专利名称：：一种用于免疫调节的胶束溶液的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于免疫增强或免疫调节的胶束溶液，其中含有胶束化的枸杞多糖或是含有胶束化(micelles)的枸杞多糖提取物。该枸杞多糖胶束可以有效避免机体对单独注射枸杞多糖产生的过敏反应，同时增加枸杞多糖在消化道中的吸收。该枸杞多糖胶束对机体产生免疫增强或免疫调节作用，尤其对需要增强或调节免疫功能而进行疾病起到治疗、改善、预防作用。本发明还包括对肿瘤、感染、自身免疫性疾病、糖尿病、过敏性疾病、消化系统疾病(过敏性肠道综合征(IBS)、炎症性肠道疾病(IBD)、便秘、腹泻等)的治疗、改善和预防作用。
背景技术：
：枸杞属植物新鲜或干燥果实的水溶性部分分离得到的枸杞多糖，一般是由杂多糖组成。其经元素分析，还显示含有氮元素。同时，枸杞多糖样品由于来源不同、最终的应用目的不同，其中常含有多种氨基酸、小肽及多种微量元素。例如，枸杞多糖(LBP)是由六种己碳单糖ARA、GLC、GAL、MAN、XYL和RHA组成的多糖侧链和十八种氨基酸组成的蛋白质主链构成。经过科研人员的大量试验工作，目前普遍认为枸杞对骨髓造血干细胞、粒单系祖细胞增殖分化具有调节作用，能提高抗细菌感染力，对肝损伤有保护作用；枸杞多糖可以调节免疫功能低下、具有解毒、抗感染作用。其注射液能使免疫器官(胸腺和脾脏)重量增加，对体液免疫和细胞免疫有促进作用，是其发挥免疫调节、抗肿瘤、抗感染、促进造血功能等作用的基础。其中的多糖肽有很好的抗脂质过氧化活性。胶束是胶体分散系中的一种，属于缔合胶体。聚合物胶束的粒径通常在200nm以下,属于物质由宏观向微观的过渡区域。这种特殊结构可导致四种效应小尺寸效应、表面与界面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，并表现出传统固体物质所不具有的许多特殊性质。因此，期待与以往的制品相比，能以医药产品、保健食品或功能食品的形式，充分、有效地利用枸杞多糖用于维持改善动物(特别是人)的健康。本发明的目的是制备出一定粒径范围内的胶束(Micelle)溶液，以增加口服给用时其粘膜的吸收性，或是降低注射给用枸杞多糖时机体产生的致敏作用，从而有效地利用枸杞资源，特别是有效地利用具有明确活性的枸杞多糖制备用于免疫调节和免疫增强的饮食品(保健食品、功能性食品等)或医药产品(医药组合物)。
发明内容为了解决上述课题，本发明者对己有产品中各种成分的利用进行了深入调査，发现进一步进行了研究，结果发现，将枸杞多糖制备成胶束溶液(例如将枸杞多糖分散到水中制备10pm以下的胶束，更进一步优选0.01lpm的胶束)状态时，显著改善粘膜的吸收，增加枸杞多糖分子结构的稳定性，结果可以起到增强或调节免疫功能。基于以上各种发现，完成了本发明。本发明的制剂特征之一是即便经胃肠道给用也显现优良效果，特别是安全性上显现其优点。尤其可以期待，在体内通过粘膜(特别是小肠粘膜)吸收而刺激增强全身免疫的效果.因此,可以期待,该胶束溶液可作为具有免疫增强/免疫调节作用的医药组合物、饮食品(保健食品等)形式使用。枸杞多糖来自于茄科(5Wfl"ceae)枸杞属";;c/w"L.)植物1种或几种植物的果实的提取物，也可以经发酵、组织培养等其它方式而得到。一般来说，这些丰直物包括枸丰己Z^c/wwC7z/weseMill、北方枸丰己Z^c/wwCTn'wewMill.尸otom'm7(Pojark.)A.M.lu、宁夏枸丰己Linn.、截萼枸丰己丄.fnwcafwmY.C.Wang、新i畫拘丰己Ldosy5fe附w附Projark.、会工枝拘丰己￡.t/osyWewwwProjark.var.rubricaulium、云南枸丰己丄.yw"wa"e"seKuangetA.M.Lu黑果枸丰己丄.rwr/zem'cwwMurr.