专利名称：肌醇磷脂4位激酶二型α亚型PI4KIIα的应用的制作方法
肌醇磷脂4位激酶二型a亚型PI4KII a的应用
背景技术：
肌醇磷脂(PI)信号通路在跨膜信号转导和多种生长因子和激素调节 细胞生长的信号通路中起核心作用。肌醇磷脂4位激酶PI4K是PI信号通路 中第一个起重要作用的激酶，在肌醇磷脂循环过程中PI4-K首先催化肌醇 磷脂(PI)环上D4位磷酸化，产生4-磷酸磷脂酰肌醇(4-phosphatidyl-inositide， PIP )，然后由PIP5-K激酶进 一 步催化合成(4,5-phosphatidyl-inosidide diphosphate, PIP2); PIP2在磷脂酶C (Phospholipase C， PLC)的作用下水 解为三磷酸肌醇(1,4，5-trisphosphoinositol， IP3 )和甘油二酯(Diacylglycerol ， DAG)，作为第二信使，引发胞内钙释放和激活蛋白激酶C(Protdn kinase C, PKC),启动细胞内的双信使系统。另夕卜，PIP2也是PI3-K的底物，因而PI4K 影响PI3-K信号通路。近年研究发现PIP, PIP2本身也具有重要生物学功能。 因此，PI4K是PI信号通路中的关键分子，关于PI4K的功能研究引起了人们 越来越多的关注。
胞内PI4K相关的信号通路<formula>formula see original document page 4</formula>
细胞生长分化 细胞凋亡 DNA与蛋白合成 代谢调节等
PI4K有二型和三型两种类型，其中二型包括a和e两种亚型(PI4KII a禾口PI4KIIP ) 。 PI4KIIa的基因编码和蛋白序列分别见GenBank accession number: NM一018425(SEQ ID NO: 10)禾B GenBank accession number: NP—060895(SEQIDNO:9)，其主要功能与膜转运密切相关。此外，PI4KIIa在神经递质释放、宿主细胞激活、调控内皮生长因子EGF方面有重要作
用。但其生物学功能还远未得到阐明。其在肿瘤中的作用和机制在国内外 均未见报道。
有文献报道癌症病人的PI激酶活力增高，细胞内PKC的量明显增高， 说明肌醇磷脂信号通路可能与肿瘤相关。关于PI4KIIa也有一些间接证据 表明其可能在肿瘤中起作用。如PI4KII a与调控细胞迁移的蛋白
valosincontaining protein (VCP)共定位，而VCP上调是癌症诊断的一个标志 物。PI4KIIa能调控与肿瘤生长密切相关的表皮生长因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)的表达。大多数肌醇磷脂激酶在癌细胞中酶 活上调，其中包括PI4K。但至今没有关于PI4K与肿瘤生长有关的直接证据 及分子机制研究。
寻找特异信号通路的抗肿瘤靶点和抗血管新生是目前抗肿瘤策略的 焦点。国际上以PI4K下游的信号分子PKC、PLC以及PI3-K为靶分子寻找 新药的工作已有报导。我们研究发现PI4KIIot在缺氧诱导因子HIF-1 a合成 中起关键作用。由于受HIF-1 a转录调控的下游基因一一血管内皮生长因 子VEGF通过调控内皮细胞的增殖、存活、转移控制血管生成，所以HIF-1 a与肿瘤生长和血管新生直接相关，调控HIF-1 a是重要的抗肿瘤的有效 策略。PI4KIIa对HIF-1 a的关键调控作用使其可能在肿瘤生长和血管新生 过程中发挥重要作用。
发明内容
我们首次发现在人宫颈癌HeLa细胞和人肾上皮HEK-293细胞过表达 PI4KIIci ，能显著上调缺氧诱导因子HIF-1 a的蛋白表达以及其下游促血 管新生基因VEGF和一氧化氮合酶NOS的表达。深入分子机制研究表明: PI4KII a对HIF-1 a的调控作用是PI3K, MAPK信号通路依赖的，并且是
通过调控其合成实现的，而对其稳定性和转录水平没有影响。通过RNA 干扰技术特异抑制PI4KIIa表达，HIF-la的表达也被显著抑制，即使外
加缺氧诱导也不能使其升高。这是一个重要发现，也是我们该发明的重要 理论基础即PI4KIIa是HIF-1 a合成所必需的，是调控HIF-1 a的关 键，预示PI4KIIa对HIF-1 a相关的功能都具有调控作用。基于HIF-1 a在肿瘤生长和血管新生中的重要作用，我们进一步研究了 PI4KIIa在肿瘤 中的作用。研究发现，随着肿瘤的生长，PI4KIIci的蛋白表达也显著升高。 通过RNA干扰技术特异降低肿瘤细胞中PI4KII a表达，能显著抑制肿瘤 生长和肿瘤血管新生。并在乳腺癌、宫颈癌等多种类型肿瘤中都起显著作 用。至此，我们首次揭示了 PI4KIIa在调控缺氧诱导因子HIF-la和肿瘤
血管新生方面的新功能和作用的分子机制。研究结果预示肌醇磷脂4位激
酶PI4KIIa可能是抑制肿瘤生长和血管新生的关键靶点。
在一个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，该方法包括以PI4K
为靶点，抑制PI4K的表达或PI4K的活性，其中所述抑制可以是直接的或
间接的。
在一个实施方案中，其中通过RNA干扰来抑制PI4K的表达。 在一个实施方案中，其中实施所述RNA干扰的小RNA序列为 正义链UGAAGCAGAACCUCUUCCUCATT (SEQ ID NO: 1 ) 反义链UCAGGAAGAGGUUCUGCUUCATT (SEQ ID NO:2)。 在一个实施方案中，其中通过对PI4K基因进行基因敲除来抑制PI4K
的表达。
在一个实施方案中，其中通过PI4K酶拮抗剂抑制PI4KI的活性。 在一个实施方案中，其中所述拮抗剂包括海洋活性物质海洋1号药一 海洋12号药。
