专利名称：：对细胞外基质降解的抑制的制作方法
技术领域：
：本发明涉及乙酰肝素酶(heparanase)抑制剂在治疗与细胞外基质降解相关的病症例如胰岛炎或自身免疫1型糖尿病中的用途。具体而言，本发明涉及对治疗胰岛炎或1型糖尿病的移植效果的改良。
背景技术：
：l型糖尿病(T1D)是一种自身免疫疾病，其中胰岛的产生胰岛素的P细胞遭到破坏。在人类中，该疾病对生活方式产生了巨大影响，并且外源胰岛素疗法对高血糖的不完善控制不可避免地会导致微血管疾病。该并发症可能最终会引起肾病、心脏病、失明以及导致坏疽和截肢的神经病。临床的胰岛移植有可能提供一种改良的T1D疗法，这是因为当机体需要胰岛素时它可以被生理性地释放。另外，该方法可避免与胰腺移植相关的手术并发症。作为T1D疗法的临床胰岛移植在最近几年随着埃德蒙顿方案(Edmontonprotocol)的实施已取得相当的进展。虽然有这样的进展，但是大量使用阻止对胰岛移植的排斥反应所需的免疫抑制药物已严重地将其应用局限于仅糖尿病已难以控制的成年受试者。再者，从长远来看，胰岛功能最终会丧失并再次需要胰岛素治疗。这种移植物失功很可能是由于用于阻止对移植物的免疫排斥的免疫抑制药物的毒性以及/或者自身免疫疾病的复发。因此，有必要开发更好的抗移植物排斥/破坏的方法以消除对有毒的免疫抑制药物的需求，从而保持受试者的健康状态和移植物的完整性。由于对存在于胰脏胰岛中的产生胰岛素的P细胞的自身免疫破坏，5NOD(非肥胖糖尿病)小鼠可自发地发展出糖尿病。自身免疫反应的病理最初涉及非侵入性MNC(单核细胞)例如T细胞和巨噬细胞在胰岛周围的积聚。随着雌性NOD小鼠的成长，这种良性或非破坏性胰岛炎的病理转变成侵入性胰岛炎(即破坏性自身免疫)，而调控这种转变的因子尚不清楚(l)。形态度量学研究已表明，当宿主胰脏中超过50%的胰岛具有侵入性胰岛炎时就会出现对P细胞的破坏，并且当胰脏胰岛素含量小于正常小鼠的10%时会出现糖尿病。在清洁级NOD小鼠群体中，糖尿病在雌性小鼠中的发病率可达到80%,而在雄性小鼠中为20%(1)。在NOD小鼠中胰岛周围胰岛炎的发生及随后的糖尿病发作是依赖于T细胞的过程，并且过继转移研究已证明，同时需要CD4+和CD8+T细胞。这种自身免疫T细胞反应与偏向Thl的细胞因子镨相关，并且被认为最初是针对有限数量的自身抗原而产生的，但通过细胞内分子扩散和细胞间分子扩散来发展，从而使得最终涉及到多种P细胞自身抗原，即胰岛素原/胰岛素、GAD65、IA-2和热休克蛋白65(HSP65)。已经确定由效应T细胞群和调节T细胞群之素。本发明涉及这样的发现，即胰脏中胰岛周围的基膜在良性或在非破坏性胰岛炎阶段作为免疫屏障，阻止白细胞侵入胰岛内。就此而言，破坏性MNC浸润的发生与源自MNC的活化乙酰肝素酶对胰岛BM(基膜)串珠蛋白聚糖(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)的局部损伤有关。本发明还涉及这样的发现，即由同种异体反应性T细胞和自身反应性T细胞产生的破坏中起关键性的作用。本发明人还有这样的重要发现，即胰岛内细胞外基质(ECM)富含硫酸乙酰肝素，其可发挥维持P细胞健康的功能。胰岛内的破坏性胰岛炎和MNC浸润的发展与ECM中的胰岛内石克酸乙酰肝素的降解有关。因此，胰岛内硫酸乙酰肝素明显是P细胞存活必需的。因此，需要进行治疗来对抗乙酰肝素酶对胰岛BM/ECM(基膜/细胞外基质)硫酸乙酰肝素的破坏。再者，需要改良的方法来阻止患有1型糖尿病的受试者中的移植排斥反应。
发明内容根据本发明的第一方面，提供了一种抑制与胰岛P细胞相关的细胞外基质降解的方法，所述方法包括将所述细胞外基质与有效量的乙酰肝素酶抑制剂相接触。在一个实施方案中，所述细胞外基质可选自基膜、胰岛周嚢(peri-isletcapsule)、胰岛内细胞外基质或它们的任一组合。根据本发明的第二方面，提供了一种抑制与胰岛p细胞相关的细胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解的方法，所述方法包括将所述细胞外基质与有效量的乙酰肝素酶抑制剂相接触。在一个实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可以为串珠蛋白聚糖、XVIII型胶原或聚集蛋白。根据本发明的第三方面，提供了一种治疗受试者中自身免疫病症的方法，其中所述方法包括给予受试者治疗有效量的乙酰肝素酶抑制剂。在一个实施方案中，所述病症可选自胰岛炎、1型糖尿病、对胰岛移植物的排斥反应或它们的任一组合。根据本发明的第四方面，提供了一种治疗受试者中胰岛炎的方法，其中所述方法包括给予受试者治疗有效量的乙酰肝素酶抑制剂。根据本发明的第五方面，提供了一种治疗或预防受试者中对移植物的排斥反应的方法，其中所述方法包括给予受试者治疗有效量的乙酰肝素酶抑制剂。在一个实施方案中，所述移植物为胰岛移植物。根据本发明的第六方面，提供了一种降低与移植相关的免疫抑制治疗水平的方法，其中所述方法包括给予受试者治疗有效量的乙酰肝素酶抑制剂。在一个实施方案中，所述移植为胰岛移植。根据本发明的第七方面，提供了一种治疗受试者中糖尿病的方法，其中所述方法包括给予受试者治疗有效量的乙酰肝素酶抑制剂。在一个实施方案中，所述糖尿病是最近发作的l型糖尿病。根据本发明的第八方面，提供了一种用于制备药物组合物的方法，包括将乙酰肝素酶抑制剂与可药用的载体相混合。根据本发明的第九方面，提供了乙酰肝素酶抑制剂在制备用于治疗胰岛炎的药剂中的用途。根据本发明的第十方面，提供了乙酰肝素酶抑制剂在制备用于治疗糖尿病的药剂中的用途。在一个实施方案中，所述糖尿病是最近发作的l型糖尿病。根据本发明的第十一方面，提供了乙酰肝素酶抑制剂在制备用于治疗移植排斥反应的药剂中的用途。在一个实施方案中，所述移植为胰岛移植。根据本发明的第十二方面，提供了乙酰肝素酶抑制剂在制备用于抑制胰岛细胞外基质中硫酸乙酰肝素降解的药剂中的用途。根据本发明的第十三方面，提供了乙酰肝素酶抑制剂在制备用于抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解的药剂中的用途。根据本发明的第十四方面，提供了乙酰肝素酶抑制剂在制备用于抑制对受试者中移植物的排斥反应的药剂中的用途。根据本发明的第十五方面，提供了乙酰肝素酶抑制剂在制备用于降低与移植相关的免疫抑制治疗水平的药剂中的用途。在第一方面、第二方面或第十二方面的任一方面的一个实施方案中，所述细胞外基质可选自基膜、胰岛内细胞外基质、胰岛周嚢或它们的任一组合。在第四方面至第七方面的任一方面的一个实施方案中，所述乙酰肝素酶抑制剂的给药可以是全身性的或局部的。给药可通过肠胃外、腔内、膀胱内、肌内、动脉内、静脉内、皮下、局部或口服。可以以这样的形式给予所述乙酰肝素酶抑制剂，所述形式即与一种或多种可药用的载体、佐剂或稀释剂的组合物形式。根据本发明的第十六方面，提供了一种用于治疗或预防与细胞外基质降解相关的病症的组合物，其中所述组合物包含乙酰肝素酶抑制剂及一种或多种可药用的栽体、稀释剂或佐剂。根据本发明的第十七方面，提供了一种用于治疗或预防细胞外基质降解相关的病症的组合物，其中所述组合物包含乙酰肝素酶抑制剂及至少一种其他免疫抑制剂或抗炎剂，并任选地包含一种或多种可药用的载体、稀释剂或佐剂。所述抗炎剂可选自甾类、皮质甾类、COX-2抑制剂、非甾类抗炎剂(NSAID)、阿司匹林或它们的《壬一组合。在一个实施方案中，所述非甾类抗炎症剂可选自布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、芬布芬(fenbufen)、非诺洛芬(fenprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、右酮洛芬(dexketoprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenicacid)、阿扎丙宗(azapropazone)、双氣芬酸(diclofenac)、醋氯芬酸(aceclofenac)、二氟尼柳(diflimasil)、依托度酸(etodolac)、吲咮美辛(indometacin)、酮咯酸(ketorolac)、氯诺昔康(lornoxicam)、曱芬那酸(mefanamicacid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、保泰松(phenylbutazone)、p比罗昔康(piroxicam)、罗非昔布(rofecoxib)、塞来昔布(celecoxib)、舒林酸(sulindac)、替i若昔康(tenoxicam)、托芬那酸(tolfenamicacid)或它们的任一组合。