丰主筒枸丰己丄.KuangetA.M.Lu、黄果枸丰己丄.Zar6arwwLinn.Fbr.awn2wricaApw附K.F.Ghing、土库曼拘丰己丄.fwrco附am'cwwTurcz.、安《惠逊氏拘禾己_Law^fersow'And.、毛'森拘丰己Z.dasyWe附w附Pojark.、力口,H拘t己丄.ca/z》rm'cw附(CaliforniaAVolfberry)、欧洲枸杞Lewrap"eww(EuropeanWolfberry)以及其它茄科枸杞属植物。将来自上述来源的枸杞多糖进行胶束化时，优选该成分在水溶液中形成凝集体。将超微粒子分散到水中进行测定时，微粒的平均粒径应在100pm以下，优选50pm以下，更优选10nm以下，更进一步优选平均粒径在0.01~l|im左右。应用力度分布仪可容易求出其平均粒径。进行超微粒化的方法无特殊困难可以使用搅拌机和匀浆器，可以使用适当的分散剂进行超微粒化，也可以通过高压乳化机、超声波等微粉化处理等方法得到合适的超微粒子。例如，应用高压乳化机制备前述lpm以下的超微粒子，所采用的乳化压，优选300kgf/cr^以上，更优选500kgf/cm2，进一步优选800kgf/cii^以上，但随处理次数的增加可适当降低乳化压。本发明的胶束化溶液，可应用乳化剂达到胶束化状态使用。关于分散剂的使用量，以含有的枸杞多糖的水溶液中所含全糖(糖总量为l)，按重量比计，优选最多混合该分散剂100(100以下)份，更优选10以下，更进一步优选0.055左右。此时，为了更好得用于实际应用，保证产品的质量可控、安全有效，也可以包含制剂学上允许的载体、增溶剂、抗氧化剂及其他辅料。通过测定抗肿瘤活性、NK(NaturalKiller)细胞活性、迟发超敏反应、细胞内外细胞因子的测定、抗体的产生量等，可以很容易地验证有无免疫增强作用。通过豚鼠试验，可以检测产品的过敏性行为。上述超微粒子可以通过动物，尤其是人的小肠粘膜吸收，可达到免疫增强效果或免疫调节效果。当其通过注射方式给用时，可以降低或消除枸杞多糖对机体产生的致敏作用。本发明的最终产品适用的对象是所有动物，特别是人。最终产品的特征之一是即便经口服给用时也能显现出优良效果，对给用方式无特殊限制。可采用经口给用、非经口给用(皮下、肌肉、静脉、经鼻、气雾或喷雾给用等)各种实施方案，可简便地适用于广大需求免疫增强或免疫调节作用的患者，大大增加了产品的安全性。本发明最终产品给用量要根据疾病的种类、严重程度、制剂的形式等作适当的选择。例如经口服给用时，以总糖换算，优选每天给患者给用lmg50g左右，可以在餐前、中间或餐后给用，但优选餐前给用。另外，静脉给用时，应适当减少给用量。做为预防用，无论健康的人，还是各种疾病的患者，均可给用本发明的最终产品已到达到全身的免疫增强或调节作用，并不特别限于伴随免疫功能异常的疾病患者。对于人以外的动物而言，可以饲料、医药产品和医药组合物的形式使用。图l是胶束化枸杞多糖粒径范围图具体实施例方式下面通过具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。实施例1将来源于宁夏枸杞6fl^anwjLinn.的粗多糖样品经过反复不同浓度的药用乙醇处理，同时辅以离心和膜分离及凝胶色谱技术，精制后得到的总多糖样品。将总多糖样品溶于蒸馏水中得到枸杞多糖溶液，同时将卵磷脂(SLP-PC700,浓度0.8mg/ml)加入到蒸馏水中制备4倍枸杞多糖浓度的卵磷脂溶液。接着在真空搅拌的情况下(真空度-0.1MPa,均匀搅拌机转速15，000rpm),将枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制备预胶束化溶液。将预胶束化溶液经高压乳化处理(乳化压1500kgf/cm2)，制备出lOOnm左右的胶束溶液。