合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份，本发明还涉及所述活性成份的制备方法和应用。(二)
背景技术：
血管生成(angi'ogenesis)指的是组织利用既存血管产生新的血管的过程。正常成年人的血管内皮细胞一般处于相对静止状态，生理情况下内皮细胞平均每数年分裂一次，仅发生于创伤修复或月经周期的卵巢和子宫内膜，但许多疾病如肿瘤，可出现组织中的新生血管内皮细胞快速增生，其增生周期相当于骨髓的生发细胞或肠道上皮细胞1、TimdrJ，D5meB，FazekasK,Ja丽icsA,PakuS.Angiogenesis-dependentdiseasesandangiogenesistherapy.尸3t力cL/2001，7(2):85-94.2、FolkmanJ.Angiogenesisincancer,rheumatoidanddisease.#W1995,1:27-31.，绝大多数恶性实体肿瘤的生长和转移是血管依赖的，即肿瘤组织在其生长过程中会诱导新的血管生成，以提供肿瘤生长所需的营养和氧气，同时通过血管向其他组织输送转移细胞，并在机体的其他部位继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移3、D'AmatoRJ，AdamisAP.Angiogenesisinhibitioninage-relatedmaculardegeneration.(9/7力t/37777oA^7.1995，102(9):1261-1262.4、ArbiserJL.Angiogenesisandtheskin:aprimer./Z/z^cadZfe27z7ato丄1996，34(3):486—497.5、O'BrienKD，McDonaldT0，ChaitA，AllenMD，AlpersCE.NeovascularexpressionofE-selectin，intercellularadhesionmolecule—1，andvascularcelladhesionmolecule—1inhumanatherosclerosisandtheirrelationtointimalLeukocytecontent.6Yrci/Ja"肌1996，93(4):672-82.6、HanahanD，FolkmanJ.Patternsandemergingmechanismsoftheangiogenicswitchduringtumorigenesis.1996，86(3):353-364.。目前认为，癌细胞能分泌大量促进血管生长的许多血管生长因子，使肿瘤形成新的血管而快速生长，而血管内皮细胞也可分泌血管生长因子促使管内皮细胞自身乃至肿瘤细胞的增殖7、Folkman，Cotran.Relationofvascularproliferationtotumorgrowth./""er&p/Mo,1976,16:207-248.8、VeikkolaT，AlitaloK.VEGFs，receptorsandangiogenesis.5e啦VC朋cer历》丄1999，90211-220.总而言之，血管生成与肿瘤的发生和转移有着密切的关系。抑制新生血管的生成已经成为肿瘤防治中的一个新域。1998年美国Folkman研究组报道血管抑素(Angiostatin)和内皮抑素(Endostatin)合用，对荷大肠瘤、前列腺瘤、乳腺瘤及脑瘤的小鼠有显著疗效，且对内皮抑素不产生抗药性，从而引起科学界的广泛关注，使抗血管生成治疗肿瘤成为一大热点。以抑制血管生成为耙点，从而达到抑制肿瘤的转移的目的，这一新观点克服了以往的治疗肿瘤的弊端，不易产生耐药性。药物的作用不会对正常的细胞产生毒性。世界各国以肿瘤血管生成作为靶点经过广泛研究，目前开发出许多血管生成抑制剂在进行ini期临床试验研究，例如血管生成抑素(Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)、烟曲霉素类似物及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素一12、血小板因子、Bufotanine等20多种。上述血管生成抑制剂，具有特异性强，作用快，剂量小，疗效高，副作用小，不易产生耐药性等优点。此类药物不但可用于大多数实体肿瘤的治疗，还可用于癌的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗，同时对其他与血管生成有关的疾病如糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗，都具有重要的理论及现实意义。合欢皮属合欢属Albizzia系豆科含羞草亚科植物，广泛分布于世界各地。我国有16种，大部分产于南部和西南部，其中最常见的有合欢^&'zw'a/〃h./n's^i/Durazz，楹树"^z'zzisc力i/e/757.s1(Osb.)Merr.，大叶合欢爿7&>^'<3Lebbeck(L.)Benth禾口白格A/Z^'zziaProcera(L.)Benth等。合欢属植物树皮、茎皮、叶、花、种子的主要的化学成分有三萜及其苷类化合物、黄酮及其苷类化合物、生物碱、有机酸、甾醇类化合物、木脂素、鞣质及挥发性成分等。现代药理实验表明，合欢属植物具有广泛的抗癌、镇静、抗生育、PAF受体拮抗和抗炎等作用。例如，被中国药典一部收录的合欢属植物中的合欢皮是一味常用中药，为豆科植物合欢^"^^yWi力/^^i/7Durazz.