透皮免疫流感多价疫苗的制备及其方法

专利名称：：透皮免疫流感多价疫苗的制备及其方法
技术领域：
：本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种透皮免疫的流感多价疫苗。
背景技术：
：流感是由流感病毒(influenzavirus)引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，在世界各国广泛流行，是危害人类健康的重要传染病之一。因此，冊O宣布对流感要严加监控。20世纪曾有过3次全球性的流感大流行，仅第一次大流行(1918-1919年)就造成2000多万人死亡，比第一次世界大战死亡的总人数还要多，而且死亡的大多数是青壮年，造成巨大的社会和经济损失。近年来，季节性流感周而复始的爆发流行，H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染人的事件，以及H7N7、H9N2亚型流感病毒的出现，并已跨越种属感染传播的事实，再次给人类敲响了警钟，流感的暴发不再是有或无的问题，而是早与晚的问题。据国家权威部门透露，我国每年流感的发病高达10亿人次以上，经济损失数百亿元以上。近些年来，我国的生态环境严重破坏，流感的发生和发展规律发生了较大变化，发病频率上升，造成了严重的社会影响和重大的经济损失。目前，对于流感尚无有效的治疗手段，而疫苗免疫接种是行之有效的手段，并发挥着重要的作用。给健康成年人群接种流感疫苗，60-80%的人会起到预防发病的效果(当传播的病毒毒株与疫苗采用毒株相同时)，更重要的是，给高危人群接种疫苗可以明显降低流感的发生，减少住院率及死亡率。冊0已为各国提供了制备流感疫苗的病毒株，国内外广泛使用的仍然是上世纪70年代基于鸡胚生产的流感灭活疫苗，主要以注射为主，并且灭活全病毒疫苗不能用于12岁以下儿童的接种、裂解疫苗抗原性弱、组分疫苗效果差，均不适用于突发性流感大流行和生物恐怖/生物战剂造成的短期内流感大流行的预防，特别是现有的免疫程序对老年人及儿童保护效果欠佳，急需解决无针无痛、简便快速、无交叉感染、安全高效的问题。因此，开展透皮免疫流感多价疫苗制备及其方法的研究成为迫切而又极为重要的科学问题。自从1940年流感病毒灭活全病毒疫苗、裂解疫苗相继问世以来，老年人群的病死率及感染的发生率都明显下降了。目前，已获准上市的流感灭活病毒疫苗主要包括针对H1N1、H3N2和B型的流感三价灭活全病毒疫苗、三价灭活裂解疫苗和亚单位疫苗，这些疫苗主要经注射途径接种，诱导血清中的抗HA/IgG抗体的产生，而不能诱导黏膜免疫sIgA抗体的产生，然而对异型流感病毒的交叉保护性反应，主要决定于自然感染过程中诱导的IgA抗体交叉反应性。而在2003年6月，美国FDA批准上市的流感三价减毒活疫苗(Flumist)，通过鼻腔接种，能够诱导机体产生包括细胞免疫、体液免疫和黏膜局部免疫在内的较全面的免疫效应，但是主要适用于2-49岁的健康人群，而对流感的发病高危人群老年人和儿童存在安全性隐患，大大限制了其发展和应用。因此，随着现代免疫学理论和技术及相关学科的迅速发展，一种针对刺激机体产生具有黏膜IgA免疫应答和系统免疫效应的流感多价疫苗以及一种新的免疫接种途径--透皮免疫应运而生。直到二十世纪初，人们仍认为皮肤是微生物、化学物质和药物不可透过的屏障，一次偶然的发现，二甲基亚砜与皮肤接触后可被吸收进入体循环，才使上述观点得以改变。1924年，Rein提出皮肤最外面的角质层是药物透皮渗透的最主要的阻力，Blank对该假说作了进一步的证实。后来Scheuplein等人指出透皮渗透是受角质层限制的被动扩散过程。Michaels等测定了一些模型药物在角质层中的表观扩散系数，指出虽然皮肤有良好的屏障特点，但是某些药物还是具有较大的渗透性。这些研究奠定了二十世纪七十年代后透皮给药系统研发的基础，并因此产生了第一个经FDA认证的商品，即剂量为3d/1次的东莨菪碱贴剂，用于治疗晕动症。FDA在最近的二十多年已经通过了35种透皮贴剂产品，大约有17种有效成分用于贴剂产品中，为透皮免疫疫苗的研究奠定了理论基础。从人和动物的健康角度出发，在疫苗的投递上发展一种安全而有效的途径仍然是需要优先考虑的问题。因为疫苗通过注射器或针头接种可能会引起被接种者的皮肤脓肿和皮肤创伤疼痛，同时也有可能使得操作者受伤，并且5艾滋、肝炎等重大传染病发病率居高不下与注射免疫交叉感染有关。此外，新型疫苗的投递技术黏膜免疫，包括滴鼻和口服免疫，比传统的非胃肠道途径更简单、容易、安全，在人和动物上成功地显示了一种新的免疫接种途径。但是，口服免疫易造成抗原在消化道受酶和酸的破坏，滴鼻免疫易造成大部分抗原流入食道，而被鼻黏膜吸收的部分很少，如何控制量效关系成为滴鼻、口服免疫亟待解决的问题。近些年，一种新的免疫接种途径一透皮免疫(Transcutaneousimmunization,TCI)应运而生，这种途径避免了以上途径的缺点，潜在的减少了注射免疫的并发症，避免了胃酸的消化作用及量效关系难以控制的影响，为疫苗的投递提供了新技术。过去的疫苗制剂多数是用针注射入皮肤内的。用针注射疫苗有诸多缺点，如注射伴有痛感，需无菌针头和注射器，需训练有素的医务人员来完成疫苗接种，注射会引起不适及用针穿刺皮肤会带来一些潜在的并发症。透皮免疫不再使用注射器，而是通过皮肤接种，避免了上述缺点，因而是疫苗递送的一大进步。此外，透皮免疫优于注射途径接种，因为在前一情况下，使用靶向皮肤表面大面积的多位点免疫接种，可能会靶向于更多的免疫细胞。足以诱导免疫应答的有效量抗原既可在单一皮肤部位、又可在覆盖多个引流淋巴结区一块完整皮肤区域进行经皮递送。与在单一部位，经皮内、皮下或肌内注射少量抗原相比，在遍布全身的各部位靠近大量不同淋巴结的这种部位进行接种会对免疫体系产生更广泛而强烈的剌激。透皮免疫，即经皮接种免疫，通过在皮肤表面外敷抗原和佐剂，诱导系统免疫和黏膜免疫产生抗体。