专利名称：仙人掌果及仙人掌果多糖在制备药物或保健品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及仙人掌果及仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、降血糖、 抗肿瘤作用的药物或保健品中的应用，属于天然植物资源的利用技术领 域。
(二)
背景技术：
广西北海涠洲岛是我国最大的死火山岛，岛上的熔岩给仙人掌生长提 供了充足的养分，加之适宜的热带气候，形成了成片野生的仙人掌。而且 岛上的仙人掌四季都可以结出数量可观的仙人掌果。涠洲岛产仙人掌果具 有特有的胭脂红色，其中富含矿物质(如硒)和硫磺酸。但迄今为止，涠 洲岛盛产的仙人掌果除了极少量被当地居民或旅游者食用外，绝大部分都 枯烂在地里，或被鸟、蛇等作为了腹中之餐，造成了资源的极大浪费，严 重影响了仙人掌果的充分开发利用。
中草药及其活性成分的药用功能具有多靶点、多途径、多环节的特点， 成为现代药物开发的热点，因此近年来天然植物在疾病预防和治疗方面的 作用引起人们的广泛关注和重视。仙人掌作为一种天然植物，具有良好的 观赏价值、食用价值、保健价值和药用价值，并且药源丰富，无毒无异味， 开发产品安全方便。近年来，动物实验及人体试验证明，仙人掌具有提高 机体免疫力、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗菌、消炎等药理作用。仙人掌 果(0puntia ficus-indica )为仙人掌属(Opuntia)植物的果实，果肉含有
丰富的微量元素、蛋白质、氨基酸、维生素、多糖类、黄酮类和果胶等。 印第安人和墨西哥人将其作为食物和药物使用已有几千年的历史。国内外 对仙人掌根茎具有降血脂和降血糖等作用均有报道，但仙人掌果是否也具 有降血脂和降血糖等活性未见报道。鉴于仙人掌果资源充足，广西北海涠
洲岛产仙人掌果颜色鲜艳，口感甘甜，维生素和多糖的含量高，因此本申 请人对仙人掌果以及从其中分离出的有效部位仙人掌果多糖进行了相关 的药理试验研究和探索。
(三)
发明内容
本发明所要解决的技术问题是根据仙人掌果所含的成分，将仙人掌 果及从其中提取分离出的仙人掌果多糖用于制备降血压、降血脂、降血糖、 抗肿瘤作用的药物或保健品中。
本发明是这样构成的仙人掌果(0puntia ficus-indica )在制备降 血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品中的应用。
仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或
保健品中的应用。
所述仙人掌果多糖是从仙人掌果中提取出来的多糖类成分，其总糖含
量为70% 80%。
具体的仙人掌果多糖的制备方法为取仙人掌果，加4 10倍重量的 水超声提取0.5 2.5小时，提取液浓縮，加入40 95%的乙醇，调节浓縮 液的乙醇浓度至40 90%进行沉淀，然后在1000 10000rpm转速下离心 2 10min，离心沉淀物加水溶解，用体积比为1 5 : 2 10的无水乙醇和 乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水层用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，浓 縮，干燥，即得。
其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具体过程为用Sevage溶液(体积比 氯仿正丁醇=4 10 : 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水层液，调pH至5 7，向水溶液中加入1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65。C保温20 28h， 1000 10000rpm离心2 10min，去除底层沉淀，得仙人掌果多糖脱蛋白 液。
具体的说，仙人掌果、仙人掌果多糖的应用方法为取仙人掌果或仙 人掌果多糖，加入或不加药用辅料，按照常规方法制备成药物制剂。
或者将仙人掌果或仙人掌果多糖与其它药用成分组合，并加入或不加 药用辅料，按照常规方法制备成药物制剂。
还可以取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加辅料，按照常规方法 制备成保健品。
或者将仙人掌果或仙人掌果多糖与其它物质组合，加入或不加辅料， 按照常规方法制备成保健品。
为了验证本发明的效果，下面将通过仙人掌果多糖的制备及对仙人掌 果原汁和仙人掌果多糖进行的药效试验研究来进一步阐述本发明。
一、 仙人掌果多糖的提取纯化
取仙人掌果，加4 10倍重量的水超声提取0.5 2.5小时，提取液 浓縮，加入40 95%的乙醇，调节浓縮液的乙醇浓度至40 90%进行沉淀， 然后在1000 10000rpm转速下离心2 10min，离心沉淀物加水溶解，用 体积比为1 5 : 2 10的无水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水层 用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，浓縮，干燥，即得仙人掌果多糖。
Sevage+木瓜蛋白酶法:用Sevage溶液(体积比氯仿正丁醇=4 10 : 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水层液，调pH至5 7，向水溶液中加入 1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65。C保温20 28h, 1000 10000rpm离 心2 10min,去除底层沉淀，得仙人掌果多糖脱蛋白液。
经测定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量达60 80%。
二、 仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血压作用的试验研究
1.仙人掌果及仙人掌果多糖单次及连续9周给药对原发性高血压大鼠 (SHR)的收縮压和心率(HR)影响1. 1实验动物
选择16周(w)龄雄性SHR60只，收縮压(SBP)》23. 94kPa (lkPa=7. 5mmHg)，体重(250土50)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司 提供，合格证号SCXK(沪)2003-0003;同龄雄性Wistar大鼠，由广西医 科大学实验动物中心提供，合格证号桂动许字2000第001号。饲养在 配备空调的动物房内，室温(25士2)。C，自由饮水。
1.2实验方法
1. 2. 1分组及给药
实验前驯化并行适应性测压训练2w，待适应环境，随机分为6组即 模型组(NC):给蒸馏水;CPFP高剂量组(HD)、中剂量组(MD)、低剂量组(LD): 分别给3. 06g kg-1 d—、 1. 58g kg-1 cT1， 0. 79g kgM d—1的CPFP;仙 人掌果原汁组(NJ):给3.15g，kg—"d—M山人掌果原汁(CPNJ);卡托普利 组(PC):给0.01g'kg—、d—i卡托普利；正常对照组(Wt): Wistar大鼠给 蒸馏水。每组10只，给药途径为灌胃。
1.2.2测压方法
用小型电吹风机对准大鼠尾巴腹侧烘热，待大鼠尾巴皮肤变为微红 时，将血压计的压脉套套至大鼠尾部近心端处，高敏换能器置于尾巴中上 1/3处，换能器表面对准尾部腹侧，固定，松紧以换能器用手推不动为好。 待大鼠平静之后，打开记录系统，可见有脉搏波出现，用充气囊使压脉套 内的压力升高到脉搏波完全消失再加压升高3. 99kPa，然后通过充气囊阀 门缓慢放气逐渐降低压脉套内压力，从开始放气到管道内压力为零一般维 持时间5 6秒。仔细观察脉搏波从被阻断到再次出现第一个波，这第一 个波出现时所对应的压力即为SBP。取连续3次测压值的平均值作为应测 SBP值，分别测定第一次用药前、用药后2小时(h)、 4h、 6h、 8h、 12h、 24h及连续给药9w期间每周S服的SBP和服。然后再根据脉搏波间接推 算出HR。
1. 2. 3统计学处理应用SPSS11. 0软件进行统计学处理，计量资料均 采用f士s表示，两组间计量资料比较采用t检验，多组均数比较采用方 差分析。
1.3实验结果
1. 3.1单次给药对SHR的SBP和服影响
单次给予CPFP后2h即有明显的降压效应，4h降压效应达到高峰。4h 时HD与治疗前相比有显著性差异(尸<0. 05) ，MD和LD降压效应较HD稍弱， 与治疗前比较均无显著性差异(尸".05)。 PC给予卡托普利后，2h血压下 降达到高峰，与NC和治疗前比较有显著性差异(尸<0.05)，降压幅度最大 值为0.80土8.03kPa,优于HD降压幅度最大值(O. 68±8. 02kPa)。从降压 疗效维持的时间来看，PC给药8h后SBP恢复到治疗前水平，CPFP各给药 组给药12h后恢复到治疗前水平，其降压稳定性优于PC;从降压幅度来看CPFP降压呈现明显的量效和时效关系。上述各组给药后24h内HR无明显 变化(/^X). 05)。
1. 3. 2连续9w给药对SHR的SBP和HR影响
各给药组在用药2w后SBP下降幅度开始明显，至8w SBP降幅减缓， 基本稳定在一个较低的水平。PC、 HD和MD分别在4w、 5w和6w开始与治 疗前相比有非常显著性意义(尸<0.01)， LD和NJ自身前后比较也有差异 (尸<0.05)。 NC在实验期间血压趋于升高，9w后SBP平均升高了 1.00kPa， 与治疗前相比有非常显著性差异(/M).01)。组间对比PC、 HD、 MD、 LD和 NJ分别在3w、 4w、 5w、 6w和5w降压效果均显著优于NC(/M).01)，其降 压的最大均值分别为2. 16±0. 18、 1.59±1.44、 1.42±0.16、 0.87±0.18 和0.82士0. 19kPa，从降压幅度来看PC的降压疗效优于CPFP给药组，但 它们之间无显著性差异(尸X).05)。另外，从降压幅度来看CPFP连续给药 9w降压也呈现明显的量效和时效关系。用药各组对HR的影响较小，用药 前后经统计学处理无显著性差异(/lX). 05)。
2. 仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(S服)血浆肾素(RA) 和血管紧张素II (AngII)的影响
2. l实验动物同实验l。 2. 2实验方法
2.2.1分组及给药同实验l，给药时间为9w。 2. 2. 2实验步骤
连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—1)，自腹主动脉取血各2ml分别置于预冷的含乙二胺四乙 酸(EDTA) 、 二巯基丙醇和8-羟基喹啉试管中，混匀，4°C， 3000转/分(rpm) 离心10min,分离血浆，-20。C密封保存待测。