的干燥树皮，具有解郁安神，活血消肿的功能，用于心神不安，忧郁失眠，肺痈疮肿，跌扑伤痛等症。合欢皮提取物具有广泛的体内、体外抑制肿瘤细胞增殖的活性，但由于其抗癌作用机制还不明确，限制了其抗癌作用的临床应用9、TsuyoshiIkeda，TetsuyaKajimoto，ToshihiroNohara，Jun-eiKinjo，Chi-HueyWong.Preparationofaneoglycolipidcarryingtheoligosaccharidecomponentofsaponinfrom"Ziz^z.3j'〃7i力W5157./7.7fetra力eo(ro/7Ze"e_ns.1995，36(9):1509-1510.10、KimZou，.YuyingZhao，Gu肌gzhongTu，JingrongCui,ZhonghuaJiaandRuyiZhang.Twodiastereomericsaponinswithcytotoxicactivityfrom^76j'w'sy〃2j'力77'515^/7.Can6o力yc/i^e/fesearc力.2000，324(3):182-188.11、KunZou，YuyingZhao，GuangzhongTu，JunhuaZheng,RuyiZhang.ANewIsomerofJulibrosideJ2from"6iziaJw_/j'6j"j'ssi/7./Asi朋A^〃ra7/^oi/〃cz^Tfesearc力.1998，1(1):59-66.12、邹坤，赵玉英，李德宇，徐锋，郑俊华，张如意.合欢皮的脂溶性成分.北京医科大学学报，1999,31(1):32-34.合欢属Albizzia系豆科含羞草亚科植物，广泛分布于世界各地。我国有16种，大部分产于南部和西南部，其中最常见的有合欢爿7iW^z'3JWiZ7".s5^./Durazz，楹树"Zu'^z'sc力i/e/757.51(Osb.)Merr.，大叶合欢^6/MJ'aZe6ZecA(L.)Benth和白格A/Wzzj'a/^ocera(L.)Benth等。合欢属植物树皮、茎皮、叶、花、种子的主要的化学成分有三萜及其苷类化合物、黄酮及其苷类化合物、生物碱、有机酸、甾醇类化合物、木脂素、鞣质及挥发性成分等。现代药理实验表明，合欢属植物具有广泛的抗癌、镇静、抗生育、PAF受体拮抗和抗炎等作用。例如，被中国药典一部收录的合欢属植物中的合欢皮是一味常用中药，为豆科植物合欢y^&'w'aj》h'力i^sw7Durazz.的干燥树皮，具有解郁安神，活血消肿的功能，用于心神不安，忧郁失眠，肺痈疮肿，跌扑伤痛等症。合欢皮提取物具有广泛的体内、体外抑制肿瘤细胞增殖的活性，但由于其抗癌作用机制还不明确，限制了其抗癌作用的临床应用13、TsuyoshiIkeda，TetsuyaKajimoto，ToshihiroNohara，Jun-eiKinjo，Chi-HueyWong.Preparationofaneoglycolipidcarryingtheoligosaccharidecomponentofsaponinfromj^7j7r7.5^i化7e^ra力eo^0/7Ze"er51.1995，36(9):1509-1510.14、KunZou，YuyingZhao,GuangzhongTu，JingrongCui，ZhonghuaJiaandRuyiZhang.Twodiastereomericsaponinswithcytotoxicactivityfrom力7Zj'27'3J〃7i6i^'5"5"i/3.Canbo力j^rajaearc力.2000，324(3):182-188.15、KunZou，YuyingZhao,GuangzhongTu，JunhuaZheng,RuyiZhang.ANewIsomerofJ"ulibrosideJ2fromZ7Ziz/sJw7iZr/s^//7./Asi朋yVaz^ra〗尸2^/〃cz^yesearc力.1998，1(1):59—66.16、刍卩坤，赵玉英，李德宇，徐锋，郑俊华，张如意.合欢皮的脂溶性成分.北京医科大学学报，1999,31(1):32-34.多成分、多靶点、多途径"是中药治疗疾病的特点，发挥祖国医学特色，从多途径、多层次、多环节，研究中药直接地或间接地影响血管新生，有着重要的临床意义和应用前景。
发明内容针对上述问题，本发明提供了合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份其同样可以用于抑制肿瘤血管及其它与血管生成，本发明还提供了所述活性成份的制备方法和应用。本发明的技术方案合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份为皂甙类化合物。所述皂甙类化合物其中含有化合物A和/或化合物B，所述化合物A的分子结构的特征为(I)其中R1:CH3R2:NHACR3:OHC-6:R化合物A的分子式为C1MH165049N，分子量为2211，熔点为202204°C，化学名为3-0-[^>吡喃木糖基-(1—2)-p-D-吡喃呋糖基-(1—6)^-D-2-去氧-2-乙酰胺基葡萄糖基]-21-o-K6s)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-p-D-吡喃鸡纳糖基-2，7-辛二烯酸基)-p-D-吡喃鸡纳糖基]-2，7-辛二烯酸基L金合欢酸-28-o-P-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酯；所述化合物B的分子结构的特征为(II)其中R1:CH3R2:OHC-6:S化合物B的分子式为C啦H股049,分子量为2170，熔点为204~206°C;化学名3-o--21-0-{(6s)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-(e-D-吡喃鸡纳糖基)-2，7-辛二烯酸基)-D-吡喃鸡纳糖基]-2，7-辛二烯酸基}-金合欢酸-28-o-e-D-吡喃葡萄-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-5-D-吡喃葡萄糖基酯。