专利名称：干酪乳杆菌在提高流感疫苗所提供之保护作用中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在增强老年个体中流感疫苗接种 所产生的体液应答因而提高疫苗接种后针对流感的保护中的用途。流行性感冒病毒(流感病毒)是呼吸道感染的一个重要原因。冬季流行性感冒影响了人群中的 5%，在儿童中具有高感染率并在老年 人中具有致命的并发症。卫生部门(与WHO—致)推荐向年龄超过65岁的个体、住在 EHPAD(无自理能力老人看护机构)的个体或者由于严重病理状况而具有潜在健康问题的 人群每年进行流感疫苗接种。疫苗接种即使不能预防该病，也可以降低流感的严重程度、持 续时间和并发症(重叠感染、住院治疗、死亡)风险。然而，尽管流感疫苗接种在大多数成年个体(70%到90% )中赋予被认为有保护 性的抗体效价(抗血细胞凝集素效价大于或等于40 ；世界卫生组织流行病学周报第33期， 第 283 页，2005 年 8 月 19 日(WHOweekly epidemiological record, No. 33, p. 283, August 19，2005))，但在老年个体中情况却不是这样，这时仅在30 %至40 %的个体中达到了这一 抗体效价(C0X等，Scand. J. Immunol.，59，1-15，2004)。老年个体对流感疫苗的这种非理 想应答(suboptimal response)是由于与个体的年龄和/或生理状况相关的免疫系统功 能缺陷所致(DENG 等，J. Immunol.，172，3437-46，2004 ；KANG 等，J. Immunol.，173，673-81， 2004)。提高免疫应答的一种方法是施用发挥佐剂作用的免疫刺激物。因此，含有佐剂 (例如MF59，它由尺寸小于250nm的稳定液滴组成，该液滴包含在水包油乳剂中的角鲨烯、 可代谢的油和两种表面活性剂(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯及三油酸酯))的新疫苗 开始在法国销售，来增强老年个体的免疫应答(BALD0等，Vaccine，19，3472-5，2001)。此 外，饮食能调节免疫应答。已经显示，在2到6个月中摄入硒和锌的补剂以及某些维生素 和微量元素可以增强福利机构中的老年个体对疫苗接种的免疫应答(ALLSUP等，J.Am. Geriatr. Soc. ,52,20-4,2004 ；BUNOUT 等，JPEN J. Parenter. Enteral. Nutr.，28，348—54， 2004 ；BUNOUT 等，JPEN J. Parenter. Enteral. Nutr.，26，372-6，2002 ；CHANDRA, Lancet, 340，1124-7，1992 ；GIR0D0N 等，Arch. Intern. Med.，159，748-54，1999 ；LANGKAMP-HENKEN 等，J. Am. Geriatr. Soc.，52，3-12, 2004 ；PR0VINCIALI 等，Age Ageing, 27，715-22，1998)。还 有报道称，某些益生菌也可以调节对疫苗(如脊髓灰质炎疫苗)的应答(DE VRESE等，Eur. J. Nutr.，44，406-13，2005)。先前已经观察到(PCT申请WO 2001/089541)，施用干酪乳杆菌能够增强与多种病 原微生物(包括流感病毒)相关的细胞介导免疫应答(由T淋巴细胞介导)。另一方面，干 酪乳杆菌对体液免疫的可能作用仍然知之甚少，前述体液免疫与流感疫苗接种所给予的保 护有关。本发明人着手研究了摄入干酪乳杆菌对于改变老年个体中流感疫苗接种所产生 的特异性血清抗体效价的作用。他们注意到了这些抗体效价的提高，尤其是导致了血清转 化率和血清保护率的增加。
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“血清保护”定义为个体中以大于或等于保护阈值的量存在针对流感病毒的血清 抗体。此保护阈值定义为大于或者等于40的抗血细胞凝集素血清抗体效价，该效价通过血 细胞凝集抑制(HAI)来测定。群体中的“血清保护率”对应于观察到血清保护之个体的比 例。公认的是，通过HAI测定大于或等于40的抗体效价与针对疫苗中所包含和存在之菌株 的保护相关(C0X N. J.等，Lancet, 1999 354 1277-82)。“血清转化”在本文中定义为针对流感病毒进行疫苗接种之后，个体中针对流感病 毒的血清抗体量的增加，疫苗接种后的抗体水平至少等于疫苗接种前所测定水平的4倍。 人群中的“血清转化率”对应于观察到血清转化之个体的比例。本发明人还注意到，摄入干酪乳杆菌对于改变流感疫苗接种所产生血清抗体效价 的积极作用看来在某些类别的老年个体(即无自理能力程度最低的老年个体，以及老年女 性)中特别显著。