血浆RA活性的测定，即测定血浆中血管紧张素I (AngI)产生的速 率。取双份血浆， 一份让其直接与抗体反应，测其Angl的浓度，作为对 照管；另一份在37匸温育30min后再让其与抗体反应，测其Angl的浓度 为测定管。测定管AngI的浓度减去对照管Angl的浓度并除以温育时间， 则为单位时间内Angl的产生速度，称RA活性。
AngII水平的测定操作步骤严格按照分析药盒使用说明书进行，待加 样操作结束后混匀，室温放置15min， 3500rpm离心15 min，吸上清液测 定各管沉淀的放射性计数(cpm)，并由r计数器预先编制的程序直接给出 有关参数、标准曲线和样品浓度。
2.2.3统计学处理同实验l。
2 3实验结果
HD和PC有降低血浆肾素活性的作用，与NC相比均有显著性差异 (尸<0. 05)，但HD与PC之间无显著性差异(PX). 05)。在降低血浆AngII方 面，PC最强，HD次之，与NC比较均有非常显著性差异(尸<0.01)，但HD 与PC之间相比无统计学意义(/DO. 05); LD和NJ相对较差，与NC比无显 著性差异(/^X). 05 )。从而提示HD有类似于血管紧张素转换酶抑制剂的作 用机制。
3.仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)血浆内皮素 (ET)和一氧化氮(N0)的影响 3. l实验动物同实验l。 3. 2实验方法
3.2. l分组及给药同实验l，给药时间为9w。 3. 2. 2实验步骤
连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—1)，自腹主动脉各取血2ml置于含10%EDTA30 P 1试管中， 混匀。4-C放置约2h后，3000rpm离心10min分离血浆，-20。C密封保存待 测。测试前复融，按照ET、 NO分析药盒说明书进行严格操作。
3.2.3统计学处理同实验l。
3. 3实验结果
与NC相比较，HD和MD有明显降低SHR血浆ET的作用(尸<0. 05)，但 与PC相比无显著性差异(/^X). 05); PC、HD和MD能显著增加NO含量(P<T. 01 或尸<0. 05)，但与PC相比均无显著性差异(尸;O. 05)。4. 仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)血浆NA和肾 上腺素(Adr)的影响
4. l实验动物同实验l。 4. 2实验方法
4.2. l分组及给药同实验l，给药时间为9w。 4. 2. 2色谱条件
色谱柱为U色谱柱(250iranX4.0mm， 5um);柱温为室温；流动相为 甲醇-O. 15mol 1^磷酸二氢钾缓冲液(1:9， pH6. 0);流速为lml min、 检测波长为280mn。此条件下分别以NA和Adr计算理论塔板数不低于3000。
4. 2. 3实验步骤
连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h,以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—1)，自腹主动脉取血1. 5ml置于含肝素试管中，混匀，4°C 条件下2000rpm离心15min，分离血浆；取血浆100ul，加0. 05mol L_1 高氯酸200 y 1, 10000rpm离心2min，倒入Millipore Ultra-free-Mc离 心管，lOOOOrpm离心3min后置-20。C冰箱待测。
4.2.4统计学处理同实验l。
4. 3实验结果
血浆样品的测定取"4.2.3"项处理好的血样超滤液按上述色谱条 件分析，给药9w后HD和PC与NC比较，NA显著降低(尸。.05)。
5. 仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)心脏重量及
其指数的影响
5. l实验动物同实验l。 5. 2实验方法
5.2. l分组及给药同实验l,给药时间为9w。 5. 2. 2实验步骤
连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔 麻醉(5ml kg—》，自腹主动脉取血后，快速取心，置预冷生理盐水中洗净， 剪去残余组织，用滤纸吸干表面水分，分离左右心室并称重，室间隔归左 室。称取左心室重量，计算表示左心室肥厚程度的左室重量指数(左心室 重与体重比)。
5.2.3统计学处理同实验l。
5. 3实验结果
与NC相比，各给药组的左室重量、左室重量/右室重量和心室重量/ 体重有显著性差异(尸<0. 05或尸<0. 01); CPFP纟合药组与PC比较左室重量无 明显差别(/^0. 05)。
6. 仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)主动脉和肾 动脉组织形态学的影响
6. l实验动物同实验l。 6. 2实验方法
6.2. l分组及给药同实验l，给药时间为9w。 6. 2. 2实验步骤
6. 2. 2. 1主动脉HE染色病理形态观察
连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—D ,自腹主动脉取血后，迅速摘取胸主动脉，用福尔马林 固定，石蜡包埋，HE染色。用光学显微镜观察并拍照。
6. 2. 2. 2主动脉和肾动脉bFGF、 Ki-67的免疫组化检测
连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24小时，以20%氨基甲酸乙酯 腹腔麻醉(5ml *kg—》，自腹主动脉取血后，迅速摘取胸主动脉和肾动脉， 福尔马林固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。组织切片经二甲苯脱蜡， 梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。
酸性修复取配置好的柠檬酸缓冲液(pH二6.0士0. 1) 800 1500ml于 压力锅中，电炉加热至沸腾。脱蜡水化后的乡且织切片置于耐高温塑料染色 架上，放入己沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气， 从喷气开始记时，1.5min后压力锅离开热源，冷却至室温。取出玻片，先 用自来水冲洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaC19.0g+Na2HP0y 12H20 6.0g +NaH2P04 2H20 0.4g+蒸馏水1000 ml)冲洗三次，每次间隔3min，除去 PBS液。每张切片加50ul 3%过氧化氢，室温下孵育10min，以阻断内源 性过氧化物酶的活性。PBS冲洗三次，每次间隔3 min，除去PBS液。
每张切片加50u 1的bFGF-2(sc-79)或Ki-67(cloneSP6)兔抗大鼠多 克隆抗体(均按1:50稀释)，在4t:下孵育过夜。PBS冲洗三次，每次间隔 3 min，除去PBS液，每张切片加50u 1即用型二步法(非生物素)PV6001 兔二步法检测试剂盒，室温下孵育15 min。 PBS冲洗三次，每次间隔3 min， 除去PBS液。
DAB显色850ul蒸馏水与DAB试剂中A、 B、 C试剂各50 ti 1混匀， 配制成lmlDAB显色液。每张切片加50ul新鲜配制的DAB溶液，自来水 冲洗，苏木素复染30秒，自来水冲洗，返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥、 中性树胶封固。
结果判定①bFGF染色结果判定参考Mattern方法，从以下两方面 评分阳性染色深度(未见染色为O，轻度染色为l，中度染色为2，深度 染色为3)和阳性细胞的百分比(未见染色记为0，染色细胞〈25%为1， 25-50%为2， 〉50%为3)，将这两方面得分相加。在未知病理诊断的条件下， 在高倍镜下分别观察10个视野后，平均得分、记录。得分0-2分为阴性 表达，超过2分(3-6)为阳性表达，其中3-4分为弱阳性，5-6分为强阳性。
②Ki-67标记指数判定参照文献，以胞核染成均一棕黄色，胞浆及 胞膜不着色为阳性细胞，随机计数5个以上高倍视野1000个细胞，平均 每100个细胞中阳性染色细胞核数为Ki-67指数(Ki-671)。
6.2.3统计学处理同实验l。
6. 3实验结果
6. 3.1对SHR组织病理形态的影响
6. 3. 1. 1组织学检査各组变化不明显。
6. 3. 1. 2光镜下检査
Wt:主动脉大部分接近正常，个别内皮细胞肿胀，中膜未见明显增厚 (6-8层)，外膜结缔组织未见沉积物。NC:主动脉动脉壁厚薄不一，内膜 增生，呈现小的高低起伏状，内皮下间隙可见少量沉积物，内皮细胞不完 整，内膜表面可见红细胞附壁，部分中膜平滑肌细胞增生，管壁中膜明显 增厚(达11-13层)，外膜结缔组织未见沉积物。HD:主动脉内膜轻度增生, 部分增厚，内皮细胞肿胀，部分中膜轻度增厚(8-IO层)，外膜结缔组织未 见沉积物。MD:主动脉内膜轻度增生，可见小的突起。内皮细胞不完整， 部分中膜增厚(10-ll层)，外膜结缔组织未见沉积物。LD:主动脉内膜轻 度增生，呈现小的高低起伏状，内皮下间隙可见少量沉积物，内皮细胞不 完整，内膜表面可见红细胞附壁，部分中膜平滑肌细胞增生，中膜明显增 厚(10-12层)，外膜结缔组织未见沉积物。NJ:主动脉内膜轻度增生，可 见小的突起。内皮细胞不完整，部分中膜增厚(9-ll层)，外膜结缔组织未
见沉积物。PC:主动脉内膜轻度增生，部分增厚，内皮细胞肿胀，部分中
膜轻度增厚(8-10层)，外膜结缔组织未见沉积物。
6. 3. 2对SHR主动脉和肾动脉平滑肌细胞(VSMC)bFGF和Ki-67的影响 6. 3. 2. 1对各组主动脉和肾动脉VSMC bFGF含量的影响 bFGF阳性染色主要弥漫性分布于动脉中膜VSMC胞浆中，在高倍视野 下观察呈颗粒状；细胞核几乎不着色。与NC相比，Wt主动脉和肾动脉VSMC bFGF含量明显降低(ZM). 01 ) ， HD和MD主动脉VSMC bFGF含量显著下降 (尸<0. 01或尸<0. 05) ， HD的肾动脉VSMC bFGF的含量也明显下降(尸<0. 05); 与PC相比，HD、 MD和NJ的VSMC bFGF含量均无明显差异(尸X). 05)。 6. 3. 2. 2对各组主动脉和肾动脉VSMC Ki-67I的影响 Ki-67阳性反应均分布于主动脉中膜VSMC的细胞核中，胞浆无染色。 与NC相比，Wt、 HD和PC的主动脉和肾动脉VSMC Ki-671明显减少(/M). 01 或/M). 05) ， NJ的肾动脉VSMC Ki-671也明显降低(踏05);与PC相比， HD、 MD和NJ的VSMC Ki-671均无明显差异(/^X). 05)。
降压实验研究表明单次给予仙人掌果多糖后2h即有明显的降压效 应，4h降压效应达到高峰，降压幅度最大值为0.68士8.02kPa。 4h时HD 与治疗前相比有显著性差异(尸<0.05)。从降压疗效维持的时间来看，仙人 掌果多糖各给药组给药12h后SBP恢复到治疗前水平。从降压幅度来看仙 人掌果多糖降压呈现明显的量效和时效关系。在连续9w给药过程中，仙 人掌果多糖对SHR显示持续的降压作用，各剂量组之间呈现量效和时效依 赖趋势，其作用特点是平缓、稳定。HD和MD与治疗前和NC相比有显著性 差异(尸<0. 01); LD和NJ与NC相比也有显著性差异(尸<0. 01)，但自身前后 比较不是非常明显，但也有差异(尸。.05) 。 HD、 MD、 LD和NJ降压的最大 均值分别为2.16±0.18、 1.59±1.44、 1.42±0.16、 0.87±0.18和 0.82±0. 19kPa。由此说明仙人掌果多糖具有良好的降血压的作用。
