治疗癌症的组合物和方法

专利名称：治疗癌症的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及包含黑芥子苷(sinigrin)或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物的药物组合物，以及其在治疗癌症中的用途。

背景技术：
人类肝脏癌症(肝癌)占癌症死亡原因的比率高达12％，且在发病后期不易治愈。因为用于治疗发展早期的肝癌的常规化疗剂(泰素(taxol)、顺铂(cisplatin)、多柔比星(doxorubicin))有相当大的副作用，所以它们的治疗益处是有限的。此外，这些药剂昂贵。环境和基因因素在肝脏的肝细胞癌发展中都起了重要作用。在大鼠实验模型中，饮食中的致癌物质被证实增加了肝癌的易感性。由于缺乏肝癌特异性药物以及常规化疗剂长期给药导致的副作用，大量研究集中在减轻肝脏疾患的症状，而不是治疗肝脏疾患。这些肝脏病症给患者带来极大不适和痛苦。本项研究致力于找到利用纯活性成分治疗和抑制肝脏癌症转移的治疗剂。
据报道，传统中药(TCMs)具有多种药理效应。TCMs具有针对人和大鼠肝脏肿瘤细胞的抗炎活性，且一些TCMs显示了对癌细胞增殖的抑制效应(Alshatwi AA，Han CT，Schoene NW，&Lei KY.(2006)Nuclear Accumulations of p53 and Mdm2 Are Accompanied byReductions in c-Abl and p300 in Zinc-Depleted Human HepatoblastomaCells(在锌耗竭的人肝母细胞瘤中，p53和Mdm2的核聚集伴随着c-Abl和p300的减少).Exp Biol Med(Maywood).231(5)611-618)。早期的研究已经表明，TCMs能够在动物中加强环磷酰胺和放疗的抗肿瘤活性。然而，这些中草药中还没有一种单独用于治疗肝癌。
黑芥子苷(sinigrin)是一种硫代葡萄糖苷，属于在诸如球芽甘蓝(brussel sprouts)、西兰花(broccoli)的芸苔(Brassica)属的某些植物以及黑芥末(黑介(Brassica nigra))籽中发现的糖苷家族。黑芥子苷是一独特的纯化合物，分子量低，为397.46，化学式为C10H16NO9S2·K。
通过引用的方式以其整体并入本文的美国专利申请第09/952,478号公开了抑制癌细胞增殖的药物组合物，其包含选自酚酸，类胡萝卜素，生育酚/固醇和硫代葡萄糖苷的卡诺拉(canola)提取物，其中酚酸是该组合物中的主要活性成份。尽管公开了黑芥子苷是12种硫代葡萄糖苷中的一种，但它没有公开黑芥子苷在卡诺拉提取物中作为活性成份的效应。
Johnson I.，et al.(Colon cancer proliferation desulfosinigrin inWasabi(Wassabia japonica)(Wasabi(Wassabia japonica)中的脱硫黑芥子苷促结肠癌增殖).Nutrition and Cancer.2004；48(2)207)探究了黑芥子苷对事先用二甲肼(DMH)处理的大鼠的肠粘膜的影响，发现与那些仅给予DMH的大鼠相比，黑芥子苷在DMH处理的大鼠的结肠组织中诱导更高水平的凋亡，且在DMH后给予的黑芥子苷抑制结肠组织中异常隐窝病灶(aberrant crypt foci)的诱导。然而，Zheng，Q，et al.(Further investigation of the modifying effect of various chemopreventiveagents on apoptosis and cell proliferation in human colon cancer cells(多种化学预防剂对人结肠癌细胞的凋亡和细胞增殖的修饰效应的进一步研究).Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，2002；128539-546)报道了黑芥子苷的作用可能不依赖于凋亡和细胞增殖。因此，对黑芥子苷在结肠癌细胞中的作用存在争议。此外，黑芥子苷对来自不同组织的癌细胞的作用尚未记载。
本发明提供了包含黑芥子苷的药物组合物以及其治疗癌症的用途。
发明概述 本发明的一方面提供用于治疗癌症的药物组合物，其包含黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物，以及药学上可接受的载体。
在本发明的实施方式中，组合物可以包含治疗有效量的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物，或两者的混合物。
本发明的另一方面提供了用黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物，或两者的混合物，或本文提供的药物组合物治疗癌症的方法。例如，所述方法可以包括给予有发展为或患癌症风险的个体治疗有效量的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物，或两者的混合物，或本文描述的药物组合物。
本发明的另一方面提供了黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物在制备用于治疗癌症的药物或药物组合物中的用途。
本发明的另一方面提供了抑制肝癌细胞生长的方法，其包括使所述肝癌细胞与本文描述的药物组合物或黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物接触。
本发明的另一方面提供了诱导肝癌细胞凋亡的方法，其包括将所述肝癌细胞与本文所述的药物组合物或黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物接触。
在一个实施方式中，药学上可接受的载体是水。
在一个实施方式中，黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物是本发明的药物组合物的唯一活性成分。
在本发明的另一实施方式中，黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物可以与其他试剂联合给药，或者药物组合物可以包含其他试剂。
在本发明的实施方式中，待治疗的癌症包括肝癌、胰腺癌和肺癌。在优选的实施方式中，所述癌症是肝癌。
待治疗的癌症可以是原发的或继发的，可以处于促进期(promotionstage)或处于进展期(progression stage)。在癌症处于进展期的一些实施方式中，药物不仅消除原发性肿瘤或使原发性肿瘤最小化，而且抑制了肿瘤细胞的转移，即继发性癌症。
在本发明的实施方式中，所述组合物或药物可以通过任一所需的合适途径给药，诸如口服、注射和灌输。在优选的实施方式中，所述组合物或药物经口给药。
在本发明的实施方式中，黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物的治疗有效量为每天约0.1mg/kg体重至约300mg/kg体重。在其他实施方式中，黑芥子苷的治疗有效量为每天约1mg/kg至100mg/kg体重。在其他实施方式中，黑芥子苷的治疗有效量是每天约10mg/kg体重。
不希望受限于任何特定的理论，黑芥子苷或包含黑芥子苷的药物组合物可以通过诱导细胞周期中G0/G1期阻滞(G0/G1 phase arrest)和/或肿瘤细胞，诸如人肝母细胞瘤细胞或肝脏癌症细胞的凋亡来治疗癌症。



并入且组成本说明书的一部分的附图仅用于示例本发明的某些优选的实施方式。与本说明书的其它部分一起，它们意在用于向本领域的技术人员解释本发明的优选的实施方式。
图1是显示HepG2，WRL-68和Clone(克隆)9细胞在经SIN处理72小时后的活力的图。黑线表示HepG2细胞的活力；深灰线表示Clone 9细胞的活力；浅灰线表示WRL 68细胞的活力。
图2A-2L是荧光活化细胞分选(FACS)的DNA柱状图，显示了HepG2细胞在经SIN处理不同时间段后在不同细胞周期时相中的分布。图A-SIN(黑芥子苷)0mM/24小时，图B-SIN 0.1mM/24小时，图C-SIN 0.5mM/24小时，图D-SIN 0mM/48小时，图E-SIN 0.1mM/48小时，图F-SIN 0.5mM/48小时，图G-SIN 0mM/72小时，图H-SIN 0.1mM/72小时，图I-SIN 0.5mM/72小时，图J-SIN 0mM/96小时，图K-SIN 0.1mM/96小时，图L-SIN 0.5mM/96小时。
图3A-3D是显示SIN处理后在不同时间点的不同细胞周期时相中的细胞分布的图。图A-孵育SIN的第24小时，图B-孵育SIN的第48小时，图C-孵育SIN的第72小时，图D-孵育SIN的第96小时. 图4显示了经不同浓度的SIN处理96小时的HepG2细胞的DNA断裂。泳道A-1kb DNA标志物，泳道B-0.25mM SIN处理，泳道C-0.5mM SIN处理，泳道D-0mM SIN，对照。
图5A是显示SIN对基因表达影响的基因倍差的散点图，x-轴表示对照基因转录，y-轴表示SIN处理的细胞的基因转录。深灰十字(cross)表示在SIN处理的细胞中其转录上调3倍的那些基因。浅灰十字表示在SIN处理的细胞中其转录下调3倍的那些基因。
图5B-5C是cDNA阵列的膜图像。图A-对照膜，图B-SIN处理的样品膜。
