专利名称：一种建立多发性硬化动物模型的方法
技术领域：
本发明属于医药动物模型技术领域，具体涉及一种建立多发性硬化动物 模型的方法。
背景技术：
多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种以炎症、脱髓鞘、轴索 破坏为特点的神经系统疾病，它的起因和病理尚不完全清楚。实^r性自身免 疫性脑脊il炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)为研 究MS普遍应用的动物模型，在许多方面模拟了人类MS的特点。
EAE可以由多种抗原诱导，如髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、蛋白脂蛋白(proteolipid protein, PLP )、髓鞘少突胶质细胞糖蛋 白(myel in ol igodendrocyte glycoprotein, M0G)等,然而以往大多数EAE 模型仅模拟出MS的急性期表现，仅很少试验真正模拟出具有典型慢性期的 MS。 MOG的含量在中枢神经系统中只占0. 05-0. 1%,却能诱导出具有多相病程 的EAE模型，且能在模型脑内产生大片脱髓鞘斑块，这与以往MBP、 PLP等诱 导的以炎性病灶为主的EAE模型明显不同，更加近似的模拟了MS，为后续的 临床治疗提供了有利的参考，但是利用M0G建立的EAE模型，与利用其他抗 原建立的EAE模型相比，M0G诱导的EAE模型临床表型多样，发病率也不同， 文献报道从不发病到100%发病非常不一致，非常不稳定，是其缺点，所以建 立一个稳定的EAE动物模型，对于后续的免疫学、影像学、病理学的研究都 有很大实用价值。
MR影像作为临床和病理的一个重要的辅助工具，可以对MS动物模型中 新旧病灶进行观察，对整个发病过程进行全程监测，是临床表现的一个重要 补充。而目前用于MRI研究EAE病理改变的大鼠模型以急性炎症为主，脱髓 鞘轻微，仅适用于急性炎症期研究，无法开展MTI等新技术在髓鞘损伤方面 的研究。由于大鼠中枢神经系统的体积很小，进行大鼠MRI研究通常选用超 高场强(>4. 7T)设备及专用小孔径动物线圈，但这些设备普及率很低，使之应用受到很大限制。有学者尝试在临床型MRI设备上应用特殊小孔径动物线 圈进行大鼠的MRI研究，结果仅能获得脑组织及其病灶的MRI图像，无法获 得质量满意的脊髓图像，而且这些小孔径线圏由研究者自制，使其普及应用 受到限制。有报道应用豚鼠进行1.5TMR成像，但其图像组织分辨率差，仅能 粗略估计病灶形态，对于精细解剖结构的显示非常不理想。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种建立多发性硬化 动物模型的方法，通过该方法制得的EAE模型，稳定性好，对于后续的免疫 学、影像学、病理学的研究有非常实用的临床价值，为研究人类的多发性硬 化疾病提供了有利的支持。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案是 一种建立多发性硬化动物 模型的方法，包括以下步骤
步骤一、准备动物，健康雄性Lewis大鼠，普通级；
步骤二、准备诱导剂MOG35.55肽段；
步骤三、制备动物模型
将MOG35.55溶于生理盐水，然后与等体积的佐剂混合成乳化物，然 后将上述乳化物注射Lewis大鼠，注射次数为两次以上，9-12周后即 制得多发性硬化动物模型；
步骤三中，将MOG35-55溶于生理盐水时，每pl生理盐水中MOG35-55 的用量为3-6pg,生理盐水的用量为30-lOOpl;
更进一步，步骤三中，每pl生理盐水中MOG35.55的用量为3 - 6jig, 生理盐水的用量为50jxl;
进一步，步骤三中，分次注射时，分为2-3次注射，每次注射的间 隔时间为3-6周；再进一步，如果分2次注射，每次注射的间隔时间为6周，如果分3次注射，每次注射的间隔时间为3周；
进一步，步骤三中，分次注射时，每次注射乳化物0.6-0.20ml;更 进一步，每注射乳化物的剂量为0.10ml;
进一步，步骤三中，对Lewis大鼠注射时，选择Lewis大鼠尾根部 皮下注射。
本发明的效果在于采用本发明所述方法制备的多发性硬化动物模型， 该模型的稳定性好，非常适合于临床对多发性硬化的研究，并且能够为影像 学、病理学的研究提供满意的图像质量，为人们更好的认识和研究多发性硬 化提供了良好的模型。