在一个实施方案中，所述海洋活性物质海洋1号药一海洋12号药来
自海龙科和棘皮海生动物。
在一个实施方案中，其中所述疾病为肿瘤或癌症。 在一个实施方案中，其中所述肿瘤或癌症包括宫颈癌和乳腺癌。 在一个实施方案中，其中所述疾病为与血管新生相关的疾病。 在一个实施方案中，其中所述与血管新生相关的疾病包括肿瘤、关节
炎，糖尿病或视网膜异常。
在上述实施方案中，所述PI4K酶为PI4KIIa亚型。
在另一个方面，本发明提供一种治疗与血管新生相关的疾病的方法， 该方法包括以PI4K为靶点，增强PI4K的表达或PI4K的活性，其中所述 增强可以是直接的或间接的。在一个实施方案中，其中通过过表达来增强PI4K的表达。
在一个实施方案中，其中通过激动剂来增强PI4K的活性。 在一个实施方案中，所述激动剂是海洋13号药一海洋22号药。 在一个实施方案中，所述海洋活性物质13号药—海洋22号药来自海
龙科和棘皮海生动物。
在一个实施方案中，其中所述与血管新生相关的疾病包括伤口愈合或
组织再生。
在前述实施方案中，所述PI4K酶为PI4KIIa亚型。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗与HIF-la所调控基因相关的 疾病的方法，该方法包括以PI4K为靶点，相应地抑制或增强PI4K的表达 或其活性，其中所述抑制或增强可以是直接的或间接的。
在一个实施方案中，所述PI4K是PI4KIIa亚型。
在一个实施方案中，其中所述与HIF-1 a所调控基因相关的疾病包括 糖尿病，肿瘤耐药或心脑血管疾病。
在另一个方面，本发明提供一种筛选药物的方法，其中，该方法包括 以PI4K为靶点，筛选抑制PI4K基因表达或抑制PI4K酶活的物质。
在一个实施方案中，其中所述药物的活性成分为PI4K基因的反义 RNA片段、或PI4K的拮抗剂。
在前述实施方案中，所述PI4K为PI4KIIa亚型。
在一个实施方案中，其中所述药物可以用来治疗肿瘤，癌症，关节炎， 糖尿病，或视网膜异常。
在另一个方面，本发明提供一种筛选药物的方法，其中，该方法包括 以PI4K为靶点，筛选增强PI4K基因表达或增强PI4K酶活的物质。
在一个实施方案中，其中所述药物的活性成分为PI4K的激动剂。
在一个实施方案中，其中所述药物可以用来促进伤口愈合或组织再生。
在前述实施方案中，所述PI4K为PI4KIIa亚型。 在另一个方面，本发明提供一种药物，其包括能够抑制PI4K基因表 达或抑制PI4K酶活的活性成分。
在一个实施方案中，其中所述活性成分为PI4K基因的反义RNA片段、或PI4K的拮抗剂。
在前述实施方案中，所述PI4K是PI4KIIa亚型。 在一个实施方案中，其中所述活性成分为小RNA序列 正义链UGAAGCAGAACCUCUUCCUCATT (SEQ ID NO: 1 ) 反义链UCAGGAAGAGGUUCUGCUUCATT (SEQ ID NO:2)。
在一个实施方案中，其中所述药物可以用来治疗肿瘤，癌症，关节炎， 糖尿病，或视网膜异常。
在另一个方面，本发明提供一种药物，其包括能够增强PI4K基因表 达或增强PI4K酶活的活性成分。
在一个实施方案中，其中所述活性成分为PI4K的激动剂。
在前述实施方案中，所述PI4K是PI4KIIa亚型。
在一个实施方案中，其中所述药物可以用来促进伤口愈合或组织再生。
在一个实施方案中，其中所述活性成分还组合以常规抑制癌症药物。
本发明所述药物的配制方法，剂型，给药途径，其中包含的辅料和载 体等以及有效剂量的确定是本领域技术人员公知的。例如，本发明的药物 除了上述活性成分外，还可以包含药用载体。在本文中，药用的载体指无 毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可 以根据治疗目的、给药途径的需要将所述药物制成各种剂型。
在本文中，给药药物还需要根据相应制剂的特性以及是否能在体内提 供所述活性成分和给药的方便程度而从所属领域技术人员已知的给药方 式中选取合适的方式。给药的有效量根据制剂形式和期望的作用时间以及 治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况 (如，病人的重量、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、 分泌排泄和疾病严重性等)而方便地确定。
以PI4KIIa为耙点具有如下优势
1. PI4KIIa是PI信号通路的上游信号分子，抑制肿瘤效率高；
2. 以PI4K的一个特异亚型作为靶分子，特异性好，副作用少；
3. 以PI特异信号通路的分子为靶分子，毒性小。
此外，该发明不仅在抗肿瘤方面具有重要意义和应用，而且在干预与HIF-1 a所调控基因相关的疾病方面也同样具有重要意义和应用，例如 HIF-la与糖尿病，肿瘤耐药性，心脑血管疾病都密切相关。同样，本发 明也在干预与血管新生相关疾病方面具有重要意义和应用，例如关节炎，
糖尿病视网膜异常，伤口愈合，组织再生等都与血管新生密切相关。所以，
我们申请专利保护肌醇磷脂4位激酶二型a亚型(PI4KII a )的新生物学功 能的发现和基于该新功能的应用。PI4KIIa是一个非常有潜力的干预与 HIF-1 a所调控基因相关的疾病、以及血管新生相关疾病的靶分子，以 PI4KII a作为靶分子可进行上述相关疾病的药物筛选和研发。