图6包括显示在SIN处理的HepG2细胞中显著上调(浅灰条)或下调(深灰条)的基因的条形图，以及详细列出基因和它们倍数变化的附表。
图7是显示在促进期对大鼠进行处理的实验方案的图。
图8A-8C是在HCC发展的促进期的大鼠肝脏的照片，显示了直接观测的结果。图A-阴性对照组的大鼠肝脏；图B-阳性对照组的大鼠肝脏；图C-SIN-处理组的大鼠肝脏。
图9A-9B是显示SIN对促进期大鼠肝脏重量的影响的柱状图(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且用ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验(student’s t-test)进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-三组的肝脏重量/体重指数，图B-阳性对照和SIN-处理组与阴性对照组相比的肝脏重量/体重指数。阴性对照组被认为是100％。
图10是显示SIN对在促进期的大鼠的血清ALT和AST水平的影响(n＝4)的条形图。将阳性对照和SIN-处理组的大鼠血清中的ALT/AST量与阴性对照组相比。阴性对照组被认为是100％。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验(student’st-test)进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。
图11是总结免疫染色的ABC染色方案的图。
图12A-12D是大鼠肝脏切片的显微图，显示了阳性对照组的肝脏中破坏的肝细胞结构和来自在促进期用SIN处理组的肝脏中恢复的肝细胞结构。图A-来自阴性对照组的大鼠肝脏切片。可以观察到肝细胞清楚的组织学结构。图B-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片。肝细胞失去了中央静脉。图C-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片。可以观察到肝细胞内细胞质的空泡化。图D-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片。已恢复了基本结构。
图13A-13G是显示了促进期GST-p阳性区域的大鼠肝脏切片的显微图。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。图A-来自阴性对照的大鼠肝脏切片(2.5X)。在整个切片中没有发现GST-p表达。图B-来自阴性对照组的大鼠肝脏切片(20X)。可以观察到正常的基本结构。图C-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片(2.5X)。可以在整个切片中发现GST-p阳性区域。图D-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片(10X)。GST-p阳性区域成簇出现。图E-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片(2.5X)。仅发现有限的GST-p阳性区域。图F-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片(20X)。恢复了基本结构。图G-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片(20X). 图14是比较促进期各组的GST-p阳性区域/全切片面积的百分比的条形图(n＝4)。将阳性对照和SIN-处理组的GST-p阳性区域/全切片面积比值与阴性对照组的比值比较。阴性对照组是0％。符号“*”表示p＜0.05。
图15A-15D显示了在促进期的大鼠p53和Mdm2的mRNA表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由p53与β-肌动蛋白的比值测量的p53表达水平。图B-通过RT-PCR测量的p53mRNA表达。图C-由Mdm2与β-肌动蛋白的比值测量的Mdm2表达水平。图D-通过RT-PCR测量的Mdm2 mRNA表达。
图16A-16D显示了在促进期的大鼠总p53蛋白和WT(野生型)p53蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由总p53与β-肌动蛋白的比值测量的总p53表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的总p53蛋白表达。图C-由WT p53与β-肌动蛋白的比值测量的WT p53表达水平。图D-通过蛋白质印迹测量的WT p53蛋白表达。
图17A-17B显示在促进期的大鼠Mdm2蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由Mdm2与β-肌动蛋白的比值测量的Mdm2表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的Mdm2蛋白表达。
图18A-18D显示了在促进期的大鼠p21蛋白和PCNA蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由p21与β-肌动蛋白的比值测量的p21表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的p21蛋白表达。图C-由PCNA与β-肌动蛋白的比值测量的PCNA表达水平。图D-通过蛋白质印迹测量的PCNA蛋白表达。
图19A-19D显示了在促进期的大鼠Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由Bax与β-肌动蛋白的比值测量的Bax表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的Bax蛋白表达。图C-由Bcl-2与β-肌动蛋白的比值测量的Bcl-2表达水平。图D-通过蛋白质印迹测量的Bcl-2蛋白表达。
图20是显示在进展期对大鼠进行处理的实验方案的图。
图21A-21E是在HCC发展的进展期的大鼠肝脏的照片，显示了直接观测的结果。图A-来自阴性对照组的大鼠肝脏。图B-来自有一个大肿瘤的阳性对照组的大鼠肝脏。肝脏已经失去了正常的形态。图C-出现转移瘤的大鼠胰腺。图D-出现转移瘤的大鼠肺脏，图E-来自SIN处理组的大鼠肝脏。
图22A-22B是显示SIN对进展期的大鼠肝脏的重量的影响的条形图(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-三组的肝脏重量/体重指数，图B-阳性对照组和SIN-处理组与阴性对照组相比的肝脏重量/体重指数。阴性对照组被视为100％。
图23是显示SIN对进展期大鼠的血清ALT和AST水平的影响的条形图(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。将阳性对照和SIN-处理组的大鼠血清中ALT/AST的量与阴性对照组相比。阴性对照组被视为100％。
图24A-24D是大鼠肝脏切片的显微图，显示了在进展期阳性对照组的肝脏中破坏的肝细胞结构以及SIN处理组的肝脏中恢复的肝细胞结构。图A-来自阴性对照组的大鼠肝脏切片。可以观察到肝细胞清楚的组织学结构。图B-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片。出现成簇的脂肪小滴，并围绕着死亡细胞。图C-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片。细胞体积变得更小，血管和血液增加。图D-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片。已恢复了基本结构，没有异常的表观。
图25A-25G是显示了进展期的大鼠肝脏切片的GST-p阳性区域的显微图。图A-来自阴性对照的大鼠肝脏切片(2.5X)。在整个切片中没有发现GST-p表达。图B-来自阴性对照组的大鼠肝脏切片(20X)。可以观察到正常的基本结构。图C-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片(2.5X)。在整个切片中可以发现GST-p阳性区域。图D-来自阳性对照组的大鼠肝脏切片(20X)。GST-p阳性区域成簇出现，并发现坏死细胞。图E-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片(2.5X)。仅发现有限的GST-p阳性区域。图F-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片(20X)。恢复了基本结构。图G-来自SIN-处理组的大鼠肝脏切片(40X)，显示了GST-p阳性区域的一个实例。
图26是比较在进展期的各组的GST-p阳性区域/全切片面积的百分比的条形图(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。将阳性对照和SIN-处理组的GST-p阳性区域/全切片面积比值与阴性对照组的比值比较。
图27A-27D显示了在进展期的大鼠p53和Mdm2的mRNA表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由p53与β-肌动蛋白的比值测量的p53表达水平。图B-通过RT-PCR测量的p53mRNA表达。图C-由总Mdm2与β-肌动蛋白肌动蛋白的比值测量的Mdm2表达水平。图D-通过RT-PCR测量的Mdm2 mRNA表达。