应用激光衍射/散射式粒度分布测定法进行中位径的测定(见图l)。实施例2将来源于枸杞丄K&wCW"ewMill、宁夏枸杞丄.6ar6an/wLinn.、新疆枸杞丄.^w"^m/;nProjark.的枸杞多糖混合样(硫酸苯酚法显色，紫外分光光度法标定多糖的含量45%)品溶液加入到等浓度的卵磷脂溶液中，边充入氮气边搅拌(锚式搅拌机转速50rpm)，制备预胶束化溶液。将预胶束化溶液经高压乳化处理(乳化压1500kgf/cm2)，制备出100nm左右的胶束融液。应用激光衍射/散射式粒度分布测定法进行中位径的测定(图略)。实施例3将来源于宁夏枸杞^c/ww6wk/n/加Linn.的粗多糖样品经过精制后得到总多糖样品，进一步应用膜分离技术得到分子量在8，00030，000之间的多糖样品。将此多糖样品溶于蒸馏水中得到枸杞多糖溶液，同时将大豆卵磷脂加入到蒸馏水中制备4倍枸杞多糖浓度的卵磷脂溶液。接着在真空搅拌的情况下(真空度-0.1MPa,均匀搅拌机转速15,000rpm)，将枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制备预胶束化溶液。将预胶束化溶液经高压乳化处理(乳化压1500kgf/cm2)，制备出90nm左右的胶束溶液液。应用激光衍射/散射式粒度分布测定法进行中位径的测定(图略)。实施例4将经过脱色素处理后黑果枸杞Ayc/wmn^zem'cwmMurr.的成熟果实，用低浓度的药用乙醇提取得到总的粗多糖。将粗多糖样品经过反复不同浓度的药用乙醇处-理，同时辅以离心和膜分离技术，精制后得到的总多糖样品溶于蒸馏水中得到枸杞多糖溶液，同时将卵磷脂(SLP-PC700)加入到蒸馏水中制备与枸杞多糖相同浓度的卵磷脂溶液。接着在真空搅拌的情况下(真空度-0.1MPa，均匀搅拌机转速15000rpm)，将枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制备预胶束化溶液。将预胶束化溶液经高压乳化处理(乳化压1200kgf/cm2)，制备出100nm左右的胶束化液。应用激光衍射一散射式粒度分布测定法进行中位径的测定(图略)。实施例54每主产于甘肃张掖土库曼枸杞ft^co附am'cw附Turcz.或西北枸杞丄./70tom'm7Pojark.(甘枸杞)的果实脱色素后，用低浓度的药用乙醇提取得到总的粗多糖。将粗多糖样品经过反复不同浓度的药用乙醇处理，同时辅以离心和膜分离技术，精制后得到的总多糖样品溶于蒸馏水中得到枸杞多糖溶液，同时将大豆卵磷脂加入到蒸馏水中制备与枸杞多糖相同浓度的卵磷脂溶液。接着在真空搅拌的情况下(真空度-0.1MPa，均匀搅拌机转速13，000卬m)，将枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制备预胶束化溶液。将预胶束化经高压乳化处理(乳化压1500kgf/cm2)，制备出100nm左右的胶束化液。应用激光衍射散射式粒度分布测定法进行中位径的测定(图略)。实施例6应用S180皮下移植模型的实施例，试验方法以腹水的形式采取Sarcoma180肿瘤细胞，该细胞在ICR小鼠(雌性，4周龄)腹腔内移植传代，用生理盐水调成3xl0、ell/ml。将该细胞稀释液移植到ICR小鼠(雌性，4周龄)的右腰背皮下，0.1ml/只。次日，根据体重进行分组(7只/组)，进行个体标记后，开始施用枸杞多糖及相应的枸杞多糖胶束溶液。1日l次经口服给用，5天后休息2天，共进行10次。每次的给用量按总糖换算成44mg/Kg。表1和表2中表示给用组的情况，枸杞多糖浸膏和胶束化的枸杞多糖后面扩弧内的数字是按总多糖量换算的使用量，单位是mg/kg。每周测定一次肿瘤直径和体重。根据肿瘤直径，用以下公式计算肿瘤的重量。