所述免疫抑制剂可选自阿伦单抗(Alemtuzumab),硫唑噤呤(azathioprine)、环抱素(ciclosporin)、环裤酰胺(cyclophosphamide)、来氟米特(lefunomide)、曱氨喋呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)、利妥昔单抗(rituximab)、柳氮磺p比咬(sulfasalazine)他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)或它们的任一组合。根据前述方面的任一方面，所述乙酰肝素酶抑制剂可选自硫酸多糖(sulfatedpolysaccharides)、硫代磷酸寡脱氧核脊酸(phosphorothioateoligodeoxynucleotides)、非碳水化合物肝素拟聚合物(non-carbohydrateheparinmimeticpolymers)、硫酸麦芽低聚糖(sulfatedmalto-oligosaccharides)、辯酸疏代甘露聚糖(phosphosulfomannans)、^琉酸间隔的寸氐聚糖(sulfatedspacedoligosaccharides)、硫酸连接的环多醇(sulfatedlinkedcyclitols)、糖氨基酸的At酸^f氐聚物(sulfatedoligomersofglycaminoacids)、假二糖(pseudodisaccharides)、制唾酸酶素B的衍生物(siastatinBderivatives),糖醛酸型Ge附-二胺l-TV-亚胺基糖(G^/ff画diaminel國N—iminosugars)、^#曰^(suramin)^4i曰^^^"^、真菌代谢产物、二苯醚、咔唑(carbazole)、吲哚、苯并-l，3-唑衍生物(benz-l，3-azolederivatives)、2，3-二氢-l,3-lH-异吲咮-5-羧酸衍生物、呋喃基-l，3-^唑-2-基、苯并噁唑-5-基乙酸、聚(N-丙烯基氨基酸)，它们的代谢物、衍生物或类似物或者它们的任一组合。所述乙酰肝素酶抑制剂可以是单克隆抗体。所述乙酰肝素酶抑制剂可以是PI-88。以下将参考附图仅通过示例的方式对本发明的优选实施方案进行描述，其中图1:(a)新生NOD/Lt胰岛和(b)成年前驱糖尿病NOD/Lt胰岛的细胞外基质中的硫酸乙酰肝素的阿利新蓝(Alcianblue)染色。注意在(a)中，胰岛基膜中存在有硫酸乙酰肝素的阿利新蓝染色。图2:用(a)兔抗小鼠巢蛋白-l和(b)兔抗小鼠串珠蛋白聚糖进行的免疫荧光染色显示，在无破坏性胰岛炎的NOD胰岛的基膜(见白色指示线)中存在(a)巢蛋白和(b)串珠蛋白聚糖(一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖即HSPG)。图3:PI-88处理阻止了NOD/Lt小鼠中的自身免疫糖尿病的发生。与用盐水(以0.2ml/天腹膜内注射(i.p.))处理的对照小鼠(n=25)相比，以乙酰肝素酶抑制剂PI-88(以10mg/kg/天腹膜内注射；以250pg/0.2ml/天腹膜内注射盐水溶液)处理周龄始于10.5周的前驱糖尿病的成年雌性NOD/Lt小鼠(n=23)阻止了临床糖尿病的发作，说明PI-88可预防破坏性胰岛炎。本发明人饲养的雌性NOD/Lt小鼠群体中的糖尿病发病率为60%。图4:(a)正常BALB/c胰岛由于基膜(BM)而显示了清晰的边界。*指示基膜。(b)在正常BALB/c小鼠中经胰管体内给予10jtg人血小板来源的纯化乙酰肝素酶/0.5mlPBS,在送递后24-48小时获得了缺乏基膜的胰岛的组织学证据(*)(原位)，因此表明正常的胰岛形态在体内可被乙酰肝素酶破坏。图5:(a)经胰管注入体内后，人血小板来源的纯化乙酰肝素酶(H)在与BALB/c胰脏中的胰管相关联的胰岛周围的免疫组织化学定位；兔抗人乙酰肝素酶的多克隆抗体。(b)对来自(a)中的BALB/c胰脏的背景染色，条件是不存在抗乙酰肝素酶一抗而存在裤酸盐緩沖液(稀释剂)和辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗兔Ig。图6:(a)对照BALB/c胰岛于10%CO2、卯％空气中培养24小时后的宏观外观。(b)BALB/c胰岛与人血小板来源的乙酰肝素酶(20jig/ml)孵育24小时后的外观。与对照胰岛不同，体外乙酰肝素酶处理10导致了对胰岛的周围损伤，以及在一些情况下的胰岛降解(C)。图7:(a)前驱糖尿病雌性NOD/Lt胰脏的苏木精和伊红染色证明了存在完整的胰岛(i)以及具有非破坏性胰岛炎的胰岛(ii)和破坏性胰岛炎的胰岛(iii)。(b)以阿利新蓝/0.65M氯化镁/pH5.8对相同胰脏标本进行的组织学染色在完整的胰岛(i)中以及胰岛基膜和细胞外基质(ii)中检测到了硫酸乙酰肝素；在破坏性胰岛炎进展至胰岛细胞团内的过程中，ECM的HS组分被破坏，如余下的胰岛细胞团(iii)中不完整的蓝染所示(iii)。图8:(a)PI-88治疗可预防胰岛同基因移植物中的疾病复发。移植于糖尿病雌性NOD/Lt小鼠的肾包膜(kidneycapsule)下的450-500个雌性NODscid胰岛的同基因移植物使非禁食血糖水平返回至正常范围(由阴影区域表示正常范围)。在对照受体(圆圈)中不再进一步处理的情况下，高血糖从第3天开始恢复。相反，在从第3天开始以PI-88(10mg/kg/天腹膜内注射)处理的糖尿病NOD小鼠中，NODscid胰岛同基因移植物维持血糖量正常最长至14天(方块)。在收集时，所述对照同基因移植物(b)显示了迅速蔓延的自身免疫破坏(单核细胞浸润物)和胰岛残余物(*)，而来自PI-88-处理小鼠的苏木精和伊红染色的同基因移植物(c)显示了血管重建的胰岛(卞)，并且在胰岛周围有MNC的积聚(*)。图9:如免疫荧光法所确证的，被分散为单细胞的分离的胰岛主要是产生胰岛素的P细胞。与在2天培养期间仍保持完整的对照胰岛细胞相比，以细菌类肝素酶(肝素酶)(I+II+III;0.25U/ml)处理1小时的p细胞会死亡(a)。将被处理的细胞置于ECM(通过细胞系在体外产生)上能够在很大程度上从类肝素酶诱导的细胞死亡中拯救P细胞(a)。这些结果表明，胰岛p细胞的存活需要细胞结合的HS。作为对该观点的支持，通过对培养物提供5-50吗/ml的肝素(一种高度硫酸化形式的硫酸乙酰肝素)，有效地拯救了细菌肝素酶处理的p细胞(*P<0.0001)(b)。图10:与在移植后7天显示出更严重的胰岛破坏(卞)的相应对照胰岛同种异基因移植物(allograft)相比(b)，来自移植后7天的PI-88处理的受体CBA/H(H-2k)小鼠的BALB/c(H-2d)胰岛同种异基因移植物显示出单核细胞(*)在胰岛周围积聚(a)。因此，PI-88对宿主的处理使得被移植的同种异基因胰岛得到更好的保持。定义本文使用的某些术语具有如下给出的含义。本文使用的术语"包含"是指"主要但不必是唯一地包括"。而且，单词"包含"的变化形式，例如动词形式的"包含，，和第三人称单数动词形式的"包含"具有作出相应改变的意义。本文使用的术语"治疗"和"疗法"是指任何和所有的应用，所述应用可以任何可能的方式来治疗病症或症状，预防病症或疾病形成或者预防、阻碍、延緩或逆转病症或疾病或者其他不良症状的进程。本文使用的术语"有效量"的含义包括试剂或化合物的无毒性但足以提供所需效果的量。所需的精确量因受试者而异，这取决于诸如所治疗的物种、受试者的年龄和总体状况、所治疗病症的严重度、被给予的具体药剂以及给药模式等因素。因此，不可能指定精确的"有效量"。然而，对于任何给定病例，适当的"有效量，，可以由本领域普通技术人员仅仅使用常规实验来确定。本文使用的术语"与胰岛P细胞相关的细胞外基质"是指包围或大体上包围胰岛P细胞或胰岛本身但不一定与其接触的任一细胞外组分。