因此，仙人掌果多糖可明显降低SHR的收縮压，并呈明显的时效和 量效关系；能明显降低SHR血浆RA、 AngII 、 ET 、去甲肾上腺素(NE) 和升高NO的含量；保护SHR主动脉内皮细胞，逆转平滑肌细胞增殖， 在某种程度上具有逆转SHR耙器官损害的作用。
三、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血脂作用的试验研究 l.仙人掌果及仙人掌果多糖对高脂血症(HLP)大鼠血脂及肝脏形态 学的影响
1.1实验动物
SD大鼠60只，雄性，体重160土10g，由广西医科大学实验动物中心 提供，合格证号为SCXK桂2003-0003;动物饲料由广西医科大学实验动 物中心生产(标准饲料)。实验期间大鼠自由摄食、饮水、通风和自然采光。
1. 2实验方法
1. 2. 1模型建立及实验分组
取大鼠60只，随机分成为空白组(KB) 10只和高脂造模型组(ZM) 50只。 常规饲养l周(w)后，禁食不禁水12小时(h)，采血，检测基础血脂。参 照文献方法制备高脂词料，即由87. 3%基础饲料、10%猪油、2%胆固醇、0. 5% 猪胆盐、0.2%丙基硫氧嘧啶配制而成。ZM大鼠以高脂饲料喂饲3w后，禁 食(不禁水)12h，采血，检测血脂。与造模前的血脂比较以确定HLP模型 是否建成。HLP模型造成后，将HLP大鼠按血清总胆固醇(TC)水平分为 5组CPFP高剂量组(HD) 、 CPFP低剂量组(LD)、仙人掌果原汁组(NJ)、阳 性对照组(LF)及HLP模型组(HL)，每组10只。 1.2.2给药方法
大鼠造模结束各组分别给予相应药物灌胃。HD和LD分别给3.06 g kg-1 d1口 0. 79g kg—1 cTCPFP， NJ给3. 15 g kg— d'仙人掌果原 汁；LF给3. 0mg kg—1 d—'洛伐他汀，空白组(KB)及HL以10ml kg^生理 盐水灌胃。每日1次，连续3w。各组均自由饮水。
1. 2. 3摄食量和体重
每日同一时间记录进食量，每w同一时间记录各组大鼠体重，以便调 整给药剂量。
1.2.4TC、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度 脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白AI (apoAI)和载脂蛋白B (apoB)的 测定
给药3w，末次给药前禁食12h，给药lh后，取血，装入抗凝或不抗 凝试管中，在4。C下3000转/分(rpm)离心10min，分别取血清或血浆，在 全自动生化分析仪上分别测定TC、 TG、 HDL-C、 LDL-C、 apoAI和apoB的
1.2.5 LDL-C/HDL-C、 TG/HDL-C比值和动脉硬化指数(AI)的计算 根据单项的血脂测定结果(TC、 TG、 HDL-C和LDL-C含量)分别计算血
脂综合指数(LDL-C/HDL-C、 TG/HDL-C比值以及AI)，其中AI根据
Frieldwald公式计算AI= (TC - HDL-C) /HDL-C。 1.2.6肝重和肝脏系数
各组大鼠处死后，迅速摘取肝脏，用预冷生理盐水漂洗再用滤纸吸干 表面水分后，称重。根据肝重计算肝脏系数肝脏系数:肝脏重量(g)/体
重(g)xiooy。。
1. 2. 7肝组织病理学观察
取肝组织，切成4-5mm3小块，10%中性福尔马林固定，梯度乙醇脱水 75%乙醇90min 959&乙醇90min 100y。乙醇90minX3次 100%二甲苯 60minX2次，62。C浸石蜡2hX2次，包埋后切片6ym，贴于普通载玻片 上。经HE染，光学显微镜下观察并拍照。
1. 2. 8统计学处理应用SPSS11. 0软件进行统计学处理，计量资料均 采用3f土s表示，两组间计量资料比较采用^检验，多组均数比较采用方 差分析。
1. 3实验结果
1.3.1造模期间大鼠摄食量和体重变化
造模期间大鼠平均日摄食量和体重均有不同程度的增加。ZM大鼠平均 日摄食量均低于KB，其中第lw有显著性差异(尸。.05)，可能由于初食高 脂饲料不适应有关；第2、 3w均无显著性差异(Z^0.05); ZM大鼠体重均 高于KB，但无显著性差异05)。
1.3.2大鼠HLP模型的建立
喂饲高脂饲料的ZM大鼠3w后测血脂。与造模前相比，血清TC、TG、LDL-C 水平显著升高(尸<0.01)， HDL-C水平明显下降(尸<0.05)。说明ZM大鼠存 在着血脂代谢紊乱，HLP模型复制成功。
1.3.3对大鼠摄食量和体重的影响
给药期间，各组大鼠生长良好，活动正常。给药前各组大鼠摄食量和 体重均无明显差别(尸X).05)。给药3w后，大鼠平均日摄食量和体重均稳 步增加，与KB、 HL相比，各给药组大鼠平均日摄食量和体重无显著性差 异(/IX). 05)，说明CPFP对大鼠摄食量和体重变化无不良影响。
1. 3. 4对HLP大鼠TC、 TG和LDL-C的影响
给药前，各HLP模型组间大鼠的血清TC、 TG和LDL-C水平相互比较 无显著性差异(尸X).05)，但都明显高于KB (尸<0.01)。
给药3w后，各组与给药前比较，KB大鼠血清TC、 TG和LDL-C分别升 高1. 84%、 6. 06%和7.14%，均无显著性差异(/^X). 05); HL大鼠血清TC、 TG和LDL-C分别升高23. 84%、27. 27%和31. 82%，均有显著性差异(尸<0. 05); HD、 LD、 NJ及LF血脂分别降低:TC(23. 10%、 18.29%、 19. 60%和31. 64%)、 TG(34. 37%、 27. 27%、 24. 64%和35. 48%)和LDL-C(26. 70%、 24. 76%、 19. 29% 和38.42%)，各组TC、 TG和LDL-C均显著降低(尸<0. 01或尸<0. 05)。
与HL比较，各给药组大鼠血清TC、 TG和LDL-C水平均非常明显下降 (尸<0. 01);与LF比较，HD大鼠血清TC、 TG和LDL-C水平均无显著性差异 (/IX). 05)，说明CPFP能显著降低HLP大鼠血清TC、 TG和LDL-C， HD和LF
效果均较好。
1. 3. 5对HLP大鼠HDL-C的影响
给药前，各HLP模型组间大鼠血清HDL-C水平相互比较无显著性差异 (/^0.05),但都明显低于KB (尸<0.01)。
给药3w后，与给药前比较，KB大鼠血清HDL-(:水平升高0.85%,但 无显著性差异(尸X). 05); HL降低8.7(m，无显著性差异0^0. 05); HD、 LD、 NJ和LF分别升高19. 78%、 8. 51%、 8. 60%和13. 83%, HD大鼠血清HDL-C 升高有显著性差异(尸<0. 05)，其余给药组均无显著性差异(/IX). 05)。
与HL比较，各给药组大鼠血清HDL-C水平均有所升高，HD和LF有显 著性差异(尸<0. 05)，说明CPFP能升高HLP大鼠血清HDL-C。
1. 3. 6对HLP大鼠apoAI和apoB的影响
给药3w后，与HL比较，HD、LD、NJ和LF血清apoAI分别升高33. 49%、 5.58%、 3. 49%和21.16%,但均无显著性差异(/^0. 05); HD、 LD、 NJ和LF 血清apoB分别降低49.269L 40.16%、 47. 18%和50. 15%,均有非常显著性 差异(AO. 01)。各给药组间apoAI和apoB水平均无显著性差异(/^X). 05)。
1. 3. 7对HLP大鼠血脂综合指数(LDL-C/ HDL-C、TG/ HDL-C比值和AI) 的影响
给药3w后，与HL比较，HD、 LD、 NJ和LF血脂综合指数分别降低 LDL-C/HDL-C(57. 68%、 52.66%、 49. 84%和62. 38%) 、 TG/HDL-C (63.89%、 57. 41%、 52. 78%和66. 67%) 、 AI (62. 23%、 53. 68%、 51. 54%和65. 80%)，均 有非常显著性差异(At). 01)。与LF比较，HD无显著性差异(/^X). 05), LD 和NJ大鼠血清LDL-C/HDL-C和AI比值有显著性差异(尸<0. 01或尸<0. 05)。
1.3.8对HLP大鼠肝重和肝脏系数的影响
给药3w后，与HL比较，HD、 LD、 NJ和LF大鼠的肝重和肝脏系数都 有不同程度的降低，肝重依次降低15. 16%、 10.15%、 11. 25%和16.99%, HD和LF降低有显著性差异(尸<0. 05);肝脏系数依次降低12. 10%、 9. 80%、 10. 09%和13. 26%， HD、 LD、 NJ和LF降低有显著性差异(風01或尸<0. 05)。
与lf比较，各给药组肝重和肝脏系数均无显著性差异(尸;o. 05)。
1. 3. 9对HLP大鼠肝脏脂肪变性的影响
1. 3. 9. 1组织学检查
KB:肝脏无异常变化，肝脏表面光滑，有光泽，未见充血、水肿等现 象；HL:肝脏体积增大，包膜紧张，边缘圆钝，切面油腻，无光泽，呈奶 黄色，可见针头大的细小颗粒，属典型肝细胞脂肪变性；各给药组肝脏
色泽、质地、体积均有明显改善。
1.3. 9.2光镜观察
KB:肝组织的形态学表现正常，肝小叶结构清晰，肝细胞排列呈条索
状，以中央静脉为中心放射状走行，未见肝细胞浊肿、脂变和坏死，汇管
区可见小叶间小血管和毛细胆管，未见炎细胞浸润和淤胆形成等改变，10
只大鼠肝细胞均未见脂肪变性(0/10);
hl:肝小叶结构欠清晰，io只大鼠均出现了中度至重度的肝细胞脂肪 变性(10/10)，胞浆中出现大小不等的脂肪空泡，肝细胞体积普遍变大变
圆，细胞核被挤在一边，肝窦明显变窄或消失，肝细胞着色较正常细胞为 浅，胞浆淡染，腺泡内多见点状或灶状坏死，汇管区伴有轻-中度炎症细
胞浸润，未见明显肝纤维化，大部分肝小叶中央静脉周显现胆固醇结晶； 各给药组肝组织均有不同程度的改善，尤其是HD和LF肝组织有较
大程度改善。
2. 仙人掌果及仙人掌果多糖对高脂血症(hlp)大鼠血液流变学的影
响
2. l实验动物同实验l。
2. 2实验方法
2. 2. 1血液流变学的测定
给药3w，末次给药前禁食12h,给药lh后，取血3.5ml，用血清洗 旋转式粘度计，测全血粘度(高、中、低切)，血浆粘度和红细胞压积值等 血液流变学指标。
2.2.2统计学处理同实验l。
2. 3实验结果
对HLP大鼠血液流变学的影响
给药3w后，与HL比较，HD、 LD、 NJ和LF全血粘度(高切、中切、低 切)、血浆粘度、红细胞(RBC)压积值均有显著性降低(尸CO. 01或AO. 05); 与LF比较，HD的RBC压积值、全血粘度(高切)和血浆粘度均显著性降低 01或尸<0. 05),效果优于LF; LD和NJ的RBC压积值也显著降低 (尸<0. 05)，说明CPFP对HLP大鼠的血液流变学异常具有明显改善作用。
3. 仙人掌果及仙人掌果多糖对高脂血症(HLP)大鼠抗氧化作用的影
响