图28A-28D显示了在进展期的大鼠总p53蛋白和WT p53蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由总p53与β-肌动蛋白的比值测量的总p53表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的总p53蛋白表达。图C-由WT p53与β-肌动蛋白的比值测量的WT p53表达水平。图D-通过蛋白质印迹测量的WT p53蛋白表达。
图29A-29B显示在进展期的大鼠Mdm2蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由Mdm2与β-肌动蛋白的比值测量的Mdm2表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的Mdm2蛋白表达。
图30A-30D显示了在进展期的大鼠p21蛋白和PCNA蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由p21与β-肌动蛋白的比值测量的p21表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的p21蛋白表达。图C-由PCNA与β-肌动蛋白的比值测量的PCNA表达水平。图D-通过蛋白质印迹测量的PCNA蛋白表达。
图31A-31D显示了在进展期的大鼠Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表达(n＝4)。结果表示为平均值±SD，且通过ANOVA评价获得的数据。使用学生氏t-检验进行数据的统计分析。符号“*”表示p＜0.05。图A-由Bax与β-肌动蛋白的比值测量的Bax表达水平。图B-通过蛋白质印迹测量的Bax蛋白表达。图C-由Bcl-2与β-肌动蛋白的比值测量的Bcl-2表达水平。图D-通过蛋白质印迹测量的Bcl-2蛋白表达。
发明详述 本发明提供了治疗个体癌症的药物组合物，包括黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物，或两者的混合物，以及药学上可接受的载体。
在本发明的实施方式中，组合物包括治疗有效量的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物。
本发明的黑芥子苷是具有397.46的低分子量的独特纯化合物，化学式为C10H16NO9S2K，其优选从黑芥(Brassica nigra，通用名黑芥末)的籽中获得。优选地，黑芥子苷具有下述化学结构
在某些实施方式中，黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物是主要的活性组分。在更优选的实施方式中，如在黑芥子苷水性溶液中，黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物是唯一的活性组分。
黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物能够以水合物的形式并入本发明的组合物中。在一个实施方式中，黑芥子苷是黑芥子苷单水合物的形式。
如本文使用的，术语“有效化合物”或“有效成分”或“有效组分”指上述的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物。在一个实施方式中，所述黑芥子苷从黑芥(Brassica nigra)的籽中提取。
如本文使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”意指有效实现其理想目的如治疗癌症的活性组分的量。
通常，活性组分的有效量为每天每千克体重约0.1至300mg，更优选为约1至100mg每千克体重，通常分为1至4份。然而，在绝大数情况下，有效日剂量是约1mg/kg至约25mg/kg体重，且在另一实施方式中是约10mg/kg体重，单次或分次剂量给药。然而在一些情况下，使用这些限制外的剂量是必需的，其可以容易地由开处方的医师或本领域的另一技术人员确定。
药物组合物可以包括至少一种药学上可接受形式的活性化合物，即黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物，任选地与药学上可接受的载体结合。
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”指促进本发明的活性组分加工成可以药用的制剂的赋形剂和辅助剂。可以通过任何理想的给药途径，包括经口、局部、肌内、腹腔内、皮下、瘤内或静脉途径给予所述药物组合物的制剂。
本文描述的药物组合物的制剂，特别是诸如药片、糖衣丸、片剂(troches)和胶囊以及合适的溶液，可以包含重量比为0.01％至99.99％，或25％至75％的活性组分以及赋形剂和/或辅助剂。
用于本发明的合适的赋形剂包括诸如糖类(例如，乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇)的填充剂；纤维素衍生物；硫酸镁；磷酸钙(例如，磷酸三钙、磷酸氢钙)；诸如淀粉糊(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉)、凝胶、黄芪胶、和/或聚乙烯吡咯烷酮的粘合剂。
可以用于本发明的合适辅助剂包括节流剂(flow-regulating agents)和润滑剂，例如滑石、硅石、硬脂酸或其衍生物(例如，硬脂酸镁)，和/或聚乙烯乙二醇。糖衣丸核(dragee cores)具有合适的包衣，如果需要，所述包衣抵抗胃液。出于此目的，可以使用浓缩的糖类溶液、漆溶液或合适的有机溶剂或溶剂混合物，所述糖类溶液任选包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇和/或二氧化钛。为了产生抵抗胃液的包衣，即肠包衣，使用合适的纤维素制剂，诸如醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟基丙烷基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。可以将染料或色素加入到药片或糖衣丸包衣中。
本发明的组合物可以配制成诸如静脉的、皮下的和肌内注射剂的注射剂、栓剂或者舌下含片的形式。在一个实施方式中，组合物被配制成口服剂型。
可选地，组合物可以局部给药，例如，通过将化合物直接注射入肿瘤内，即瘤内注射，所述组合物通常为贮存剂(depot)或持续释放制剂。在本文描述的实施方式中，可以应用黑芥子苷或药物组合物的多种递送系统，包括，但不限于，脂质体和乳剂。此外，可以在靶向药物递送系统中使用药剂，例如，在包被有肿瘤特异性抗体的脂质体中。然后将所述脂质体靶向肿瘤并被肿瘤特异性摄取。
依照本领域公认的方法制备例如注射剂、栓剂、舌下含片、药片和胶囊等剂型的药物制剂。
在制备注射剂时，如果需要，将有效成分与pH调节剂、缓冲剂、增溶剂、悬浮剂、稳定剂和防腐剂混合，随后依照常规方法制备静脉、皮下或肌内的注射剂。
增溶剂的实例包括聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨醇酯80、烟碱、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、聚乙二醇(macrogol)以及蓖麻油脂肪酸乙酯。悬浮剂的实例包括甲基纤维素、聚山梨醇酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯树胶、粉状黄芪胶、羧甲基纤维素钠以及聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯。
稳定剂包括亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和乙醚。防腐剂包括尼泊金甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚和氯化甲酚。
当活性化合物或组合物口服给药时，它可以是药片或胶囊的形式，或作为水性溶液或悬浮剂。
如果是药片，通常使用的载体包括乳糖、甘露醇和玉米淀粉。通常也添加诸如硬脂酸镁的润滑剂。如果是胶囊形式，活性化合物在硬胶囊中以干燥形式给药，或在软胶囊中在合适的凝胶或液体载体如液体聚乙烯乙二醇或卡拉胶凝胶中给药。
当液体溶液需要口服使用时，将黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物溶于诸如盐水、水或聚乙烯乙二醇(例如，PEG 400)的稀释剂中。在一个实施方式中，将活性成分溶于水中。对于口服的水性悬浮液而言，可以将活性成分与乳化和悬浮剂结合。如果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂。
在本发明的实施方式中，待治疗的癌症包括肝癌、胰腺癌和肺癌。在一个实施方式中，所述癌症是肝癌。
在一些实施方式中，待治疗的癌症可以是原发的或继发的，可以是在促进期或在进展期。促进期意味着待治疗的个体有患癌症的风险，但尚未表现出癌症的症状。例如，个体可以是那些接触大量放射或致癌物质的那些个体。进展期意味着肿瘤已经形成，诸如经诊断的患者中的肿瘤。
