专利名称：可用于诊断和治疗b细胞慢性淋巴细胞白血病的能够在肿瘤细胞中诱导凋亡的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含识别白细胞分化抗原CD6的人源化单克隆抗体并 能够在肿瘤细胞中诱导凋亡的药物组合物，其可用于治疗B细胞慢性 、淋巴细胞白血病。
现有技术
单克隆抗体(MAb)的治疗相关性已在医学实践中得到了验证。特 别是在癌症中，在患有不同类型肿瘤的患者中，MAb构成了目前治疗 "武器库，，的一部分(Weiner， L. M.等人，(2006) Hum Antibodies 15 (3) :103; Imai， K.等人，(2006) Nat Rev Cancer 6 (9) :714)。
凋亡是细胞死亡的天然生物学机制，然而它也可以以治疗方式被 诱导。凋亡是用于达到控制肿瘤生长的有关途径，并且构成了几种药 物所利用的作用机制，所述药物包括在患有不同类型肿瘤的患者冲具 有治疗用途的MAb。因此，寻找能够促进由凋亡所介导的细胞死亡的 药物成为医学肿瘤学所关注的问题(Cartron， G.等人，(20(H) Blood 104: 2635 )。
淋巴组织增生性综合征，特别是B细胞慢性淋巴细胞白血病 (B-CLL)，是当代的一个健康问题。B-CLL是在西半球具有最高流行 率的白血病，并且没有该疾病的具有治愈效果的疗法可用(Chiorazzi， N.等人，(2005) NEngl JMed 352 (8): 804; Herisharm， Y.等人，(2005) Transfus Apher Sci 32 (1) :85 )。目前，使用能够消除这些患者中 的肿瘤细胞的MAb是一种可选的治疗方法(Robak， T. (2005) TransfusApher Sci 32 (1): 33 )。然而，主要基于使用识别诸如CD52和CD20 的分子的MAb的该方法的一个主要缺点在于，抗肿瘤的治疗效果非常 有限，并且引起个体的正常淋巴细胞的消除(Nuckel， H.等人，(2005). Eur J Pharmacol 514 (2-3): 217; Cartron， G.等人，(2004) Blood 104:2635 )。缺乏识別特异性导致延长的淋巴细胞减少，这在接受治 疗的患者中构成了频繁出现感染的风险因素，由于该疾病的固有特征， 这些患者对于感染的出现非常敏感(Boye， J.等人，(2003) AnnOncol 14 (4) :520; Cartron， G.等人，(2004) Blood 104: 2635; Potter, M. (1999) 12 (4) :359 ; Ravandi， F.等人，(2006) Cancer Immunol Imm画ther 55 (2): 197 )。
B-CLL患者的肺瘤细胞表达正常B淋巴细胞的特征性的细胞表面 标志物，例如CD19和CD20。特别地，已将肿瘤细胞的出现与共表达 白细胞分化抗原CD5的外周血B淋巴细胞相关联(Herishanu， Y.等人， (2005) Transfus Apher Sci 32(1) :85) 。 CD5是B-CLL的区别性标 志物，但不是决定性的，这是因为它可能只代表了外周血中肿瘤细胞 亚群的依照情况的标志物，并且仍然不确定其在骨髓中起源，还是源 自髓外来源(Caligaris-Cappio， F.等人，(2004) Hematol Oncol CI in N Am 18: 849 )。
白细胞分化抗原CD6是一种还很少研究和表征的分子。CD6是主 要在T淋巴细胞中中表达的表面糖蛋白。基本上，认为CD6在这些细 胞中是具有共刺激功能的受体，尽管机制还不了解(Amffo， A.等人， (1997) Immunol Today 18 (10): 498; Patel，D. D. (2000) J Biol Regul Homeost Agents 2000 14 (3): 234 )。已将其在成熟胸腺细胞中的表 达与在该淋巴器官中在淋巴细胞成熟过程中这些细胞对于凋亡的抗性 相关联(Singer， N. G.等人，(2002) Int Immunol. 14 (6):585 )。