这些组分还包括硫酸乙酰肝素和/或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，例如串珠蛋白聚糖、XVIII型胶原或聚集蛋白。术语"细胞外基质"的含义包括基膜。本文使用的术语"烷基"的含义包括，具有l-10个碳原子的单价的("烷基")和二价的("亚烷基")直链或支链饱和脂肪基团。所述烷基基团可以为d-6烷基。所述烷基基团可以为d-4烷基。所述烷基基团可以为c^烷基。因此，例如，术语烷基包括但不限于曱基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1，2-二曱基丙基、l，l-二曱基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-曱基戊基、3-曱基戊基、2，2-二曱基丁基、3，3-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、1，2，2-三曱基丙基、1，1，2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、l-曱基己基、2，2-二曱基戊基、3，3-二甲基戊基、4，4-二曱基戊基、1，2-二甲基戊基、1，3-二甲基戊基、1，4-二曱基戊基、1，2，3-三曱基丁基、U，2-三曱基丁基、1，1，3-三甲基丁基、5-甲基庚基、l-曱基庚基、辛基、壬基、癸基等。12本文使用的术语"芳基"是指具有6-14个碳原子的单价的("芳基")和二价的("亚芳基")单环、多环、轭合和稠合的芳烃残基。所述芳基基团可以为Cwo芳基。芳基的实例包括苯基、萘基、菲基等。所述芳基基团可以任选地被取代，例如被独立地选自曱基、乙基、卤素、CF3、CH2OH、OH、O-曱基和O-乙基的一个或多个取代基取代。具体实施例方式首先应理解，本文提供的附图和实施例是为了对本发明及其各实施方案进行举例说明而非对其进行限定。根据本发明，提供了用于抑制细胞外基质降解的组合物、方法和试剂盒。所述方法通常包括使用包含至少一种乙酰肝素酶抑制剂的组合细胞外基质(ECM)由一个大分子网络构成，所述网络填充组织中的细胞外空间并为不同器官中的细胞提供分子支架(3)。ECM由结构蛋白(如胶原)、特化蛋白(如层粘连蛋白)和蛋白聚糖(如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，包括串珠蛋白聚糖、XVIII型胶原或聚集蛋白(2))构成。通常，基膜(BM)为薄片形式的细胞外基质(ECM),它包围细胞群，从而提供了物理支持和细胞迁移的主要屏障(3)。它们一般由蛋白和多糖组分组成。硫酸乙酰肝素糖胺聚糖为BM的主要多糖组分(4，5)。本发明人已经验明，胰岛内ECM富含硫酸乙酰肝素(参见图1)，且包围胰岛的BM含有串珠蛋白聚糖(参见图2(b))。因此，本发明人集中研究了作为一种关键的BM组分并作为MNC介导的乙酰肝素酶所致降解的初始靶标的串珠蛋白聚糖。串珠蛋白聚糖是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，由一个核心蛋白(400-470kDa)和三个与之连接的多糖(糖胺聚糖)硫酸乙酰肝素(HS)组成(6)。HSPG/串珠蛋白聚糖与IV型胶原和层粘连蛋白相互作用，从而稳定了整个BM结构。在血管的BM中，串珠蛋白聚糖主要促进膜带阴离子电荷(由于带负电荷的硫酸根)和有选择的通透性(6)。糖苷内切酶(内型-p-葡糖醛酸糖苷酶)——乙酰肝素酶(也被称为肝素酶)是唯一已知的可剪切HSPG的硫酸乙酰肝素(HS)(也被称为硫酸肝素)链的哺乳动物酶。乙酰肝素酶以大约65kDa的酶原形式产生，为了形成有活性的酶需要被蛋白水解剪切成两个较小的多肽(8kDa和50kDa)(7，8)。至少对于T细胞而言，乙酰肝素酶的表达似乎受促炎性细胞因子的调节，并且该酶最终可以通过磷酸甘露糖受体结合于细胞表面上(3)。已经发现乙酰肝素酶在侵入细胞降解ECM所需的场所(armoury)、特别是在转移性肿瘤和肿瘤相关的血管发生中发挥着关键功能(3)。乙應，#錄考應4磁^乙應，#^犖庠及详^/勿/^破银^W^應本发明人已发现，胰岛周嚢具有与包含串珠蛋白聚糖(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖即HSPG)的基板或基膜(BM)—致的性质。再者，胰岛内浸润伴有对基膜的严重破坏。对肿瘤转移的研究已表明，由于降解性酶例如乙酰肝素酶对基本的BM和/或细胞外基质的破坏，可出现肿瘤细胞的侵入(3)。类似地，在NOD/Lt胰脏中，包围胰岛的BM在非破坏性胰岛炎期间作为免疫屏障，阻止白细胞侵入胰岛内。破坏性MNC浸润的发生与源自MNC的活化乙酰肝素酶对胰岛基膜的局部损伤有关。本发明人发现了下述独特的事实，即一旦基膜屏障被打通，所述破坏性胰岛炎的进程就与乙酰肝素酶对胰岛内细胞外基质中硫酸乙酰肝素的破坏有关，并且与p细胞死亡有关。对胰岛的体内(图4和5)和体外乙酰肝素酶处理可造成胰岛损伤，并且在一些情况下会完全破坏胰岛(图6)。因此，p细胞的存活不仅依赖于胰岛ECM-p细胞的完好关联，而且依赖于完好BM和胰岛内ECM硫酸乙酰肝素的维持。就被移植到肾包膜下的胰岛而言，所述移植物可由来源于宿主的毛细血管网络进行血管重建，所述毛细血管网络来源于宿主肾实质中的血管。在胰岛移植排斥反应和自身免疫破坏过程中活化白细胞所采用的路径涉及从新形成的移植物内血管的迁移，或者从移植物下的肾组织中邻近原有肾血管的迁移。白细胞向炎症部位的募集需要活化的T细胞穿过附近部位的血管内皮并通过内皮下的BM进入相邻组织。在白细胞粘附于血管内皮细胞上并滚动以及与内皮细胞结合的趋化因子相互作用后，它们会借助诸如MMP和乙酰肝素酶等多种酶的降解功能穿过内皮细胞之间的血管内皮，然后通过内皮下的BM(9)。發u酸乙酰肝素担当趋化因子的血管粘附配体、粘合剂/固定剂/转运剂，并担当白细胞在内皮下BM中迁移的屏障。乙酰肝素酶对BM石危酸乙酰肝素的降解是对白细胞迁移关键且重要的过程。活化T细胞/白细胞不是迁移自胰岛内毛细血管，而是从胰岛周围的移植物内位点移动，穿过胰岛BM并进入胰岛细胞团。这种MNC迁移需要乙酰肝素酶-介导的BMHSPG的降解。活化的白细胞、受促炎性细胞因子刺激的内皮细胞和血小板可产生乙酰肝素酶(10,11)。在啮齿动物中，已经发现乙酰肝素酶活性的表达与T细胞通过血管BM的渗出以及中枢神经系统中炎症的发生有关(12)。同样，在啮齿动物中脂多糖(LPS)诱导的炎症已经被乙酰肝素酶抑制剂PI-88的体内处理所阻止。活体显微术证明了白细胞的滚动和与血管BM的粘附，但无渗出。这些结果表明，PI-88还能抑制活化的MNC进入胰岛移植物。^4移潜參Wf々,2瘦^4《发'^敏4'^虽然NOD小鼠中胰岛炎的形成和糖尿病的发作是需要CD4+和CD8+T两种细胞的依赖于T细胞的过程，但是移植至糖尿病NOD小鼠的NODscid胰岛同基因移植物以及NOD小鼠中的疾病复发却是由CD4+T细胞介导的，并且可通过耗尽或非耗尽的抗CD4单克隆抗体治疗来阻止。因为胰岛P细胞是II类主要组织相容性复合体(MHC)-ve,所以糖尿病相关的P细胞-特异性自身抗原似乎是由一种或多种移植物内抗原呈递细胞(APC)群加工并且以与宿主II类MHC关联方式呈递，从而导致被自身反应性CD4T细胞识别并对胰岛P细胞造成间接损伤。与抗CD4单克隆抗体治疗不同，用抗CD154单克隆抗体的共刺激阻断方案没有阻止胰岛同基因移植物中的疾病复发或者仅使之延迟。虽然在采用非清髓条件处理的糖尿病NOD小鼠中混合型造血干细胞嵌合体的诱导可保护NOD胰岛移植物使之免受自身免疫损伤，但是该实验方法不适合于临床的胰岛移植。一般而言，预防胰岛移植物中的疾病复发是一个难以克服的障碍，并且仍然是现在临床的胰岛移植试验的主要关注点。自身反应性T细胞穿过被移植的同基因胰岛的基膜并通过胰岛内ECM侵入至移植物部位的过程也是乙酰肝素酶依赖的。因此，本发明涉及由乙酰肝素酶抑制剂例如PI-88来防止自身反应性T细胞穿过被移植的同基因胰岛的基膜侵入移植物位点。應名付/^^Sf差西移控胰岛同种异基因移植物的排斥反应是由于移植物中被动携带的供体型过客白细胞(passengerleukocyte)直接激活了抗供体的反应性T细胞(13)。