在其他实施方式中，癌症已经转移。实例包括，但不限于，从肝脏转移到肺脏或从肝脏转移到胰腺的癌症，其被称为继发癌。
在癌症处于进展期的一些实施方式中，组合物不仅消除或使原发肿瘤最小化，也抑制了肿瘤细胞的转移。
在本文描述的药物组合物的一些实施方式中，正在用活性化合物或组合物治疗的个体是哺乳动物。在一个实施方式中，所述个体是人类患者。
本文描述的药物组合物或活性成分能够降低肿瘤细胞的细胞活力，诸如人肝癌细胞，同时不对健康细胞造成伤害。本文描述的组合物或活性成分可以通过G0/G1期阻滞机制抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方式中，本发明的药物组合物或活性成分将肿瘤细胞的细胞活力降低到约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％或小于约40％。
本文描述的组合物或活性成分也能够诱导诸如人肝癌细胞的肿瘤细胞的凋亡。在一些实施方式中，可以通过可观测的梯形电泳图谱(DNA ladder)验证肿瘤细胞凋亡的出现。在一些实施方式中，药物毒性和代谢途径中的基因mRNA表达在应答组合物或活性成分时改变。这样的基因包括，但不限于，cyp4b1，cyp4f3，cyp 7a1，por，nat2，nat5，nat8，mgst1，arnt，xrcc2，nudt1，rad50，rad51，cdkn 1a，tnf，tnfrsf1 1a，bcl-2，rad23a，chek2，dpyd，ccng，atm，fgf2，rarb，cct2，cct4，cct5和ar。表达的变化可以是增加或减少。这些基因表达的变化可以是3倍至7倍或更高。
在其他实施方式中，组合物或活性成分的给药导致与凋亡和肿瘤形成相关的基因在mRNA或蛋白水平或两者的表达变化，而与癌症的分期无关(即，癌症可以处于促进期或进展期)。这样的基因包括p53，mdm2，p21，pcna，bax和bcl-2。组合物或活性成分的给药逆转p53(总的)，Bcl-2，Mdm2和PCNA增强的表达，并恢复p53(野生型)，p21和Bax在肿瘤中降低的表达。
本文描述的方法还涉及用本文所述的黑芥子苷或药物组合物治疗癌症的方法。所述方法，例如，可以包括给予有患癌症的风险或已患癌症的个体治疗有效量的本发明的活性组分，诸如黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物，或者本发明的药物组合物。
本发明的活性组分或组合物可以经静脉、皮下和肌内、舌下、口腔、局部或瘤内给药，其利用包含剂量单位的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物的多种剂量单位形式。黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物的剂量单位是约0.1mg至约100mg，约1mg至约15mg，或者可以是1mg，2.5mg，5mg或10mg。
依赖于癌症的症状和严重度，患者的性别、年龄和体重，给药的方法，给药的时间和间隔以及性能，分配，以及药物制剂的种类、特效成分等，剂量或有效量会变化。本领域的技术人员可以理解，对于剂量，没有特定的限制。通常给予的活性组分的有效量为每天约0.1至300mg每千克体重，或1至100mg每千克体重，通常分为1至4份来给药。然而，在大多数情况下，有效的日剂量为约1mg/kg至约25mg/kg体重，可以是约10mg/kg体重，以单次或分次剂量给药。然而，在一些情形下，使用这些限制外的剂量是必要的，这由开处方的医师来确定。可以在雷明顿氏药学(Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990))中找到用于配制和给药的多种技术。
本文描述的某些实施方式涉及抑制肝癌细胞生长的方法，所述方法包括将肝癌细胞与本文描述的药物组合物或者黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物接触。
其他实施方式涉及诱导肝癌细胞凋亡的方法，包括将肝癌细胞与本文描述的药物组合物或者黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物接触。
在一些实施方式中，所述肝癌细胞是哺乳动物细胞，包括人肝癌细胞。
某些实施方式还涉及黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物在制备用于治疗个体癌症的本文提供的药物或药物组合物中的用途。可以给予有患本文所述癌症的风险或患本文所述癌症的个体所述药物或药物组合物。
可以通过常规方法，例如在雷明顿氏药学(Remington′sPharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990))中找到的多种配制技术，来制备药物组合物。
实施例 通过下述系列实施例进一步说明本发明的实施方式。提供的实施例用于示例而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1 细胞活力检测 中性红(NR)细胞毒性检测是测定细胞存活/活力的化学敏感性检测，其基于存活细胞合并和结合中性红的能力，所述中性红是一种离体活体染料。NR是通过非离子扩散易于渗透细胞膜的弱阳离子染料，在细胞内的溶酶体内聚集，在那里它与溶酶体基质中的阴离子位点结合。细胞表面或敏感性溶酶体膜的变化导致溶酶体脆弱和渐进性不可逆的其他变化。这种由异生物质(xenobiotics)的作用带来的变化导致NR的摄取和结合减少。因此区分有活力的、受损的或死亡的细胞是可能的(Babich，H et al，1990)。
黑芥子苷单水合物购自Fluka。中性红染料粉末、Na2HPO4，NaH2PO4和NaHCO3购自Sigma。NaCl和SDS粉末购自USB。胰岛素、胎牛血清、PSN抗生素混合物、细胞培养基DMEM和RPMI粉末购自GibcoBRL，USA。96孔板购自IWAKI，JP。使用的试剂列于下表1中 表1用于细胞活力检测的试剂
在实验中使用三种不同的细胞系，即HepG2、WRL-68和Clone 9细胞系。HepG2是人肝母细胞瘤细胞系。它是抗HCC研究中公知的细胞模型(Alshatwi AA，et al，2006)。WRL-68是具有与肝细胞和肝原代培养物相似结构的人正常肝胚胎细胞系(Gutierrez-Ruiz，et al，1994)。该细胞系用作对照。克隆(Clone)9是大鼠Sprague Dawley(SD)肝脏正常细胞系。在体内研究中，黑芥子苷(SIN)将用于SD大鼠动物模型。在所述细胞活力研究中应用该细胞系是用来测试SIN是否在大鼠动物模型中有毒。
HepG2、WRL-68和克隆(Clone)9细胞在完全培养基(RPMI或DMEM)中生长，用胰蛋白酶消化并洗涤。将每种细胞类型的1万个细胞接种于96孔板中。预孵育24小时后，用不同浓度的SIN处理细胞并孵育72小时。孵育后，收集细胞并用1X PBS缓冲液洗涤两次。将50微升中性红溶液添加到每孔中。将整个板置于通有5％CO2的37℃培养箱内。孵育1小时后，用1X PBS缓冲液洗涤所述板两次，并在60℃烤箱中过夜完全干燥。将100μl 1％SDS溶液添加到每孔中以裂解细胞并溶解中性红染料。在OD540nm测量颜色。
图1显示了用不同浓度的SIN处理72小时后，HepG2，WRL 68和克隆(Clone)9细胞的活力。即使在低浓度(约25μM)，SIN能够将HepG2细胞的活力降到约70％。随着SIN浓度增加到1,000μM，HepG2细胞的活力继续降到约35％。HepG2细胞的IC50值低于250μM。相比之下，即便在SIN浓度达到1,000μM，也没有在健康肝脏细胞(WRL-68细胞或克隆9细胞)的培养物中观察到细胞活力的降低。结果表明SIN能够特异性抑制肿瘤细胞的生长。
实施例2 细胞周期分析 流式细胞术是测量经过传感器时的悬浮细胞或颗粒的某些物理和化学特性的快速定量方法。当细胞标记有碘化丙啶(PI)时，可以测量DNA含量，这可用于确定细胞周期的时相。当获得细胞周期时，可以记录细胞周期图。
鞘液购自FACSFlowTM，并是即用型的。乙醇购自BDH。PI购自Sigma。RNase A购自USB。下述表2中列出了使用的试剂 表2用于细胞周期分析的试剂
用胰蛋白酶消化HepG2细胞、洗涤并在完全RPMI培养基中接种于25mm2培养板中。预孵育24小时后，将不同浓度(250μM and 500μM)的SIN添加到培养板内。将完全RPMI培养基添加到含有对照细胞的一个板中。用SIN孵育不同时间段后，收获细胞，将培养基从培养板中移除，并用2ml 1X PBS缓冲液洗涤所述板两次。收集所有溶液，并将细胞用胰蛋白酶消化并收集。将全部溶液于1,000rpm离心3分钟。移除上清并将细胞沉淀重悬于1ml 1X PBS缓冲液中洗涤。将悬浮液转移到微量离心管中。在1,000rpm离心洗涤液3分钟后，弃掉上清。
将细胞沉淀重悬于1ml的70％乙醇和0.1ml 1X PBS缓冲液中。将悬浮液置于4℃过夜以固定细胞。于1,000rpm离心3分钟后，加入1ml 1X PBS用以洗涤。将PI溶液(1ml)加到细胞中，随后将所述细胞在37℃孵育30分钟。利用带有充足鞘液的FACScan流式细胞仪来分析DNA含量。通过由De Novo软件公司生产的FCS快捷软件(FCS express software)分析结果。