图1表示过表达PI4KIIa能显著提高人肾上皮HEK-293细胞中HIF陽1 a的蛋白含量。A是表示检测PI4KIIa的过表达效率的图，其中通过免疫 印迹的方法用PI4KII a的抗体检测在人肾上皮HEK-293细胞中 GFP-PI4KIIa的过表达效率；B是检测过表达PI4KIIa对于HIF-1 a蛋白 表达量的影响的图，其中用HIF-1 a的抗体检测不同处理方式的HEK-293 细胞中HIF-1 a的蛋白含量，以Actin作为内参。H: 1。/。缺氧24小时，Co: 0.2 mM氯化钴处理6小时，N:正常培养对照细胞，GFP:过表达PEGFP-C1 质粒48小时的细胞，GFP-PI4KII a :过表达PEGFP-PI4KII a质粒48小时 的细胞。
图2表示RNA干扰PI4KIIa能显著减少常氧或缺氧条件下多种细胞 中HIF-1 ci的蛋白含量。A是对PI4KIIa的干扰效率的鉴定的图，其中用 免疫印迹的方法检测三种不同细胞(人肾上皮HEK-293细胞，人宫颈癌 HeLa细胞，人乳腺癌MCF-7细胞)中PI4KII a的基因干扰效率；B是检 测常氧条件下干扰PI4KII a对于人宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF-7细 胞中HIF-la蛋白含量的影响的图，其中用HIF-1 a的抗体检测常氧条件 下两种不同癌细胞(人宫颈癌HeLa细胞，人乳腺癌MCF-7细胞)中干扰 掉PI4KIIa对于细胞内HIF-la蛋白含量的影响。对照转染了非特异性 小RNA的细胞，PI4KIIa:转染了 PI4KII a特异性的小RNA的细胞，C 是检测常氧以及缺氧刺激条件下干扰PI4KIIa对于人肾上皮HEK-293细 胞中HIF-la蛋白含量的影响，其中用免疫印迹的方法检测缺氧刺激或常氧条件下干扰掉PI4KIIa对于人肾上皮HEK-293细胞中HIF-1 a蛋白含量 的影响。
图3显示PI4KIIa能调控缺氧诱导因子HIF-1 a下游促进血管新生的 基因VEGF和iNOS。 A是显示过表达PI4KII a对细胞中VEGF的mRNA 表达的影响的图，其中采用RT-PCR的方法检测不同处理方式后人肾上皮 HEK-293细胞中VEGF的mRNA表达水平，以细胞中的P -actin的作为内 参，H: 1%缺氧24小时，Co: 0.2mM氯化钴处理6小时，N:正常培养 对照细胞，GFP:过表达PEGFP-C1质粒48小时的细胞，GFP-PI4KII a : 过表达PEGFP-PI4KII a质粒48小时的细胞；B是显示过表达PI4KII a对 细胞中iNOS的蛋白表达的影响的图，其中用iNOS的抗体通过免疫印迹 的方法检测不同处理方式后细胞中iNOS的蛋白含量，各符号的意义同A。
图4显示肿瘤中的HIF-1 a和PI4KIIa的蛋白含量都随着肿瘤生长增 加。A是表示肿瘤生长不同天数的重量的图，其中将鼠成纤维肿瘤MCA205 细胞注射到C57/BL6小鼠体内，注射后7天，10天，14天，17天后各取 一只小鼠，处死取出肿瘤称取重量；B表示肿瘤生长不同时间时PI4KIIa 和HIF-la蛋白含量检测，其中将A中的肿瘤裂解，用免疫印迹的方法检 测肿瘤中的HIF-1 a和PI4KIIa的蛋白含量。
图5显示RNA干扰PI4KIIa能通过抑制血管新生达到抑制人宫颈癌 HeLa细胞诱导的肿瘤生长的目的。A是表示干扰PI4KIIa对人宫颈癌 HeLa细胞在小鼠体内诱导的肿瘤的生长的影响的图，其中将转染了对照 小RNA和PI4KII a特异性小RNA的Hela细胞按照上文描述的方法注射 到小鼠腹部，每两天测量一次肿瘤的大小，直到肿瘤注射的第18天；B 是干扰PI4KII a对人宫颈癌HeLa诱导肿瘤血红素含量的影响，其中将A 中生长到18天的肿瘤取出，采用Dmbkin's高铁血红蛋白方法测量肿瘤的 血红素含量，进行比较；C是显示用抗CD-31的抗体通过免疫组化的手段 检测干扰掉PI4KIIa对人宫颈癌HeLa诱导肿瘤中血管生长情况的图，其 中将A中培养到18天的肿瘤取出切片，采用抗CD31的抗体通过免疫组 化的方法，比较不同处理方式的肿瘤中的血管情况。
图6显示RNA干扰PI4KII a能明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞和人肾 上皮HEK-293细胞诱导的肿瘤生长。A是显示干扰掉PI4KII a对人乳腺癌MCF-7细胞诱导肿瘤生长的影响的图，其中将转染了对照小RNA和 PI4KII a特异性小RNA的MCF-7细胞按照上文描述的方法注射到小鼠腹 部，每两天测量一次肿瘤的大小，直到肿瘤注射的第18天；B是显示干 扰掉PI4KIIa对人肾上皮HEK-293细胞诱导肿瘤生长的影响的图，其中 将转染了对照小RNA和PI4KII a特异性小RNA的HEK-293细胞按照上 文描述的方法注射到小鼠腹部，每两天测量一次肿瘤的大小，直到肿瘤注 射的第18天，选择4天，8天，12天肿瘤生长情况进行比较。
图7显示经典的抑癌药物长春新碱(VCR)和长春瑞宾(VNR)对于 PI4K的酶活都有抑制作用。A是显示长春瑞宾和长春新碱对PI4K酶活的 影响的图，其中用不同浓度的VCR和VNR处理HeLa细胞1-3小时后， 按照上文所述方法检测PI4K的酶活，以溶剂处理组为对照，进行比较处 理；B是显示长春瑞宾和长春新碱对细胞中HIF-la的影响的图，其中采 用免疫印迹的方法检测不同浓度的VCR和VNR处理HeLa细胞1-3小时 后细胞中的HIF-la的蛋白含量。
图8显示在海洋活性提取物中筛选对PI4KII a有调控作用的分子。A 显示筛选得到的对PI4K酶活有抑制作用的海洋活性提取物，其中对数生 长期的人宫颈癌HeLa细胞经过不同海洋提取物处理1-3小时后用相应裂 解液裂解，采用上述PI4K酶活测定的方法进行其酶活检测，将对PI4K酶 活有抑制作用的药物处理所得数据进行比较分析；B显示筛选得到的对 PI4K酶活有激活作用的海洋活性提取物，其中与A种样品同样处理，将 对PI4K酶活有激活作用的药物处理所得数据进行比较分析。
