼠2型糖尿病模型中，由p-异a酸造成的血清胰岛素含量快速下降以及由黄腐酚造成的血糖含量下降，表明它们在治疗与胰岛素不敏感症和高血糖症有关的人类疾病方面具有潜在的临床疗效。此外，p-异a酸和金合欢属儿茶的5:1混合物在db/db鼠糖尿病模型中呈现协同效应。p-异a酸、黄腐酚和金合欢属RIAA[5:1]成分对2个独立的糖尿病动物模型和3个錄^/模型的阳性反应表明它们可用于降低血糖或提高胰岛素敏感性的临床表现中。表31金会Jt^^,和酒花衍生物对db/db糖尿病鼠体内非空腹血糖和胰岛素的效应。103测试材料剂量mg/kg-每天]葡萄糖[预治疗百分比％]胰岛素[预治疗百分比％]<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>卞对每组中的5个动物连续3天每天施加1次剂量。#显著低于各自的对照(p<0.05)。实施例35在糖尿病db/db鼠模型中会会^t^yg罗和酒花衍生物比值的沐力优化003341#"星^一使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠对测试材料降低空腹血糖或胰岛素浓度的能力进行分析。这一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受体而对瘦素产生抗性。血浆胰岛素从第10天到第14天这段时间开始升高，血糖从4到8周开始升高。在测试时(9周)动物体重显著增加50±5g，并呈现胰岛肥大的迹象。的角鲨烯混合物。第21天重复进行加强注射。第22-27天检查小鼠关节炎体征，从研究中移除那些无反应的小鼠。从第28天开始每天对小鼠用测试化合物以强词法进行治疗，直到第42天结束，共持续14天。本实施例中所用化合物105RIAA(MgRho)剂量分别为10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；THIAA剂量分别为10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；塞来昔布剂量为20mg/kg以及脱氢皮质(甾)醇剂量为10mg/kg。003421使用以下所述的关节炎指数对每只脚爪的关节炎症状进行评估(分为0-4)。根据此关节炎指数，0=无可见迹象；1=水肿和/或红斑单趾；2=水肿和/或红斑双关节；3=水肿和/或红斑超过两个关节；以及4=整个脚爪和脚趾出现严重关节炎并伴随有关节强直和关节畸形。邀恭^^t^/——在实验最后，对小鼠实施安乐死，并截取其一肢保存于福尔马林缓冲液中。在取得关节炎指数分析的满意结果之后，从每个治疗组中随机选取两个动物通过服E染色进行组织学分析。软组织、关节和骨骼的变化以四分制进行评定，得分4表明严重损伤。图31显示关节组织损伤的组织学检测结果，并显示在THIAA处理的个体治疗中没有或极小存在关节损伤的迹象。这里有明确剂量反应标识并且在250mg/kg禾n50mg/kg下的组织学得分分别降低了40%和28%。这与关节组织只有106轻微损伤的塞来昔布治疗组相差无几。需注意塞来西布(20mg/kg)治疗组的组织学得分实际上增加33%。动物个体间存在显著差异，例如一个经赋形剂处理的动物显示中度关节损伤迹象，而其他动物明显未受任何损伤。除了脱氢皮质(甾)醇治疗组的一个动物外，其他所有治疗组均呈现关节膜炎症状。(3片/天)N3535性别男性11(31%)12(34%)女性24(69%)23(66%)平均值标准差平均值标准差年龄(年)46.013.247.913.4体重(磅)220.635.2219.531.6体质指数(kg/m2)35.04.035.44.0收縮压(mm)131.015.1129.713.9舒张压(ram)83.78.582.67.8腰围(英尺)42.94.942.94.5臀围(英尺)47.14.047.63.2空腹胰岛素含量(incIU/mL)13.25.217.512.1餐后两小时胰岛素含量(mcIU/mL)肌252.199.3*59.2*空腹血糖含量(mg/dL)96.59.099.010.3餐后两小时血糖含量(mg/dL)109.230.5128.436.9空腹甘油三酯含量(mg/dL)231.2132.2255.5122.5*若实验主体胰岛素值、体质指数、基础代谢指数、血压值、甘油三酯和高密度脂蛋白值异常，则在分析时将其排除。108组之间的差异在第8周(p<0.05)时显著。使用已发表的方法[(胰岛素(mcIU/mL卢血糖(mg/dL))/405]计算空腹胰岛素和血糖的HOMA得分。c=X/[T]x+Y/[T]y，式中T=毒性，其代表生长受抑制或被杀死的细胞所占分数，X、Y是测试混合物每种成分的相对分数，且X+Y=l。图示观察值是在95%置信区间内所得8个观察值的平均数。当估计的百分数下降落于相应观察分数的95%置信区间之下时，就表示具有协同作用。现在本发明已充分描述完毕，显而易见本领域的技术人员在不背离随附权利要求的精神和范围内均可对本发明做出变更和修改。权利要求1.用以治疗哺乳动物中对其所需蛋白激酶调节敏感的癌症方法，其中所述方法包括使用有效治疗剂量的六氢异α酸给哺乳动物用药。2.权利要求1的方法中，六氢异a酸从以下组群中进行选择六氢异律草酮、六氢异类律草酮和六氢聚律草酮。3.权利要求1的方法中，进行调节的蛋白激酶选自以下组群中Abl(T3151)、Aurora-A、Bmx、CDK9/cyclinTl、CK1y1、CK1y2、CK1y3、cSRC、DAPK1、DAPK2、EphBl、ErbB4、Fer、FGFR2、GSK3J3、GSK3a、HIPK3、IGF-1R、MAPKAP-K2、MSK2、PAK3、PAK5、PI3K、Pim-l、PKA(b)、PKBJ3、PKBy、PRAK、Rsk2、Syk、Tie2、TrkA、TrkB、以及ZIPK。4.权利要求1的方法中，对激酶调节敏感的癌症选自以下组群中膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌和子宫癌。5.哺乳动物中对其所需蛋白激酶调节敏感的癌症治疗混合物，其中混合物包括有效治疗剂量的六氢异a酸，这里有效治疗的剂量调节与癌症相关的蛋白激酶。6.权利要求5的混合物中，六氢异a酸从以下组群中进行选择六氢异律草酮、六氢异类律草酮和六氢聚律草酮。7.权利要求5的混合物中，还包括药用可接受的辅料，其可从以下组群中选择涂料、等渗和吸收延缓剂剂、粘结剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色齐U、调味剂、甜味剂、吸收剂、去污剂以及乳化剂。8.权利要求5的混合物中，该混合物还包括选自以下组群的一种或多种成分抗氧化剂、维生素、矿物质、蛋白质、脂肪以及碳水化合物。全文摘要本发明公开了用于癌症治疗的蛋白激酶调节的化合物和方法。本发明公开的化合物和方法基于酒花中常见的六氢异α酸。文档编号A61K31/122GK101505743SQ200780030611公开日2009年8月12日申请日期2007年6月20日优先权日2006年6月20日发明者杰弗里·布兰德,琳达·帕西奥雷蒂,约翰·G·巴比士,维拉·康达,艾米·杰尼·霍尔,艾纽·德赛,马修·L·特里普申请人:麦特普罗泰欧米克斯有限公司