SIN处理在HepG2细胞中引起G0/G1期阻滞(图2，3)。用0.5mMSIN处理96小时后的HepG2细胞，与未处理的细胞相比，在亚G1期阻滞的细胞的增加变得非常明显(图2J，L)。图3还通过显示用不同浓度SIN处理后在不同时间点的不同细胞周期时相中的细胞分布证实了阻滞的亚G1(sub G1)期。处于G1期后的时相(S和G2期)的细胞数目减少，而处于G1和亚G1期的细胞数目增加(图3)。上述结果表明SIN处理的HepG2细胞的生长通过G0/G1期阻滞机制被抑制。
实施例3 通过DNA断裂检测确定凋亡 DNA断裂或梯形电泳图谱(DNA laddering)是凋亡的一个指标。在凋亡过程中，与DNA修复和细胞复制有关的酶失活，且核蛋白被降解。核结构碎裂后，核内的DNA被由半胱氨酸天冬氨酸酶活化的DNase切割成碎片。该DNase酶仅在凋亡过程中活化并导致DNA断裂成核小体单位(Hugh J M Brady，2004)。DNA断裂用于识别凋亡事件。
EDTA、甘油、二甲苯青(Xylene Cyanole)、RNase A和蛋白酶K购自Sigma。溴酚兰、琼脂糖、Tris-碱、硼酸、NaCl和SDS粉末购自USB。乙醇购自BDH。使用的试剂列于下表3中 表3用于DNA断裂检测的试剂
如前面的实施例中所描述的那样处理和收获HepG2细胞。通过涡旋振荡将细胞沉淀重悬于400μl的裂解缓冲液中。将20μl 10mg/ml的蛋白酶K完全分散后添加到溶液中。将所述溶液在37℃孵育3小时以完全裂解细胞。孵育后，使溶液冷却到室温。将150微升饱和NaCl溶液添加到细胞裂解液中并涡旋振荡。将所述裂解液在7,000rpm下离心15分钟。将上清收集到新的微量离心管中。将1毫升冰冷纯乙醇添加到所述溶液中以沉淀DNA。沉淀后，将微量离心管在14,000rpm下于4℃离心20分钟。移除上清并用70％乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心。将所述沉淀在室温下干燥。将50微升含RNase A的TE缓冲液添加到微量离心管中以溶解干燥后的DNA。将样品在37℃下孵育2小时以溶解DNA。
将0.3g琼脂糖、20ml TBE缓冲液和3μl EB混合并加热以制备1.5％的琼脂糖凝胶用以DNA断碎裂检测。10微升溶解的样品与2μl6X DNA上样染料(loading dye)混合以制备上样样品。样品在1.5％琼脂糖凝胶上在80V下跑1小时。在紫外透照仪(UV illuminator，UVP)下检测DNA条带并将所述凝胶拍照以成像。
在用0.25mM SIN处理的HepG2细胞中，梯形电泳图谱(DNAladder)开始出现在琼脂糖凝胶的上部(图4泳道B)。在用0.5mM SIN处理96小时的HepG2细胞中，梯形电泳图谱清晰可见，表明这些细胞经历了凋亡(图4泳道C)。在未处理的HepG2细胞中，没有观察到DNA裂解或降解(图4泳道D)。
实施例4 cDNA微阵列 核酸阵列技术的进展使得可以在单次实验中分析多个基因的表达。cDNA微阵列以更全面和低成本高效的方式用于表征与具体生物途径相关的基因表达。cDNA微阵列膜上的基因靶向药物毒性和代谢途径。它是研究SIN的生物活性有益的方法。
Oligo GEArray人药物代谢和毒性微阵列膜(OHS-401)和带有Truelabeling-AMP2.0的Oligo GEArray试剂盒(GA-034)购自SuperArray。生物素-UTP购自ROCHE。焦碳酸二乙酯(DEPC)，MOPS、SDS、NaCl、脱水柠檬酸钠、醋酸钠和琼脂糖购自USB。氯仿、异丙醇和甲醛(12.3M)购自Sigma。

试剂购自Invitrogen。乙醇购自BDH.Super RX X-光胶片购自FujiFilm Ltd。Oligo GEArray试剂盒的内容物列于下述表4中，且使用的其他试剂列于下述表5中 表4Oligo GEArray试剂盒的内容物
表5用于cDNA微阵列的其他试剂

如前面的实施例中所描述的那样处理和收获HepG2细胞。将细胞沉淀溶解于500μl

试剂(Invitrogen，CA，USA)中。使整个溶液在室温静止5分钟。将溶液在14,000rpm下于4℃离心10分钟。将上清收集到含有100μl氯仿的新管中。在室温下摇动孵育10分钟后，将溶液在14,000rpm下于4℃离心15分钟。如果分层不够清晰，再次离心是必要的。将上面的水层小心地转移到含有250μl异丙醇的新管中。摇动后，将所述管在室温下静止10分钟用于RNA沉淀。将所述管在14,000rpm下于4℃离心10分钟。弃掉上清并将0.5ml的75％乙醇加到管中用于洗涤。将所述管在7,500rpm下于4℃离心5分钟。小心地将上清用移液管吸走，使沉淀在室温下干燥。加入50微升高压灭菌的DEPC-H2O以在55℃下溶解RNA15分钟。
通过分光光度计在OD 280nm，260nm和320nm处测定RNA样品。用1X TE缓冲液(pH 8.0)将RNA样品稀释1000X。将1X TE缓冲液用作分光光度测量的空白对照。当OD 260nm和OD 280nm处的读数比大于2.0时，RNA样品的质量是可接受的。用公式(OD 260nm处的1U吸光度＝40μg/ml标准RNA)计算样品中RNA的量并用稀释因数校正。
通过Superarray TrueLabeling-AMPTM 2.0试剂盒将mRNA逆转录成cDNA。将3微克总RNA、1μl寡dT引物(G1)和一定体积的不含RNase H2O(RNase-Free H2O)混合成10μl总体积。将混合物在70℃孵育10分钟并立即置于冰上冷却。将4微升不含RNase的H2O、4μl5X cDNA合成缓冲液(G3)，1μl RNase抑制剂和1μl cDNA合成酶混合物(G2)加到每管中并混合。将所述管在42℃下孵育50分钟，随后在75℃下孵育5分钟，而后冷却到37℃。
将各样品的3微克RNA用于RNA凝胶电泳。将多种体积的RNA样品和2μl RNA上样染料混合并加入RNA上样缓冲液以制成总体积为20μl的混合物。将上样混合物在70℃下孵育15分钟以使RNA变性。
如表5中所述制备RNA凝胶，1X MOPS用作电泳缓冲液。将20微升RNA样品上样混合物加载至所述凝胶并在100V下电泳35分钟。将凝胶用EB后染色一定时间并用高压灭菌的DECP水脱色。在紫外透照仪(UVP)下检测RNA条带，并将凝胶拍照以成像。获得28s和18s核糖体RNA的锐利条带(Sharp bands)被视为高质量的RNA。
将16微升2.5X RNA聚合酶缓冲液(G24)、2μl生物素化UTP(10mM)以及2μl RNA聚合酶(G25)加到每一管中并混合。在37℃下将整个混合物孵育1小时。
使用SuperArray Array Grade cRNA Cleanup试剂盒进行cRNA纯化。将60μl不含RNase的H2O加到各cRNA合成反应管中，终体积为100μl。将整个反应混合物转移到1个1.5-ml没有RNase的管中。将350微升裂解&结合缓冲液(G6)加到各反应混合物中并混合。与350μl 100％乙醇混合后，将各样品立即加载到其各自的离心柱中央。然后将所述离心柱在8,000x g下离心30秒。弃掉穿流液(flow-through)并在各离心柱中加入600μl洗涤缓冲液(含乙醇的G17)。将离心柱在8,000x g下离心30秒。弃掉穿流液并在各离心柱中加入200μl洗涤缓冲液(含乙醇的G17)。将离心柱在11,000x g下离心3分钟，转移到新的洗脱管中并弃掉穿流液。将50微升不含RNase的10mM Tris缓冲液(pH 8.0)(G26)加到各离心柱的中央。将所述柱在室温下孵育2分钟，而后在8,000x g下离心1分钟。穿流液(flow-through)即是纯化的cRNA。如前述确定cRNA产物的质量和数量。
使用Oligo

微阵列人药物代谢和毒性膜(Oligo

Microarray Human Drug Metabolism and Toxicitymembranes)。将阵列膜用5ml去离子水预湿润。将杂交管反向放置5分钟以检测有无渗漏。GEAhyb杂交液使用前加温到60℃。弃掉杂交管中的水并将2ml杂交溶液加到各管中在60℃进行预杂交。预杂交2小时后，弃掉初始预杂交溶液，并将2μg cRNA产物和0.75ml杂交溶液加到各管中在60℃杂交过夜。
杂交后，将杂交混合物倒入新的干净的微量离心管中并储存于-20℃。将5毫升洗涤液1(1％SDS，0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠二水合物)加到杂交管中。将所述杂交管置于60℃烤箱内并在25rpm下洗涤15分钟。洗涤后弃掉洗涤液1并将5ml洗涤液2加到杂交管中。将样品放于60℃烤箱内并在25rpm下洗涤15分钟。立即将洗涤液弃掉。使杂交管和烤箱冷却到室温。将2毫升GEAblocking溶液Q加到各杂交管中并涡旋振荡。将杂交管置于室温下的烤箱中并在25rpm下孵育40分钟。孵育后，弃掉溶液Q并将2ml稀释的AP-SA缓冲液加到杂交管中且在连续的7.5rpm搅动下孵育10分钟。在轻摇下，将所述膜用4ml 1X缓冲液F洗涤4次，每次5分钟。末次洗涤后，将膜用3ml缓冲液G冲洗2次。将1毫升CDP-star化学发光底物加到各杂交管中并孵育5分钟。将所述膜包裹在保鲜膜(Saran foil)中，并立即暴露于X-光胶片不同时间。
通过计算机扫描捕获来自EC L溶液的信号的胶片并通过SuperArray网站提供的在线软件进行分析。背景设置为“最小值”，密度设置为“平均”。
图5A显示了药物毒性和代谢途径中的许多基因在SIN处理前后的HepG2细胞中表达的差异。图5B是对照膜的图像，且图5C是SIN处理的样品膜的图像。