3. l实验动物同实验l。 3. 2实验方法 3. 2. 1样本处理
给药3w，末次给药前禁食12h，给药lh后，取血，装入不抗凝试管 中，在4。C下3000rpm离心10min，取血清，分装，-20。C保存。
3.2.2血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定
测定原理以黄嘌呤氧化酶法测定，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应 系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作 用下呈紫红色。严格按照SOD测试盒说明书操作，在550mn处测定SOD的 吸光度(0D)，根据下列公式计算血清SOD活性
血清SOD活性(U/ml)=(对照管0D值-测定管0D值)+对照管0D值+ 5(mx样品测试前稀释倍数。注每lml反应液中SOD抑制率达50%时所对 应的S0D量为一个SOD活力单位(U)。
3. 2. 3血清丙二醛(MDA)含量的测定
测定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。过氧化脂质降解产物中的MM 可与TBA縮合，形成红色产物。严格按照S0D测试盒说明书操作，在532mn 处测定MDA的0D值，根据下列公式计算血清MDA含量
MDA含量(mnol/mlh(测定管0D值-测定空白管0D值)+ (标准管0D 值-标准空白管0D值)X标准品浓度X样品测试前稀释倍数。
3.2.4统计学处理同实验l。
3. 3实验结果
对HLP大鼠抗氧化作用的影响
给药3w后，HD、 LD、 NJ和LF血清S0D活性分别升高50. 06%、 40. 64%、 37. 24%和34. 33%;与HL比较，HD、 LD和NJ有非常显著性差异(尸<0. 01)， LF有显著性差异(尸。.05)。血清MDA含量分别降低36， 33%、 32. 72%、 27. 78%
和28.66%，各给药组均有非常显著性差异(At).Ol)。另外，各给药组组间 S0D和MM均无显著性差异(PX). 05)。
实验结论l.仙人掌果多糖具有降脂及调节脂蛋白代谢的作用能降 低高脂血症大鼠血中的TC、 TG、 LDL-C和apoB水平，升高HDL-C和apoAI 水平；并保护肝脏细胞结构功能的改变，增强其对脂质代谢的作用。
2. 仙人掌果多糖能改善血液粘度和流变性，直接改善血液成分能降 低高脂血症大鼠的全血粘度(高、中和低)、血浆粘度、RBC压积，而改善 血液流变性。通过改善血液浓、粘、聚状态，促进脂类物质的代谢。
3. 仙人掌果多糖能清除自由基，减少脂质过氧化物的产生可以有效 降低高脂血症大鼠血清中MDA含量，升高血清中SOD活性，提示仙人掌果 多糖可能通过提高自由基清除酶的活性，维护体内自由基稳态与平衡，增 加LDL的抗氧化能力，减少脂质过氧化物的产生，从而发挥防治高脂血症 和动脉粥样硬化的作用。
因此，仙人掌果多糖具有降脂及调节脂蛋白代谢的作用，能改善血液 粘度和流变性，直接改善血液成分，清除自由基，减少脂质过氧化物的产 生，从而发挥防治高脂血症和动脉粥样硬化的作用。
四、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血糖作用的试验研究
1.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠糖代谢和一般体征的
影响
1. 1实验动物
SD大鼠，雌雄各半，体重(200土10)g，由广西医科大学实验动物中 心提供，合格证号为SCXK桂2003-0003;动物饲料由广西医科大学实验 动物中心生产(标准饲糾。DM模型鼠自由摄食、饮水，通风，自然采光。
1.2实验方法
1. 2. 1 DM大鼠模型建立及指标测定 1. 2. 1.1 DM大鼠模型建立及分组
SD大鼠禁食12小时(h)，以60mg kg—'链脲霉素(STZ)腹腔注射(STZ 溶解于0. lmol L—\ pH4. 2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液中，现配现用， 置于冰上)。正常对照组(Sd)大鼠腹腔注射等量上述缓冲液。72h后(大 鼠采血前禁食12h)用血糖(BG)测定仪测定空腹血糖(FBG)值，凡FBG》 13mmol L—4见为DM大鼠模型。
将成模DM大鼠按BG浓度由高到低排序进行物理编号，随机将DM大 鼠分为DM模型对照组(NC)、胰岛素组(IN)、原汁组(NJ)、 CPFP中剂量组 (MD)和CPFP高剂量组(HD)。
1.2.1.2给药剂量与方法
IN给鳳kg-1 d—1夷岛素(Ins)，NJ给仙人掌果原汁3.15g kg—1 cf1， MD和HD分别给1. 58g kg-1 (Tl, 3. 06g kg-1 cf1。每天上午空腹给药1 次，连续灌胃8周(w)。
1.2. 1.3 —般体征观察
观察大鼠的精神活动、毛发改变、饮水量、进食量和大小便等一般状 况，并记录体重变化情况。 1.2.1.4血糖的测定
给药第4w和第8w，用BG测定仪测定各组FBG，计算并统计分析药物 对DM大鼠BG水平的影响。
1.2.1.5糖化血红蛋白(GHB)的测定
给药8w末，拔大鼠眼球采血2-4ml置于离心管中，以500 1000转/ 分(rpm)，离心5 10分钟(min)，弃上清留沉淀的红细胞，然后用生理盐 水洗涤2 3次。用GHB测定试剂盒测定GHB含量，具体操作详见试剂盒 说明书，计算并统计分析药物对DM大鼠GHB水平的影响。计算公式每 10g GHB吸光度(0D)=测定管0D/2ml血液中GHB克数X2X 10g
1. 2. 2统计学处理应用SPSS11. 0软件进行统计学处理，计量资料均 采用3f土s表示，两组间计量资料比较采用t检验，多组均数比较采用方 差分析。
1.3实验结果
1.3.1对STZ所致DM大鼠的一般状况的影响 1. 3. 1. 1 —般状态观察
Sd大鼠精神振奋，活动频繁，毛发纯白有光泽，垫料干燥；NC大鼠 精神萎靡，活动度低，尾巴湿冷，毛发枯黄、无色泽、脱落，竖毛弓背， 垫料极潮，下腹部及外阴部毛浸湿，大便稀澹，出现"三多一少"的症状； 给予CPFP和Ins后，DM大鼠精神逐渐好转，活动增多，皮毛光泽渐好， 垫料比较干燥，大便稀塘减少，"三多一少"的症状减轻。
1.3.1.2对DM大鼠体重的影响
在实验中Sd和IN大鼠体重呈持续增长趋势；NC大鼠体重逐步下降， 说明DM大鼠体内产生代偿，代谢紊乱；给予CPFP后，DM大鼠体重8w时 显著高于NC同期体重(尸<0. 05)。
1. 3. 2药物对STZ所致MD大鼠FBG的影响
给药4w和8w后，各组FBG均有不同程度的降低。与同期NC比较HD、 MD和NJ均有显著降血糖作用(尸<0. 01)，降糖效果呈现一定的量效和时效 关系。HD、 MD和NJ之间均无显著差异(/IX).05)。
1. 3. 3药物对STZ所致DM大鼠GHB的影响
结果显示与NC相比，HD、 MD和NJ的GHB含量显著降低(尸<0. 01或 尸<0. 05)，但HD、 MD和NJ之间无显著差异(尸力.05)。提示HD、 MD、 NJ均 能较稳定地降低血糖。
2. 仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠脂代谢的影响 2. l实验动物同实验l。
2. 2实验方法
2.2. l血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、 LDL-C和高密度脂蛋白 -胆固醇(HDL-C)的测定
给药8w末，取血，4°C， 3500rpm离心10min，在全自动生化分析仪 上测定血清TC、 TG、 LDL-C和HDL-C含量，并根据Frieldwald公式计算 动脉硬化指数(AI): AI二 (TC - HDL-C) /HDL-C。
2.2.2统计学处理同实验l。
2.3实验结果
与Sd相比，NC大鼠TC、 TG和LDL-C显著升高(尸①.01), HDL-C含量 显著下降(尸<0.05);给药8w后，与NC相比，HD和IN的TC和TG含量显 著下降(At). 05) ， LDL-C含量也有所减少，其中HD的LDL-C含量降低效果 显著(AD.05);同时，HD和IN的HDL-C含量显著升高(/M).05)。
3.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠胰腺组织形态学的影
响
3. l实验动物同实验l。 3. 2实验方法
3. 2. 1胰腺组织HE染色形态观察
给药8w末，取血后，迅速取胰腺，用福尔马林固定，石蜡包埋，HE 染色。光镜下观察心肌组织病理学变化并拍照。
3. 2. 2胰腺组织a细胞和e细胞的免疫组化检测
给药8w末，剖腹取胰腺，福尔马林固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、 切片。组织切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。
酸性修复取配置好的柠檬酸缓冲液(pt^ 6.0±0. 1) 800-1500ml于 压力锅中，电炉加热至沸腾。脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料染色 架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气， 从喷气开始记时，1. 5 miri后压力锅离开热源，冷却至室温。取出玻片， 先用自来水冲洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 12H20 6.0g +化1^04*2仏0 0.4§+蒸馏水1000 1111)冲洗三次，每次间隔3min，除去 PBS液。
每张切片加50nl3y。过氧化氢，室温下孵育10min，以阻断内源性过 氧化物酶的活性。PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。每张切片 加50u 1的Glucagon Ab-1或Insulin Ab-5 (均按1:50稀释)，在4。C下 孵育过夜。PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液，每张切片加50 u 1 即用型快捷免疫组化Maxvision"抗兔-HRP检测试剂盒，室温下孵育15 min。 PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。
DAB显色850 u 1蒸馏水与DAB试剂中A、 B、 C试剂各50 u 1混匀， 配制成lmlDAB显色液。每张切片加50P1新鲜配制的DAB溶液。自来水 冲洗，苏木素复染30秒，自来水冲洗，返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥、 中性树胶封固。
镜下观察各组免疫组化片进行综合评分。1、表达面积①阳性表达 细胞数为0计为0分。②阳性表达细胞数《2596计为1分；③阳性表达细 胞数为26 50%计为2分；④阳性表达细胞数占51 75%计为3分；⑤阳 性表达细胞数>75%计为4分。2.表达强度①阳性信号强烈，呈棕褐色，