合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制备方法，其特征在于用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取合欢皮的干燥树皮、茎皮、叶、花、种子、豆荚或根，并将提取液过滤、浓縮成浸膏；所得的浸膏采用D-101型大孔树脂洗脱分离，收集有效组份进行硅胶层析柱洗脱分离，再收集有效组份进行反相苯乙烯色谱柱分离，得有效组份，回收溶剂成浸膏，冷冻干燥制成干粉。其进一步特征在于将所述反相苯乙烯色谱柱分离得有效组份进行反相C18色谱柱洗脱分离后得皂甙类化合物A和皂甙类化合物B。合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，其特征是所述皂甙类化合物有抗肿瘤血管生成及其它与血管生成有关疾病治疗、预防的用途；或在抑制血管生成的药物中使用；或者用作常规药用载体和/或赋形剂；或者在制备抑制血管生成的保健食品中的应用；或者在制备抑制血管生成的化妆品中的应用。其进一步特征是在制成所述抑制血管生成药物时，可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等；在制成所述抑制血管生成药物时，可以按常规的制剂工艺，单独使用或与其它药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，例如注射液、片剂、粉齐U、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等多种形式；制成的所述抑制血管生成药物用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视阿膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤疮；制成的所述抑制血管生成药物用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。本发明的有益效果本发明首次明确合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份为皂甙类化合物，并将其作为用于肿瘤血管生成及其它与血管生成有关的疾病预防、治疗的药物，从多成分、多靶点、多途径、多层次、多环节方面直接地或间接地影响血管新生，具有重要的临床意义和应用前景，以血管生成理论为研究背景，为今后阐述中药的作用机制，发展中医药理论新的方向，发现新的药物作用靶点提供重要的科学依据。图1:298-J--D-G-R的反相Resource柱色谱2:298-J-D-G-R2-A、298-J_D-G-R2-B(化合物A、化合物B)的反相C^液相色谱3:合欢皮的有效组份、化合物A、化合物B的分离纯化图框架图图4:化合物A的液相色谱图图5:化合物B的液相色谱图图6:298-J-D-G的质谱图图7:298-J--D-G-R的质谱8:化合物B对人血管内皮细胞迁移能力的抑制作用图图9:化合物B对体内Matrigeltube法血管的抑制作用10:化合物B抑制鸡胚尿囊膜血管生成图(CAM实验)图lh化合物A的质谱12:化合物A的碳谱13:化合物A的氢谱14:化合物A的红外谱15:化合物B的质谱16:化合物B的碳谱17:化合物B的氢谱18-化合物B的红外谱图具体实施方式合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份为皂甙类化合物。所述皂甙类化合物其中含有化合物A和/或化合物B，所述化合物A的分子结构的特征为(I)其中R1:CH3R2:NHACOHC-6:R化合物A的分子式为C鹏H服049N，分子量为2211，熔点为202~204°C，化学名为3-0-[|3-0-吡喃木糖基-(1—2)-(3-0-吡喃呋糖基-(1—6)-卩-0-2-去氧-2-乙酰B安基葡萄糖基]-21-o-{(6s)-2-反式-24圣甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式誦2,6-二甲基-6-o-P-D-吡喃鸡纳糖基-2，7-辛二烯酸基)-(3-D-吡喃鸡纳糖基]國2，7-辛二烯酸基)-金合欢酸-28-o-(3-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-(3。-吡喃葡萄糖基酯；所述化合物B的分子结构的特征为(II)其中R1:CH3R2:OHC-6:S化合物B的分子式为(^凡62049，分子量为2170，熔点为204206°C;化学名3-o-[P-D-吡喃木糖基-(1—2)-D-吡喃呋糖基-(1—6)-D-吡喃葡萄糖基]-2l-o-{(6s)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-(e-D-败喃鸡纳糖基)-2，7-辛二烯酸基)-P-D-吡喃鸡纳糖基]-2，7-辛二烯酸基}-金合欢酸-28-0-D-吡喃葡萄-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)D-吡喃葡萄糖基酯。