专利名称：紫铆素及其衍生物在制备具有抑制免疫系统作用药物的用途的制作方法
紫铆素及其衍生物在制备具有抑制免疫系统作用药物的用途 发明领域
本发明涉及一种化合物及其衍生物的新用途，具体来说，是紫铆 素及其衍生物在制备治疗色素代谢疾病如白癜风和白发的药物的用 途。
背景技术：
白癜风是常见的一种局限性色素减退性皮肤病，发病率为
0.5-2.0%，由于致病原因和发病机理目前尚未明确，国际上至今仍处 于易诊难治的状况。该病被世界医学界列为疑难病症之一。目前白癜 风的药物治疗方法有补骨脂素联合UVA治疗、皮质激素疗法、凯林 联合UVA疗法、金属元素配合PUVA疗法、苯丙氨酸配合UVA疗 法以及中药疗法。驱虫斑鸠菊为菊科植物驱虫斑鸠菊Vemonia anthelminticaWilld的瘦果。于夏秋果实成熟时割取；或分别割取成熟 果枝，打下果实，存于阴凉干燥处。原产于印度、巴基斯坦，中国新 疆已有长约四百年的栽培历史。主要分布于新疆阿克苏地区。是新疆 维吾尔民间治疗白癜风的药物，在70年代新疆药学研究人员将其制 成医院制剂，应用于临床治疗白癜风，治愈率为7-20%，有效率大于 90%，并且未见毒副作用。但是至今对驱虫斑鸡菊中的有效成分尚不 清楚。为此，本发明人进行了进一步的筛选分离工作，发现了驱虫斑 鸠菊治疗白癜风和白发等其他色素代谢疾病的化合物为紫铆素，从而 完成了本发明。发明目的
本发明的目的是提供紫铆素及其衍生物在制备治疗色素代谢疾 病如白癜风和白发的药物的用途。
发明内容
本发明所述的紫铆素为3"-4，-7-三羟基二氢黄酮，结构式为
紫铆素衍生物包括在5,6，7，8，3，,4',5',6'位被-OH取代的一组化合物及 生成的相应糖苷类化合物；或被-OR或-R取代的一组化合物，其中R 为Q-C8的烃基。
它可以从植物驱虫斑鸠菊种子或其他植物中提取获得，也可以通 过化学合成获得。如果从驱虫斑鸠菊种子中提取获得，提取方法之一 为用甲醇加热回流，得到甲醇提取液，减压回收，浓縮，得到浓縮 液，用乙酸乙酯和水分配，取乙酸乙酯层，将上清液通过硅胶柱层析， 用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到洗脱液，再在硅胶柱层析用石油醚-丙酮 (4: l-h 1)洗脱，将洗脱液，再用葡聚糖凝胶LH20用50-80%甲 醇洗脱，得到洗脱液，再用十八烷基键合硅胶层析，用50-100%甲醇 洗脱，得到洗脱液，再用硅胶柱层析用氯仿-甲醇(10-25: 1)洗脱， 得到。经过色谱分析证实为紫铆素。我们进行药理实验证实，紫铆素可使黑色素细胞增殖，酪氨酸酶 的活性提高，黑色素含量增高，可提高黑色素合成基因(酪氨酸酶基 因.酪氨酸酶相关基因-1、酪氨酸酶相关基因-2)的表达，使黑色 素小体类型发生明显变化，更趋向于色素颗粒的产生。因此，紫铆素 可以治疗色素代谢疾病。紫铆素对细胞免疫、体液免疫具有抑制作用。
通过对血清抗体、补体以及T淋巴细胞分泌IL-2活性分析，进一步 在分子水平显示紫铆素对免疫系统具有抑制作用。紫铆素对黑色素瘤 细胞系SKMel-19， SKMel-23，Mel-2A,MeWo,Bro.表现出了抑制作用。
附图
简介
图i…一紫铆素及其衍生物在体外对黑色素含量的影响。
图2-…-紫铆素在体外对黑色素细胞内酪氨酸酶活性的影响。
图3-…-紫铆素在体外对黑色素细胞增殖的影响。
图4-…紫铆素在体外对黑色素合成基因表达影响。
图5-…紫铆素在体外对黑色素细胞中黑色素小体的影响。
图6一…紫铆素在对棕色豚鼠皮肤黑色素细胞的影响。
图7一…紫铆素在体外对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。
图8-…紫铆素在体外对小鼠脾细胞分泌IL-12活性的影响。
具体的实施方案
实验例1紫铆素的体外药效学研究
因白癜风患者皮损区的色素细胞及其功能受损，我们研究了紫 铆素对体外培养的人体黑色素细胞的影响。1. 1.实验方案
1. 1. l筛选模型正常人黑色素细胞；
1. 1. 2.来源儿童包皮环切手术的多余包皮，无感染。
1. 1. 3.培养条件:取正常儿童包皮胰酶消化后获得黑色素细胞，存:DMEM培养基中添加bFGF,CT，TPA,FCS,双抗等各种因子，5%C02，37"C条件下培养7天后进行传代，传代细胞在上述条件下培养48小时后加入不同浓度的药物和对照，测定相关分析指标。1. 1. 4.测定方法细胞增值用MTT法；酪氨酸酶活性测定W多巴
染色法;黑色素含量用碱消化法;黑色素合成基因(酪氨酸酶接W.酪
氨酸酶相关基因-l 、酪氨酸酶相关基因-2 )的农达用Northern Blotting;
电镜分析用扫描电镜。1. 2.结果
1. 2. 1.紫铆素及其衍生物在体外对黑色素细胞中黑色素的影响紫铆素及其衍生物在体外对黑色素细胞中合成黑色素的f Mf]'
提高作用，见阁1。其中化合物为紫铆素(Butin):
/服 分子式C15H1205
严—\