实施例5 通过给予黑芥子苷预防大鼠HCC的发生 在体内实验中将Sprague Dawley(SD)大鼠用作动物模型。从香港中文大学的实验室动物服务中心(Laboratory Animal Services Center ofThe Chinese University of Hong Kong)获得雄性SD大鼠(80-90g体重)。将大鼠饲养于啮齿动物室，12小时明暗周期且恒定温度为25℃。每只笼内饲养4只大鼠。自由进食和饮水。观察所有动物并每天称重。
黑芥子苷单水合物购自Fluka。CCl4购自Merck。玉米油(VeCorn)购自超市.DMSO，DEN和甲醛购自Sigma。用于动物处理的试剂列于下面的表6中 表6用于动物处理的试剂
实验诱导大鼠的肝癌。将SIN给予不同阶段的处理组的大鼠。在实验设计中应用化学致癌物质以能够在短时间内诱导肝癌(Ha W.S.etal.，2001)。二乙基亚硝胺(DEN)经常被其他的科学家用于诱导肝癌。按照已建立的实验方案(Kovalszky，I.et al.，1992)，在实验中应用DEN联合CCl4给药的方法以诱导大鼠肝癌。
DEN是能够影响所有动物种类的遗传毒性致癌物，被认为很可能是人类致癌物质(Group 2A)(IARC，1978)。DEN由P450催化并形成α-羟基亚硝胺，其被报道主要产生肝脏肿瘤(IARC，1978)。四氯化碳(CCl4)是非遗传毒性致癌物质。它能够在大鼠中产生肝脏和乳腺肿瘤(IARC，1999)。当将CCl4与其他致癌物质一起使用时，肿瘤形成的几率增加(IARC，1999)。这表明CCl4在肝癌形成过程中是理想的促进剂。
促进期的实验是研究SIN在癌症发展的促进期的作用。15只大鼠被随机分为3组阴性对照组(5只大鼠)，阳性对照组(5只大鼠)和SIN处理组(5只大鼠)。
实验方案总结于图7中。
表7总结了大鼠的处理细节。
表7促进期大鼠的处理 在促进期的实验中，阴性对照组的大鼠在前2周接受每周一次的DMSO腹腔注射(i.p.)，然后在时间表的其余时间内接受每周一次的玉米油腹腔注射。阳性对照组和SIN处理组大鼠都在前2周接受每周一次的致癌物DEN的腹腔注射(i.p.)，然后在时间表的其余时间接受每周一次促进剂CCl4腹腔注射。在引发剂致癌物质处理和促进剂CCl4处理之间插入2周的禁食。在2周的禁食期，大鼠禁食5天后喂食2天，再进行另外5天的禁食。动物自由饮水。禁食后，阴性对照组和阳性对照组每天经口给予水一次。禁食后，SIN处理组经口给予剂量为15mg/kg的黑芥子苷28周，每天一次。
在实验期间，每天监测大鼠的体重。末次CCl4注射后一周，通过氮气窒息处死所有的大鼠，并收集血液。用冰冷的1X PBS灌注大鼠肝脏，并快速切除、洗涤和称重。将大鼠肝脏拍照以成像。每一肝脏随机切出5张切片并将肝脏的其余部分冻于液氮中，储存在-80℃用于进一步的分析。将肝脏切片固定于10％甲醛溶液中24小时，并储存于75％乙醇中用于组织学分析。
阴性对照组的肝脏具有健康的形态(图8A)，而在来自阳性对照组的肝脏上直接观察到许多肿瘤(图8B)。然而，在来自SIN处理组的肝脏上没有可见的肿瘤(图8C)。SIN处理也逆转了在阳性对照组观察到的肝脏重量的增加(图9A，9B)。与阴性对照组相比，阳性对照组的肝脏重量百分比和肝脏重量指数都大大增加，而在SIN处理组它们仅轻微升高(图9A，9B)。这些结果表明SIN处理维持了肝脏的正常形态。
实施例6 促进期肿瘤的AST/ALT检测 ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酸)是特异性位于肝脏的两种酶。这两种酶通常极少分布在血清中。当肝脏受损时，肝细胞破裂从而使这两种酶释放入血液中。AST/ALT检测用于诊断肝脏损伤。将大鼠血液收集到13ml BD PLUS-SST II血清真空管(vacutainer)中，并在冰上静止20分钟以凝固。然后将所述真空管在3,500rpm下离心15分钟。收集上层血清。在2天内进行AST/ALT检测以使酶的损失最小化。
AST/ALT(UV-Rate)检测试剂盒购自Stanbio。真空管(Vacutainer)购自BD Ltd。
血清AST活性检测通过Stanbio AST(UV-Rate)试剂盒测量。按照试剂盒的实验方案，将15毫升ddH2O加到试剂盒中的一个试剂瓶中，并充分混合。对于每一反应，在37℃下将1毫升试剂孵育至少10分钟。将100微升血清样品加到试剂溶液中并严格孵育1分钟。在OD340nm处测量吸光度。孵育1分钟后，进行读数并将该点的读数计为0时间。每间隔30秒读数一次，进行三分钟。计算每分钟吸光度的变化并通过公式 来计算AST活性。
通过Stanbio ALT(UV-Rate)试剂盒进行ALT检测，实验方案与AST检测相同。
阳性对照中的大鼠血清ALT和AST水平高于阴性对照水平2.5倍(图10)。SIN处理将ALT和AST的量降低到与阴性对照相似的水平(图10)。因为血清ALT/AST水平是肝脏损伤的指标，所述结果表明SIN处理能够预防或使肝脏损伤最小化。
实施例7 在肿瘤促进期，SIN处理恢复了肝细胞的基本结构 进行组织学分析以观察肝细胞的基本结构。二甲苯购自Mallinckrodt。乙醇购自BDH。ABC染色(抗-兔)试剂盒(sc-2018)购自Santa Cruz。Superfrost显微镜玻片购自Fisher。30％H2O2，DAB和甲醛购自Sigma。抗-GST-pi兔多克隆抗体购自MBL。使用的试剂列于下面的表8中 表8用于组织学分析的试剂
将肝脏样品用10％甲醛固定并放于片匣中脱水以及用石蜡固定。随后，将肝脏样品包埋于固结的石蜡中，用显微镜用薄片切片机切成5μm厚的切片。将切好的样品贴于Superfrost显微镜玻片上用于进一步的研究。
将带有肝脏切片的玻片置于玻片架上，脱蜡，并依次用二甲苯(3次，每次5分钟)、100％乙醇(3次，每次3分钟)、95％乙醇(3分钟)、80％乙醇(3分钟)和蒸馏水(5分钟)再水化。然后将玻片浸入苏木精中约3分钟，在水中使颜色形成几分钟，随后用酸乙醇(acid ethanol)和水进行短暂脱色。将玻片浸入伊红中约30分钟使细胞质染成红色，接着在自来水中冲洗几分钟。必需进行玻片校核(Slide-checking)以确保最好的染色效果。依次用95％乙醇(3分钟)，100％乙醇(3次，每次5分钟)和二甲苯(3次，每次5分钟)使玻片脱水。最后，将玻片用盖玻片封固，并干燥。Axiophot-2通用显微镜(Zeiss)与计算机连接。通过Spot32图像捕获软件(Diagnostic Instruments)捕获图像。
将带有肝脏切片的玻片置于玻片架上，脱蜡并如前所述用二甲苯和不同浓度的乙醇再水化。将玻片用1％H2O2溶液在室温孵育5分钟以封闭内源性过氧化物酶活性，随后在自来水中洗涤5分钟。新鲜配制热柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。将玻片在热柠檬酸缓冲液中加热5分钟用于抗原修复。将玻片用PBS洗涤三遍，每遍5分钟。将玻片从PBS中取出并放于湿润室皿中。用Santa Cruz ABC染色试剂盒进行免疫染色。图11总结了ABC试剂盒中整个设计方案。将200微升稀释的正常血清溶液加到各玻片的切片上并孵育1小时以封闭非特异性结合。使正常的血清流出后，加入200μl稀释的抗-GST-pi抗体(兔多抗，1∶10)并在4℃孵育过夜。用1X PBS洗涤3次，每次5分钟，加入200μl稀释的生物素化二抗(1∶200)并在室温孵育30分钟。用PBS洗涤3次(每次5分钟)后，加入200μl抗生物素蛋白&生物素化的辣根过氧化物酶大分子复合物(ABC)孵育30分钟。将玻片用PBS洗涤并通过DAB溶液显色约3分钟。用自来水洗涤几分钟后，使玻片在苏木精中复染3分钟并用自来水洗涤。如前所述使玻片脱水。最后，将玻片用盖玻片封固并使其干燥。
通过与计算机连接的Axiophot-2通用显微镜(Zeiss)检查并捕获图像以成像。通过Spot 32图像捕获软件(Diagnostic Instruments)记录图像。通过Image J软件的分析，放大2.5倍的图像用于计算GST-p阳性区域/全部面积的比值。
图12A显示了阴性对照的肝脏肝细胞的正常的基本结构细胞和核的轮廓清楚且细胞染成亮红色。然而，在来自阳性对照组的肝脏，肝细胞严重受损。细胞染成暗红色且中央静脉消失(图12B)。而且，可以观察到肝细胞内的细胞质空泡化(图12C)。在来自SIN-处理组的肝脏中，肝细胞的基本结构和中央静脉恢复(图12D)。
在来自阴性对照的肝脏中，没有发现GST-p表达(图13A，B)。然而，GST-p免疫染色显示了阳性对照中广泛的成簇GST-p阳性区域(图13C，D)。在来自SIN-处理组的肝脏中仅发现有限的GST-p阳性区域(图13E，F)，提示SIN处理能够恢复肝细胞的基本结构。图14比较了各组的GST-p阳性区域百分比。SIN处理将GST-p阳性区域从阳性对照组的约35％降到测试组的仅5％。
实施例8 促进期基因表达检测 检测了与凋亡和肿瘤有关的所选择基因在mRNA和蛋白水平的表达模式，以研究黑芥子苷抑制肿瘤发生的机制。
寡dT引物、10mM dNTP混合物、Taq聚合酶、SuperScript II逆转录酶和β-肌动蛋白引物混合物购自Invitrogen。5X第一链缓冲液以及10X PCR缓冲液购自GibcoBRL。MgCl2购自Sigma。靶基因引物混合物购自Tech Dragon Ltd。使用的试剂列于下面的表9中 表9用于基因表达检测的试剂