令人感兴趣地，CD6分子在正常个体外周血中的少数B淋巴细胞 亚群中表达，但对于其在这些细胞中的起源和功能表征的了解非常有 限。此外，B-CLL患者的外周血单核细胞也表达CD6分子。认为CD6 分子与CD5分子共表达，但与CD5分子不同的是，CD6仅最终在B-CLL患者的样品中被分析到。
进一步地，用特异于CD5分子的单克隆抗体所进行的识别在B-CLL 患者的肿瘤细胞中诱导了凋亡，但只在它们的亚组中(Pers， J.O.等 人，(2002) Leukemia 16: 44 )。
CD6分子^皮鼠类MAb ior-UA所识别。在用B-CLL患者的样品来 进行的先前研究中，发现鼠类MAb ior-tlA在B淋巴细胞中抑制由抗 -IgM抗体所诱导的凋亡(Osorio, L.M.等人，(1997) Blood， 89 (8):2833 )。另一方面，该抗-CD6鼠类MAb的治疗组合物对于银屑 病具有治疗效果(Montero， E.等人，(1999) Autoimmunity 29 (2): 155 )。
后来，通过使用基因工程方法(EP 0699755 ),获得了被命名为 Tlh的该抗人CD6鼠类单克隆抗体的人源化形式(EP 0807125 )。
通过使用人源化的MAb Tlh，我们发现，它识别在外周血的肿瘤 细胞中表达的CD6分子，并且令人惊讶地，它还识别在B-CLL患者骨 髓的肺瘤细胞中表达的CD6分子。此外，该抗体还识别不表达CD5分 子的肿瘤细胞，从而使CD6成为包括CD5亚群的肿瘤标志物。此外， 人源化单克隆抗体Tlh在B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的肿瘤细胞 中而不在正常淋巴细胞中诱导凋亡。
本发明的新颖性在于，提供了包含抗-CD6单克隆抗体的治疗组合 物，以将其应用于患有淋巴组织增生性综合征，特别是B细胞慢性淋 巴细胞白血病的患者。
令人惊讶地，人源化单克隆抗体Tlh对CD6分子的识别诱导了患 有表达CD6分子的淋巴组织增生性综合征的患者的肿瘤细胞，特别是 患有B细胞慢性淋巴细胞白血病的患者的肿瘤B淋巴细胞通过凋亡的 死亡，这导致TlhMAb在这种类型的肿瘤中的治疗用途。此外，TlhMAb 治疗可以使恶性细胞对于细胞毒性药物的效应敏感，这使得能够将人 源化单克隆抗体Tlh与放射疗法、化学治疗剂或其他生物疗法联合使 用。发明详述
本发明涉及识别人抗原CD6的单克隆抗体的治疗组合物，其在治 疗淋巴组织增生性综合征患者中有效。更具体地，本发明包括包含识 别人白细胞分化抗原CD6的人源化单克隆抗体Tlh的药物组合物的使 用，以及其用于诊断和治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的用途。
术语"人源化单克隆抗体，，，是指如专利号0699755 (E. P. Bul ) 中所描述的通过基因工程方法而获得的单克隆抗体。
本发明的目标为治疗制剂，其包含单独的或与选自下列的任何试 剂相组合的、从具有保藏号ECACC 96112640的杂交瘤I0R-T1A获得的 人源化单克隆抗体Tlh，所述人源化单克隆抗体Tlh通过识别CD6分 子而诱导B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的肺瘤细胞的凋亡
-化学治疗剂，例如磷酸氟达拉滨，
-针对肿瘤性淋巴细胞表面分子的特异性单克隆抗体，例如抗 -CD2Q抗体。
此外，本发明的药物组合物还包含合适的赋形剂(其可以是经緩 冲的生理溶液)，并且可以在0.05-1 mg/Kg体重的剂量范围内以注
射剂的形式进行施用。
另一方面，本发明涉及用于诊新B细胞慢性淋巴细胞白血病的诊 断药剂，其包含抗-CD6单克隆抗体。
1.-包含人源化单克隆抗体Tlh的药物组合物的荻得