合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，所述皂甙类化合物有抗肿瘤血管生成及其它与血管生成有关疾病治疗、预防的用途；或在抑制血管生成的药物中使用；或者用作常规药用载体和/或赋形剂；或者在制备抑制血管生成的保健食品中的应用；或者在制备抑制血管生成的化妆品中的应用。在制成所述抑制血管生成药物时，可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等；在制成所述抑制血管生成药物时，可以按常规的制剂工艺，单独使用或与其它药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，例如注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等多种形式；制成的所述抑制血管生成药物用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤疮；制成的所述抑制血管生成药物用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。下面将结合具体实施例及实验，对本发明作进一步说明，文中所述有效部位为包含有皂甙类化合物的混合物，有效单体为化合物A或化合物B。实施例1:合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制备方法1.1将lkg合欢皮分别用IOL、8L759&乙醇(水或不同浓度的甲醇或丙酮溶液)100'C回流提取两次，每次2小时，过滤，去渣。合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏，此有效部位编号为298-J。将所得浸膏298-J经D101型大孔树脂吸附，再用水，30%乙醇，80%乙醇，各洗脱3个柱体积，收集各相，回收80%乙醇相得浸膏，此有效部位编号为298-J-D。将所得298-J-D用100~200目的硅胶常压分离，用体积比氯仿甲醇水为9丄0,16.5:3.5:1梯度洗脱，等体积收集，将第33~44瓶合并，回收溶剂得浸膏，此有效部位编号298-J-D-G。将所得298-J-D-G用反相苯乙烯柱中压分离，用30%~50%乙腈梯度洗脱，按体积收集(70ml150ml，150ml300ml，300ml600ml)如图1所示，回收各相溶剂得浸膏，此有效部位分别编号为298-J-D-G-Rl，298-J-D-G-R2，298-J-D-G-R3。将所得298-J-D-G-R2用反相C18色谱柱中压分离，用70%的甲醇水溶液洗脱，结果见图2，按色谱单峰收集，回收溶剂，冷冻干燥得有效单体298-J-D-G-R2-A(化合物A)，298-J-D-G-R2-B(化合物B)。总的分离纯化路线见图3。1.2化合物A与化合物B的HPLC分析将所得白色粉末298-J-D-G-R2-A，298-J-D-G-R2-B经HPLCAgilent1100分析采用XDBC-18柱(4.6mmX150mm,填料cj)5um)，流动相采用65%甲醇(V/V,甲醇水=65:35)。柱温25。C,215nm检测，进样量5uL。AgilentChemstation软件采集、分析数据。298-J-D-G-R2-A的含量为90%298-J-D-G-R2-B的含量为92.50%。298-J-D-G-R2-A的液相分析结果见图4，298-J-D-G-R2-B液相分析结果见图5。1.3:合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份理化鉴定所述有效组份298-J,298-J-D,298-J-D-Q298-J-D-G-R1，298-J-D-G-R2，298-J-D-G-R3的Molish反应呈紫红色，Libermann-Buchard反应呈紫红色，三氯化锑显色为红色。有效组份298-J-D-G的MALDI-TOF-MS显示准分子离子峰m/z在800-2400。这与有关合欢的文献报道的皂甙类成分的分子量相一致，结果见图6;以上结果说明这有效组份均含有至少一种以上皂甙类化合物；有效组份298-J-D-G-R2的MALDI-T0F-MS显示准分子离子峰m/z如图7所示。有效组份298-J-D-G-R2进行反相C18色谱柱洗脱分离后得化合物A/化合物B，化合物A/化合物B，Molish反应呈紫红色，Libermann-Buchard反应呈紫红色，三氯化锑显色为红色。1.4:合欢皮中提取的有效组份的活性鉴定1.4.1有效组份对人微血管内皮细胞增殖的抑制作用将人微血管内皮细胞(HMEC-1，法国国家卫生医学研究所惠赠)置于含lmmol谷氨酰胺，Wg/mL氢化可的松，10ng/mL表皮生长因子(EGF)和15%小牛血清的MCDB-131培养液中培养(37°C、5%C02、95%湿度)。取对数生长期细胞，以1(fcell/mL细胞接种于96孔板，100叱/孔，每组设4个平行孔，放置于37。C、5%湿化0)2的培养箱过夜。加不同浓度以上提取分离的298-J(l~100ng/mL)，298-J-D(150jug/mL),298-J國D誦G(110pg/mL),298-J-D國G-Rl(卜10pg/mL)，298曙J画D-G-R2(卜10jig/mL)，298-J-D華G-R3(l~10pg/mL)，298-J-D-G-R2-A(化合物A)(0.050.5|ig/mL)，298-J-D-G-R2-B(化合物B)(l5)ig/mL)，水为阴性对照，培养72小时后，去掉上清液，每孔轻轻地加入10%三氯醋酸IOO叱固定，静置5min后移到4。