在这种方法中，抗原被应用到完整的皮肤表面，在穿越角质层后被定居在皮肤中的朗格汉斯细胞摄取并加工，然后被运输到引流淋巴结以启动免疫应答。常用的佐剂主要包括霍乱弧菌的CT和大肠杆菌的LT，当使用贴剂(patch)将志贺氏痢疾杆菌和沙门氏菌抗原、大肠杆菌CS6抗原与LT或CT透皮免疫时，在不同的动物模型以及近来的人体志愿者中既能激发抗体应答(IgG和IgA)，又能激发强烈的细胞免疫和黏膜免疫应答，并且未发现任何不良反应。位于美国马里兰州的IOMAI公司是透皮疫苗给药的创造者，不仅证明透皮疫苗可提供有力的免疫反应，证明是安全的。IOMAI的研究人员己经证明，当以不同剂量通过皮贴剂透皮给药时，可以安全地诱发出与口服免疫具有相同数量级的免疫反应，这些发现对于有效的无针疫苗接种战略具有重要意义。透皮免疫的机制目前还不是十分清楚，但已有研究表明，起源于骨髓的树突状细胞--一朗格汉斯细胞LCs以及与其一起定居在表皮内的M细胞在免疫应答过程中发挥了重要作用。LCs主要有两种功能免疫监视和抗原递呈功能，在被抗原激活后，迁移出皮肤，进入引流淋巴结，诱导T、B细胞的抗原特异性反应。在应用抗原的同时，透皮免疫还添加了免疫刺激剂(细菌毒素或激活信号)，可提供激活DCs成熟的必要信号，高水平表达共刺激分子、分泌因子，使之变成强大的抗原提呈细胞，联合抗原引起初次免疫应答。现已证实人和动物经透皮免疫后，这些毒素不会导致副作用的出现，从而保证了接种的安全性，并且透皮免疫避免了肝脏的首过效应，提高了生物利用度；避免了注射引起的疼痛；延长了作用时间，减少用药次数；可自行用药，并随时停药，使用方便，使用者顺应性好。特别适用于儿童、老人和大聚集群体的免疫接种。透皮免疫途径常用的剂型为贴剂(patch)，该制剂经皮肤敷贴方式免疫，既可引起局部反应，又可引起全身反应。除此之外，还包括软膏剂、硬膏齐[J、涂剂和气雾剂等。透皮制剂因为低价位和患者良好的顺应性己被广泛应用，使用呈明显增加趋势，尤其是儿童和老年人更喜欢使用透皮制剂。雌酮和睾丸激素透皮制剂的应用就是很好的例子。对妇女来讲，可用7天的Climara/E透皮制剂(雌二醇透皮系统)具有副作用最小，不用频繁更换用药的优点，因而上市后很快得到了妇女患者的喜爱。对老年男性来讲，几年内将会出现的睾丸激素透皮制剂体积小，使用方便，并且价格也可能会比较低。现在还有几个更新的透皮技术也在研发中。美国的Pharmetrix和NexMed公司正在开发渗透力增强剂，提高亲脂性和亲水性药物在皮肤中的渗透能力。其它公司应用电穿孔技术使药物更容易通过皮肤，如Noven公司和Elan公司正在应用电离子渗入法，使不同的药物(包括多肽)更容易渗入皮肤，Noven公司还有一个哌甲酯的透皮制剂处于II期临床阶段。目前促进抗原渗7透皮肤的方法多种多样，除促渗剂外，一些在药物上使用的有效化学方法和物理方法，包括离子导入、电穿孔以及超声、激光和放热等促渗技术也正被引入到疫苗当中来。促渗剂一般分为两类一类仅增加抗原在角质层的扩散，例如，丙酮、乙醇等。另一类则不仅增加抗原的扩散，还能促进抗原从角质层向活组织的分配，例如，二甲基亚砜(DMSO)、油酸、葵基甲基亚砜(DCMS)以及一些表面活性剂等。在透皮免疫中，佐剂与抗原共同应用才能诱导强烈的体液、细胞和黏膜免疫应答，因此寻找安全、有效的透皮免疫佐剂也具有重要的现实意义。总之，开发流感透皮疫苗代替传统的注射疫苗具有很大的应用前景，因为流感透皮疫苗具有简单、安全、有效、适用于所有人群以及可以自我接种的特点。
发明内容本发明目的在于提供透皮免疫流感多价疫苗及其制备方法。本发明透皮免疫流感多价疫苗包含透皮免疫佐剂、流感多价疫苗抗原、促渗剂。本发明流感多价疫苗包含了流感三价(H1N1、H3N2、B)、四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；也可以是包含了H1-H16亚型，Nl-N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原；流感多价疫苗抗原为灭活疫苗抗原或减毒活疫苗抗原；疫苗中流感疫苗抗原为通常所使用的量，灭活疫苗抗原(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)HA含量为1.5ug-100ug/0.2ml/人份，而减毒活疫苗抗原的量为IX106EID5。_50X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X106'5_75TCID5。-10X106'5_7'5TCID5。/0.2ml/人份。本发明中涉及的促渗剂是二甲基亚砜(DMSO)、油酸、咪喹莫特、乙醇、丙二醇、丙酮或葵基甲基亚砜(DCMS)以及吡咯酮衍生物，优选油酸或咪喹莫特；抗原与促渗剂的混合体积比例为5-20:1，优选10:1(V/V)。本发明中涉及的透皮佐剂是细菌ADP-外毒素(bacterialADP-ribosylatingexotoxin,hARE)的成员，包括霍乱毒素(choleratoxin，CT)、大肠杆菌不而f热毒素(Escherichiacoliheat-labileenterotoxin，LT)以及它们的突变体，此外还包括CpG等其他类型佐剂；透8皮佐剂与抗原的混合重量比例为1:1-1:10(w/w)，优选l:l、1:2、1:9、1:5、1:7。