CD4+和CD8+T细胞对该排斥反应过程的贡献似乎受以下因素的影响供体/受体品系的组合、胰岛组织的分化状态以及在胰岛移植物中存不存在II类MHC+ve管上皮。研究已经证明，在以下处理之后，延长了胰岛同种异基因移植物存活，通常还伴有耐受诱导在体外以高氧预处理胰岛组织或者以抗CD8单克隆抗体或抗CD4+抗CD8单克隆抗体短时间处理受体小鼠，用鼠科CTLA4-Fc或抗CD154单克隆抗体与供体特异性输注或者与抗-ICOS单克隆抗体联合的抗-CD154单克隆抗体共刺激阻断。单独使用免疫抑制药物或者与其他试剂结合使用免疫抑制药物的其他研究已证明，可诱导稳定的胰岛同种异基因移植物的存活。在许多这类模型中，已证明耐受性依赖于宿主的调节性CD4+CD25+T细胞，表明这是一个积极的免疫调节过程。然而，在患有自身免疫诱导的糖尿病的同种异基因宿主的情况下，在常规的无自身免疫的小鼠中可有效阻止同种异基因移植物排斥反应的免疫治疗通常不会成功，或者充其量是延迟排斥反应(14-16)。这个问题的原因在于胰岛同种异基因移植物也对自身免疫攻击敏感(17)，并因此需要靶向两个独立的破坏机制自身免疫疾病的排斥反应和复发。在NOD小鼠中使用重度免疫抑制方案或供体特异性造血干细胞嵌合体已经克服了这些障碍，但对于临床的胰岛移植来说这种方法是有问题的(例如有害的副作用)或不切合实际的。由于该原因，白细胞迁移经过BM及对胰岛内硫酸乙酰肝素的破坏的乙酰肝素酶-依赖性机制已成为干涉治疗的目标，这是因为它是胰岛移植物中胰岛同种异基因移植物排斥反应和自身免疫疾病复发的共同通路。实际上，用呈现几分抑制乙酰肝素酶活性的肝素处理小鼠已经延长了小鼠中皮肤同种异基因移植物的存活。本发明涉及这样的意外发现，即乙酰肝素酶在胰岛同种异基因移植物排斥反应中起到重要作用。此外，本发明人已经发现，乙酰肝素酶抑制剂例如PI-88可以延迟常规小鼠中胰岛同种异基因移植物的免疫破坏，并且可以保护自身免疫的糖尿病NOD宿主中的胰岛同基因移植物。因此，乙酰肝素酶抑制剂可构成一种用于临床胰岛移植的新治疗剂，并且可最小化或者避免对有害的免疫抑制药物的需求。16乙鹰，#凝#辦乙酰肝素酶是一种内型-P-葡糖醛酸糖苷酶，它剪切出现于细胞表面的蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素侧链并作为包围细胞的细胞外基质和基膜的主要组分。已经分离或者合成了多种乙酰肝素酶抑制剂，包括肝素及修饰的肝素衍生物、被认为作为过渡态类似物的多种天然及合成的聚阴离子聚合物和较小分子。各类分子及它们的具体实例在下文中讨论。本发明的乙酰肝素酶抑制剂选自硫酸多糖、硫代磷酸寡脱氧核苷酸、非碳水化合物肝素拟聚合物、硫酸麦芽低聚糖、磷酸硫代甘露聚糖、硫酸间隔的低聚糖、硫酸连接的环多醇、糖氨基酸的硫酸低聚物、假二糖、制唾酸酶素B的衍生物、糖醛酸型Gew-二胺l-7V-亚胺基糖、苏拉明和苏拉明类似物、真菌代谢产物、二苯醚、咔唑、吲哚和苯并-l，3-唑衍生物。所述乙酰肝素酶抑制剂可以包括单克隆抗体。所述硫酸多糖可选自肝素、l-角叉菜胶、K-角叉菜胶、岩藻多糖、戊聚糖多硫酸酯、6-0-羧曱基曱壳质IE、硫酸昆布多糖(laminarinsulfate)、螺旋藻含钙藻胶(calciumspirulan)和硫酸葡聚糖。非碳水化合物肝素拟聚合物的实例选自以下式1-式7所示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在式l-7中，n小于或等于60。硫酸麦芽低聚糖的实例选自以下式8-式11所示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式Ri13eOBn13f0(CH2)7CH313gOPEG5000-OMe13hOPEG2000-OMe13iNHCOCH2OPh13jNH-LC-生物素硫酸"间隔的"低聚糖的实例由以下通式16表示,-0OXxoox化R-烷基或芳基间隔子在式16中，X可以为S03Na或H。另外，在式16中，R可以是烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基或烷基芳基芳基。硫酸"间隔的"低聚糖的其他实例可由下文所示的通式14和式15的化合物表示。式:_^_14间二甲苯基15(CH2)10在式14和15中，X可以为S03Na或H。硫酸连接的环多醇的实例选自式17和19表示的化合物。由式18表示的化合物是制备该环多醇的起始试剂。在式17和19中，X可以为S03Na或H。糖氨基酸的硫酸低聚物的实例选自以下式20、21和22的化合物。20202211在式20-22中，X可以为S03Na或H。假二糖的实例选自以下式23和24的化合物及其盐。2324制唾酸酶素B的f汙生物的实例选自以下式25、26、27和28的化合物。HOOH、C02HHO^uV^NHHO^^NHHO^ONHHoX^NHNHAcOHNHAcNHAc25262728糖醛酸型Ge附-二胺l-2V-亚胺基糖的实例选自以下式29、30和31的化合物及其盐。HO-HO-AcHNNHNHNH32Me33Et34tBu35真菌代谢产物的实例选自以下式36、37和38的化合物。r，HONHCOCF329HOHOC02HNHCOCF3H02CNHCOCF3HO"^^NH.HCI3031苏拉明和苏拉明类似物的实例选自以下式32、33、34和35的化合物。式32和35是相同化合物的不同表示。Na03SS03NaNa03SS03NaNHHNHN〕w、NHc22<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>二苯醚、吵唑、吲哚和苯并-1，3-唑衍生物的实例选自以下式39、39a、40、41和42的化合物及其盐。S03H42H03S.所述乙酰肝素酶抑制剂还可选自以下的化合物<h2N\nhNHCOCF3HONaS03HNOOS03Na.OS03Na治^W逸合參;^,法用于本发明中的化合物可以以组合物的形式治疗性地或预防性地给予。在一种治疗应用中，以足够治愈或者至少部分地阻止疾病及其并发症的量，将组合物给予已经患有该疾病的受试者(例如疾病发作早期)。所述组合物提供的所述化合物或药剂的量应足以有效地治疗所述受试24者。通常，合适的组合物可以依照本领域普通技术人员已知的方法制备，因而可包括可药用的载体、稀释剂和/或佐剂。用于制备可给药的组合物的方法对本领域技术人员是显而易见的，并且更详细i己栽于众'j如/e附/wgto"jPA"/7flce"//c"/iSc/e"ce，15thed"MackPublishingCompany,Easton，Pa.中，该出版物通过引用的方式纳入本文。用于本发明的组合物可包括局部制剂(topicalformulation),并包含活性成分和一种或多种可用的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂，以及可选的任一其他治疗成分。适宜于局部给药的制剂包括适宜于渗透过皮肤到达需要治疗部位的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、乳膏、软膏剂或糊剂，以及适宜给予眼、耳或鼻的滴剂。用于本发明的滴剂可以包含无菌水性或油性溶液或悬浮液。所述滴剂可以通过将所述活性成分溶解于含有杀细菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他合适防腐剂的水溶液中制得，并且任选地包含表面活性剂。然后可以将所形成的溶液过滤使之澄清，转移至合适的容器中并灭菌。可以通过以下方式完成灭菌高压灭菌即在卯。C-100。C下保持半小时，或者通过过滤，之后经无菌操作将其转移至容器内。可包含在所述滴剂中适合的杀细菌剂和杀真菌剂的实例有硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002%)、苯扎氯铵(0.01%)和醋酸氯己定(0.01%)。用于制备油性溶液的合适溶剂包括甘油、稀乙醇(dilutedalcohol)和丙二醇。用于本发明的洗剂包括那些适合应用于皮肤或眼的洗剂。眼用洗剂可以包含任选地包含杀细菌剂的无菌水溶液，并且可以通过与上述关于滴剂制备的方法类似的方法制备。用于皮肤的洗剂或搽剂也可以包含速干并冷却皮肤的试剂(例如乙醇或丙酮)和/或增湿剂，例如甘油或者油(如蓖麻油或花生油(arachisoil))。