C放置lh后倒掉固定液，用去离子水洗5次，空气干燥。每孔加入0.4。/o磺酰罗丹明B(SRB)IOO叱37。C培养箱放置30min，用1%醋酸液洗5次，空气干燥。加100叱10MmTris碱液(pH10.5)溶解，自动分光光度仪在515nm波长处测定每个小孔的吸光度值(A)。上述实验重复3次。抑制率(％)计算如下对照组A值一药物组A值抑制率(％)=-Xioo%对照组A值一空白组A值根据所得的结果计算其半数抑制量(IC5Q)，结果表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>以上结果说明随着提取分离的步骤的推进，我们所得的有效部位的ICs。值也在降低，也就表明有效部位的纯度得到逐步提高。1.4.2对人血管内皮细胞迁移能力的抑制作用。取对数生长期细胞，以105cell/mL细胞接种于24孔板，lmL/孔，每组设4个平行孔，细胞贴壁后，沿孔中线划去细胞，培养基洗涤，去除死细胞，分别加水阴性对照组和298-J(30.0^ig/mL)，298-J-D(10.0ng/mL)，298-J-D-G(2.8pg/mL)，298國J-D-G-Rl(1.8ng/mL)，298-J-D-G-R2(1.5|ig/mL)，298國J-D-G-R3(1.5ng/mL)，298-J曙D-G-R2-A(0.2pg/mL)，298曙J-D-G-R2誦B(1.2|ig/mL)，分别在0h，6h,12h,24h,拍照，量取中间空白带的宽度，记录。阴性对照组细胞的空白带的宽度较小，说明细胞迁移数量较高，而加入药物加以干预后，细胞迁移数明显减少。化合物B结果见图8所示，其它6个有效部位的结果与和化合物A/B相似，数据未给出。以上结果说明有效部位、有效单体均有抑制内皮细胞迁移的作用。他们可能通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制新生血管的生成。1.4.3体外Matrigeltube法血管抑制试验。体外小管形成试验参照文献[17、ThaloorD，SinghAK，SidhuGS，"a丄Inhibitionofangiogenicdifferenti-ationofhumanumbilicalveinendothelialcellsbycurcumin[J].6W脸o时/釘《1998，9:305_312.]的方法进行。于4。C下在96孔培养板的底部，加入50yL生长减少型Matrigel,铺平后于37。C孵育4h。分别将不同浓度的298-Kl~100pg/mL)，298-J-D(l~50ng/mL)，298-J-D-G(l~10pg/mL)，298-J-D-G-Rl(l~10ng/mL)，298-J-D-G-R2(l~10|ig/mL)，298-J-D-G-R3(卜10pg/mL)，298-J画D-G画R2國A(0.050.5吗/mL)，298-J-D-G-R2-B(l~5pg/mL)，与含150mL/L小牛血清的MCDB-131培养液和HMEC-1(4X104细胞/孔，每孔体积为0.25mL)混匀后加入到培养板中，以培养基为阴性对照，于37'C、50mL/LC02条件下培养24h后，在倒置显微镜下，观察以上各样品对内皮细胞体外血管样形成的影响。结果显示以上各样品对HMEC-1体外Matrigel小管的形成均有明显的抑制作用。以化合物B为例，当浓度为lyg/ml时，对HMEC-l小管形成即有影响，小管的数目减少；浓度为2yg/ml时，HMEC-1贴壁后几乎无移动，基本无小管形成；在3"g/ml浓度下，细胞贴壁困难。化合物B的浓度为1yg/ml、1.5Ug/ml、2ug/ml和3yg/ml时，4个实验组形成管腔的面积与对照组相比较有明显差异(结果见图9所示)其它样品的结果与化合物A/3相似，未给出。以上结果说明有效部位、有效单体有着明显的体外抑制血管生成作用。1.4.4合欢属植物提取物抑制鸡胚尿囊膜血管生成(CAM实验)白皮种蛋，参考张树成的方法18、张树成，吴志奎，王蕾，等.研究中药血管生成活性和作用的鸡胚绒毛尿囊膜试验模型的应用.中国中医基础医学杂志，1999，5:16-19.制备鸡胚尿囊膜。用打孔器制备直径为6mm的微孔滤膜圆片，湿热高压消毒。设298-J组，298-J-D组，298-J-D-G组，298-J--D-G-R1组，298-J-D-G-R2组，298-J-D-G-R3组，298-J_D-G-R2-A组，298-J-D-G-R2-B组及生理盐水阴性对照组。将药物滴于滤纸上，制成药膜，吹干备用。鸡胚培养3d后分组，将药膜贴于CAM的部位。加药48h后，观察药膜周围的血管数，并摄影记录。化合物B的结果见图10。生理盐水阴性对照组CAM血管生成非常明显，整体呈鲜红色，血管在药膜下呈放射状生长，血管粗大，血液充盈，血管分支较多，毛细血管密度大。化合物B给药组则明显抑制了血管生成，放射状生长的血管数目大为减少，血管主要以零星、杂乱、叶脉样等表现形式存在，血管细小，稀疏，血管分支少，血管色淡浅黄，在药膜片下及周围局部鲜有血管区，或者血管断裂或消失。其它样品的结果与化合物A/B相似，数据未给出。以上结果说明有效部位、有效单体有着明显的体内抑制血管生成作用。1.4.5:合欢皮有效单体(化合物A，化合物B)的分子结构鉴定。1.4.5.1化合物A为白色粉末，易溶于水，熔点为204~204°C，Molish反应呈紫红色，Libermann-Buchard反应呈紫红色，三氯化锑显色为红色说明化合物A为皂甙类化合物。