本发明中涉及流感多价疫苗抗原包括四价(Hl、H3、H5、B)，五价(Hl、H3、H5、H7、B)也可是(Hl、H3、H5、H9、B)也可是(Hl、H3、H5、H7、H9)等等量组合；六价(Hl、H3、H5、H7、H9、B)也可是(Hl、H2、H3、H5、H7、H9)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6)等等量组合；八价(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、朋、H7、B)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H9、B)等等量组合；十价(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、HIO、B)也可以是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10)等等量组合；十二价(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、B)等等量组合；十四价(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、B)等等量组合；十六价(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15、H16)也可以是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15、B)等等量组合，也可以是包含了H1-H16亚型，N1-N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原。上述流感多价疫苗抗原均可以采用CN20061007909.5专利申请的方法制备。本发明上述一种流感多价灭活疫苗贴剂的制备使用鸡胚培养和传统的分离纯化方法；流感疫苗抗原的制备按照常规的方法感染鸡胚获得，也可用哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养获得；获得的疫苗抗原首先经福尔马林灭活，然后除菌、超滤浓縮、柱层析或密度梯度离心进行分离纯化；浓縮纯化后的疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特等混合，加入常规医用敷料制成透皮疫苗贴剂。上述本发明所提供的通过鸡胚生产流感多价灭活疫苗的方法，包括以下1)鸡胚大量培养病毒，收集病毒进行福尔马林灭活，然后通过除菌、超滤浓縮、密度梯度离心或其它层析方法分离纯化。2)浓縮纯化后的流感疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特，加入常规医用敷料制成透皮疫苗贴剂；上述本发明所提供的通过哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、二倍体细胞等)生产流感多价灭活疫苗的方法，包括以下步骤1)使用无血清培养基培养哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、二倍体细胞等)大量培养病毒，收集病毒进行福尔马林灭活，然后通过除菌、超滤浓縮、密度梯度离心或其它层析方法分离纯化；2)浓縮纯化后的流感疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特混合，加入常规医用敷料制成透皮疫苗贴剂。本发明还提供一种流感减毒活疫苗贴剂的制备通过反向遗传学方法，A、B型多价疫苗抗原分别以冷适应减毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/ArmArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒质粒拯救系统制备多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或其他层析方法分离纯化；浓縮纯化后的多价疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特等混合，加入常规医用敷料制成透皮疫苗贴剂。本发明上述所提供的通过鸡胚生产流感多价减毒活疫苗的方法，包括以下步骤1)利用反向遗传学方法，8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等细胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生多价疫苗抗原；2)鸡胚大量培养病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化；3)浓縮纯化后的流感多价疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特混合，加入常规医用敷料制成透皮疫苗贴剂。10本发明上述所提供的通过哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产流感多价减毒活多价疫苗抗原的方法，包括以下步骤-1)利用反向遗传学方法，8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生多价疫苗抗原；2)使用无血清培养基培养哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)大量培养多价疫苗抗原，收集病毒通过除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化；3)浓縮纯化后的流感多价疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特等混合，加入常规医用敷料制成透皮疫苗贴剂。本发明包含的流感病毒三价、四价及多价疫苗抗原可以是减毒或灭活多价疫苗抗原的任何一种抗原，其中灭活多价疫苗抗原可以是灭活全病毒疫苗、裂解疫苗、病毒体或病毒样颗粒等其中的任何一种。本发明疫苗形式可采用液体、粉末状、乳脂状及乳化的促渗剂型，优选粉末状。疫苗成分还可以含有如稳定剂、保湿剂及防腐剂等一系列添加物。