抗人CD6的人源化单克隆抗体Tlh从具有保藏号ECACC 9"12640 的杂交瘤IOR-TIA获得，如在(EP 0 807 125 A2 )中所描述的。
本发明的药物组合物包含抗-CD6的人源化单克隆抗体Tlh，此外 还包含经緩冲的生理溶液作为合适的赋形剂，类似于用于配制用于静 脉内使用的单克隆抗体的其他那些，如在EP 08O7125中所描述的。
本发明的组合物在0. 05 - 1 rag/Kg体重的剂量范围内以注射剂的 形式进行施用。2.-人源化单克隆抗体Tlh的识别特异性的表征 用缀合至FITC的抗人CD19单克隆抗体对B细胞慢性淋巴细胞白 血病患者的外周血单核细胞和骨髓细胞进行标记。随后，将细胞与下 列单克隆抗体进行温育缀合至生物素的抗人CD6单克隆抗体(Tlh) 或缀合至PE-Cy5的抗人CD5单克隆抗体(Pharmingen )或缀合至生物 素的抗人CD20单克隆抗体(Rituximab-Rx)。用链霉抗生物素蛋白 -PE-Cy5缀合物来检测生物素化的抗体的结合。在流式细胞仪FACScan 上获得至少10000个活细胞。通过碘化丙锭(PI)染色来将死细胞排 除。
3.-人源化单克隆抗体Tlh对于B细胞慢性淋巴细胞白血病患 者的细胞的抗肿瘤效应的表征
在37。C和5。/flC02下，将正常个体或B细胞慢性淋巴细胞白血病患 者的外周血单核细胞用0.1 ng/mL的人源化单克隆抗体Tlh或同种型 对照(单克隆抗体R3h)处理18小时。之后，洗涤细胞，并在环境温 度下与缀合至FITC的膜联蛋白V—起温育IO分钟。然后，用碘化丙 锭对细胞进行标记，并在流式细胞仪FACScan上获得。凋亡细胞被定 义为"膜联蛋白V+/PI-"。
实施例
下面的实施例旨在用于举例说明本发明。
抗人CD6的人源化单克隆抗体Tlh从具有保藏号ECACC 96112640 的杂交瘤IOR-TIA获得，如在(EP 0 807 125 A2 )中所描述的。
实施例1:人源化单克隆抗体Tlh识别B细胞慢性淋巴细胞白血病患 者的外周血的肿瘤细胞评价了 TlhMAb对于19位B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的外周 血单核细胞的识别，并测定了在通过标志物CD19和CD20所限定的B 细胞上CD6分子的表达。此外，将这些细胞标志物的表达与正常个体 的样品进行比较(
图1)。通过使用FACScan来分析样品的流式细胞 术来进行该研究。在图1中，正常值被描绘为红色的实心方块。
实施例2:人源化单克隆抗体Tlh识别B细胞慢性淋巴细胞白血病患 者的骨髓的肿瘤细胞
评价了 Tlh MAb对于4位B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的骨髓 细胞的识别，并测定了在通过标志物CD19和CD20所限定的B细胞上 CD6分子的表达(图2 )。通过使用FACScan来分析样品的流式细胞 术来进行该研究。
实施例3:人源化单克隆抗体Tlh识别不表达CD5分子的B细胞慢性 、淋巴细胞白血病患者的肺瘤细胞*
评价了 Tlh MAb对于B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的外周血单 核细胞(图3a)和骨髓细胞(图3b)的识别，并测定了肿瘤细胞中 CD6分子与CD5分子的共表达。样品1代表具有CD6+CDS+肿瘤细胞的 患者，和样品2代表具有CD6+CD5-肿瘤细胞的患者。通过^f吏用FACScan 来分析样品的流式细胞术来进行该研究。
实施例4:人源化单克隆抗体Tlh诱导B细胞慢性淋巴细胞白血病患 者的肿瘤细胞通过凋亡的死亡
评价了人源化单克隆抗体Tlh诱导B细胞慢性淋巴细胞白血病患 者的肿瘤细胞通过凋亡的死亡的能力。在将肿瘤细胞与人源化单克隆 抗体Tlh在体外进行温育之后，采用下列标准来测定凋亡细胞的百分 比凋亡细胞对于使用膜联蛋白V的标记呈阳性和对于通过碘化丙锭