其MALDI-TOF-MS显示准分子离子峰m/z2236[M+Na+2]+。结果见图11"H-NMR(500Hz，C3D60，Sppm)显示有7个甲基单峰质子信号0.93，1.02，1.02，1.08，1.15，1.18,1.88,l个宽单峰烯氢质子信号5.58,3个相对低场的含氧碳上质子信号3.56，5.21和6.31，2个烯碳信号143.5，123.0，和1个酯羰基碳信号174.6，根据生源关系以及碳氢数据确定化合物A的甙元为齐墩果酸型三萜皂甙元，比较其碳谱数据与文献报道的julibrosideIII(19.Tsuyoshilkeda，SatokoFujiwara，KaoruAraki，etal.CytotoxicglycosidesfromAlbiziajulibrissin[J].J.Nat.Prod，1997，60(2):102)中苷元金合欢酸的碳谱数据,完全一致结果见表2。表2甙元金合欢酸的"C丽R数据(py-ds)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>有9个糖基质子信号4.934.87(lH,d,J=8.0Hz,glcH-l),5.02(lH,d，J=8.5Hz，fUcH-l)，5.06(lH,d，J=6.5Hz，xylH-l，6.03(lH,d,J=8.0Hz，glc，H-l)，5.88(1H，brs,rhaH画l)，6.28(1H，s,arafH-l)，5.37(lH,d,J=8.5Hz,glc，H-l)，4.82(lH，d,J=6.5Hz，quiH誦l)，4.83(lH,d，J=7.5Hz,qui，H-l)，4个去氧糖上甲基质子双峰信号1.76(3H，d，J=5.5Hz,rha6-C，1.58(3H,d，J=5.0Hz,qui，6-CH3)，l,34(3H，d,J=6.0Hz，qui6-CH3)，1.46(3H，d，J=6.0Hz,fiic6-CH3);1H-NMR13C-NMR(500Hz,C3D6O，S卯m):中有9个糖端基碳信号595.6，99.2，99.4，101.8，103.2,104.5，105.6，106.7和111.0和4个去氧糖上甲基碳信号17.3，18.6，18.8和18.9。化合物A氢谱显示一典型的乙酰甲基质子信号8.49(lH，d，J二8.5Hz);碳谱有氨基碳信号S58.1以及1个乙基羰基碳信号S170.1。说明化合物A分子中有9个单糖，其中4个是6-去氧单糖，l个为氨基糖。除rha和araf糖为a-构型外，其他糖均为e构型，与文献化合物JulibrosideIII(Jin)糖部分碳谱数据对照，完全一致，说明化合物A与JulibrosideIII糖的取代种类，数目以及联接方式一样。结果见表3表3化合物A糖部分的13CNMR和^NMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>除苷元和糖信号外，碳谱多出20个碳信号，分析其氢谱及碳谱信号特征，推测其可能含有两个单萜结构。化合物A碳谱中有S145.4，133.6的烯碳和56.2羟甲基信号，说明内侧的单萜9位是羟甲基取代，氢谱中7.0附近能见到两组三重锋7.09，7.03，碳谱在40.8和38.7各有一个5位碳信号，说明外侧的MT'中C-6是R构型。比较其氢谱及碳谱与文献报道Julibrosideni(jni)的化合物的单萜部分数据完全一致。结果见表4。化合物A的13C-NMR见图12，iH-NMR见图13。表4.单萜酸(MT)的"C匿<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>IR(KBr)cm-l:3413，2928，1692，1631,1384,1071，结果见图14。综上所述，鉴定化合物A为3-0-[卩-0-吡喃木糖基-(1—2)-卩-D-吡喃呋糖基_6)+0-2-去氧-2-乙酰胺基葡萄糖基]-21-0-{(63)-2-反式-2-羟甲基-6曙甲基—6-0-[4-0-((611)-2-反式-2，6-二甲基-6-0-卩-D-吡喃鸡纳糖基-2，7-辛二烯酸基)-P-D-吡喃鸡纳糖基]-2，7-辛二烯酸基卜金合欢酸-28-o-P-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)--a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-p-D-吡喃葡萄糖基酯即(3画o画(3-D-xylopyranosyl隱(1—2)-卩-D國fUcopyranosyl-(1—6)-(3-D-2-deoxy-2-acetamidogluco-pyranosyl]-21-o-{(6s)-2trans-2-hydroxymethyl-6-methyl-6-o-[4-o-((6R)-2-trans-2，6-dimethyl-6-o-P-D-quinovopyranosyl)-2,7-octadienoyl)-|3-D-quinovopyranosyl]-2,7-oGtadienoyl}-acadcaGid-28-o-P一D曙glucopyranosyl一(1—3)一[a-L-arabinofUranosyl-(l—4)〗-a-L-rhamnopyranosyl-(l—2)画卩-D-glucopyranosyl6ster1.5.2化合物B为白色粉末，易溶于水，熔点为204206匸Molish反应呈紫红色，Libermann-Buchard反应呈紫红色。