下面通过实施例来更好说明和理解我们的发明，但我们的发明和应用 不限于实施例的范围。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉 的《生物化学与分子生物学实验技术》(高等教育出版社，杨安钢，毛积 芳，药立波主编)；《蛋白质电泳技术》(科学出版社，郭尧君编著)；《蛋 白质相互作用分子克隆手册》(清华大学出版社，Erica Golemis编著)； 《细胞实验指南》(科学出版社，D丄.斯佩克特等著，黄培堂等译)；《精编 分子生物学实验指南》(科学出版社，F.奥斯伯R.布伦特等著，颜子颖等 译)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。
具体实施方式
实施例l:材料和方法 细胞培养
人宫颈癌HeLa细胞(ATCC: CCL2),人乳腺癌MCF-7细胞(ATCC: HTB-22 )和人肾上皮HEK-293 (ATCC: CRL-1573)细胞获自美国典型 细胞培养中心(ATCC)。细胞在DMEM营养混合物(Kaighn' s改进)中 培养，该营养混合物含有10%胎小牛血清(Hycloe)，硫酸链霉素(100u g/ml)，和氨苄青霉素(100单位/ml)，细胞放于细胞培养箱37°C， 5%C02 的条件下进行培养。按照制造商的使用说明，通过使用阳离子型脂质 Lipofectamine 2000 (invitrogen)，在6孔或6-cm板中对所述细胞进行转染 (30%-60%汇合)(具体方法参见invitrogen Lipofectamine 2000产品说明 书)。转染之后培养6小时细胞换液到含10%胎牛血清和双抗的DMEM培 养基中继续培养。
半定量RT-PCR
根据制造商的使用说明，用TRIzol (irwitrogen)提取细胞中的总RNA， 并经过紫外分光光度计(德国Eppendorf生产，型号为603105430)定量 后取2ug进行反转录，反转录具体实验方法如下2ug的RNA与适量 逆转录酶(MMLTV-RT ， Promega) 、 RNA酶抑制剂(Promega)在42。C共 同孵育1小时，然后72'C孵育10分钟获得细胞总cDNA。随后将20 nM VEGF的上游弓I物(CCATGAACTTTCTGCTGTCTT)(SEQ ID NO: 5)， 20 nM VEGF的下游引物(ATCGCATCAGGGGCACACAG) (SEQ ID NO: 6)， 4 Hi cDNA， 12.5 lU预混聚合酶混合物(takara)以及无菌水混合至总体 积25ul，进行25个循环的PCR实验94。C30秒，60°C 30秒，72°C 30 秒。PCR产物进行琼脂糖电泳并通过凝胶成像系统(BIO-PRINT凝胶成像 系统,法国)进行半定量分析。以细胞内的肌动蛋白(P-actin)作为内参。
免疫印迹
细胞经过相应处理(如瞬时转染，缺氧处理等)后，用0.25%胰酶消 化细胞，800g离心5分钟后弃掉上清收集细胞，然后用PBS清洗细胞2遍，用RIPA裂解液Tris.HCl， 50 mmol/L，pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40， 1%;脱氧胆酸钠，0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; 1.2mM苯甲基磺 酰氟(PMSF),l吗/ml亮抑酶肽(leupeptin) ， l吗/ml抑肽酶(aprotinin)) 裂解30分钟，裂解产物12000g离心15分钟。取上清与2X SDS加样缓冲 液(0.1MTris-cl;4。/oSDS;0.2。/。溴芬兰，20%甘油，0.1MDTT)混合，100°C 煮10分钟，离心取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳后转膜(硝酸纤维膜， PALL)，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1.5小时后，分别用相应蛋白的 抗体(具体稀释浓度参见所用抗体的说明书)(如兔抗鼠抗HIF-1 a抗体， Santa curz;羊抗兔抗PI4KII a抗体，Abgent;兔抗羊抗Actin抗体，Santa curz;羊抗兔抗iNOS抗体，Santa curz)孵育1.5小时，用TTBS (50mM Tris/HCl ， 140mMNaCl， 0.05% Tween-20 ， PH7.2)洗所述膜3次，每 次15分钟。相应二抗(根据一抗的情况确定二抗，BIOS)孵育1个小时， 再次洗膜3次，每次15分钟后，NC膜上发光底物，进行曝光检测(具体 方法参考精编分子生物学实验指南)。
PI4K酶活检测