用于本发明的乳膏、软膏剂或糊剂是所述活性成分的外用半固体制剂。它们可以通过如下方式制备将极细的或粉末形式的所述活性成分(单独或者在水性流体或非水性流体的溶液或悬浮液中)与油脂性基质(greasybasis)或非油脂性基质(non-greasybasis)混合。该基质可以包括烃类，例如硬石蜡、软石蜡或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂(metallicsoap);胶浆剂；天然来源的油，例如杏仁油、玉米油、花生油(arachisoil)、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸(例如硬脂酸或油酸)与醇(例如丙二醇或聚乙二醇(macrogol))。所述组合物可以掺入任何适合的表面活性剂，例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或者例如山梨坦酯或其聚氧乙烯衍生物的非离子型表面活性剂。也可以包含助悬剂和例如羊毛脂的其他成分，所述助悬剂例如天然树胶、纤维素衍生物或例如硅酸二氧化硅(silicaceoussilicas)的无4几材料。所述组合物也可以以脂质体的形式给药。脂质体通常来自于磷脂或其他脂质物质，并通过分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用任何无毒、生理可接受且可代谢的能够形成脂质体的脂质。脂质体形式的所述组合物可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等等。优选的脂质为磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，两者可以是天然的，也可以是合成的。形成脂质体的方法是本领域已知的，关于这方面具体可参见Prescott编著，MethodsinCellBiology,第XIV巻，AcademicPress,NewYork,N.Y.(1976)，第33页等，其内容通过引用的方式纳入本文。所述组合物还可以以适宜于通过吸入给药(例如通过鼻内吸入或口吸入)的气雾剂形式(例如液体或粉末)给药。结合方案通过结合方案可实现治疗的优势。本领域技术人员可了解，可将本文公开的乙酰肝素酶抑制剂作为治疗胰岛炎和/或1型糖尿病的结合治疗方法的一部分给予。在结合治疗中，各药剂可以被同时给予，或者被以任一顺序序贯给予。如果序贯给予，那么优选以相同的途径给予各组分。或者，各组分可以配制为单剂量单位形式的结合产品。本领域的普通技术人员知晓可用于与本发明的组合物结合的合适药剂。本发明的治疗方法可以与常规治疗联合应用。常规治疗可包括在移植之前处理胰岛(例如以高氧)。常规治疗还可包括抗炎性治疗、免疫抑制治疗、手术或其他形式的医学介入。抗炎剂的实例包括甾类、皮质甾类、COX-2抑制剂、非甾类抗炎症剂(NSAID)、阿司匹林或它们的任一组合。非甾类抗炎症剂可选自布洛芬、萘普生、芬布芬、非诺洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、右酮洛芬、噻洛芬酸、阿扎丙宗、双氯芬酸、醋氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、吲哚美辛、酮咯酸、氯诺昔康、曱芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、罗非昔布、塞来昔布、舒林酸、替诺昔康、托芬那酸或它们的任一组合。免疫抑制剂的实例包括阿伦单抗、硫唑嘌呤、环孢素环磷酰胺、来氟米特、甲氨喋呤、霉酚酸酯、利妥昔单抗、柳氮磺吡啶、他克莫司、西罗莫司或它们的任一组合。可以治疗性地或预防性地给予本文公开的化合物和组合物。在一种治疗应用中，将化合物和组合物给予已经患病的患者，给药量足够治愈或者至少部分地阻止所述病症及其症状和/或并发症。所述化合物或组合物提供的活性化合物的量应足以有效地治疗所述患者。浙量针对任何具体患者的有效治疗剂量水平将依赖于多种因素，包括所治疗障碍及该障碍的严重度；使用的化合物或药剂的活性；使用的组合物；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别及饮食；给药时间；给药途径；药剂或化合物的滞留(s叫uestration)率；治疗的持续时间；与治疗结合使用或同时使用的药物，以及医学领域中公知的其他相关因素。本领域技术人员将能够通过常规实验确定药剂或化合物的治疗可施用疾病所必需的有效且无毒的量。通常，预期的有效剂量范围为每24小时每kg体重约0.01mg-约100mg;—般地，每24小时每kg体重约0.02mg-约卯mg;每24小时每kg体重约0.03mg-约80mg;每24小时每kg体重约0.04mg-约70mg;每24小时每kg体重约0.05mg-约60mg;每24小时每kg体重约0.06mg-约50mg。更一般地，预期的有效剂量范围为每24小时每kg体重约0.07mg-约40mg;每24小时每kg体重约0.08mg-约30mg;每24小时每kg体重约0.09mg-约25mg;每24小时每kg体重约O.lmg-约20mg。或者，有效剂量的上限可以至约500mg/m2。通常，预期的有效剂量范围为约25-约500mg/m2,优选约25-约350mg/m2，更优选约25-约300mg/m2,还更优选约25-约250mg/m2,甚至更优选约50-约250mg/m2，还甚至更优选约75-约150mg/m2。在治疗应用中，治疗通常贯穿于疾病状态的持续期。而且，对本领域普通技术人员来说显而易见的是，各次给药的最佳量和给药间隔将由以下因素决定所治疗的疾病状态的性质和程度；给药形式、途径和部位；以及所治疗的具体个体的情况。这种最佳条件也可以通过常规技术确定。对本领域普通技术人员来说还显而易见的是，最佳疗程(例如在确定的天数内每天给予的组合物的剂量数)可以由本领域技术人员使用常规的疗程确定试验来确定。發絲逸本发明的组合物可以是适宜于注射给药的形式、适宜于口服摄入的制剂形式(例如胶嚢剂、片剂、胶嚢形片剂(caplet)、酏剂(elixir))、适宜于局部给药的软膏、乳膏或洗剂形式、适宜于作为滴眼剂送递的形式、适宜于经由肺吸入(例如鼻内吸入或口腔吸入)给药的气雾剂形式(例如液体或粉末)、适宜肠胃外(例如静脉内、脊柱内、皮下或肌内)给药的形式，即皮下注射、肌内注射或静脉内注射。4'#、孝#浙、腐多唐;^佐身载体、稀释剂、赋形剂和佐剂在以下方面必须是"可用的"，即与所述组合物的其他成分相容并对其受者无毒。这类载体、稀释剂、赋形剂和佐剂可用于增强本发明的组合物的完整性和半衰期。它们还可以用于增强或保护本发明的组合物的生物活性。可药用载体或稀释剂的实例是去矿质水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，例如花生油(peanutoil)、红花油、橄才苋油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachisoil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如曱基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和曱苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮(volatilesilicone);矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如曱基纤维素、乙基纤维素、羧曱基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚烷撑二醇或低级烷撑二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；西黄蓍胶或阿拉伯胶，和石油凝胶(petroleumjelly)。通常，所述一种或多种载体占所述组合物重量的10%-99.9%。28所述载体还可以包括与本发明的化合物共价结合的化合物或融合蛋白。这类生物载体和化学载体可用于增强所述化合物向靶标的送递，或者增强所述化合物的治疗活性。