MALDI—T0F—MS显示准分子离子峰m/z2196[M+Na+2]+。结果见图15'H-NMR(500Hz，C3D60,5ppm)显示9个甲基质子单峰信0.96，1.03，1.05，1.10，1.16,1.31和1.88:碳谱显示2个烯碳信号143.7，123.4,和一个酯碳基信号174.6，根据生源关系以及碳氢数据确定化合物B的甙元为齐墩果烷型三萜皂甙元，比较其碳谱数据与文献报到的JulibrosideII(JII)(20.Tsuyoshilkeda，SatokoFujiwara，KaoruAraki,etal.CytotoxicglycosidesfromAlbiziajulibRissi[J].J.Nat.Prod,1997，60(2):102)中式元金合欢酸的碳谱数据(见表5)，完全一致。表5甙元的。C丽R数据(py-d5)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>有九个糖的端基质子信4.87(lH，d,J二7.0Hz,quiH-l)4.82(lH，d,^8.0Hz:qui，H-l),4.96(lH，d，J=8.0Hz,glcH-l),5.01(lH,d,J=7.5Hz，fucH-l)5.09(lH,d，J=7.0Hz,xylH-l)5.34(lH,d，J=8.0Hz,glcH，-l)，5.90(lH,brs,rhaH,-l),6.07(lH，d,J=8.0Hz，glc'H-l)，6.26(lH,brs，arafH-l)，4个6-去氧糖甲基质子双峰信号1.34(3H，d,J=6.0Hz，qui6-CH3)1.58(3H,d，J=5.0Hz，qui，6-CH3)1.48(3H,d，J=6.0Hz,6-CH3),1.75(3H，d,J=6.0Hz,6-CH3)。13C-NMR(500Hz,C3D6O，S卯m):中观察到9个糖端基碳信号95.5，99.0，99.4，101.4，103.2，105.4，106.5，106.5，107.0和110.7，4个去氧糖上甲基碳信号17.2，18.7，18.89和18.9。说明分子中有9个单糖，其中4个是6-去氧糖，将化合物B糖部分碳谱数据与文献报到的皂甙JulibrosideII(JII)糖部分的碳谱数据(表6)进行比较，完全一致。表6化合物B糖部分的"CNMRHNMR数据(py-ds)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>除苷元和糖信号外，碳谱也多出20个碳信号，分析其氢谱及碳谱信号特征，推测其可能含有两个单萜结构。化合物B碳谱中有3144.8，133.5的烯碳和56.06羟甲基信号，说明内侧的单萜9位是羟甲基取代，氢谱中7.0附近能见到两组三重锋7.09，7.03，碳谱在40.8和40.8各有一个5位碳信号，说明外侧的MT'中C-6是S构型。比较其氢谱及碳谱与文献报道Julibrosidein(JIII)的化合物的单萜部分数据完全一致。结果见表7，化合物B的13C-NMR图见图16，'H-NMR图的结果见图17。表7.单路酸(MT和MTT)的"C醒R、'HNMR<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>IR(KBr)cm-l:3413，2926，1694，1644,1374，1076结果见图18综上所述鉴定化合物B为化学名3-o-[e-D-吡喃木糖基-(1—2)-3-D-吡喃呋糖基-(1—6)-日-D-吡喃葡萄糖基]-21-0-{(6s)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-(e-D-吡喃鸡纳糖基)-2，7-辛二烯酸基)-P_D-吡喃鸡纳糖基]-2，7-辛二烯酸基}-金合欢酸-28-o-D-吡喃葡萄-(1—3)-[(i-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酉旨艮卩3-o-[P-D-xylopyranosyl-(l—2)-(3-D-fucopyranosyl-(l—6)-p-D-gluCopyranosyl]—21陽o-{(6s)_2-trans-2-hydroxymethyl—6-methyl—6-0—[4-o—((6R)-2-trans—2，G-dimethyl画6-o-卩-D-quinovopyranosyl)画2,7-octadienoyl)陽j3-D-quinovopyranosyl]-2,7-oGtadienoyl}-acacicaGid-28國o-卩-D-glucopyranosyl-(1—3)—[a-L-arabinofuranosy1-(l—4)]-a-L-rhamnopyranosyI-(l—2)-(3-D-glucopyranosylester。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式都同样落于本发明的权利要求书所限定的范围。权利要求1、合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份为皂甙类化合物。