本发明透皮免疫将抗原和佐剂应用于皮肤诱导抗原特异性免疫应答，是一种新颖的免疫策略，在人和动物上具有能诱导强烈的黏膜IgG和slgA抗体的产生和全身免疫应答的双重效果，并且对毒素和强毒株病毒的黏膜攻击有较好的免疫保护效果。此外，透皮免疫具有诱导系统免疫和黏膜免疫的双重功效。透皮免疫接种还具有以下特点(1)使用安全、简便，人人可以自己经皮接种，适合于流感大流行或家庭化；(2)维持恒定的血药浓度或药理效应，增强了治疗效果，减少了副作用，避免了注射的疼痛和交叉感染；(3)—苗多效，既可预防普通流感，又可预防人禽流感；(4)双重功效，既可产生系统免疫，又可产生黏膜免疫；(5)副反应低，既可用于成年，又可适用儿童与老年；(6)制备简单、成本低廉，工艺流程简单，可以大大降低生产成本。本发明为一种透皮免疫的流感多价疫苗，该疫苗的主要成分为利用反向遗传学重配冷适应病毒株技术制备的流感三价、四价及多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)减毒活病毒抗原或灭活流感病毒抗原，分别与一种透皮免疫佐剂(既可延长抗原停留时间对皮肤细胞的靶向性，又可增强抗原提呈细胞的抗原提呈功能)、一种促渗剂(既可增加抗原扩散，又可促进抗原从角质层向抗原提呈细胞中聚集)制备贴剂，可有效预防人普通流感病毒、高致病性人禽流感病毒的感染。实验证明该疫苗在诱导黏膜slgA及系统性IgG抗体免疫应答方面效果显著，能安全、有效地的预防人普通流感和高致病性人禽流感。本发明的优点还在于，带有LT、CT或CpG等佐剂透皮免疫的流感四价或多价灭活或减毒活疫苗，在哺乳动物中可同时诱导有效的黏膜免疫和系统免疫，并使机体产生高效价slgA和IgG、IgA，其效果较目前所应用的疫苗组分——无论是单纯的流感灭活病毒颗粒、加佐剂的灭活病毒及活病毒都理想。本疫苗经实验验证，通过使用一种透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等经透皮免疫可以有效地提高疫苗的免疫原性，且无任何毒副作用，表明有很好的安全性。本发明的流感多价灭活或减毒活疫苗与以往疫苗免疫途径及佐剂均不同。经透皮途径免疫Balb/c小鼠，结果证明，按第O、14天两次透皮免疫程序，可产生高效价的IgA和IgG抗体，即可同时诱导黏膜免疫和系统免疫。可以很好的保护小鼠免受流感病毒的攻击，且产生了一定的交叉保护性，这是通常注射免疫的灭活流感疫苗所无可比拟的。经透皮途径免疫雪貂和猴子，无论是流感多价灭活疫苗还是减毒活疫苗，均可产生较高的HI效价，进一步说明透皮免疫途径为流感多价疫苗可供选择的理想途径之一。图1流感病毒四价灭活疫苗两种途径免疫Balb/c小鼠血清IgG/IgA滴度比较具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量体积百分含量。实施例1:流感病毒的鸡胚培养，采用传统的培养方法。A型流感病毒株包括(Hl、H3、H5等亚型)和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。流感病毒培养采取接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，33-35。C培养48_72h(视病毒亚型不同培养时间略有不同)，4'C冰箱过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液获得大量病毒。哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、二倍体细胞等)培养流感病毒，A型流感病毒株包括(Hl、H3、H5等亚型)和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。采用微载体系统(如Cytodex1、3等)在100mlWAVE反应器中培养，逐渐过渡到10L的生物发生器中培养，并加入3g/L微载体可获得Vero细胞的良好生长，此时用流感病毒感染Vero细胞，在感染36-48小时后可获得TCID50达到106-107/ml的病毒量。流感四价灭活疫苗抗原的制备A型流感病毒株Hl、H3、H5和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。采用传统的鸡胚尿囊腔培养流感病毒方法或微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。①接种9-11日龄鸡胚尿囊腔大量培养H1、H3、H5和B型流感病毒，收集病毒经福尔马林灭活，除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌。②由哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产Hl、H3、H5和B型流感病毒，用无血清培养基，采用的方法有微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。收集病毒经福尔马林灭活，除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌，制备流感四价灭活疫苗抗原。流感四价减毒活疫苗抗原的制备A型流感病毒株H1、H3、H5和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。采用传统的鸡胚尿囊腔培养流感病毒方法或微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。