用裂解液(lOOmM NaCl,300mM蔗糖，3mM MgCl2,l%Triton X-100，5mMCaCl2,10mM Pipes, 1.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF),lng/ml亮抑 酶肽(leupeptin)， l|ig/ml抑肽酶(aprotinin) ,lOmM NaF和5 mM EDTA (PH6.8))裂解细胞(1C^细胞/ml裂解液)，冰上裂解20分钟，650g离心 10min,去除细胞核及较大的细胞碎片，保留含有PI4K蛋白的上清。将提 取的PI-4K蛋白溶液l(Vl加入20iiil的检测缓冲液(50mM Tris-HCl,2mM EGTA (乙二醇二乙醚二胺四乙酸)，2mM EDTA, 10mM Mg2+, 0.4% TritonX-100, 1.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF),l吗/ml亮抑酶肽(leupeptin)， ljig/ml抑肽酶(aprotinin))。每个Eppendorf管里加入15|li1前述处理好的 PI4K混合液，lOpl含500|ig/ml的PI脂质体溶液，2pCi[ Y -32P]ATP溶液。 振荡均匀，置于37。C水浴，反应5-10min。取出Eppendorf管放置冰上， 加入lOO)nl的lmol盐酸溶液，再加入300^1的氯仿甲醇(2:1， v/v)混 合液，终止反应。振荡两分钟，离心lmin。溶液分成两相，上相为水层， 下相为有机层。将水层吸走，保留有机相。再用1NHC1: CH3OH(l:l,V/v),洗两遍。收集有机相，真空蒸发。用氯仿溶解磷酸化产物PI(4)P，用TLC 薄板做展层实验。展层约25min，将TLC薄板置于通风厨内凉干，将薄板 放于碘缸内碘蒸汽染色imin。 PI4K磷酸化产物PI(4)P在TLC薄板上的定 位是根据标准PI(4)P在薄板上的位置来确定的。使用以磷屏存储技术 (Wang,Y丄，Wang,J" Sun,H.Q.， Martinez,M,， Sun,Y.X.， Macia，E., Kirchhausen,T., Albanesi，J.P., Roth,M.G., and Yin,H丄.(2003). Phosphatidylinositol 4 phosphate regulates targeting of clathrin adaptor AP-1 complexes to the Golgi. Cell //《299-310.)为原理的Storm 820 Imaging System (Amersham Pharmacia Biotech)测量32P-PI(4)P条带的放射活性。根 据获得的"P-PI(4)P放射活性来对裂解液中PI4K的酶活做一个相对的定量 分析，所检测到的32P-PI(4)P放射活性与PI4K的酶活成正比。
动物研究
按照食品与药物管理局的非临床实验室研究的良好实验室规范(GLP 条例)和根据作为立法基础的德国动物保护法进行体内实验。
C57BL/6小鼠和BALB/C裸鼠(维通利华)在SPF条件下保养(层流 气流设备，Scantainer, Scanbur)，分别用作MCA205小鼠肿瘤细胞(MCA205 细胞从C57BL/6鼠分离，分离方法参考文献Shu， S. Y., S. A. Rosenberg. 1985. Adoptive immunotherapy of newly induced murine sarcomas. Career A" 45: 1657-1662)和人宫颈癌HeLa细胞，人乳腺癌MCF-7细胞的受体。 2X 105/0.2ml MCA205细胞接种到6-8周的C57/BL6小鼠腹部两侧，接种 后3天，7天，10天，17天后将小鼠处死，取出肿瘤采用上述免疫印迹的 方法用于HIF-la和PI4KIIa的蛋白含量检测。5 X 106/0.2ml HeLa细胞或 者MCF-7细胞经过相应的基因操作(瞬时转染PI4KII a特异性小RNA或 非特异性对照小RNA)后，经过过夜培养，用0.25%胰酶消化后注射入小 鼠的腹部两侧，同只小鼠的两侧分别是实验组和对照组的细胞。经过18 天的大小测量观测，处死小鼠采用Drabkin's高铁血红蛋白方法(Drabkin，D. (1949》The standardardization of hemoglobin measurement. Am. J. Med. Sci. 2/7, 710-711.)测量肿瘤的血红素含量以及用抗CD-31的抗体做免疫组化 的方法检测肿瘤中血管生长情况(A Giatromanolaki. (1997) Comparative evaluation of angiogenesis assessment with anti-factor-VIII and anti-CD31
14immunostaining in non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research, Vol 3, Issue 12 2485-2492)。
实施例2:过表达PI4KII a对肿瘤细胞中与肿瘤生长密切相关的缺氧诱导 因子HIF-la的调控功能研究
人肾上皮HEK293细胞按照上述方法瞬时转染质粒PEGFP-PI4KII a或 PEGFP-Cl (PEGFP-Cl购买自Promage， PEGFP-PI4KII a根据《精编分 子生物学实验指南》构建)。48个小时后，裂解细胞，用上述免疫印迹的 方法对细胞中的PI4KIIci进行检测，以确定转染效率。在检测到转染的 GFP-PI4KIIa表达的基础上，检测过表达细胞中HIF-1 a的蛋白含量，并 以细胞中的持家蛋白肌动蛋白(Actin)作为比较的内参。为了保证实验的 可靠性，我们设计了阳性对照的实验，我们采用0.2mM氯化钴处理细胞6 小时(Co)， P/。氧气处理细胞24小时的HEK-293 (H)中的HIF-la蛋白 含量与正常氧气培养下的细胞中该蛋白含量进行比较。
此结果证明过表达PI4KIIa能像氯化钴或者缺氧一样能导致HIF-1 a 蛋白在细胞体内含量的增加(图1)。
实施例3干扰PI4KII a对缺氧诱导因子HIF-1 a的调控功能研究