从300μg大鼠肝脏中提取RNA，并如前面实施例中所述那样进行检测。将3微克总RNA、1μl寡dT引物和一定体积的不含RNase的H2O混合到12μl的总体积。将混合物在70℃孵育10分钟并立即在冰上冷却。将4微升5X第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT、1μl 10mMdNTP混合物和1μl SuperScript II加到每管中并混合。将所述管在42℃下孵育50分钟，随后在70℃孵育15分钟，然后置于冰上冷却。这样就制备好了用于PCR扩增的cDNA。
在Gene

PCR系统中于20μl终体积中进行PCR反应。PCR反应混合物包含1μl前面合成的cDNA，2μl 10X PCR缓冲液，0.4μl10mM dNTP混合物，1.2μl 25mM MgCl2，1μl 10mM引物混合物，0.2μl重组Taq聚合酶和14.2μl高压灭菌的ddH2O。每一基因的引物混合物的细节总结于下面的表10中 表10用于PCR的引物序列
对于作为内对照的β-肌动蛋白基因和Mdm2基因的合成，将PCR混合物在94℃孵育5分钟，随后是30个循环的扩增。每一循环由94℃变性45秒、55℃退火45秒以及72℃延伸30秒组成。完成所有的循环后，在72℃进行最后的延伸步骤10分钟。PCR产物用于凝胶电泳。
对于合成p53，分别将循环的次数增加到35次，退火温度提高到58℃，延伸时间延长到1.5分钟。
如前所述，在DNA凝胶上显现PCR产物。
通过软件Image J分析PCR产物的强度。测量的β-肌动蛋白基因的条带强度作为内对照。靶基因与β-肌动蛋白基因的条带强度比用于比较不同处理组的各基因的mRNA水平。
HEPES、MgCl2、甘油、DTT、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，β-巯基乙醇和EDTA购自Sigma。Tris-碱、溴酚蓝，曲拉通-X-100，NaCl、PMSF、甘氨酸和SDS粉末购自USB。ECL检测试剂盒购自AMERSHAM。蛋白酶抑制剂片购自ROCHE。甲醇购自BDH。吐温-20购自Pharmacia Biotech。Immobilon-P PVDF膜购自Millipore。包括抗-Mdm2小鼠单克隆SMP14、抗-p53小鼠单克隆Pab 246、抗-Bcl-2小鼠单克隆c-2、抗-Bax小鼠单克隆5B7、抗-p21小鼠单克隆和抗-PCNA小鼠单克隆抗体的一抗购自Santa Cruz，CA。抗-野生型p53小鼠单克隆Ab6购自Oncogene Science。山羊抗-小鼠IgG和山羊抗-兔IgG抗体的二抗购自Santa Cruz，CA.Super RX X-光胶片购自FujiFilm Ltd.用于蛋白质印迹分析的试剂列于下面的表11中 表11用于蛋白质印迹分析的试剂


将300微克的各肝脏样品以1g/ml在溶液C中均浆，所述匀浆使用玻璃均浆器在冰上进行。将均浆液转移到微量离心管中并于13,000rpm下离心20分钟。收集上清并将等体积的2X上样染料添加到各样品中。将样品储存在-20℃。蛋白用于Bax，Bcl-2，PCNA和p21的表达水平的免疫检测。
将300微克的各肝脏样品以1g/ml在溶液A中均浆，所述匀浆使用玻璃均浆器在冰上进行。将均浆液转移到微量离心管中并于3,000rpm下离心5分钟以离下未破碎的组织。收集上清并在冰上孵育5分钟，而后于5,000rpm下离心5分钟。弃掉上清并通过100μl溶液B裂解沉淀。裂解过程在冰上持续20分钟。孵育后，将溶液在12,000rpm下离心15秒以离下细胞碎片。收集上清并将等体积的2X上样染料加到各样品中。样品用于p53和mdm2表达水平的免疫检测。
小型-PROTEAN II电泳单元(Bio-Rad)用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。按照操作方案装配凝胶模子。将约3ml水倒入做好的模子中检测有无渗漏。将水弃掉，依照已建立的方案制备分离胶溶液。10％的丙烯酰胺凝胶用于分离。将分离胶以合适的体积(约2/3满)倒入模子中。将凝胶溶液倒入模子中后，倒入一薄层蒸馏水以确保凝胶表面的平滑。使凝胶聚合30分钟。然后移除凝胶上面的蒸馏水。将压缩胶倒入分离胶上方。立即将用于制备样品狭槽(slot)的梳子插入压缩胶中。使压缩胶聚合超过30分钟。将整个凝胶装备(gelsetup)置于凝胶槽中，然后将新鲜配制的1X SDS电泳缓冲液加入到槽内，没过凝胶装备。随后移除梳子。蛋白样品与上样缓冲液加到压缩胶中的狭槽内。凝胶在150V下电泳1小时，直至染料到达凝胶末端。
从玻璃板中移除凝胶，并浸入转移缓冲液中。PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)用于蛋白质印迹。首先将膜在甲醇中湿润1分钟。将膜分别浸没入H2O和转移缓冲液中几分钟。将6张裁剪成相同大小的滤纸在转移缓冲液中浸湿。将3张滤纸置于转移槽的床的上面。赶走气泡。随后，将膜置于上方。然后凝胶和另3张湿润的滤纸被置于膜上面。转移过程是在10V下进行1小时(mA限4mA/cm2凝胶)。通过在TBST缓冲液中洗涤几次移除膜上多余的转移缓冲液。所述膜用于进行抗体封闭。
各转移的膜印迹在4ml含5％脱脂奶粉和一抗的TBST中于4℃下孵育过夜。孵育后，将膜在TBST缓冲液中洗涤3次，每次10分钟。然后将各转移的膜印迹在4ml含5％脱脂奶粉和二抗的TBST中在室温孵育1小时。孵育后，将膜在TBST缓冲液中洗涤3次，每次10分钟。所述膜用于ECL反应。
ECL试剂储存在4℃。对于每一印迹，将ECL试剂盒(Amersham)中的0.5ml溶液1和0.5ml溶液2在使用前新鲜混合。将所述印迹与混合的溶液接触5分钟。利用相同的溶液，可以使两个印迹依次显色。将膜包在保鲜膜中，立即暴露于X-光胶片中不同时间段。曝光时间取决于抗体的强度。
将捕获ECL反应信号的胶片扫描入计算机并通过Image J软件分析以读取暗密度(density of darkness)。
DNA断裂已经表明SIN处理可以诱导HepG2细胞的凋亡(图4)，这可能是SIN抑制癌症的机制。因此，有兴趣检测诸如p53和Bcl-2的凋亡相关基因以及包括Mdm2，p21，PCNA和Bax在内的肿瘤形成相关的基因的表达模式。在mRNA水平或蛋白水平或两者的水平检测基因表达。如Figs.13-17所示，SIN的处理逆转了大多数情况下的阳性对照组的表达变化，这可能是由于黑芥子苷抑制肿瘤作用的机制。
具体来说，p53和Mdm2的mRNA表达在阳性对照组明显增加，而它们的表达在SIN处理组降低到接近阴性对照组的水平(图15)。在肿瘤内经常观测到p53的过表达，但它们中的一些是突变的p53。图16A显示，尽管总p53水平在阳性对照组和SIN处理组都显著增加(图16A，B)，但在阳性对照组野生型p53蛋白的水平降低，而SIN的处理将其表达恢复到甚至高于阴性对照组的水平(图16C，D)。Mdm2蛋白表达在阳性对照组显著增加，SIN处理部分逆转了这种增加(图17)。SIN处理也逆转了阳性对照组中PCNA蛋白和Bcl-2蛋白增加的表达以及Bax蛋白降低的表达(图18C，D；图19)。然而，令人惊讶地，SIN处理组p21蛋白的表达远远高于阴性对照组和阳性对照组的表达(图18A，B)。这一结果提示了SIN抑制肿瘤生长的机制的复杂性。
实施例9 通过给予黑芥子苷治疗大鼠的HCC 研究了SIN对癌症发展进展期的影响。图20总结了应用于大鼠的方案。大鼠数量和分组方法都与促进期实验中所述的相同。
阴性对照组大鼠在前2周接受每周一次的DMSO腹腔注射(i.p.)，然后接受28周的每周一次的玉米油腹腔注射。阳性对照组和SIN处理组大鼠都在前2周接受每周一次的DEN腹腔注射(i.p.)，然后接受28周的每周一次CCl4腹腔注射。在DEN处理和CCl4处理之间插入2周的禁食。从第33周起，阴性对照组和阳性对照组一天经口给予水一次。SIN处理组每天经口给予剂量为15mg/kg的黑芥子苷一次，持续24周。处理后，杀死大鼠。收集血液和肝脏，并如前面的实施例所述进行处理。
阴性对照组的肝脏具有健康的表观(图21A)，而在来自阳性对照组的肝脏上直接观察到大肿瘤，导致肝脏失去了正常的形态(图21B，C)。然而，在来自SIN处理组的肝脏上几乎没有可见的肿瘤(图21D)。SIN处理也逆转了在阳性对照组观察到的肝脏重量的增加(图22)。与阴性对照组相比，阳性对照组的肝脏重量百分比和肝脏重量指数都大大增加，而在SIN处理组它们仅轻微升高(图22)。这些结果表明SIN处理恢复了肝脏的正常形态。
实施例10 进展期的AST/ALT检测 如前面实施例所述的那样实施AST/ALT检测。阳性对照中的大鼠血清ALT和AST水平分别是阴性对照组大鼠水平的215％和265％(图23)。SIN处理将ALT和AST的量降低到与阴性对照组相似的水平(图23)。因为血清ALT/AST水平是肝脏损伤的指标，所述结果表明SIN处理至少能够部分逆转肝脏损伤。
实施例11 SIN处理恢复了进展期肝细胞的基本结构 如前面实施例中描述的那样进行实验。图24A显示了阴性对照的肝脏肝细胞的正常的基本结构细胞和核的轮廓清楚且细胞染成亮红色。然而，在来自阳性对照组的肝脏，肝细胞严重受损，如出现的成簇脂滴所显示的(图24B)。而且，可以观察到细胞死亡、增加的血管和血流以及肝细胞内的细胞质空泡化(图24C)。在来自SIN-处理组的肝脏中，恢复了基本结构，没有异常的表观(图24D)。