①利用现有反向遗传学方法，A型多价病毒以冷适应减毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60为病毒骨架，B型多价病毒以B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，分别整合当年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即将H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如C0Sl、C0S7、Vero、MDCK、293T等细胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生4种多价病毒。②鸡胚大量培养4种多价病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌。③由哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产4种多价病毒用无血清培养基，采用的方法有微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。收集病毒通过除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌，制备流感四价减毒活疫苗抗原。流感多价灭活疫苗抗原的制备A型流感病毒株Hl、H3、H5、H7、H9等亚型和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。采用传统的鸡胚尿囊腔培养流感病毒方法或微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。①接种9-11日龄鸡胚尿囊腔大量培养H1、H3、H5、H7、H9等亚型和B型流感病毒，收集病毒经福尔马林灭活，除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌。②由哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产Hl、H3、H5和B型流感病毒，用无血清培养基，采用的方法有微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。收集病毒经福尔马林灭活，除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层14析分离纯化，透析及过滤除菌，制备流感多价灭活疫苗抗原。流感多价减毒活疫苗抗原的制备A型流感病毒株Hl、H3、H5、H7、H9等亚型和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。采用传统的鸡胚尿囊腔培养流感病毒方法或微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。①利用现有反向遗传学方法，A型多价病毒以冷适应减毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60为病毒骨架，B型多价病毒以B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，分别整合当年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即将H1、H3、H5、H7、H9等亚型和B型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生多种多价病毒。②鸡胚大量培养多种多价病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌。③由哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产多种多价病毒用无血清培养基，采用的方法有微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌，制备流感多价减毒活疫苗抗原。流感多价灭活疫苗透皮贴剂的制备①将A、B型及人禽流感病毒感染哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)，用无血清培养基培养病毒，或按照鸡胚培养的传统方法从感染鸡胚的尿囊液中获得病毒。②由细胞培养生产灭活病毒于感染的细胞上清液中加入福尔马林，其终浓度为0.025%，于32"C孵育24小时，然后采用0-50%蔗糖连续梯度进行区带离心，经DNA去除、透析及过滤除菌获得成品，于-7(TC储存。终产品经检验符合下列标准15DNA(Vero细胞)内毒素致热原血凝素含量(HA)蛋白质含量蔗糖含量福尔马林含量Benzonase含量③佐剂与抗原的混合将透皮免疫佐剂LT、CT或CpG等与多价疫苗抗原按照l:l、1:2、1:9、1:5或1:7(w/w)的比例混合，用IOOOOMW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成疫苗；疫苗与促渗剂二甲基亚砜、油酸或咪喹莫特或葵基甲基亚砜按10:1(V/V)及常规医用敷料比例混合制成贴剂。流感多价减毒活疫苗透皮贴剂的制备①利用反向遗传学方法，8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等细胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生多价流感病毒。②鸡胚大量培养病毒，收集病毒采用0-5096蔗糖连续梯度进行区带离心，经透析及过滤除菌获得成品，于-7(TC储存。③由哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产病毒-用无血清培养基培养病毒，采用0-50%蔗糖连续梯度进行区带离心，经DNA去除、透析及过滤除菌获得成品，于7(TC储存。