肿瘤重量(mg)=肿瘤短径(mm)2><肿瘤长径(mm)+2根据肿瘤重量可以计算出肿瘤增殖抑制率肿瘤增殖抑制率(％)=(l-给用组的肿瘤重量+无处置组的肿瘤重量)x100下面仅通过肿瘤移植后第16天的各组肿瘤增殖抑制率和肿瘤生长情况，评价在该模型中药效。表l肿瘤重量(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>t-检验Student'st-检验，分别将各组相对于无处置组进行t-检验。M-检验Mannwhi加ey-U检验，分别将各组相对于无处置组进行顺位和检验。N.S.:无显著性差异；p<0.01有显著性差异。枸杞多糖胶束溶液的给用组中，在给用期间，与对照组相比，逐渐抑制肿瘤增殖，p<0.01，显著抑制肿瘤增值。表2肿瘤增殖抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上结果表明，与以前的产品相比，本发明产品的胶束溶液可达到期望的药效。实施例7:豚鼠过敏试验将实验动物分为枸杞多糖组l(分子量8,000~30,000)、枸杞多糖组2(分子量30，000~100,000)、枸杞多糖组3(分子量100,000~300,000)、枸杞多糖胶束组(多糖分子量8,000~1，000，000)、2%卵白蛋白阳性对照组、0.9%氯化钠注射液阴性对照组。各组动物以无菌操作隔日分另Uip注射0.5ml/只，共三次致敏，然后将各组动物分为2批，每批3只，分别于首次注射后第14、21天静脉注射lml/只攻击。于攻击后15min内，观察动物有无咳嗽、抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、休一克及死亡等情况。反应级数_反应症状_0无明显反应1只有轻微抓鼻、颤抖或竖毛2有3次或以上咳嗽、有抓鼻、颤抖或竖毛3多次或连续咳嗽、伴有呼吸困难或痉挛、抽搐等4痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡给药组及阴性对照组动物经两次攻击后，未见明显异常症状，试验结果均为阴性。而阳性对照组可见动物出现呼吸困难、痉挛、大小便失禁、休克死亡等。结果表明枸杞多糖的胶束溶液对豚鼠无致敏作用(见表3)。表3过敏试验结果攻击时间组别动物数评分平均分阴性对照组30000阳性对照组34444枸杞多糖32343第14天组l枸杞多糖组232332.7枸杞多糖组333142.7胶束组30000阴性对照组0000阳性对照组34444枸杞多糖32121.7第21天组l枸杞多糖组233212枸杞多糖组333222.3胶束组300008实施例8溶血试验取兔血15ml，去除纤维蛋白，经四次洗涤，将所得红细胞用0.9%氯化钠注射液稀释成2n/。(v/v)的混悬液。然后取试管7支，15号管加入受试药物0.10.5ml;第6管不加受试物，作阴性对照；第7管仍不加受试药物，用蒸馏水代替O.9氯化钠注射液，作阳性对照。将各管置于37'C水浴中保温，开始每隔15分钟观察一次，l小时后每隔l小时观察一次，连续观察4小时。结果阳性对照管加入蒸馏水后即刻出现溶血现象。阴性对照管及各试验管连续观察4小时，上清液无色透明，无溶血现象，经振荡摇匀后红细胞均匀散开，也无红细胞凝聚现象。结果表明，枸杞多糖胶束溶液对家兔红细胞无明显体外溶血及致凝集作用(见表4)。表4枸杞多糖胶束溶液溶血试验结果组别管号0.250.5药后时间(h)0.751234阴性管6—阳性管7+1—2—++++++枸杞多糖胶束3—溶液4—5—一无浴血十全浴血，阴性对照为生理盐水(阳性对照为蒸馏水实施例9血管刺激试验取内毒素控制在1.0以下的枸杞多糖胶束样品(Endosafe法，USP30)及0.9%氯化钠注射液。将实验动物分为胶束溶液组和0.9%氯化钠注射液对照组，给用剂量为人临床用量的等效剂量，每日给药一次，连续7天，分别以无菌操作家兔耳缘静脉推注给药。