沿V^、Y^、^K^—M分子量272 kD
6紫铆素衍生物I:紫铆查尔酮(Butein)
紫铆素衍生物II:5,6,7,4'—四羟基黄酮
i. 2. 2.紫铆素在体外对黑色素细胞中酪氨酸酶活性的影响
紫铆素在体外可提高黑色素细胞屮酪氨酸酶的活性，见阁
1. 2. 3.紫铆素在体外对黑色素细胞增值的影响紫铆素可促进黑色素细胞增殖，见f冬l3。
分子式- Cl5Hl205分子量272 kD
/—、
《> 、，,《命-"DM
,'丫 Y W
分于式C15H1()06分子量286 kD
《/
今
胁防'1. 2. 4.紫铆素在体外对黑色素合成基闺表达的影响
对其机理探讨得出紫铆素可提高黑色素合成基因(酪氨酸酶战因.酪氨酸酶相关基因-1、酪氨酸酶相关基因-2)的表达，见阁4。
1. 2. 5.紫铆素在体外对黑色素细胞中黑色素小体的影响从电镜分析可看到黑色素小体类型发生明显变化，更趋向十色素
颗粒的产牛。见图5。
实验例2.紫铆素的体内药效学研究
通过灌胃给药观察紫铆素对棕色豚鼠体内黑色素细胞在^底^所含比例的影响。
2. 1.实验方案
实验动物英闺短毛棕色豚鼠，新疆实验动物中心提供。受试药物设置
紫铆素
高浓度组8.74mg/kg (按最大耐受量的1/25计算)
屮浓度组4.37mg/kg (按撮大耐受l:的1/50计算)
低浓度组2.19mg/kg (按最大耐受量的1/100计党)
阳性对照组8—M0P (8甲氧基补骨脂素，中W药品牛:物制品鉴定
所)阴性对照组2.5%氢醌空白对照组；生理盐水
2. 2.动物模型的建立
先外用氢醌和补骨脂(8-M0P)，观察氢醌、8-M0P对有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞的影响外用氢醌后，可使有色豚鼠皮肤站底层增厚，使黑色素生成减少这一结果与有关文献相符；使用8-MOP后，可使有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞增加。确定模型成.、〉:。
2. 3.结果
紫铆素Rl提高有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞的比例。『^i、屮、低剂量的紫铆素可以使用药前后有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞冇显著性变化(PO.05);高、屮、低剂量的紫铆素组之问无^著性斧异(P>0.05)，但在数值上有变化。其中屮剂量组对有色豚鼠皮肤堪底^黑色素细胞的影响较大。见图6。
实验例3 .紫铆素对小鼠免疫系统的影响
3. 1.实验方案
3. i. 1.实验模型培养昆明系新生小鼠脾细胞。3. 1. 2.动物来源新疆实验动物中心提供。
3. 1. 3.培养条件:取昆明系新生小鼠脾脏胰酶消化后获得脾细胞，在RPM11640培养基中添加FCS，双抗等各种因子，5%C02, 37('C条件下培养下培养48小时后加入不同浓度的药物和对照，测定相关分析指标。3. 2.结果
山TN前病W研究多支持fJ癜风的发病与免疫系统冇关，发现l。癜风患者体内有特异性抗体存在。进行紫铆素对小鼠免疫系统影响的研究结果显示紫铆素对细胞免疫、体液免疫具冇抑制作用。通过对脾细胞及脾细胞分泌1L-2活性分析，进-'歩在分子水平显&紫铆素对免疫系统具有抑制作用，见图7， 8。
实验例4 .紫铆素在体外对黑色素瘤细胞的影响
由于紫铆素可使黑色素细胞增殖，我们考察了其在体外对黑色素瘤细胞的影响。
4. 1.筛选模型黑色素瘤细胞系SKMel-19， SKMel-23， Mel-2A，MeWo， Bro;
4. 2.来源德国柏林自由大学本杰明 富兰克林医学研究屮心。
4. 3.培养条件在DMEM培养基中添加FCS,双抗等各种因子，5%C02， 37()C条件下培养24小时后加入不同浓度的药物和对照，测定相关分析指标。
4. 4.测定方法细胞增值用MTT法4. 5.结果
紫铆素可对黑色素瘤细胞系SKMel-19， SKMel-23， Mel-2A，MeWo， Bro表现出了不同程度的抑制作用。
10
权利要求
1.紫铆素及其衍生物在制备抑制免疫系统作用药物的用途，其中所述的紫铆素及其衍生物的结构式为紫铆素衍生物包括在5，6，7，8，3’，4’，5’，6’位被-OH取代的一组化合物及生成的相应糖苷类化合物；或被-OR或-R取代的一组化合物，其中R为C1-C8的烃基。
全文摘要
本发明公开了紫铆素及其衍生物在制备具有抑制免疫系统作用药物的用途，其特征在于将紫铆素及其衍生物作为活性成分与药学上可接受的载体制成具有抑制免疫系统作用的药物。
文档编号A61P17/00GK101559050SQ20081017219
公开日2009年10月21日 申请日期2004年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者于鲁海, 力 孙, 靖 尚, 徐建国, 李建红 申请人:靖 尚