合成 一 段专门干扰PI4KII a的小RNA序列(正义链 UGAAGCAGAACCUCUUCCUCATT ( SEQ ID NO:l );反义链 UCAGGAAGAGGUUCUGCUUCATT (SEQIDNO:2))和非特异性的对 照小RNA序列(正义链UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO:3); 反义链ACGUGACACGUUCGGAGAATT(SEQIDNO:4))。按照上述方法 里的说明对HeLa细胞和MCF-7细胞进行转染后培养72-96个小时，将细 胞进行裂解并进行上述免疫印迹检测PI4KIIa的蛋白含量以确定所述干 扰序列的干扰效果，在证明干扰小RNA的千扰效率很高的基础上检测干 扰细胞与对照细胞中HIF-la的蛋白含量，进行比较，以细胞中的持家蛋 白肌动蛋白(Actin)作为内参。为了确定在缺氧条件下，PI4KIIa是否也 对HIF-1 a有相应的调控作用，HEK-293细胞在瞬时转染了千扰PI4KIIa 特异性小RNA或非特异性的对照小RNA后66个小时加入氯化钴处理6个小时，然后对干扰效率和相应的HIF-1C1进行检测比较。
本结果证明，不管在常氧条件还是缺氧条件下，干扰掉PI4KIIa都能 显著的抑制细胞中HIF-la的蛋白含量(图2)。
实施例4. PI4KII a对HIF-1 a下游促血管生成基因的调控功能研究 在人肾上皮HEK293细胞中过表达GFP-PI4KIIa和GFP，转染后48
小时，按照本文上述方法进行RT-PCR实验检测过表达细胞与对照细胞中 VEGF的mRNA水平并进行比较，持家基因肌动蛋白(P-actin)做为比 较的内参。使用VEGF (引物序列见实施例1)与肌动蛋白P-actin)的相 应上下游引物(P-actin上游引物TCCTGTGGCATCCACCAAAC (SEQ IDNO:7) ; P-actin下游引物GAAGCATTTGCGGTGGACCA (SEQID NO:8))。为了验证实验方法的正确性，我们设立了阳性对照，B卩0.2mM 氯化钴处理细胞6小时(Co)， 1。/o氧气处理细胞24小时的HEK-293 (H) 中的VEGFmRNA含量与正常氧气培养下的细胞中该基因的mRNA含量 进行比较。为了进一步验证PI4KIIa对于HIF-1 a下游调控基因的影响， 我们选择了在人宫颈癌细胞HeLa中检测另外一个受HIF-1 a调控且与血 管新生有着密切联系的蛋白诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。实验设计与方 案与VEGF的检测相同。
本结果证明过表达PI4KIIci能显著上调与血管新生密切相关的缺氧 诱导因子HIF-la的下游基因VEGF和iNOS的转录和表达(图3)。
实施例5.检测肿瘤在不断长大的生长过程中PI4KIIa和HIF-1 a的蛋白 含量变化
生长对数期的小鼠成纤维瘤MCA205细胞(MCA205细胞从C57BL/6 鼠分离，分离方法参考文献Shu， S. Y., S. A. Rosenberg. 1985. Adoptive immunotherapy of newly induced murine sarcomas. Ca"cer Was. 45: 1657-1662)用0.25c/。胰酶消化收集后用PBS洗3遍。通过细胞计数调节最终 的细胞浓度为l X 10Vml,然后注射到C57/BL6小鼠腹部两侧，每侧注射0.2 ml细胞悬液。肿瘤种植之后3天，7天，10天，17天时分别取一只小鼠出 来，处死后取出肿瘤，测量重量后用RIPA裂解液匀浆裂解15分钟，从裂解 混合物中取50ul出来，12000g离心15分钟后采用BCA方法(参考细胞实验
16指南)来测裂解产物总蛋白浓度，剩下的裂解混合物加SDS加样缓冲液煮
沸15分钟，用于按照实施例l中的免疫印迹方法检测PI4KIIa ， Actin和 HIF-1 a的蛋白含量。
实验结果证明，随着肿瘤的生长，肿瘤组织中的PI4KIIa和HIF-la的
蛋白含量都明显增加(图4)。
实施例6. PI4KIIa对人宫颈癌HeLa细胞诱导的肿瘤血管新生以及肿瘤 生长的调控
人宫颈癌HeLa细胞瞬时转染前述序列(实施例3中所述序列)的PI4KI1 a特异性干扰小RNA或非特异性对照小RNA后20小时，用0.25%胰酶消化 收集后用PBS洗3遍。通过细胞计数调节最终的细胞浓度为2.5X 10々ml,然 后分别注射到BALB/C裸鼠小鼠腹部两侧，每侧注射0.2ml细胞悬液。细 胞注射后每隔天用游标卡尺测量大小，在肿瘤生长到18天时，处死小鼠， 取出肿瘤采用Drabkin's高铁血红蛋白方法测量肿瘤的血红素含量以及用 抗CD-31的抗体(购自BD公司)做免疫组化的方法(具体方法参照细胞实 验指南)检测肿瘤中血管生长情况。
本结果表明干扰掉PI4KIIa后能显著抑制人宫颈癌HeLa细胞诱导的 肿瘤中血管的新生(图5B，C)，并抑制肿瘤的生长(图5A)。
实施例7.PI4KI1 a对乳腺癌MCF-7细胞以及人肾上皮HEK-293细胞诱
导的肿瘤生长的调控
人乳腺癌MCF-7细胞以及人肾上皮HEK-293细胞均瞬时转染PI4KIIa
特异性小RNA或非特异性小RNA (序列与实施例3中所述一致)后20小时， 用0.25。/。胰酶消化收集后用PBS洗3遍。通过细胞计数调节最终的细胞浓度 为2.5 X 10々ml,然后分别注射到BALB/C裸鼠小鼠腹部两侧，每侧注射0.2 ml 细胞悬液。细胞注射后每隔天用游标卡尺测量肿瘤大小，直到肿瘤生长到 18天时。
该实验结果表明，干扰掉PI4KIIa后能明显抑制乳腺癌MCF-7细胞以 及人肾上皮HEK-293细胞诱导的肿瘤生长(图6)。实施例8.经典抑癌药物长春新碱(VCR)和长春瑞宾(VNR)对PI4K 和HIF-1 a的调控