用于产生融合蛋白的方法在本领域中是已知的，并且i己载于例如AusubelW(见CurrentProtocolsinMolecularBiology.WileyInterscience，ISBN047150338，1987)和SambrookCa/(见MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,ThirdEdition2001)中。本发明的组合物可以是适宜于注射给药的形式、适宜口服摄入的制剂形式(例如胶嚢剂、片剂、胶嚢形片剂(caplet)、酏剂(elixir))、适宜于局部给药的软膏、乳膏或洗剂形式、适宜于作为滴眼剂送递的形式、适宜于吸入(例如鼻内吸入或口腔吸入)给药的气雾剂形式、适宜肠胃外给药的形式(即皮下注射、肌内注射或静脉内注射)。对于作为可注射的溶液或悬浮液给药而言，无毒的可用于肠胃外的稀释剂或载体可以包括林格氏溶液(Ringer'ssolution),等渗盐水、磷酸盐緩沖的盐水、乙醇和l，2-丙二醇。一些适宜于口服的栽体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂的实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠、阿拉伯胶、西黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服制剂可以包含合适的调味剂和着色剂。当以胶嚢剂形式使用时，所述胶嚢剂可以用例如延緩胶嚢剂崩解的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的化合物作为包衣。供口服给药的固体形式可以包含可用于人药和兽药实践中的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂(coatingagent)、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、曱基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄胞胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高呤土、纤维素、碳酸钩、硅酸4丐或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油(oilofwintergreen)、樱桃、橙或覆盆子调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或曱基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯曱酸钠、维生素E、29a-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯曱酸曱酯、对鞋基苯曱酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。供口服给药的液体形式除包含上述试剂以外还可以包含液体载体。合适的液体载体包括水、油(例如橄榄油、花生油(peanutoil)、芝麻油、向曰葵油、红花油、花生油(arachisoil)、椰子油)、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯，或它们的混合物。供口服给药的悬浮剂还可以包含分散剂和/或助悬剂。合适的助悬剂包括羧甲基纤维素钠、曱基纤维素、羟丙基曱基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙醇(acetylalcohol)。合适的分散剂包括卵磷脂；脂肪酸(例如硬脂酸)的聚氧乙烯酯(polyoxyethyleneester);聚氧乙烯山梨糖醇(polyoxyethylenesorbitol)的单油酸酯或其二油酸酯或其硬脂酸酯或其月桂酸酯；聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylenesorbitan)的单油酸酯或其二油酸酯或其硬脂酸酯或其月桂酸酯；诸如此类。供口服给药的乳剂还可以包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上文给出的分散剂或者天然胶例如瓜尔胶、阿拉伯胶或西黄蓍胶。本领域技术人员应了解，所述组合物可以作为单独的药剂或者作为结合治疗方法的一部分给药，用于在诊断阶段或在该阶段后治疗自身免疫疾病(例如胰岛炎和/或1型糖尿病)，例如作为后续治疗或巩固治疗来补充现有的对这种疾病的治疗。所述组合物还可以用于对在遗传上或在环境上易发生这种疾病的受试者进行预防性治疗。下面将通过参考以下的具体实施例进一步对本发明进行更加详细地描述，所述实施例不应被以任何方式解释为对本发明范围的限制。实施例实施例1乙疯躇^//发'破银#腐^义及侈#潜尿病本发明人进行的研究已经表明，与新生NOD小鼠相比，前驱糖尿病及糖尿病发作NOD小鼠中的乙酰肝素酶转录物增加7倍；在正常CBA/H小鼠中仅检测到了背景水平(见表1)。这些结果已经被这样的证据加强，即以乙酰肝素酶抑制剂PI-88(9)处理10-11周龄雌性NOD/Lt小鼠可在最长至24周龄的小鼠中阻止临床糖尿病的发作(见图3)。此外，本发明人已经发现，在经胰管将人血小板来源的纯化乙酰肝素酶送递至常规的(非自身免疫的)小鼠体内，可导致胰岛BM和胰岛内HS的原位破坏(见图4)。这些结果与乙酰肝素酶在NOD小鼠中引发破坏性胰岛炎的作用是一致的，并证明了PI-88保护NOD小鼠使之免于发作临床糖尿病的能力。表1:实时RT-PCR分析显示，来自前驱糖尿病雌性NOD/Lt小鼠及来自糖尿病发作的雌性NOD/Lt小鼠的胰岛中的乙酰肝素酶mRNA比分离自雌性NOD/Lt新生鼠的胰岛(参考样品)上调7倍胰岛样品_乙酰肝素酶mRNA的相对表达*4-5周新生的NOD/Lt1.0前驱糖尿病的NOD/Lt7.06±2.61糖尿病发作的NOD/Lt6.85±0.58CBA/H(常规的小鼠品系)_1.24±0.78_来自常规CBA/H小鼠的胰岛作为阴性对照。数据显示为3个单独系列的样品的平均值士SE。实施例2乙翁开#爽附/7^4在4^尿^7VOZ)V、^丘4被《^i瘦破银种應4/^差^W參丝參^Mt这參力夢通常，前驱糖尿病雌性NOD胰脏的组织病理学及对移植至糖尿病NOD小鼠的同基因胰岛的自身免疫破坏的组织病理学表明，自身反应性T细胞和其他MNC不是经由胰岛内血管进入胰岛的。取而代之的是，在由活化白细胞在胰岛BM接触面局部产生的降解性酶例如乙酰肝素酶使胰岛BM崩解后，侵入白血病便从胰岛周围位置移动至胰岛细胞团中。此后，MNC浸润进程可导致对胰岛内ECM硫酸乙酰肝素的降解及对胰岛的破坏。对这种依赖于酶的白细胞侵入机制是否在糖尿病NOD小鼠的胰岛同基因移植物的自身免疫破坏中发挥功能的研究包括一般性实验，例如检查在移植后多个时间所收集的胰岛同基因移植物中的乙酰肝素酶转录物的移植物内表达情况。本发明人已经使用导管内胶原酶注入方法(4-5供体小鼠/胰岛分离)，通过胶原酶消化从6-8周龄的雌性NODscid小鼠的胰脏中分离出了供体胰岛。将新鲜分离的NODscid胰岛以受体NOD/Lt品系血凝块形式(50-100个胰岛/凝块)移植至雌性糖尿病NOD/Lt小鼠的肾包膜下(250个胰岛/移植物)(22)。通过使用无免疫能力的NODscid供体小鼠而不是青年的雌性NOD/Lt小鼠来制备胰岛，消除了将源自供体胰岛炎的MNC或已经被供体胰岛炎损坏的胰岛被动地带到移植部位的可能性。因此，在用于后续分析的移植部位仅产生源自宿主的免疫反应。NODscid胎鼠皮肤(来自17日龄妊娠胎鼠供体)的同基因移植物或者移植于肾包膜下的成年NODscid曱状腺作为完整的对照移植物(对自身免疫损伤不敏感),分离的NODscid胰岛和正常NOD/Lt肾组织作为另外的阴性对照。在移植后第3、4、5、6、8、10和14天时收集移植物；将每个移植物的大部分冷冻于液氮中用于随后的RNA提取，将剩下的移植物冷冻于液体氟利昂中用于免疫组织化学或者固定在10%的中性緩冲的福尔马林中用于组织学。使用异硫氰酸胍/氯化铯方法提取RNA。