④佐剂与抗原的混合将透皮免疫佐剂LT、CT或CpG等与疫苗按照1:1(w/w)或1:2、1:9、1:5、l:7的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成疫苗；疫苗与促渗剂二甲基亚砜、油酸或咪喹莫特或葵基甲基亚砜按10:1(V/V)及医用敷料比例混合制成贴剂。实施例2:流感多价灭活/减毒活疫苗的小鼠体内效果观察1、免疫计划方案，使用不同剂型的(透皮，注射免疫为对照)流感病毒疫苗免疫小鼠①用40#剪刀对6-8周龄Balb/c小鼠剃毛。剃毛过程应不对皮肤造成任何损伤。剃毛范围从胸阔中部至紧贴劲背下部。让小鼠休息24h。此前己对小鼠作了标记以便辨认，并已预先取血以获得免疫前血清。②然后按如下方法免疫小鼠。用20mg/ml甲苯噻嗪溶液0.03-0.06ml，100mg/ml氯胺酮0.5ml麻醉小鼠；这一剂量的麻醉剂使小鼠静止不动约lh。(D将免疫溶液按以下方法加到小鼠的去毛背部皮肤上将1.2cmX1.6cm的镂空聚苯乙烯板轻轻放在小鼠背部，用浸透盐水的无菌纱布部分湿润皮肤(可用免疫溶液)，然后用滴管将免疫溶液加在镂空板处，形成2cm2的免疫溶液贴剂。或者在剃毛部位涂上固定体积的免疫溶液。小心使滴管尖不刮伤或擦伤皮肤。④使得免疫溶液(约100W至200W)在小鼠背部静置60至180min。60min后，轻轻抓住小鼠的脖子和尾部，用大量微温的自来水冲洗10秒钟。然后用一块无菌纱布将小鼠轻轻拍干，再洗10秒；再次拍干后将小鼠放回笼中。小鼠看起来对麻醉、免疫接种、洗涤过程或外毒素的毒性没表现出任何不适反应。免疫接种后，未见皮肤剌激或红肿，小鼠生存状态良好。2、按照例1所制备佐剂/抗原混合体，同时将抗原用PBS稀释到其HA浓度为^15ug/ml，减毒活疫苗的量》5X106EIDs。，作为无佐剂对照组(Tabl)。为制备适用于小鼠透皮免疫的剂型，可将溶液用PBS作适当稀释。21组Balb/c小鼠分别接受不同剂型的疫苗透皮免疫，每只小鼠100u1含有佐剂的抗原溶液。分别于第O、14天进行免疫，并于第28天测定血清，唾液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效价。表l疫苗透皮免疫Balb/c小鼠的免疫方案组别(Balb/c)疫苗抗原种类剂量免疫途径1.灭活疫苗(来源于Vero细胞)5X106EID6。lOOnl/透皮..2.灭活疫苗(来源于鸡胚)5X106EID50lOOu1/透皮3减毒活疫苗(来源于Vero细胞)5X106EID50100u1/透皮4.减毒活疫苗(来源于鸡胚)5X106EID50lOOu1/透皮5.Vero细胞对照5%of1uglOOu1/透皮6.鸡胚对照5%of1uglOOu1/透皮3、血清，唾液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效价的测定①免疫后28天，取动物的唾液、肺脏及血清标本，测定每份标本的抗体效价。②用0.5mlPBS注入小鼠口腔，收集唾液测定其IgA含量。③肺组织裂解标本的制备处死小鼠，打开喉部，取出肺脏并用PBS清洗，研磨肺组织并离心匀浆去细胞组织，收集上清液并储存于-2(TC，用于IgA效价测定。IgG和IgA效价测定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA检测试剂盒(GenzymeVirotech)。37'C孵育2小时后加入羊抗鼠IgG或IgA抗体(Pharmigen)及底物液和显色液检测特异性IgG和IgA抗体效价。⑤HAI效价测定取小鼠血液，按照Palmeretal指定方法测定甲型和乙型流感病毒HAI效价。⑥数据显示在无佐剂的情况下，灭活的全病毒颗粒不能激发机体的IgA和IgG免疫应答，相反，如果在活病毒或灭活的全病毒颗粒中加入LT、CT或CpG等佐剂，可激发机体产生较高效价的IgA、IgG、和HAI(Tab2)。表2不同种类流感疫苗株透皮免疫小鼠后唾液、肺灌洗液中IgA效价以及血清IgG和HAI效价的测定结果效价IgAIgGHAI种类毒株佐剂唾液肺灌洗液血淸血清wsMLFluAFluAFluBFiuAFluBFluB訓l固2H5N1B灭活苗(来源于细胞)NC，WS，1T，ML1080102010320<1016C<10640<10320腳102,40010025，600160640803208032040160CT8020160160320320102,40051，200320160320160CpG4020320则64032051，2C025,60032060640320灭活苗(来源于鸡胚)NC，WS，XJ，MLur<10801020160160<10320<10320痛5，120100102，400803201603208016040160CT80203201603203205UG051，200640160320160CpG802032016064032051,20025，60032032064:0320减毒活疫苗(来源于细胞)NC，WS，XJ"，ML2080402080160401608064080320320102'40032025，60016064080320160160160160CT804032016032032025，6。