人宫颈癌HeLa细胞培养至对数生长期，低血清(1%血清)预处理12 小时后，在原有培养基中加入不同浓度(25nM ， 50nM) VCR或者不同浓 度(15yM， 60uM) VNR与细胞共同孵育l-3小时，0.25%胰酶消化后细 胞按照实施例1中测定PI4K酶活的方法检测细胞裂解液中的PI4K的活力， 用于检测HIF-1 a蛋白含量的细胞在相应药物处理后用RIPA裂解液裂解， 按照实施例l中描述的方法做免疫印迹实验。
此结果表明长春新碱和长春瑞宾这两种经典的抑癌药物对于PI4K的 酶活有明显的抑制作用，并有一定的剂量依赖性(图7A)，同时这两种药 物对于PI4KIIa所调控的转录因子HIF-1 ci的蛋白量也有抑制作用(图 7B)。
实施例9.筛选对PI4K酶活有调控功能的药物
选取20余种海龙科和棘皮海生动物，经过冻干研磨获得粗粉，再经 过95%和50%的乙醇两次提取后保留上清液，再经过石油醚，乙酸乙酯， 正丁醇以及水的分馏获得不同溶解性的各成分，然后通过柱层析的技术获 得众多的单体化合物，用于检测在人宫颈癌HeLa细胞中对PI4K酶活的影 响。具体检测方法如下人宫颈癌HeLa细胞培养至对数生长期，低血清(1。/。 血清)预处理12小时后，在原有培养基中加入不同的海洋动物有效提取物 与细胞在细胞培养箱中共同孵育1-3小时后采用上述PI4K酶活检测的方法 检测各种不同药物对于PI4K的酶活影响。
此实验筛选过程中共筛选得到10种上调PI4K酶活的海洋活性物质，12 种下调PI4K酶活的海洋活性物质(图8)。参考文献
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<130〉 IB083197
〈160〉 10
<170〉 Patentln version 3.1
〈210> 1
〈211〉 23
<212〉 RNA <213>人工序列
<220〉
<221>特异性干扰PI4KI1 a的小RNA序列正义链
<222> (l)..咖
<223>
<400> 1
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〈210> 2
<211〉 23
<212〉 RNA <213〉人工序列
<220>
<221〉特异性干扰PI4KI1 a的小RNA序列反义链
〈222〉 (1). ■ (23)
<223〉
〈400> 2
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<210〉 3
<211〉 21〈212〉 RNA <213>人工序列
<220〉
〈221〉非特异性对照小RNA序列正义链
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<400> 3
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<210> 4
<211> 21
<212> 隱 <213>人工序列
<220>
<221〉非特异性对照小RNA序列反义链
<222〉 (1). ■ (21)
〈223〉
<400> 4
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<210> 5
<211> 21
〈212〉 腿
〈213〉 人工序列
<220〉
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〈222> (1)..(21) 〈223〉
〈400> 5
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<210> 6
<211〉 20
<212〉 腿<213〉人工序列 <220>
〈221> VEGF下游引物
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<400〉 6
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<210> 7
<211> 20
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<221> " actin上游引物
<222> (l)..咖 <223>
<400〉 7
tcctgtggca tccaccaaac 20
<210> 8
<211〉 20
<212〉 腿 <213>人工序列
<220〉
<221〉 P - actin下游引物
<222> (l)..咖 〈223>
〈400〉 8
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<210> 9
<211〉 479
<212〉 PRT
〈213〉 人<220>
<221〉 PI4KII a的蛋白氨基酸序列
〈222> (1)..(479)
〈223〉
<400> 9
Met Asp Glu Thr Ser Pro Leu Val Ser Pro Glu Arg Ala Gin Pro Pro 15 10 15
Asp Tyr Thr Phe Pro Ser Gly Ser Gly Ala His Phe Pro Gin VaPro 20 25 30
Gly Gly Ala Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Pro Ser Pro 35 40 45