小块状，计为3分，②阳性信号中等，呈棕色，粗颗粒状，计为2分；③
阳性信号较弱，呈淡棕色，细颗粒状，计为l分；④无阳性信号，计为0 分。两项相加，0分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(+) ，4-5分为中度阳性(++)， 6-7分为强阳性(+++)。计数采用双盲法。 3. 3实验结果
3. 3. 1对DM大鼠组织病理形态的影响
Sd胰腺中胰岛数量较多，体积较大，胰岛呈圆形或椭圆形的细胞团， 边界清晰，胰岛内细胞数量较多，排列整齐，胞浆丰满，核多为圆形；NC 胰岛数量明显减少，结构破坏，轮廓消失，胰岛内细胞数量明显减少，细 胞排列不规则，边界不清，部分细胞肿胀或皱縮坏死，胰岛内出现空泡； IN胰岛数量明显增多，轮廓完整，分布规则，细胞边界清晰；HD和MD与 NC相比胰腺病变较轻，胰岛轮廓完整，胰岛内细胞数量增多，分布规则，
胞浆疏松，淡染，细胞边界较清晰。
3.3.2药物对STZ所致MD大鼠胰岛P细胞和a细胞的影响 3.3.2.1胰岛P细胞Ins表达情况
结果显示:与NC相比较，各给药组Ins表达阳性率显著升高(尸<0. 05)， 表明各给药组对STZ所致胰岛P细胞损伤具有明显的保护作用。免疫组 化染色显示各组表达Ins程度:NC胰岛中央部分着色程度较正常组明显变 浅，面积缩小；各给药组中胰岛P细胞着色加深且面积增大。
3. 3. 2. 2胰岛a细胞胰高血糖素表达情况
结果显示与NC相比，各给药组胰高血糖素表达无显著差异 (尸;0.05)。免疫组化染色显示各组表达胰高血糖素程度与NC相比，Sd 和各给药组a细胞胰高血糖素表达无显著差异(/lX).05)。
4. 仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠抗氧化作用的影响 4. l实验动物同实验l。
4. 2实验方法
4. 2. 1心肌中丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)测定 给药8w末，取血后，取心脏，用冰生理盐水清洗，滤纸吸干，称重 后，用生理盐水配成10%心肌匀浆，于冷冻离心机3000rpm离心15min， 取上清液，按要求用生理盐水稀释成一定倍数后用于心肌MDA和SOD测定。 4. 2. 1. 1血清MDA含量的测定
测定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。过氧化脂质降解产物中的MDA 可与TBA縮合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收。严格按照SOD测 试盒说明书操作，在532nm处测定MDA的0D值，根据下列公式计算血清MDA含量
MDA含量(nmol/ml)-(测定管0D值-测定空白管0D值)+ (标准管0D 值_标准空白管0D值)X标准品浓度X样品测试前稀释倍数。 4.2.1.2血清SOD活性的测定
测定原理以黄嘌呤氧化酶法测定，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应 系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作 用下呈紫红色。严格按照SOD测试盒说明书操作，在550nm处测定S0D的 吸光度(0D)，根据下列公式计算血清SOD活性
血清SOD活性(U/ml)=(对照管0D值-测定管0D值)+对照管0D值+ 5(mx样品测试前稀释倍数。注每lml反应液中S0D抑制率达50%时所对 应的S0D量为一个SOD活力单位(U)。
4. 3实验结果
4. 3. 1药物对DM大鼠心肌MDA和SOD的影响
链脲霉素(STZ)所致NC大鼠心肌MDA含量较Sd有显著增高，SOD 活性则显著降低，显示DM大鼠心肌抗氧化能力下降。用药8w后，与NC 比较，HD、 MD和NJ心肌MDA值均显著降低(尸⑦.01)，相应SOD活性明显 增高(尸<0.01)，但与IN相比均有显著差异(/M).01)。
5. 仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠心肌超微结构的影响 5.1实验动物同实验l。
5. 2实验方法
给药8w后，取血后，摘取心脏，迅速放入预冷的2.5%戊二醛(用磷 酸缓冲液配制，pH7.2)固定，之后用PBS(pH7.2)漂洗10min三次，放入 1%锇酸(四氧化锇)，固定2h， PBS漂洗10min三次，50% 90%乙醇逐级脱 水，丙酮脱水，环氧树脂包埋，38°C、 45°C、 6(TC依次聚合36h, LKB-V 超薄切片机切片，约70nm，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，在H-500型透射电 子显微镜下观察心肌线粒体和心肌纤维等超微结构的变化并拍照。
5. 3实验结果
电镜下观察Sd心肌纤维未见异常，心肌肌节对位整齐，无肌原纤维
溶解，线粒体结构完整，嵴排列规则，清晰可见。NC可见心肌肌节对位错
乱，呈过度收縮，部分肌原纤维溶解，线粒体肿胀，线粒体边界不清，部
分嵴断裂溶解，形成线粒体内小空泡，表明链脲霉素STZ所致DM大鼠心 肌有一定损伤。各给药组大鼠心肌肌节对位基本整齐，仅见少部分错位， 肌原纤维溶解较少，线粒体稍见肿胀和空泡。
6. 仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠肝和骨骼肌胰岛素受 体(InsR)及骨骼肌葡萄糖转运蛋白4 (GLuT4) mRNA表达的影响
6. l实验动物同实验l。 6. 2实验方法 6. 2. 1 RNA抽提
6. 2. 2 RNA纯度和完整性分析
6. 2. 3总RNA逆转录成cDNA
6.2.4逆转录-聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)
6. 3实验结果
6. 3. 1药物对链脲霉素(STZ)所致DM大鼠肝脏和骨骼肌InsR的影响 结果显示各给药组DM大鼠肝脏和骨骼肌InsR的数量较NC均有增
加(踏Ol)。
6. 3. 2药物对STZ所致DM大鼠骨骼肌GLuT4的影响
结果显示各给药组大鼠骨骼肌GLuT4的数量较NC均有增加
(尸<0. 01) 0
实验结论通过观察仙人掌果多糖对STZ所致糖尿病大鼠糖代谢、脂 代谢及抗氧化作用的影响，并从组织学上研究了仙人掌果多糖对胰腺及糖 尿病心肌病的影响。然后从基因水平探讨了仙人掌果多糖降糖作用的可能 机制。提示
1. 本研究采用60mg kg-'—次腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，以 适宜剂量给糖尿病大鼠灌胃仙人掌果多糖后，结果显示仙人掌果多糖 能改善糖尿病"三多一少"的症状，显著降低BG和GHB。同时，也降低糖 尿病大鼠的TC、 TG、 LDL-C和AI，升高HDL-C的含量，这表明仙人掌果多 糖促进了糖和脂肪的利用，减轻了糖毒性和脂毒性对机体的损伤，有利于 糖尿病的恢复和防止并发症的产生。
2. 组织形态学观察显示仙人掌果多糖在降糖和降脂的同时，改善了 STZ所致糖尿病大鼠胰腺的损伤程度，增加胰岛e细胞和胰岛素的分泌， 因此促进胰岛P细胞修复，增加胰岛素分泌可能是仙人掌果多糖作用机制 之一。
3. 糖尿病降低了大鼠抗氧化功能，使MDA水平升高，SOD活性降低。 给予仙人掌果多糖后降低了MDA水平，升高S0D活性，这表明仙人掌果多
糖能提高机体的抗氧化功能，减轻过氧化损伤。
4. 电镜观察显示仙人掌果多糖对STZ所致糖尿病大鼠心肌肌节对位 错乱、肌原纤维溶解和线粒体肿胀有不同程度的改善，表明其能减轻糖尿 病导致的心肌损害。
5. 通过RT-PCR对肝脏和骨骼肌InsR、骨骼肌GLuT4分析可知，仙人 掌果多糖能提高InsR和GLuT4的含量，说明其降糖机制可能是通过增加 InsR和GLuT4含量而产生降糖作用的。
因此，仙人掌果多糖能降低血糖、糖化血红蛋白和血脂，改善糖代谢 和脂代谢紊乱，提高机体的抗氧化能力，延缓并发症的发生发展，改善机 体的状况，这与其修复受损的胰岛I3细胞、促进胰岛素分泌、增加InR和 GLuT4含量有关。
五、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)抗肿瘤作用的试验研究
(一)体外抗肿瘤作用的研究
1. 实验材料
l.l细胞株人肝癌细胞株HEPG-2、人卵巢癌细胞株SKOV3、人胃癌 细胞株SGC7901由医学科学实验中心细胞室提供；人肝癌细胞株HCOLM3、 人肝正常细胞株L02等由第二军医大学肿瘤所提供。
2. 实验方法
2. 1细胞的培养、冻存与复苏
本实验选用人肝癌、胃癌、卵巢癌4种细胞株，于37t)、 5%0)2的培 养箱中，10%新生牛血清以及青链霉素各100U/ ml的1640培养液中培养。 倒置显微镜观察细胞生长情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期 细胞用于实验。
冻存时，取对数生长期细胞，消化、离心、去上清。加入冻存液，使 细胞密度约为lX10Vml分装于冻存管中，先置于4aC60分钟，再置于 -20。C60分钟，再置-8(TC超低温冰箱中保存。
复苏时，将超低温冰箱中的肿瘤细胞冻存管迅速转入37'C水中，保持 冻存管管口部位于水面之上，搅拌加速解冻，待完全解冻后，用75%酒精 棉球擦拭冻存管壁。将解冻后细胞转移到离心管中，加入约6倍冻存液量 的培养基1000rpm离心5分钟，弃上清，重复此步一次。再加入培养液， 混匀细胞，转至培养瓶中培养。
2.2噻唑蓝(MTT)法确定仙人掌果多糖提取物对肿瘤细胞的抑制作
用
本实验选择胃癌7901、肝癌HEPG-2 、 LM3卵巢癌SK0V3、人正常肝 细胞L02细胞株，采用MTT法研究仙人掌果多糖的抗癌效果。取对数生长 期的肿瘤细胞株，浓度为5Xl(^个/ml，加入到96孔板，每孔加含细胞 的培养液100ul，置37。C, 59&C02培养箱孵育48h后，分别加入不同浓度 的仙人掌果多糖，用PBS溶液调整每孔细胞总体积为200 u 1， 48h后加入 20ixlMTT(2mg/ml)， 37°C, 5% 0)2培养箱孵育4h后，弃上清，每孔加入 DMS0 200ul，放入酶标仪，中速振荡5分钟后，于490nm波长处测定吸 光度(0D值)，每个浓度平行测定3孔。以PBS溶液为空白对照，按下列 公式求出生长抑制率(IR)。
实验组平均0D值
抑制率(IR， ％) = (1— - ) X100%
空白对照平均OD值
2. 3 Annexin V-FITC染色观察细胞凋亡
(1) 将LM3细胞于6孔板内生长，处于对数生长期内加入 CPFP(2. 500mg/ml)诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
(2) 用PBS洗涤细胞两次；
(3) 在500u l的Binding Buffer中加入2y 1 Annexin V-FITC， 5u 1 Propidium Iodide， 混匀；
(4) 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀霜生.