9的标记呈阴性。使用地塞米松(Dex)和利妥昔单抗(Rx， 一种抗-CD20 单克隆抗体)作为阳性对照。使用人源化单克隆抗体R3h (IgGl同种 型，并且特异于表皮生长因子受体)作为阴性对照。将结果(图4) 与未经处理的细胞(无TTO)进行比较。通过使用FACScan来分析样 品的流式细胞术来进行该研究。
附图简述
图1 -
在B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的外周血单核细胞中，通过人 源化单克隆抗体Tlh测定的CD6的表达。潜在的肿瘤特异性抗原。
图2 -
在B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞中，通过人源化单 克隆抗体Tlh测定的CD6的表达。潜在的肿瘤特异性抗原。
图3 -
在关于CD5表达而言阴性的B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的外 周血单核细胞中，通过人源化单克隆抗体Tlh测定的CD6的表达。
图4 -
在B细胞慢性淋巴细胞白血病患者的肿瘤细胞中，使用人源化单 克隆抗体Tlh诱导了通过凋亡的死亡。
权利要求
1.用于诊断和治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含识别人白细胞分化抗原CD6的人源化单克隆抗体，所述人源化单克隆抗体诱导肿瘤细胞的凋亡；以及另外还包含合适的赋形剂。
2. 根据权利要求1的药物組合物，其特征在于，所述人源化单克 隆抗体是从具有保藏号ECACC 96112640的分泌型杂交瘤IOR-TIA荻得 的Tlh。
3. 根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述組合物包含体Tlh，所述人源化单克隆抗体Tlh诱导肿瘤性B淋巴细胞的凋亡 -化学治疗剂，-针对肿瘤性淋巴细胞表面分子的特异性单克隆抗体。
4. 根据权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述化学治疗剂 为磷酸氟达拉滨。
5. 根据权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述针对肿瘤性 淋巴细胞表面分子的特异性单克隆抗体为抗-CD20抗体。
6. 根据权利要求1的药物组合物，其特征在于，所述合适的赋形 剂为经緩冲的生理溶液。
7. 根据权利要求1至6的药物组合物，其特征在于，在0. 05 - 1 mg/Kg体重的抗-CD6单克隆抗体剂量范围内，所述组合物具有治疗效 果。
8. 诊断药剂，其特征在于，所述诊断药剂包含用于诊断B细胞慢 性淋巴细胞白血病的单克隆抗体Tlh。
9. 抗-CD6单克隆抗体用于诊断B细胞慢性淋巴细胞白血病的用途。
10. 根据权利要求9的用途，所述用途为单克隆抗体Tlh用于诊 断B细胞慢性淋巴细胞白血病的用途。
11. 抗-CD6单克隆抗体在制备用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的药剂中的用途。
12. 根据权利要求11的用途，所述用途为由具有保藏号ECACC96112640的分泌型杂交瘤I0R-TlA产生的人源化抗体Tlh用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的用途。
全文摘要
本发明涉及免疫学领域，特别是涉及包含识别白细胞分化抗原CD6的人源化单克隆抗体的药物组合物的获得。根据本公开内容，本发明的目标为提供包含抗-CD6的人源化单克隆抗体的药物组合物以用于诊断和治疗淋巴组织增生性综合征，特别是B细胞慢性淋巴细胞白血病。本发明的应用领域扩展至肿瘤学。
文档编号A61P35/02GK101678101SQ200780050248
公开日2010年3月24日 申请日期2007年12月24日 优先权日2006年12月26日
发明者J·E·蒙特罗卡西米洛, R·佩雷斯罗德里格斯, R·阿隆索拉梅尔兹 申请人:分子免疫中心