在来自阴性对照组的肝脏中没有发现GST-p表达(图25A，25B)。然而，GST-p染色显示了阳性对照组整个切片中成簇的GST-p阳性区域(图25C)。也观察到了坏死的细胞(图25D)。在来自SIN-处理组的肝脏中仅存在有限的GST-p阳性区域(图25E，25F，25G)，表明SIN处理能够恢复肝细胞的基本结构。图26比较了各组的GST-p阳性区域百分比。SIN处理将GST-p阳性区域从阳性对照组的约30％降低到SIN处理组的低于10％。
实施例12 进展期的基因表达检测 如前面实施例所述的那样，进行基因表达检测。选择的凋亡和肿瘤形成相关的基因，包括p53，Mdm2，p21，PCNA，Bax和Bcl-2的表达模式通过mRNA水平或蛋白水平或两者的半定量PCR检测和蛋白质印迹来检测。如图27-31所示，SIN处理逆转了大多数情况下阳性对照组中这些基因的表达变化，这可能提示了黑芥子苷抑制肿瘤功能的机制。
具体来说，p53和Mdm2的mRNA表达在阳性对照中都明显增加，而在SIN处理组中，它们的表达降回到接近阴性对照的水平或甚至低于阴性对照的水平(图27)。经常在肿瘤中观测到p53的过表达，但所述p53中的一些是突变的p53。图28A表明，尽管总p53蛋白的水平在阳性对照和SIN处理组中显著增加(图28A，B)，但野生型p53蛋白的水平在阳性对照中降低，而SIN处理使其表达恢复到甚至高于阴性对照的水平(图28C，D)。Mdm2蛋白表达在阳性对照中显著增加，SIN处理部分逆转了其表达(图29)。SIN处理也逆转了阳性对照组中增加的PCNA蛋白和Bcl-2蛋白的表达以及降低的Bax蛋白的表达(图30C，D；图31)。与促进期的情况不同，p21蛋白表达在阳性对照中如预期的那样降低，而SIN处理将其表达恢复到远高于阴性对照组的水平(图30A，B)。
通过本发明的上述说明，本领域的技术人员会认识到可以对本发明进行改良、变化和修改。本领域技术内的这种改良、变化和修改都在附加的权利要求书的范围之内。
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1.治疗肝癌的药物组合物，其由黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物，以及药学上可接受的载体组成。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物包含治疗有效量的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物，所述治疗有效量为每天约1mg/kg体重至约100mg/kg体重。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述治疗有效量是每天10mg/kg体重。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体是水。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物配制成选自药片、糖衣丸、片剂、胶囊、合适的溶液或悬浮液和贮存剂或持续释放制剂的剂量单位形式。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含约0.1mg至约100mg剂量单位的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述剂量单位为约1mg至约15mg。
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述剂量单位是1mg、2.5mg、5mg或10mg。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述癌症是原发性癌。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述癌症是继发性癌。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物减低了肿瘤细胞的活力。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物诱导了肿瘤细胞的凋亡。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物改变了选自p53，mdm2，p21，pcna，bax和bcl-2的凋亡相关基因的表达。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物改变了药物毒性和代谢途径中的基因的mRNA表达，其中所述基因是选自cyp4b1，cyp4f3，cyp 7a1，por，nat2，nat5，nat8，mgst1，arnt，xrcc2，nudt1，rad50，rad51，cdkn1a，tnf，tnfrsf11a，bcl-2，rad23a，chek2，dpyd，ccng，atm，fgf2，rarb，cct2，cct4，cct5和ar的至少一种基因。
15.治疗个体肝癌的方法，包括给予个体治疗有效量的权利要求1至14中任一项所述的药物组合物或者黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症是原发性癌。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症是继发性癌。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述药物组合物经静脉、腹腔、皮下、肌内、口腔、局部或瘤内给予个体。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述药物组合物经口给药。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物以每天约1mg/kg至约100mg/kg体重的治疗有效量给药。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物以每天10mg/kg体重的治疗有效量给药。
22.如权利要求15所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述个体是人。
24.抑制肝癌细胞生长的方法，包括使所述肝癌细胞与治疗有效量的权利要求1至15中任一项所述的药物组合或者黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物接触。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述肝癌细胞是哺乳动物肝癌细胞。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述肝癌细胞是人肝癌细胞。
27.诱导肝癌细胞凋亡的方法，其包括使所述肝癌细胞与治疗有效量的权利要求1至15中任一项所述的药物组合或者黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物接触。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述肝癌细胞是哺乳动物肝癌细胞。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述肝癌细胞是人肝癌细胞。
30.黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物在制备用于治疗个体肝癌的药物中的用途，其中所述药物由黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物以及药学上可接受的载体组成。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述药物包含每天约1mg/kg至约100mg/kg体重的治疗有效量的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述治疗有效量是每天10mg/kg体重。
33.如权利要求30所述的用途，其中所述药物可接受的载体是水。
34.如权利要求30所述的用途，其中所述癌症是原发性癌。
35.如权利要求30所述的用途，其中所述癌症是继发性癌。
36.如权利要求30所述的用途，其中所述药物配制成选自药片、糖衣丸、片剂、胶囊、合适的溶液或悬浮液和贮存剂或持续释放制剂的剂量单位形式。
37.如权利要求36所述的用途，其中所述药物包含约0.1mg至约100mg的剂量单位的黑芥子苷或其药学上可接受的衍生物或两者的混合物。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述剂量单位是约1mg至约15mg。
39.如权利要求36所述的用途，其中所述剂量单位是1mg、2.5mg、5mg或10mg。
40.如权利要求30所述的用途，其中所述药物经静脉、腹腔、皮下、肌内、鞘内、口腔、局部或瘤内给予个体。
41.如权利要求40所述的用途，其中所述药物经口给药。
42.权利要求30所述的用途，其中所述个体是哺乳动物。
43.权利要求30所述的用途，其中所述个体是人。
全文摘要
本发明提供了包含黑芥子苷和其药学上可接受的载体的药物组合物以及其治疗肝癌的用途。也提供了治疗个体肝癌的方法，其包括给予有需要的个体和患有癌症的个体药学上有效量的黑芥子苷。
文档编号A61K9/52GK101674838SQ200880007049
公开日2010年3月17日 申请日期2008年3月7日 优先权日2007年3月9日
发明者何永成, 洁 孟 申请人:香港中文大学