(5) 避光、室温反应5分钟。将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微 镜下、双色滤光片(FITC和罗丹明)观察，Annexin V-FITC荧光信号呈绿 色，PI荧光信号呈红色。
2.4流式细胞术定量检测细胞凋亡率
取对数生长期的肿瘤细胞，经各浓度CPFP作用后，收集细胞，用结合 缓冲液调节细胞密度为lX107ml，取100n l悬液，加5y 1 Annexin-v/FITC 和10ul碘化丙锭溶液，常温避光孵育15分钟，力卩400ul PBS混匀，流式 细胞仪分析。
2. 5 RT-PCR检测P53基因mRNA的表达
2.6蛋白质印迹检测P53相关蛋白表达
2. 7统计学分析
应用SPSS13. 0软件进行统计学处理，计量资料均采用^S表示，两 组间计量资料比较采用t检验，两组率的比较采用X2检验，多组均数比较 采用方差分析。
3. 实验结果
3.1 CPFP对肿瘤细胞的抑制作用
结果表明，CPFP不同剂量及5-FU的常用剂量对人体卵巢癌SKOV-3、胃 癌7901、肝癌HEPG-2、肝癌LM3细胞的增殖有不同的抑制作用。CPFP与5-FU 比较，抑制能力较弱。相同浓度下，CPFP对LM3细胞的抑制作用较其他株 细胞明显，但考虑到药物浓度较大，总体来说一定剂量仙人掌果多糖对肿 瘤细胞的抑制作用不大。在比较对同一种肿瘤细胞抑制率相近的条件下， CPFP对人正常肝细胞L02的抑制作用很小而阳性对照药物5-FU对人正常肝 细胞L02抑制作用明显。
3. 2 CPFP对细胞凋亡的影响
CPFP(2. 500mg/ml)作用LM3细胞48小时后，Annexin V-FITC染色可 以观察荧光显微镜下的凋亡细胞。流式细胞术检测CPFP作用下LM3细胞 凋亡率可知，NS组的凋亡率为9.76%; CPFP(0.625mg/ml)组凋亡率为 19. 77%; CPFP(2. 500mg/ml)组凋亡率为34. 12%,由此推测CPFP可能具有
诱导凋亡的作用。
3. 3 CPFP对P53表达的影响
结果表明，随CPFP剂量增加，LM3细胞中P53基因mRNA的表达有一 定下调趋势。蛋白质检测的结果也发现同样的趋势。
4. 结论
(1)仙人掌果多糖对肿瘤细胞的抑制作用本实验研究表明仙人掌 果多糖不同剂量对人正常肝细胞L02的抑制作用很小，但阳性对照抗肿瘤 药物5-FU的常用剂量对L02的抑制作用明显。仙人掌果多糖不同剂量和
阳性对照抗肿瘤药物5-FU的常用剂量对人体卵巢癌SKOV-3、胃癌7901 、 肝癌HEPG-2 、肝癌LM3细胞的增殖均有不同的抑制作用。仙人掌果多糖 的抑制作用与5-FU比较，抑制能力较弱，且用药浓度较大。即仙人掌果 多糖的细胞毒性较小，直接杀伤细胞的能力较弱。推测仙人掌果多糖对肿 瘤的抑制可能通过其他途径发挥作用。
(2) 仙人掌果多糖对细胞凋亡的作用本实验研究表明仙人掌果多 糖作用LM3细胞48小时后，Annexin V-FITC染色可以观察荧光显微镜下 的生长活跃的肿瘤细胞和药物诱导下已凋亡的肿瘤细胞。可以观察到正常 LM3细胞，其轮廓清晰；其中的凋亡细胞皱縮、颜色发白，形状较周边正 常细胞均有所改变，呈绿色荧光。根据流式细胞术检测LM3细胞调亡率可 知，NS组的凋亡率为9.76%;仙人掌果多糖(0.625mg/ml)组凋亡率为 19. 77%;仙人掌果多糖(2. 500mg/ml)组凋亡率为34. 12%，由此可以推测
仙人掌果多糖可能具有一定的促凋亡作用。
(3) 仙人掌果多糖作用下的P53的表达分析本实验RT-PCR结果研 究表明，不同剂量仙人掌果多糖作用下LM3细胞P53基因mRNA的表达强 度变化具有一定趋势，随仙人掌果多糖剂量的增加，P53基因mRNA的表达 下调。根据Western blot结果可以看出，不同剂量仙人掌果多糖作用下 LM3细胞P53基因蛋白的表达强度不同，其变化具有一定趋势，随仙人掌 果多糖剂量的增加，P53基因蛋白的表达有所减弱。由此推测仙人掌果多 糖降低突变型P53在分子及蛋白水平的表达可能是其抗肿瘤机制之一。
(二)体内抗肿瘤作用的研究
1. 实验材料
l.l实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，18 20g，由广西医科大学实 验动物中心提供(试验动物生产许可证SCXKG桂2006-0003，试验动物使 用许可证SYKG桂2003-0005) 。 S180荷瘤小鼠种源，由上海细胞所提供。
2. 实验方法
2. l动物急性毒性试验
因受仙人掌果多糖(CPFP)浓度和体积的影响， 一次给药无法测出其 LD50，故依据动物能耐受的最大浓度、最大体积的药量，每隔12h给药l次， 共给药2次，测定CPFP最大给药量。按急性毒性试验常规方法分剂量分组 灌胃。
2.2 S180荷瘤小鼠腋下移植瘤的抑制实验
2.2.1 S180荷瘤小鼠瘤株保种、传代及移植瘤模型制备
(1) S180瘤株的保种
取体重20g的昆明小鼠4 5只，腹腔接种S180瘤株，定期7 9天传一
代，腹腔保种。
(2) S180腋下移植瘤模型的建立 取腹腔传代7天且生长良好的S180肉瘤小鼠，脱颈椎处死，75%乙醇消
毒动物皮肤，无菌条件下操作，小心剪开小鼠腹腔，吸取生长良好的动物 腹水，注意观察腹水颜色，腹水为乳白色无絮状沉淀物者为佳，血性腹水
则不可用。台盼蓝染色证明活细胞数〉98%，腹水用生理盐水按l : 2比例稀 释，吹打混匀，细胞计数板计数，调整细胞数为2X106个活细胞/ml。取 昆明种小鼠50只，右侧腋部皮肤常规酒精消毒，持lml注射器予小鼠腋下 皮下注射O. 2 ml瘤细胞悬液，制成局灶性肿瘤模型。操作过程中注意紧贴 皮下进针，勿将瘤细胞悬液漏出。在造模后第4天和第6天观察S180腋下移 植瘤模型的成瘤情况。
2. 2. 2实验动物分组及给药
接种24h后，小鼠按性别、体重随机分成五组，每组10只，连续给药 IO天生理盐水组(NS):生理盐水0.2 ml 10g- 1 d- 1， po; CTX组 CTX 0. 02 g kg- 1 d- 1， ip; CPFP高中低剂量组:1. 97 g kg- 1 d-1、 0.99 g kg- 1 d- 1、 0. 49 g kg- 1 d- 1， po。
质评标准为具有下列一项实验资料作废
(1) 生理盐水组小鼠肿瘤平均瘤重小于lg或20Q/。小鼠的瘤重小于0.4 g，表示肿瘤生长不良。
(2) 给药组小鼠死亡超过20%，或去瘤后平均体重下降超过15%，表示 药物的不良反应。
2. 2. 3计算抑瘤率
第ll天称体重并处死动物，剪开小鼠右腋下皮下组织，剥离肿瘤、胸 腺、脾脏，称重，按下列公式计算抑瘤率，胸腺指数，脾指数。
他伤宇"、—生理盐水组瘤重一实验组瘤重y翻《y
抑瘤率(%)--生理盐水组瘤重-X100 %
2.3 CPFP对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响 2.3.1 S180荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数的测定 胸腺指数=胸腺重量(mg) /体重(g) 脾指数=脾脏重量(mg) /体重(g) 2.3.2脾淋巴细胞转化功能测定
(1) 实验方法植物血凝素诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖实验(MTT法)
(2) 原理当T细胞受植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白(Con A)等致
分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过 线粒体水解酶将MTT (四甲基偶氮唑盐)分解为蓝紫色formazan结晶而显
色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。
(3) 脾淋巴细胞悬液的制备用药结束后脱颈椎处死小鼠，于超净 台中无菌取出脾脏，用眼科剪反复剪碎，PBS冲洗，经200目尼龙网过滤至 离心管中，沿离心管侧壁加入淋巴细胞分离液l ml，离心1500转/分钟， 10分钟，吸取中间层细胞，用含109&小牛血清的RPMI-1640培养基调整细 胞浓度为5 X 106/ml单个脾细胞悬液。(4)淋巴细胞转化功能的测定将制备好的小鼠脾细胞悬液加入96 孔培养板中，100ul细胞悬液/孔。每只鼠设对照孔3复孔，每孔加IOO Ull640培养液；ConA刺激孔3复孔，每孔加100 pi Con A (10 mg/L) 溶液。于37。C、 5呢C02培养箱中孵育40h后，取出每孔加入IO u 1 MTT (5 mg/ml)溶液，继续孵育4h。取出后，小心吸去上清，每孔加入DMS0150 Ul，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，在酶标仪上选择570 mn处的 波长，测OD值，计算刺激指数(SI)。
SI =刺激孔(加Con A孔)OD值/对照孔OD
2. 4 CPFP对S180荷瘤小鼠血清自由基的作用
S180荷瘤小鼠造模、分组，给药10天后，第ll天眼球取血处死小鼠。 血浆2000 r/分钟离心10分钟，收集上层无溶血的血清于EP管中，-20°C 冰箱中备用， 一周内测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、 一氧化 氮(则。
2. 5透射电镜观察CPFP对S180荷瘤小鼠瘤组织超微结构的影响 2.6CPFP对S180荷瘤小鼠瘤组织病理学形态及P53、 Bax、 VEGF蛋白表 达水平的影响