051,200320160320160CpG802032016064032051,2CO12,800320640160320减毒活疫苗(来源于鸡胚)NC,WS，——2040808080化3208016016040XJ,MLLT802032016032032012，咖25，600640320320160CT402032016032032051,20012>80016032064016018CpG802032016064032051,20025,600320320160320—一<10<10n.dn.d<10<10<10<1080160<10<10—-<10<10n.dn.d<10<10<10<1080160<10<10LT<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10CT<10<10<1D<10<10<10<10<10<10<10<10<10CpG<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10<10NC表示NewCaledonia/20/99，WS表示Wisconsin/67/2005,XJ表示XiJiang/424/2004,ML表示Malaysia/2506/2004,PL表示肺灌洗液，n.d表示没有测定3、以LT为佐剂的流感四价灭活疫苗不同免疫途径的比较，将疫苗分别进行透皮免疫，肌肉注射两种不同免疫途径进行接种。结果表明，肌肉注射虽然产生了更高效价的IgG，但却没有检测到明显的IgA抗体。但透皮免疫却产生了高效价的IgA。IgA抗体在对抗呼吸道的传染病中发挥重要作用，说明流感多价疫苗透皮免疫途径为可供选择的理想途径之一(图l)。实施例3:流感多价灭活/减毒活疫苗的雪貂体内效果观察1、免疫计划，使用不同剂型的流感病毒疫苗免疫雪貂①按照例1所制备佐剂/抗原混合体的方法，制备适用于雪貂透皮免疫的剂型，可将溶液用PBS作适当稀释LT。②6-10周龄的雄性和雌性雪貂，选取体重为1-2kg的用于本实验，所有这些动物在实验之前均为血清阴性。免疫后14天，雪貂通过颈静脉取血测定HI效价。③6组雪貂，分别接受不同剂型的疫苗透皮免疫，每只lml含有佐剂如LT、CT或CpG等的抗原溶液，贴剂用于耳背或上肢外侧，按照表3的组别分别进行免疫，并于第14天测定HI效价。2、血清HI效价测定雪貂颈静脉取血，按照OIE标准指定的方法进行HI测定。3、实验结果显示，流感四价灭活或减毒活疫苗，无论是鸡胚培养得到的，还是Vero细胞培养得到的病毒抗原，加佐剂如LT、CT、CpG等经透皮途径免疫雪貂后，均可产生较高的HI效价。进一步说明透皮免疫途径是流感多价疫苗可供选择的理想途径之一(表3)。细胞对照---鸡胚对照一-19表3疫苗免疫雪貂后HI效价测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>c:Geometrimeantiter几何平均效价实施例4:透皮流感多价灭活/减毒活疫苗的猴子体内效果观察1、免疫计划，使用不同剂型的流感病毒疫苗免疫猴子①按照例1所制备佐剂/抗原混合体的方法，制备适用于猴子透皮免疫的剂型，可将溶液用PBS作适当稀释LT、CT、CpG等佐剂。②选取健康猴子用于本实验，所有这些动物在实验之前均为血清阴性。免疫之后14天，猴子通过颈静脉取血测定HI效价。③6组猴子，分别接受不同剂型的疫苗透皮免疫，每只lml含有佐剂如LT、CT或CpG等的抗原溶液，贴剂用于耳背或上肢外侧，按照表4的组别分别进行免疫，并于第14天测定HI效价。2、血清HI效价测定猴子颈静脉取血，按照OIE标准指定的方法进行HI测定。3、实验结果显示，流感四价灭活或减毒活疫苗，无论是鸡胚培养得到的，还是Vero细胞培养得到的病毒抗原，加佐剂如LT、CT、CpG等经透皮途径免疫雪貂后，均可产生较高的HI效价。进一步说明透皮免疫途径是流感多价疫苗可供选择的理想途径之一(表4)。表4疫苗免疫猴子后HI效价测定结果组别疫苗免疫剂量疫苗来源猴子个数免疫前血清HI效价GMTC免疫后14天HI效价GMTA灭活苗5X106EID50鸡胚1A〈10<101602802A<101603A〈10320B减毒活疫苗5X106EIDM鸡胚IB<10<106404002B<10320犯<10320C灭活苗5X106EIDM细胞1C<10<103204002C<106403C<10320D减毒活疫苗5X106EIDM细胞ID<10<103206402D<106403D<101280E鸡胚尿囊液IE<10<10<10GO<102E<10<10犯<10FMDCK细胞介质IF<10<10〈10<10<102F<10<103F<10对照阳性猴子2560抗血清c:Geometrimeantiter几何平均效价实施例5:流感四价减毒活疫苗的人体体内效果观察1、在健康人群志愿者中，评价并比较透皮途径给药加AL(OH)3佐剂的流感灭活疫苗和流感四价减毒活疫苗和的免疫效果，贴剂用于耳背或上肢外2、开放的、受控制的，随机的来评价了疫苗在男性和女性受试者的局部和系统免疫反应。3、所有受试者执行下述检测-0天，21天ELISA检测黏膜IgA(局部免疫反应)，分别检测疫苗中每一流感代表株。O天，21天检测血清HA-HI抗体滴度，分别检测每一流感代表株。4、数据来源下述项目(1)所有时间点血清HI抗体的几何平均数GMTs(95%有效值)。(2)对HI:21天时血清转化率。(3)对HI:21天时转化系数。(4)对HI:21天时的保护率。(5)仅对IgA:从0-21天受试者IgA抗体滴度增加2-4倍的百分率。5、经过对局部和全身症状的8天随访期，两种疫苗对安全性和反应性均耐受。关于接种无严重有害作用显示。6、疫苗免疫原性的检测通过血凝抑制滴度来决定血清转化率(疫苗的百分率是根据21天HI滴度是0天至少增加4倍而限定的，每一疫苗株)，转化系数(是根据21天比0天HI几何平均滴度(GMTs)的倍增值而限定的，每一疫苗株)，血清保护率(接种后公认显示保护HI滴度^40而限定的，每一疫苗株)，另外黏膜IgA抗体反应用ELISA来检测。7、接种一剂量透皮流感灭活疫苗或四价减毒活疫苗21天后HI血清阳性，血清转化率和血清保护率见表5。