图1是三种临床表型的EAE大鼠发病进程图，其中，图1A是单纯急性 型大鼠发病进程；图1B是慢性进展型的大鼠发病进程；图1C是复发緩解 型的大鼠发病进程；
图2是急性期的EAE模型大鼠病灶的MR影像表现，其中，图2A是 T2WI见脑桥大片云雾状高信号示意图，图2B是双侧丘脑病灶,并可见USPIO 强化示意图3.是EAE模型大鼠病灶的组织病理学表现，其中，图3A是LFB染 色，(光镜xlOO),实施例1中的大鼠的丘脑病灶，内嚢部分受累，可见大 片脱髓鞘斑块；图3B是HE染色，(光镜xlOO),实施例2中的大鼠的左 顶叶皮层病灶，炎症细胞围绕小血管周围，伴有小胶质细胞和巨噬细胞浸润 示意图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述 实施例1
本实施例意在建立一种急性重度EAE模型，该方法建立的EAE模型的 发病临床表现以中重度为主，发病时间一致，病灶相对较大，脱髓鞘病灶重，
5适合典型急性期研究，建立该模型的具体方法如下
步骤一、准备健康雄性Lewis大鼠10只，普通级，体重为300士10g;
步骤二、准备诱导剂MOG35.55肽段，该物质可以在生物用品试剂公司
购买到，也可以自己合成，本实施例中的MOG35-55肽段为宣武医院自己合成
的；
步骤三、制备动物模型
本实施例中，每次注射时均先将MOG35.55溶于50^1的生理盐水中，
然后与等体积的佐剂50)^1混合成乳化物O.lml,然后对Lewis大鼠进行 乳化物注射，注射部位为尾根部皮下注射；本实施例中，注射次数为 2次，2次注射的间隔时间为6周，第一次注射时，乳化物中含有150吗 MOG35_55、添加含结核分枝杆菌(H37RA型)200pg的完全福氏佐剂 (complete Freund' s adjuvant, CFA) 50pl;第二次注射时，乳化物 中含有300jag的MOG35.55、不完全福氏佐剂(incomplete Freund' s adjuvant, IFA)5(^1，第2次注射后即制成急性重度EAE模型；
本实施例中所用的佐剂IFA购自Sigma公司，IFA (不完全福氏佐 剂)添加MT后即为CFA(完全福氏佐剂)，MT即结核分枝杆菌(H37RA 型)，在佐剂中的浓度为4mg/ml,生理盐水与佐剂的量是等量的，可以 根据需要适当改变，保证MT的浓度即可；生理盐水的作用是溶解 MOG35-55，佐剂的目的是包裹抗原小颗粒，使之緩慢释放并产生最大量 的抗体。
本实施例制得的急性重度EAE模型，其临床表现、MR影像及组织 病理学表现如图1A 、 2A、 3A所示。
实施例2
本实施例意在建立一种多相病程的慢性期EAE模型，通过本发明所述的 方法建立的模型其临床表现以轻中度为主，发病时间不一，发病持续时间不 同，具有急性、慢性进展、慢性复发和隐匿型多个病程，其病灶大小与方法 一无明显差别，但病灶范围更加广泛，脱髓鞘程度相对方法一为轻，适合慢性期的研究，建立该模型的具体方法如下
步骤一、准备健康雄性Lewis大鼠10只，普通级，体重为300士10g; 步骤二、准备诱导剂MOG35.55肽段，该物质可以在生物用品试剂公司
购买到，也可以自己合成，本实施例中的MOG35.55肽段为宣武医院自己合成
的；
步骤三、制备动物模型
本实施例中，每次注射时均先将MOG35-55溶于50^il的生理盐水中， 然后与等体积的佐剂50^1混合成乳化物O.lml，然后对Lewis大鼠进行 乳化物注射，注射部位为尾根部皮下注射；本实施例中，注射次数为 3次，每次注射的间隔时间为3周，第一次注射时，乳化物中含有150吗 MOG35-55、添加含结核分枝杆菌(H37RA型)200pg的完全福氏佐剂 (complete Freund' s adjuvant, CFA) 50^1;第二次及第三次注射时， 乳化物中均含有150(xg的MOG35.55、不完全福氏佐剂(incomplete FreuruT s adjuvant, IFA)50pl，第3次注射后即制得慢性期EAE模 型。
本实施例中所用的佐剂IFA同样购自Sigma公司。
本实施例制得的多病程EAE模型，其临床表现、MR影像及组织病 理学表现如图1A、图IB 、图1C、 2B、 3B所示。
上述两个实施例中，对Lewis大鼠分次注射的用量可总结为如下表
格
注射剂量 乳化物0. 1ml第一次注射第二次注射第三次注射