S180荷瘤小鼠造模、分组，给药10天后，第ll天眼球取血，脱颈椎处 死小鼠，剥离瘤组织，10%中性福尔马林固定，24h内制成蜡块备用。
2. 6. 1观察瘤组织病理学形态
结果判定低倍镜下(X100)观察坏死面积，按坏死面积大小分级 判断为灶状坏死(+ ),小片状坏死(++)，大片状坏死(+++)。
2.6.2免疫组化法检测P53、 Bax、 VEGF蛋白表达
结果判定P53阳性染色定位于肿瘤细胞核。细胞核出现棕黄色或棕 褐色颗粒为阳性表达细胞。Bax阳性染色定位于肿瘤细胞质。细胞质出现 棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达细胞。VEGF阳性染色定位于肿瘤细胞质。 细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达细胞。每张切片高倍镜下随机 观察5个视野，计数阳性细胞百分率或阳性组织相对灰度值。
2.7数据处理 —
应用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料均采用i+S表示，两组 间计量资料比较采用t检验，两组率的比较采用X2检验，多组均数比较采
用方差分析。
3. 实验结果
3.1动物急性毒性试验
在试验中观察到，小鼠灌服药物2星期内，CPFP各剂量组和生理盐水 对照组动物无异常差别，药后14d，处死小鼠，解剖，肉眼观察心、肝、 脾、肺、肾、脑、小肠，均无异常发现。试验结果表明小鼠24h内共灌 胃给予CPFP4. 746g kg-l，最大耐受量达4. 746g kg-1。
3.2 CPFP对S180荷瘤小鼠腋下移植瘤的抑制实验 3.2.1肿瘤造模情况观察及各实验组瘤块比较
小鼠接种2天内，外观无明显变化，活动、饮食正常；接种瘤细胞后 第3 4天，部分小鼠可触及皮下米粒大小肿块；接种后第4 6天肿块逐渐 明显，各组成瘤率均约为80%。仙人掌果多糖高、中、低剂量组及CTX组肿 瘤生长较生理盐水组缓慢。但CTX组小鼠饮食减少，体重减轻明显，皮毛 无光泽，竖毛现象明显，活动明显减少，常拥挤在一起；而仙人掌果多糖 高、中、低剂量组小鼠明显比CTX组和生理盐水组小鼠活泼，体重减轻不 明显，皮毛有光泽，竖毛现象不明显。给药结束后处死各组小鼠，取瘤块 分析比较.生理盐水组与仙人掌果多糖中、低剂量组瘤块大小均约为 (0. 8—1.1 cm) X (0. 8—1. 0cm)，仙人掌果多糖高剂量组瘤块大小约为 0. 4cmX 0. 6cm， CTX组瘤块大小约O. 3cm-0. 45cm。
3.2.2 CPFP对S180小鼠腋下移植瘤抑瘤作用
仙人掌果多糖高、中剂量、CTX组的瘤重明显低于生理盐水组，而仙 人掌果多糖低剂量组其瘤重则与生理盐水组相近。表明仙人掌果多糖的 高、中剂量组及CTX组对肿瘤均有明显的抑制率，其中以高剂量组和CTX组
的效果最好。
3.3 CPFP对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响 3. 3. 1 CPFP对胸腺指数及脾指数的影响
与生理盐水组比较，CPFP各剂量组胸腺指数较生理盐水组有所增高， 其中高、中剂量具有显著差异(P〈0. 05)，脾脏指数无显著性差异(P〉0. 05); 环磷酰胺组胸腺指数明显降低，与生理盐水组相比有显著差异(P<0.05)， 脾脏指数无明显差异(P>0.05)。提示CPFP能促使胸腺发育，改善荷瘤小 鼠所引起的胸腺抑制作用，对脾脏的发育无明显促进作用；CTX可显著抑 制荷瘤小鼠的胸腺，对脾脏无明显抑制作用。
3.3.2 CPFP对脾淋巴细胞转化功能的影响
与生理盐水组比较，CPFP高、中剂量组均有显著差异(P〈0.01)， CTX 组脾淋巴细胞转化能力明显低于生理盐水组(P〈O.OD，提示CPFP能明显 提高荷瘤小鼠的脾淋巴细胞转化功能，环磷酰胺组荷瘤小鼠的脾淋巴细胞 转化功能明显低于生理盐水组。
3.4仙人掌果多糖对Sw。荷瘤小鼠SOD、 MDA、 NO的影响
与生理盐水组比较，仙人掌果多糖高、中剂量组均能提高SOD含量 (代0.05或代0.01)，仙人掌果多糖高、中、低剂量组均能降低MDA、 NO 含量(代0.05或代0.01)。
3. 5仙人掌果多糖对瘤组织超微结构的影响
生理盐水组瘤细胞形态不规则，细胞间有连接，绒毛丰富。细胞器 结构较清晰核形态不规则，核浆比例大，核异形性强，核内异染色质多， 核仁明显。仙人掌果多糖1.97g kg—'组可见凋亡细胞，细胞间间隙增大， 细胞核内染色质边集，核仁浓縮或碎裂，并可见类圆形凋亡小体，胞质内
线粒体空泡变性，线粒体嵴融合，呈早期凋亡迹象。CTX组可见有核异 型，细胞浆出现大片空泡区，粗面内质网扩张，核糖体脱落，核膜消失， 核碎裂，呈晚期凋亡迹象。
3. 6 S咖荷瘤小鼠瘤组织病理学形态及Bax等蛋白表达水平观察
3. 6. 1 CPFP对于Sw。瘤组织病理学形态改变的影响 低倍镜下观察，生理盐水组和CPFP低剂量组可见肿瘤细胞生长活跃，
有部分坏死灶，CPFP高剂量、中剂量组和CTX阳性对照组对肿瘤的破坏力 大于生理盐水组和CPFP低剂量，观察可见瘤内有大片状坏死，坏死面积较 大及程度较为严重，经秩和检验，各组坏死无明显差异。
3.6.2 CPFP对于瘤组织Bax蛋白表达的影响
与生理盐水组比较，CPFP组瘤组织中Bax蛋白表达数值均有所提高， 与生理盐水组相比，高、中剂量组P〈0.05。
3.6.3 CPFP对瘤组织P53蛋白表达的影响
与生理盐水组比较，CPFP组瘤组织中P53蛋白表达明显降低，高剂量 组P〈0.01， CTX、中、低剂量组P〈0.05。
3.6.4 CPFP对于瘤组织VEGF蛋白表达的影响
与生理盐水组比较，CPFP组瘤组织中VEGF蛋白表达均降低，高剂量 组P〈0.01,中剂量组P〈0.05，低剂量无显著意义。
4. 结论
(1) 仙人掌果多糖对S自荷瘤小鼠的抑瘤作用
实验结果表明，与生理盐水组比较，仙人掌果多糖高、中组抑制肿瘤 有显著性差异(P〈0.01或P〈0.05)， CTX组抑瘤率抑制肿瘤有显著性差异 (P〈0.(U)。 CTX为临床上广泛应用的抗肿瘤药物，系氮芥与磷酰胺基结合 而成的化合物，可直接破坏DNA并阻止其复制。CTX在体经肝细胞色素P45。 氧化，裂环生成中间产物醛磷酸酰胺，并在肿瘤细胞内分解出强有效的磷 酰胺氯芥，可与DNA发生烷化，形成交叉联结，抑制肿瘤细胞的生长繁殖， 从而发挥抗癌作用，为周期非特异性药物，疗效确切。本实验中，CTX组 抑瘤率达60%以上，对S自肉瘤有良好的抑制作用。仙人掌果多糖高剂量、 中剂量组抑瘤率高于30%,实验复重三次，结果基本一致。 一般认为中药 的抑瘤率超过30%，实验重复三次，连续数次疗效稳定，且有统计学意义， 可评定药物有一定疗效。本实验结果表明仙人掌果多糖对S自小鼠腋下 移植瘤有明显的抑制作用。
(2) 仙人掌果多糖对S目荷瘤小鼠抗肿瘤免疫作用 本研究结果显示，仙人掌果多糖能提高胸腺指数，对脾脏指数无明显
影响，说明其主要促进胸腺细胞增殖分化，促进细胞免疫功能，从一定程 度上改善荷瘤小鼠免疫器官状况，对因荷瘤而损伤的免疫系统功能有一定 的保护和促进恢复作用。在本实验研究中，仙人掌果多糖组对Sw。荷瘤小 鼠T淋巴细胞增殖活性有较大程度提高，提示仙人掌果多糖可增强T淋巴
细胞的增殖活性和提高免疫应答能力，是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。
(3) 仙人掌果多糖对Sw。荷瘤小鼠体内自由基的作用 清除自由基是一条有效的抗癌、抑癌手段。SOD的活力反映了机体清
除氧自由基的能力。本实验主要测定了Sw。荷瘤小鼠血浆MDA和SOD含量，显 示仙人掌果多糖能降低Sw。荷瘤小鼠血浆MDA，升高SOD含量。仙人掌果多糖 高剂量、中剂量与生理盐水组比较有显著性差异(P〈0.05或P〈0.01)。提 示仙人掌果多糖抗肿瘤机制可能与清除自由基有一定关系。
(4) 仙人掌果多糖对Sw。荷瘤小鼠瘤组织病理学形态的影响 低倍镜下观察各实验组瘤内坏死面积，生理盐水组和仙人掌果多糖低
剂量组可见肿瘤细胞生长活跃，有部分坏死灶，可能是由于肿瘤组织生长 过快，局部缺血形成的小坏死灶，仙人掌果多糖高剂量、中剂量组瘤体普 遍小于生理盐水组，可见瘤内有大片状坏死，坏死面积较大及程度较为严 重。经秩和检验各组间无明显差异，可能与各组肿瘤均有坏死有关。
(5) 免疫组织化学法及仙人掌果多糖对Sw。荷瘤小鼠Bax、 P53蛋白表 达的影响
Bax和P53是两种常见的癌基因或抑癌基因，其蛋白表达在各种恶性 肿瘤治疗的研究中，可作为一种预后标志。实验结果中与生理盐水组比 较，仙人掌果多糖组瘤组织中Bax蛋白表达数值均有所提高，高、中剂量 组P〈0.05，低剂量组无显著意义。与生理盐水组比较，仙人掌果多糖组瘤 组织中P53蛋白表达明显降低，高剂量组P〈0. 01， CTX、中、低剂量组P〈0. 05。 表明仙人掌果多糖能提高Bax基因蛋白表达；降低P53基因的突变，这可能
是其抗肿瘤的重要机理之一。
(6) 仙人掌果多糖对S哪荷瘤小鼠VEGF蛋白表达及NO含量的影响 本研究表明，仙人掌果多糖组瘤组织中VEGF蛋白表达及NO含量降低，
提示抑制肿瘤血管生长有可能也是仙人掌果多糖抗肿瘤的机制之一。
因此，仙人掌果多糖对肿瘤细胞有一定的抑制作用，对正常细胞的抑 制作用不明显；具有一定抑制肿瘤生长的作用；能提高胸腺指数、脾指数， 提高淋巴细胞增殖功能，增强机体细胞免疫。
本发明通过实验研究得知仙人掌果中所含的仙人掌果多糖可通过调 节内皮功能、抑制肾素血管紧张素系统及逆转平滑肌细胞增殖三方面起到 控制高血压的发生发展；有明显的降血脂、抗氧化、改善血液流变学及肝 脏脂肪变性作用，对防治高脂血症和肝脂肪变性的发生发展有积极意义； 能改善糖代谢和脂代谢，增加胰岛卩细胞、胰岛素受体InsR和Glu4，提 高机体的抗氧化能力、修复受损心肌细胞，对防治糖尿病及其并发症有良 好的潜在应用价值；并具有一定的抗肿瘤作用。因此本发明为开发天然无 毒的防治高血压、高血脂、糖尿病及抗肿瘤的药物或保健品奠定了基础， 有效促进了仙人掌果资源的充分利用。