推注后肉眼观察局部静脉血管及周围组织有无红肿，末次推注后将动物处死，于注射部分近心端1.5cra至3cm处剪取耳缘，用10%甲醛固定，常规组织切片，观察有无血栓形成，内皮损伤及其它病理变化。结果给药期间及末次用药24小时后，肉眼观察各组动物耳缘静脉及周围组织无红肿现象，组织切片检查可见兔耳血管完整，未见内皮损伤，周围组织无水肿及炎性细胞浸润，与对照组比较无明显差异。结果表明，枸杞多糖胶束溶液对家兔血管无明显刺激作用，亦未引起血管周围组织明显病变。权利要求1.一种用于免疫增强或免疫调节的胶束溶液，其中含有胶束化的枸杞多糖。2.根据权利要求1所述的枸杞多糖胶束溶液，含有起乳化作用的分散剂卵磷脂，最终的产品为水溶液。3.根据权利要求2所述的胶束溶液，当溶液中枸杞多糖的含量为1时，以重量比计，最多混合100份分散剂。4.根据权利要求1~3任一项所述胶束溶液，可以含有制剂学上允许的载体或增量剂以及矫味剂。5.根据权利要求14任一项所述的胶束溶液，总糖在整个体系内所占重量百分比为0.01~80%。6.根据权利要求1~5任一项所述的胶束溶液，其所含有的枸杞多糖胶束为分散剂与多糖溶液混合制备出0.01100pm的粒子。7.根据权利要求6所述的胶束溶液，其中优选制备出平均粒径为lpm以下的胶束溶液。8.根据权利要求17任一项所述胶束溶液，枸杞多糖来自于茄科(So/a"ceae)枸杞属(Ayc/"wL.)植物1种或几种植物的果实的提取物，也可以经发酵、组织培养等其它方式而得到，一般来说，这些植物包括枸杞Ayc/wmCW"ewMill、北方枸杞厶C7z/朋^Mill.户o/aw/m7(Pojark.)A.M.Lu、宁夏枸杞丄.6flr6an/附Linn.、截萼枸杞丄Jnmcflrt/wY.C.Wang、lfi畺枸丰己丄.i/osyWewwnProjark.、会工枝拘丰己Z.(/oyj^fewwwProjark.vw.rubricaulium、云南拘丰己_L少wrawa"ewjeKuangetA.M.Lu黑果枸丰己丄.rwAem'cwwMurr.柱筒枸丰己丄.KuangetA.M.Lu、黄果拘禾己L6crr6wwwLinn.Far.awaw/icfir/pwAWK.F.Ching、土库曼枸杞丄.fwco附aw/cw附Turcz.、安德逊氏枸杞丄.aw(3fersow'And.、毛森枸杞丄.c/asy5fewwmPojark.、力卩州枸杞丄.ca/z/om/cww(CaliforniaWol化erry)、欧洲枸杞ewopaeww(EuropeanWolfberry)以及其它茄科枸杞属植物。9.根据权利要求1~8任一项所述胶束溶液，其中所含枸杞多糖的分子量为小于3,000,000。其中所含枸杞多糖的分子量优选为8,0001,000,000。10.根据权利要求19任一项所述枸杞多糖胶束溶液，它可单独在癌症、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病，也可以用于其它制剂治疗或预防时的辅助用药，也可以作为某些制剂处方中的一部分应用。全文摘要一种用于免疫调节的胶束溶液，涉及免疫增强作用和/或免疫调节制品领域，其是将来自于茄科(Solanaceae)枸杞属植物(LyciumL.)的枸杞多糖或含枸杞多糖的提取物制备成胶束溶液。优选将枸杞多糖进行分散化处理，尤其是制备出一定粒径范围内的胶束(Micelle)溶液，以增加口服给用时粘膜对枸杞多糖的吸收性，或是降低注射给用时机体对枸杞多糖产生的致敏作用，从而发挥免疫增强作用和/或免疫调节作用。文档编号A61K9/00GK101559140SQ20081010419公开日2009年10月21日申请日期2008年4月16日优先权日2008年4月16日发明者仰振球,冯志媛,刘万水,尹永祥,李军林,谭皕营申请人:北京京卫燕康药物研究所有限公司