所有用于比较的样品都使用相同的反应混合物以寡聚脱氧胸苷启动逆转录。使用有效的引物/探针组(AppliedBiosystems)进行实时RT-PCR。定量地分析乙酰肝素酶mRNA在组织样品中的表达。在本发明人实验室中建立的实时RT-PCR使用Taqman荧光探针(6-FAM用于耙基因和内源参考基因(泛素缀合酶E2D1(UBC))来测量PCR产物。依照标准步骤(使用测试基因和UBC的Cr值)计算靶基因转录物的相对量。首先通过用输入cDNA的标准量测试引物/探针浓度的限制区间来优化每种引物/探针组的扩增效率。然后，使用整合在LinRegPCR程序中的线性回归分析来计算PCR效率及扩增曲线的最佳拟合线的相关系数；该信息可用于鉴定最佳引物/探针浓度。使用这些条件，以与测试cDNA相同的效率扩增持家基因(UBC)和耙基因。这使得可弥补输入cDNA的不同量，并且可使用比较CT方法在样品之间确定测试PCR产物的相对量。本发明人的初步研究表明，在NODscid胰岛同基因移植物的自身免疫破坏过程中，乙酰肝素酶mRNA的表达在峰值表达时(在移植后第5-6天)被上调大约4倍(见以下表2)。表2:实时RT-PCR分析显示，乙酰肝素酶mRNA在糖尿病NOD/Lt小鼠正在被自身免疫破坏的NODscid胰岛同基因移植物中上调*移植至糖尿病NOD的乙酰肝素酶mRNA的相对表达同基因移植物移植后的时间(天数)**3天4天5天6天10天14天NODacid胰岛1.542.474.534.542.161.89NODscid胎鼠皮肤*1.000.960.851.010.380.42*将NODscid胎鼠皮肤同基因移植物(对自身免疫疾病不敏感)移植到雌性糖尿病NOD/Lt小鼠的肾包膜下面，作为完整的背景对照同基因移植物。**这些数据代表两个独立系列的同基因移植物样品。实施例3磁凝乙疯##f^S^^7VOZ)腐4,W/^在或it^應名^好X^破银遂除了存在于胰岛BM中的串珠蛋白聚糖/HS之外，HSPG也是更广泛分布的ECM的组分。ECM由大分子网络构成，其功能是填充组织中的细胞外空间，并为特定组织的细胞提供侵入白细胞可在其上迁移的支架(3)。实际上，已经证明p细胞的存活和功能依赖于它们与胰岛内ECM相互作用的保持(23，24)。因此，乙酰肝素酶可能不仅可促进活化的MNC通过胰岛BM的进入，而且可降解胰岛内ECM，从而不但促进侵入MNC的迁移而且降低邻近p细胞的生存力。用于确证胰岛相关的A泉酸乙酰肝素和乙酰肝素酶与胰岛完整性关系的一般性实验不但包括从糖尿病NOD小鼠(±PI-88处理)身上收集NODscid胰岛和Nodscid胰岛同基因移植物，而且还包括从新生的、前驱糖尿病的(士PI-88处理)、糖尿病发作的和糖尿病的(发作后2-4周)NOD/Lt小鼠身上收集胰脏，用于在10%的中性緩沖的福尔马林中固定。通过用阿利新蓝/0.65M氯化镁/pH5.8(限制HS特异性的条件)的组织学染色在福尔马林固定的切片中定位硫酸乙酰肝素(HS)(25)(见第19页，图7)。该分析已经证实，HS被局限于胰岛BM中，分布于胰岛内33ECM中，并且在自身免疫损伤中被损坏。实施例4^#源乙翁##雜谬发'^#^源银"及可以从人血小板中纯化乙酰肝素酶(26,27);已经证明血小板来源的乙酰肝素酶可快速剪切来自内皮细胞的硫酸乙酰肝素(HS),并且该活性是pH依赖性的(26)。本发明人进行的研究已经表明，经BALB/c小鼠的胰管将纯化的人血小板乙酰肝素酶送递至体内可导致正常胰岛形态的丧失(见图4和图5)。证实仅乙酰肝素酶是否能诱导BALB/c胰岛损坏或NODscid胰岛损坏的一般性实验包括，将分离的胰岛与人血小板来源的纯化乙酰肝素酶(10-20fig/ml;见图6)孵育过夜。以磷酸盐緩冲盐水(PBS)处理对照胰岛。然后，用显微镜/组织学方法检查所迷胰岛，以显示乙酰肝素酶诱导的胰岛损坏/破坏。实施例5乙應，:^躇附及AC4^蛋冷^應^^#;^差^移潜^#>^€^《在^^或由于本发明人进行的研究可表明乙酰肝素酶在原位及移植后的胰岛自身免疫损伤中起重要功能，因此需要研究乙酰肝素酶是否在胰岛同种异基因移植的排斥反应过程中在白细胞向移植部位的迁移/募集以及胰岛内侵入方面发挥作用。在胰岛同种异基因移植物被移植于肾包膜下的情况下，乙酰肝素酶可在以下方面发挥基本的功能(i)同种异体反应性T细胞通过胰岛BM向胰岛细胞团的浸润，(ii)活化的白细胞从肾血管并可能从一些源自宿主的移植物内血管的渗出，以及(iii)对胰岛内硫酸乙酰肝素的破坏。一般性实验包括，分析从移植到CBA/H(H-2k)受体小鼠后3-14天时所收集的BALB/c(H-2d)胰岛同种异基因移植物中乙酰肝素酶转录物的移植物内表达(见表3)。在胰岛同种异基因移植的排斥反应过程中，乙酰肝素酶mRNA的表达在峰值表达时(在移植后第5-7天)上调大约3-4倍(见下表3)。表3:实时RT-PCR分析显示，乙酰肝素酶mRNA在CBA/H(H-2k)小鼠正在发生排斥反应的BALB/c(H-2d)胰岛同种异基因移植物中上调2-8倍<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>A完整CBA/H胰岛同基因移植物作为背景对照。实施例6"iV-M命斧/乙應，;^瘅^/"潜^病iW2)小扃^^^名^差忠移兹參存承前驱糖尿病NOD小鼠的PI-88处理可阻止临床糖尿病的发作(见图3)并因此阻止破坏性胰岛炎的发作，该结果强烈地表明对乙酰肝素酶活性的抑制对胰岛有原位免疫保护作用。因此，以PI-88对移植的小鼠进行体内处理应该可阻止对胰岛同种异基因移植物的排斥反应、胰岛同基因移植物中的疾病复发(见图8),并可促进糖尿病NOD/Lt小鼠中胰岛同种异基因移植物的存活和功能。为了评估PI-88治疗是否有移植物保护作用，将NODscid胰岛以400-500个胰岛/移植物的量移植至自身免疫的糖尿病NOD小鼠中。从移植后第3天(在移植物血管重建后)开始以腹膜内注射PI-88(10mg/kg/天)来处理所述小鼠。以盐水处理对照的移植小鼠。通过每周2-3次(2-3x)测量非禁食血糖水平(使用血糖仪(MediSense2))来监测移植物功能。对受体小鼠的PI-88处理可阻止胰岛同基因移植物中的疾病复发最长至移植后2周，并使得这些移植物保持血糖量正常；相反，对照移植物受到迅速蔓延的自身免疫破坏并且受体动物中的血糖水平经2周返回至糖尿病范围。本发明人进行的研究已经在原位证实了在胰岛周围存在基膜(BM),已经将串珠蛋白聚糖(一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)鉴定为胰岛BM的组分，已经揭示出来自前驱糖尿病和糖尿病发作的NOD小鼠的胰岛中的乙酰肝素酶转录物上调7倍，并且已经发现使用PI-88(3)抑制乙酰肝素酶可阻止NOD小鼠中的T1D。因此，由活化的胰岛炎MNC产生的乙酰肝素酶似乎在以下过程中起到关键作用通过损坏胰岛BM和胰岛内ECM将非破坏性胰岛炎转化成破坏性胰岛炎，从而诱导p细胞损伤和T1D。类似地，胰岛同基因移植物遭受到乙酰肝素酶诱导的免疫损伤；通过以PI-88进行体内处理可使在糖尿病NOD受体小鼠中的NODscid胰岛同基因移植物免于疾病复发。实施例7勿^^##存;^5^#^^凝乙疯>^#HSPG是胰島的BM和ECM的原位组分。前面的实施例已经显示，乙酰肝素酶不但降解胰岛内ECM，而且可促进活化的MNC通过胰岛BM的进入。这种活性似乎不仅可促进侵入MNC向胰岛的迁移，而且由于p细胞似乎依赖于ECM石克酸乙酰肝素以维持其活性，所以这种活性可降低附近p细胞的生存力。进行了体外研究来进一步验证这个观点。使用分散酶(Dispase，lmg/ml)分散成单细胞中的分离的BALB/c胰岛主要由产生胰岛素的P细胞组成，这一点被免疫荧光法所确证。与经过2天培养期后保持完整的对照胰岛p细胞不同，以细菌类肝素酶(肝素酶)(i+n+m;每种类肝素酶均为0.25U/ml)处理1小时的p细胞(该过程将完全破坏与胰岛ECM和细胞表面相关联的HS)没有存活(图9(a))。将被处理的细胞置于ECM(由细胞系在体外产生)上能够在很大程度上从类肝素酶-诱导的细胞死亡中拯救出p细胞(PO.OOOl)(图9(a))。这些发现表明，胰岛p细胞的存活需要细胞相关的HS。作为对该观点的支持，通过为培养物提供5-50照/ml肝素(一种高度硫酸化形式的硫酸乙酰肝素)可有效地拯救细菌类肝素酶处理的p细胞(*P<0.0001)(图9(b))。