2、根据权利要求l所述合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份，其特征是所述皂甙类化合物其中含有化合物A和/或化合物B,所述化合物A的分子结构的特征为-(I)其中R1:CH3R2:NHACR3:OHC画6:R化合物A的分子式为C1()4H165049N，分子量为2211，熔点为202~204°C,化学名为3-o-[p-D-吡喃木糖基-(1—2)-P-D-吡喃呋糖基-(1—6)-(3-0-2-去氧-2-乙酰胺基葡萄糖基]-21-o-K6s)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2,6-二甲基-6-0-(3-D-吡喃鸡纳糖基-2，7-辛二烯酸基)-卩-D-吡喃鸡纳糖基]-2，7-辛二烯酸基)-金合欢酸-28-o-P-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酯所述化合物B的分子结构的特征为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)其中R1:CH3R2:OHC-6:S化合物B的分子式为C1()2H162049，分子量为2170，熔点为204~206°C;化学名3-o-[e-D-吡喃木糖基-(1—2)-P-D-吡喃呋糖基-(1—6)-3-D-吡喃葡萄糖基]-21-0-{(6s)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2,6-二甲基-6_0-(e-D-吡喃鸡纳糖基)-2，7-辛二烯酸基)-e_D-吡喃鸡纳糖基]-2,7-辛二烯酸基}-金合欢酸-28-o-P-D-吡喃葡萄-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酯。3、合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制备方法，其特征在于用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取合欢皮的干燥树皮、茎皮、叶、花、种子、豆荚或根，并将提取液过滤、浓縮成浸膏；所得的浸膏采用D-101型大孔树脂洗脱分离，收集有效组份进行硅胶层析柱洗脱分离，再收集有效组份进行反相苯乙烯色谱柱分离，得有效组份，回收溶剂成浸膏，冷冻干燥制成干粉。4、根据权利要求3所述合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制备方法，其特征在于将所述反相苯乙烯色谱柱分离得有效组份进行反相C18色谱柱洗脱分离后得皂甙类化合物A和皂甙类化合物B。5、合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，其特征是所述皂甙类化合物有抗肿瘤血管生成及其它与血管生成有关疾病治疗、预防的用途；或在抑制血管生成的药物中使用；或者用作常规药用载体和/或赋形剂；或者在制备抑制血管生成的保健食品中的应用；或者在制备抑制血管生成的化妆品中的应用。6、根据权利要求5所述合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，其特征是在制成所述抑制血管生成药物时，可以加入一种或多种药学上可接受的载体。7、根据权利要求6所述合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，其特征是:所述载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。8、根据权利要求6所述合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，其特征是:在制成所述抑制血管生成药物时，可以按常规的制剂工艺，单独使用或与其它药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，例如注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏齐U、霜剂或乳剂等多种形式。9、根据权利要求6所述合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，其特征是:制成的所述抑制血管生成药物用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤疮。10、根据权利要求4所述合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的应用，其特征是:制成的所述抑制血管生成药物用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。全文摘要本发明涉及合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成份。所述活性成份为皂甙类化合物。其有抗肿瘤血管生成及其它与血管生成有关疾病治疗、预防的用途；其可以在抑制血管生成的药物中使用；或者用作常规药用载体和/或赋形剂；或者在制备抑制血管生成的保健食品中的应用；或者在制备抑制血管生成的化妆品中的应用，为此，本发明还提供了所述活性成份的制备方法，用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取合欢皮的干燥树皮、茎皮、叶、花、种子、豆荚或根，并将提取液过滤、浓缩成浸膏；所得的浸膏采用D-101型大孔树脂洗脱分离，收集有效组份进行硅胶层析柱洗脱分离，再收集有效组份进行反相苯乙烯色谱柱分离，得有效组份，回收溶剂成浸膏，冷冻干燥制成干粉。文档编号A61K36/48GK101239093SQ20081002049公开日2008年8月13日申请日期2008年3月10日优先权日2008年3月10日发明者磊冯,张莲芬,红李,慧花,坚金,核陆申请人:江南大学