实施例1含有150U gM0G35-55的生 理盐水50 u 1 +含有 MT200 u g的CFA 50 u 1含有300U gM0G35-55的生 理盐水50 y 1 +IFA 50 u 1
实施例2含有150U gM0G35-55的生 理盐水50 u 1 +含有 MT200 u g的CFA 50 u 1含有150U gM0G35-55的生 理盐水50 u 1 +IFA 50 u 1含有150y gM0G35—55的生 理盐水50 u 1 +IFA 50 u 1
通过上述两个实施例可以看出，本发明所述方法建立的EAE才莫型，其优
7点在于两种方法都模拟了 MS典型的脱髓鞘病灶，病灶范围大，方法二更 加模拟了 MS的临床不均一性。两种模型在3.0TMR设备上成像清晰，无论 是脑还是脊髓都有清晰的组织分辨率，病灶边界清楚，无论是Gd-DTPA或 是USPIO造影剂强化，都可见明确的强化效果，非常有助于临床进行研究。
上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式 或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的 实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由 附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在 本发明的范围内。
权利要求
1、一种建立多发性硬化动物模型的方法，包括以下步骤步骤一、准备动物，健康雄性Lewis大鼠，普通级；步骤二、准备诱导剂MOG35-55肽段；步骤三、制备动物模型将MOG35-55溶于生理盐水，然后与等体积的佐剂混合成乳化物，然后将上述乳化物注射Lewis大鼠，注射次数为两次以上，9-12周后即制得多发性硬化动物模型。
2、 如权利要求1所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于步骤三中，将MOG35.55溶于生理盐水时，每H1生理盐水中MOG35.55的用量为3-6pg，生理盐水的用量为30- 100^1。
3、 如权利要求2所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在 于步骤三中，每pl生理盐水中MOG35.55的用量为3 - 6pg,生理盐水的 用量为50^1。
4、 如权利要求1或2所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特 征在于步骤三中，分次注射时，分为2-3次注射，每次注射的间隔时间为 3-6周。
5、 如权利要求4所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在 于如果分2次注射，每次注射的间隔时间为6周，如果分3次注射，每次 注射的间隔时间为3周。
6、 如权利要求2所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在 于步骤三中，分次注射时，每次注射乳化物0.6-0.2ml。
7、 如权利要求6所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在 于每次注射乳化物的剂量为0.10ml。
8、 如权利要求1所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在 于步骤三中，对Lewis大鼠注射时，选择Lewis大鼠尾根部皮下注射。
全文摘要
本发明属于医药动物模型技术领域，具体涉及一种建立多发性硬化动物模型的方法。本发明所述的方法，将MOG<sub>35-55</sub>肽段与佐剂形成的乳化物分2-3次注射Lewis大鼠，采用尾根部皮下注射，每次注射的间隔时间为3-6周，从而成功得到EAE动物模型。采用本发明所述的方法制得的多发性硬化动物模型，稳定性好，非常适合于临床对多发性硬化的研究，并且能够为影像学、病理学的研究提供满意的图像质量，为人们更好的认识和研究多发性硬化提供了良好的模型。
文档编号A61B19/00GK101564320SQ20081010496
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者于春水, 张海琴, 李坤成, 文 秦, 佳 马 申请人:首都医科大学宣武医院