因此，胰岛p细胞需要细胞相关的HS来保持活力及健康。这些数据支持这样的观点，即胰岛p细胞在细胞水平对于乙酰肝素酶的直接损伤是敏感的。实施例8#斧/乙應##雜考<:^4/#V、扃尹^5y!LB/c應4/^^^f^瘁移潜參存法W多祷HS在保持胰岛和胰岛(5细胞的完整性和存活中起到关键的作用。已经证明乙酰肝素酶在NOD小鼠胰岛的自身免疫破坏中起到主要作用，并且外源的人乙酰肝素酶在体外可破坏正常胰岛(来自常规的小鼠)(见前面的实施例)。PI-88对乙酰肝素酶活性的抑制可短暂地拖延对糖尿病NOD/U小鼠中胰岛同基因移植物的迅速蔓延的自身免疫破坏。因此，乙酰肝素酶还可能在胰岛同种异基因移植物的免疫破坏中起到重要作用(甚至在没有自身免疫攻击的情况下)。与在移植后7天显示出更严重的胰岛破坏的相应对照胰岛同种异基因移植物相比(图10(b)),来自移植后7天的PI-88处理的受体CBA/H(H-2k)小鼠的BALB/c(H-2d)胰岛同种异基因移植物显示出单核细胞在胰岛周围积累(图l(a))。因此，对宿主的PI-88处理对被移植的同种异基因胰岛有着更好的保持。因此，乙酰肝素酶抑制剂可代表一种用于同种异基因宿主中的胰岛移植物的抗排斥反应方法，并且具有保护被移植的胰岛使其避免遭受异体免疫攻击和自身免疫攻击的能力。实施例9^f甜^邀合參根据本文提供的实施本发明的最佳模式，具体优选的组合物在下文列出。以下组合物仅可被解释为组合物的示例性实例，而不能被以任何方式解释为对本发明的范围的限制。"义應f斧给秀的邀合參制备一种用于肠胃外注射的组合物在10ml-2升l。/。羧曱基纤维素中包含0.05mg-5g的本文公开的适当药剂或化合物。类似地，用于静脉内输注的組合物可包含250ml无菌的林格氏溶液和0.05mg-5g的本文公开的适当药剂或化合物。^B义口應辨邀合參胶嚢形式的适当药剂或化合物的组合物可通过用以下物质填充标准的两段式硬明胶胶嚢而制备500mg粉末形式的所述药剂或化合物、100mg的乳糖、35mg的滑石及10mg的硬脂酸镁。371.SolomonM,SarvetnickN.(2004)ThepathogenesisofdiabetesintheNODmouse.Adv，Lnmunol.84:239.2.Parish,CR(2006)Theroleofheparansulfateininflammation.NatRevImmunol6:633.3.ParishCR，FreemanC，HulettMD(2001)Heparanase:akeyenzymeinvolvedincellinvasion.Biochim.Biophys.Acta1471:M99.4.NoonaaDM,FulleA，ValentePetal,(1991)Thecompletesequenceofperlecan，abasementmembraneheparansulfateproteoglycanrevealsextensivesimilaritywitlilamininAchain，lowdensitylipoprotein-receptor，andtheneuralcelladhesionmolecule.J.Biol.Chem.266:22939.5.TimpiR，(1993)Proteoglycansofbasementmembranes.Experientia49:417.6.Conde-Knape，K.(2001)Heparansulfateproteoglycansinexperimentalmodelsofdiabetes:aroleforperiecanindiabetescomplications,Diab/MetabResandRev17:412.7，VlodavskyI，.FriedmannY，ElkinMetal(1999)Mammalianheparanase:genecloning，expression,andftmctionintumorprogressionandmetastasis.NatureMed5:793，8.HulettMD，FreemanC,HamdorfBJ,BakerRT,HarrisMJandParishCR(1999)Cloningofmammalianheparanase,animportantenzymeintumorinvasionandmetastasis.NatureMed5:803.9.ParishCR.(2005)Heparansulfateandinflammation.NatureImmunol.6:861,10.VlodavskyI，EldorA,Haimovitz-FriedmanAetal(1992)Expressionofheparanasebyplateletsandcirculatingcellsoftheimmunesystem:possibleinvolvementindiapedesisandextravasation.Invasionmetastasis12:112.11.ParishCR，HindmarshEJ,BartlettMRetal(1998)Treatmentofcentralnervoussysteminflammationwithinhibitorsofbasementmembranedegradation.ImmunolCellBiol76:104.12.NaparstekY,CohenIR，FuksZetal.(1984)ActivatedTlymphocytesproduceamatrix-degradingheparansulfateendoglycosidase.Nature310:241.13.LaffertyKJ,ProwseSJ，SimeonovicCJetal(1983)Immunobiologyoftissuetransplantation,Areturntothepassengerleucocyteconcept.Ann,Rev,Immunol,1143.14.MakhloufL,GreyST,DongVetal(2004)Depletinganti-CD4monoclonalantbodycuresnew-onsetdiabetes,preventsrecurrentautoinmumediabetesanddelaysallograftrejectioninnonobesediabeticmice.Transplantation77:990.15.DemirciG,StromTB,LiXC(2003)Isletallograftrejectioninnonobesediabeticmiceinvolvesthecommongamma-chainandCD28/CD154-dependentand-independentmechanisms.JImmunol171:3878.16.MolanoRD，PileggiA，BemeyTetal(2003)ProlongedisletallograftsurvivalindiabeticNODmicebytargetingCD45RBandCD154.Diabetes52:957,17.Wang，Y.,Hao,L.,Gill，R.G.andLafferty,K.J.(1987)AutoimnmnediabetesinNODmouseisL3T4T-lymphocytedependent.Diabetes36:535.18.MolanoRD,PileggiA,BerneyTetal.(2003)Long-termisletallograftsurvivalinnonobesediabeticmicetreatedwithtacriloirms，rapamycinandinterleukin-2antibody.Transplantation75:1812.19.GuoZ，WuT，SozenHetal(2003)Asubstantiallevelofdonorhematopoieticchimerismisrequiredtoprotectdonor-speci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