组别时间接种一剂量21天时HI的血清阳性、血清保护率和血清转化率n血清阳性%血清保护率n%血清转化率n%NC0天20420.00021天201890.01680.01575.0灭活苗o天20420.0420.021天201995.01890.01785.0wso天201050.0420.021天2020100.01995.01680.0灭活苗o天20945.015.021天201995.01890.01575.0XJo天20420.00021天201785.01575.016肌0灭活苗o天20840.0630,021天201995.01890.01470.0ML0天20420.00021天201785.01575.01680.0灭活苗o天20840.0630.021天201890.01785.01575.0血清阳性(n，％):编号和受试者的滴度^10血清保护率(n，％)*编号和受试者的滴度^4022血清转化率(n,%):编号和受试者从0天到21天的滴度至少是4倍的增殖8、结果表明一剂量接种21天后，透皮免疫流感多价减毒活疫苗和灭活疫苗产生相似的血清阳性，血清转化率和血清保护率。权利要求1、一种透皮免疫流感多价疫苗，其特征在于该透皮免疫流感多价疫苗包含透皮剂、透皮免疫佐剂和流感多价疫苗抗原；流感多价疫苗包含了流感三价、四价或多价疫苗；也就是包含了H1-H16亚型，N1-N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗；流感多价疫苗是灭活疫苗或减毒活疫苗；疫苗中流感病毒抗原为通常所使用的量，灭活疫苗抗原含量为1.5μg-100μg/0.2ml/人份，减毒活疫苗抗原的量为5×106EID50-50×106EID50/0.2ml/人份或0.1×106.5-7.5TCID50-10×106.5-7.5TCID50/0.2ml/人份；促渗剂为二甲基亚砜、油酸、咪喹莫特、乙醇、丙酮以及吡咯酮衍生物或葵基甲基亚砜；抗原与促渗剂的混合体积比例为5-20∶1；透皮佐剂为细菌ADP-外毒素的成员，包括霍乱毒素、大肠杆菌不耐热毒素以及它们的突变体，此外还包括CpG等其他类型佐剂；透皮佐剂与抗原的混合重量比例为1∶1-110。2、如权利要求1所述的透皮免疫流感多价疫苗，其特征在于该透皮免疫流感多价疫苗中抗原与促渗剂的混合体积比例为10:1。3、如权利要求1所述的透皮免疫流感多价疫苗，其特征在于该透皮免疫流感多价疫苗中抗原与促渗剂的混合体积比例为1:2、1:9、1:5、1:7。4、如权利要求l、2或3所述的透皮免疫流感多价疫苗，其特征在于该透皮免疫流感多价疫苗中其中灭活疫苗是灭活全病毒疫苗、裂解疫苗、病毒体或病毒样颗粒中的任何一种。5、如权利要求l、2或3所述的透皮免疫流感多价疫苗，其特征在于该透皮免疫流感多价疫苗采用液体、粉末、乳脂或乳化或贴片的透皮剂型。6、如权利要求4所述的透皮免疫流感多价疫苗，其特征在于该透皮免疫流感多价疫苗采用液体、粉末、乳脂或乳化或贴片的透皮剂型。7、如权利要求l、2、3或6所述的透皮免疫流感多价疫苗的制备方法，其特征在于该方法为通过反向遗传学方法，A、B型多价疫苗抗原分别以冷适应减毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒质粒拯救系统制备多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、二倍体细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或其他层析方法分离纯化；浓縮纯化后的多价疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特混合制成疫苗贴剂。8、如权利要求5所述的透皮免疫流感多价疫苗的制备方法，其特征在于该方法为通过反向遗传学方法，A、B型多价疫苗抗原分别以冷适应减毒流感病毒株A/ArmArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒质粒拯救系统制备多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、二倍体细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或其他层析方法分离纯化；浓縮纯化后的多价疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特混合制成疫苗贴剂。9、如权利要求5所述的透皮免疫流感多价疫苗的制备方法，其特征在于该方法为通过反向遗传学方法，A、B型多价疫苗抗原分别以冷适应减毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用流感病毒质粒拯救系统制备多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、二倍体细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓縮、蔗糖密度梯度离心或其他层析方法分离纯化；浓縮纯化后的多价疫苗抗原与透皮免疫佐剂如LT、CT或CpG等、促渗剂如油酸或咪喹莫特混合制成疫苗贴剂。全文摘要本发明提供一种透皮免疫流感多价疫苗及其制备方法。本发明透皮免疫流感多价疫苗包含透皮免疫佐剂、流感多价疫苗抗原、促渗剂及医用敷料等。本发明的流感多价灭活或减毒活疫苗与以往疫苗免疫途径及佐剂均不同。经透皮途径免疫Balb/c小鼠、雪貂、猴体及人体，结果证明可产生高效价的IgA和IgG抗体，即能够同时诱导系统免疫和黏膜免疫，可用于普通流感、高致病性人禽流感的免疫预防。文档编号A61K39/295GK101450209SQ20081024702公开日2009年6月10日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者杨鹏辉,段跃强,王希良,王金成,罗德炎,丽邢申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所