Pro Glv Ser Pro Glv His Asp Arg Glu Arg Gin Pro Leu Leu Asp Arg 50 55 60
Ala Arg Glv Ala Ala Ala Gin Gly Gin Thr Gin Thr Val Ala Ala Gin 65 70 75 80
A]a Gin Ala Leu Ala Ala Gin Ala Ala Ala Ala Ala His Ala Ala Gin 85 90 95
Ala His Arg Glu Arg Asn Gli, Phe Pro Glu Asp Pro Glu Phe Glu Ala 100 105 110
Val Val Arg Gin Ala Glu Leu Ala lie Glu Arg Cys lie Phe Pro Glu 115 120 125
Arg lie Tyr Gin Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Phe Val Lys Asp Pro Gin 130 135 140
Gly Arg lie lie Ala Val Phe Lys Pro Lys Asn Glu Glu Pro Tyr Gly M亏 150 155 160
His Leu Asn Pro Lys Trp Thr Lys Trp Leu Gin Lys Leu Cys Cys Pro
170 1^5
Cvs Cys Phe Glv Arg Asp Cys Leu Val Leu Asn Gin Glv Tyr Leu Ser 180 185 190
Glu Ala Glv Ala Ser Leu Val Asp Gin Lys Leu Glu Leu Asn lie Val 195 200 205
Pro Arg Thr Lys Val Val Tyr Leu Ala Ser Glu Thr Phe Asn Tyr Ser 210 215 220
Ala lie Asp Arg Val U's Ser Arg Gly Lys Arg Leu Ala Leu Glu Lvs 225 230 235 240
Val Pro Lvs Val Glv G]n Arg Phe Asn Arg lie Glv Leu Pro Pro Lys 245 250 255<image>image see original document page 24</image><400> 10 cggccgcgagcgcagtggtgtgga.gcgcgccgggtcccggagccggctgtctgagggatg60
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"tt,gctgac"t33ttCC418权利要求
1.一种筛选药物的方法，其中，该方法包括以PI4K为靶点，筛选抑制PI4K基因表达或抑制PI4K酶活的物质。
2. 权利要求l所述的方法，其中所述药物的活性成分为PI4K基因的反义 RNA片段、或PI4K的拮抗剂。
3. 权利要求1或2中的方法，其中所述PI4K为PI4KIIa亚型。
4. 权利要求1或2所述的方法，其中所述药物可以用来治疗肿瘤，癌症， 关节炎，糖尿病，或视网膜异常。
5. —种筛选药物的方法，其中，该方法包括以PI4K为靶点，筛选增强PI4K 基因表达或增强PI4K酶活的物质。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述药物的活性成分为PI4K的激动剂。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述PI4K为PI4KII a亚型。
8. 权利要求5或6所述的方法，其中所述药物可以用来促进伤口愈合或组 织再生。
9. 一种药物，其包括能够抑制PI4K基因表达或抑制PI4K酶活的活性成 分。
10.权利要求9的药物，其中所述活性成分为PI4K基因的反义RNA片段、 或PI4K的拮抗剂。
11.权利要求9或10所述的药物，其中所述PI4K为PI4KII a亚型。
12. 权利要求9或10的药物，其中所述活性成分为小RNA序列 正义链UGAAGCAGAACCUCUUCCUCATT(SEQ ID NO: 1) 反义链UCAGGAAGAGGUUCUGCUUCATT(SEQ ID NO:2)。
13. 权利要求9的药物，其中所述药物可以用来治疗肿瘤，癌症，关节炎， 糖尿病，或视网膜异常。
14. 一种药物，其包括能够增强PI4K基因表达或增强PI4K酶活的活性成分。
15. 权利要求14的药物，其中所述活性成分为PI4K的激动剂。
16. 权利要求14或15的药物，其中所述PI4K为PI4KIIa亚型。
17.权利要求14或15的药物，其中所述药物可以用来促进伤口愈合或组 织再生。
全文摘要
本发明公开了肌醇磷脂4位激酶(Phosphatidylinositol 4-kinase type IIα，PI4KIIα)的新的生物学功能，以及基于该新功能的应用。PI4KIIα在调控缺氧诱导因子HIF-1α及其下游促血管新生基因VEGF中起关键作用。选择性降低PI4KIIα表达，能显著抑制肿瘤生长和肿瘤血管新生。PI4KIIα可作为干预HIF-1α所调控基因相关的疾病、以及血管新生相关疾病的靶分子。此外，利用该靶分子可以针对上述相关疾病进行药物筛选。
文档编号A61P17/02GK101560546SQ20081010427
公开日2009年10月21日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者李江美, 畅 陈 申请人:中国科学院生物物理研究所