由于天然药物在高血压病的治疗过程中，对心、脑、肾等多个脏器及
系统具有调节和保护作用，同时可以较好地改善患者的生活质量；治疗高 血糖时能从整体调节出发，扶正固本，改善调节胰岛p细胞及受体的功能， 减少抗体的拮抗，作用温和持久；在降压和降糖的同时能达到降脂；天然 药物及其活性成分抗肿瘤具有多靶点、多途径、多环节的特点；且中草药 具有价格相对低廉，副作用相对较少，辨证论治，灵活加减，非常适宜于 慢性疾病的治疗；因此仙人掌果及仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、 降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品方面将具有良好的应用前景。
具体实施例方式
本发明的实施例l:仙人掌果多糖的制备
取仙人掌果，加10倍重量的水超声提取1. 5小时，提取液浓縮，加 入95%的乙醇，调节浓縮液的乙醇浓度至70%进行沉淀，然后在5000rpm 转速下离心10min，离心沉淀物加水溶解，用体积比为1 : 2的无水乙醇和 乙酸乙酯混合液萃取2次，水层用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，浓縮， 干燥，即得仙人掌果多糖。
其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具体过程为用Sevage溶液(体积比 氯仿正丁醇=4: 1)萃取水溶液2次后，取水层液，调pH至5 7，向水溶 液中加入2u/100ml的木瓜蛋白酶，65。C保温26h， 10000rpm离心5min， 去除底层沉淀，得仙人掌果多糖脱蛋白液。
经测定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量达71.1%。
本发明的实施例2:取仙人掌果打浆(成糊状)，过滤(去渣、去籽)， 加1 20倍重量的水至500 1000ml，再加入0 20%重量的市售凉粉或海 洋胶、0 20%重量的蜜糖或木糖醇，搅拌均匀，放入锅内煮沸后加入允许 范围内的防腐剂，经过滤，装罐，封口，灭菌，放置冷却凝结；或者搅拌 均匀后注模，烘干(保留10 50%水份)，出模，得半成品，包装，即得仙 人掌果膏。该膏剂口服，每次250克，每日1-2次；可用于防治肿瘤。
本发明的实施例3:以新鲜仙人掌果或仙人掌果汁为原料，经全部或 部分发酵或勾兑酿制成酒精度》7% (V/V)的溶液，过滤，装罐，封口， 即得仙人掌果酒。该酒剂口服，每次10ml，每日1-2次；可用于防治肿瘤。
本发明的实施例4:取仙人掌果打浆(成糊状)，过滤(去渣、去籽)， 加糖，搅匀，注模，烘干(保留10 60%水份)，出模，得半成品，包装， 即得仙人掌果果丹皮。该制剂口服，每次l-5克，每日1-2次；可用于防 治肿瘤。
本发明的实施例5:仙人掌果加水煎煮0.5 2小时后，加入1 30% 体积量的牛奶和1 30%体积量的茶水，再加入甜味调料，搅匀，装罐，封 口，灭菌，即得仙人掌果奶茶，该茶剂口服，每次10—25ml，每日l-2 次；可用于防治肿瘤。
本发明的实施例6:取实施例1制备的仙人掌果多糖或仙人掌果，加
入矫味剂，控制合适的相对密度，分装、灭菌，制得仙人掌果多糖口服液
或仙人掌果汁。每lml 口服液中含仙人掌果多糖O. 1克或仙人掌果1克， 每次服用10ml，每日2-3次，用于高血压的治疗。
本发明的实施例7:取实施例1制备的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入溶剂、混匀，静置、滤过，再浓縮至相对密度为1.30 1.35 (50 60 °C)，加入赋型剂制粒或以浓縮液喷雾干燥制粒，分装、灭菌，制得仙人 掌果多糖颗粒或仙人掌果颗粒剂。每袋1-5克，每次服用1袋，每日2-3 次，用于高血脂的治疗。
本发明的实施例8:取实施例1制备的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入适宜的赋型剂，用滚转制粒法制得仙人掌果多糖片或仙人掌果片。每片 含0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙人掌果，每次服用1-5片，每日2-3 次，用于高血糖的治疗。
本发明的实施例9:取实施例1制备的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入适宜的赋型剂，直接用全自动胶囊分装机分装，制得仙人掌果多糖胶囊 或仙人掌果胶囊。每粒含0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙人掌果，每 次服用l-5粒，每日2-3次，用于高血糖的治疗。
本发明的实施例10:取实施例1制备的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入适宜的赋型剂，制成滴丸。每丸含0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙 人掌果，每次服用1-5丸，每日2-3次，用于高血压的治疗。
权利要求
1.仙人掌果在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品中的应用。
2. 仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物 或保健品中的应用。
3. 根据权利要求2所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于仙人掌果多糖是从仙人掌果中提取出来的多糖类成分，其总糖含量为60% 80%。
4. 根据权利要求3所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于仙人掌果 多糖的制备方法为取仙人掌果，加4 10倍重量的水超声提取0. 5 2.5 小时，提取液浓縮，加入40 95%的乙醇，调节浓縮液的乙醇浓度至40 90%进行沉淀，然后在1000 10000rpm转速下离心2 10min，离心沉淀物 加水溶解，用体积比为1 5 : 2 10的无水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取 1 4次，水层用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，浓縮，干燥，即得。
5. 根据权利要求4所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于SeVage+ 木瓜蛋白酶法去除蛋白的过程为用体积比为氯仿正丁醇=4 10 : 1 5 的Sevage溶液萃取水溶液l 3次后，取水层液，调pH至5 7，向水溶 液中加入1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65。C保温20 28h， 1000 10000rpm离心2 10min,去除底层沉淀，得仙人掌果多糖脱蛋白液。
6. 根据权利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的应用，其特征 在于取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加药用辅料，按照常规方法 制备成药物制剂。
7. 根据权利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的应用，其特征 在于将仙人掌果或仙人掌果多糖与其它药用成分组合，并加入或不加药 用辅料，按照常规方法制备成药物制剂。
8. 根据权利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的应用，其特征 在于取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加辅料，按照常规方法制备 成保健品。
9. 根据权利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的应用，其特征在于将仙人掌果或仙人掌果多糖与其它物质组合，加入或不加辅料，按照常规方法制备成保健品。
全文摘要
本发明公开了仙人掌果及从仙人掌果中提取的仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品中的应用。由于仙人掌果中所含的仙人掌果多糖可控制高血压的发生发展，对防治高脂血症和肝脂肪变性的发生发展有积极意义，对防治糖尿病及其并发症有良好的潜在应用价值，并具有一定的抗肿瘤作用，因此本发明为开发防治高血压、高血脂、糖尿病及抗肿瘤的药物或保健品奠定了基础，有效促进了仙人掌果资源的充分利用。而且仙人掌果属于天然植物资源，其药用和保健效果好，对人体多个脏器及系统具有调节和保护作用，价格相对低廉，副作用相对较少，辨证论治，灵活加减，非常适宜于慢性疾病的治疗；因此仙人掌果及仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品方面将具有良好的应用前景。
文档编号A61P9/00GK101352474SQ20081007377
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者刘华钢 申请人:刘华钢