无自理能力程度水平用AGGIR(Autonomie Gerontologie Groupeslso-Ressources [老年自主性国际标准化组织])分类网格来定义(VETEL等，Soins Gerontol.，23-7,1998)。AGGIR网格的第1类、2类和3类集合了无自理能力程度高的个体； 第4类和5类集合了具有无自理能力程度低的个体；第6类集合了有自理能力的个体。因此，本发明的主题之一是干酪乳杆菌菌株用于制备增强疫苗接种后针对流感之 保护的可经口施用组合物的用途。本发明还使得可以提高在流感疫苗接种时所给予的体液 免疫。特别地，它还使得可以获得保护性的抗体效价(血清保护)。根据本发明的一个优选实施方案，所述组合物拟施用于65岁或以上的接受流感 疫苗接种的老年个体。优选地，所述个体至少为70岁。特别有利地，所述组合物拟施用于有自理能力的个体或者无自理能力程度低的个 体和/或女性。在本发明实施中，所述干酪乳杆菌菌株可以单独使用，或者与干酪乳杆菌菌种 或其他菌种的其他乳酸菌组合使用。它可以有利地与酸乳发酵菌(即保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)禾口口誉热链球菌(Streptococcus thermophilus))组合<吏用。优选地，根据本发明之用途制备的组合物中含有每毫升至少IO5个、优选至少IO6 个、一般为IXlO8到1.5X109个干酪乳杆菌细胞。当干酪乳杆菌与酸乳发酵菌组合使用时，所述组合物也有利地包含每毫升至少 IO7个、优选2 X IO8到IX IO9个嗜热链球菌细胞和每毫升至少5 X IO5个、优选4X IO6到 2 X IO7个保加利亚乳酸杆菌细胞。非常适用于本发明的一种干酪乳杆菌菌株是1994年12月30日以编号1-1518保 藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes[法国微生物保藏中 心]，25rue du Docteur Roux, Paris)的菌株。根据本发明制备的组合物能够以食品或食品补剂的形式施用。例如，它们可以是 乳制品特别是发酵的乳制品，其中至少包含所述干酪乳杆菌菌株，其如上文所述任选地与 其他乳酸菌(例如与酸乳发酵菌)组合。为了得到最佳效果，所述干酪乳杆菌菌株优选在流感疫苗接种之前至少1个星期 施用，优选至少两个星期，有利地为至少3个星期，最优选至少4个星期。其后可以继续施 用干酪乳杆菌至期望的时间，以保持疫苗接种所产生的免疫力提高。干酪乳杆菌的每日用量为优选至少101(ICFU、更有利地为2X IOltlCFU的干酪乳杆菌。这一用量可以在每日一次或 多次的摄入中施用。通过接下来涉及非限制性实施例的进一步描述，可以更为清晰地理解本发明，所 述实施例展示了干酪乳杆菌菌株提高流感疫苗接种所产生的体液免疫的特性。
实施例为了评估食用一种含有干酪乳杆菌CNCM 1-1518的发酵乳制品(Actimel )对 流感疫苗接种所产生的特异性血清抗体效价的影响而进行了研究，前述特异性血清抗体效 价是在疫苗接种后3周(疫苗接种后2至4周的应答峰值)以及在停止食用该产品的情况 下疫苗接种后3个月和5个月(为了监测血清抗体效价的变化)的效价。研究概沭本研究是随机、双盲、以安慰剂为对照的多中心实验性研究。将86人分为每组43 人的2个平行组，一组接受Actimel ,另一组接受对照产品(安慰剂)。本研究的过程图示于
图1。本研究的总持续时间为178天。本研究包括以选择老年个体为目标的选择访视(selection visit，VI)。该访视 发生在纳入访视(inclusion visit, V2)之前的一个月期间。在V2 (第0天)时，对所有中 心的所有个体已进行了两周以上的纳入和随机分组。所有个体都于第ο天(V2)开始食用研究产品(根据随机分组为Actimel 或对 照产品)，并持续7周(疫苗接种前4周和疫苗接种后3周)。在第28天(V3)(即在开始食用研究产品4周后)时，通过在三角肌中肌内注射对 所有个体进行流感疫苗接种(同一批Vaxigrip疫苗)。在第28天(V3)、第49天(V4)、第118天(V5)和第178天(V6)进行医学访视。个体的选择本研究中包含的个体是居住在无自理能力老人看护机构(EHPAD)的老年个体。纳入标准-至少70岁的男性或女性；-AGGIR分数为2到5 (包含边界)的个体；-在选择访视(Vl)采集血液样品时，抑制变体A/CalifOrnia/7/2004(疫苗原型) 相关毒株所致豚鼠红细胞凝集的抗体效价低于40的个体；-体重指数(BMI)为16kg/m2至27kg/m2(包含边界)的个体；-对其参与本研究给出了知情同意并能理解所提供信息的个体；排除标准-患有预期寿命少于6个月的严重进行性疾病的个体；-患有失衡性I型或II型糖尿病的个体；-对乳蛋白和/或鸡蛋发生变态反应或过敏反应的个体；-已知为乳糖不耐受的个体；-慢性或医源性免疫抑制的个体，尤其是在前期选择访视(VI)的两个月中以口服 皮质类固醇或免疫抑制剂治疗超过2周的；随机分组
通过随机抽取来决定把个体分配至“产品”组或“对照”组，平均到标记为“A”或 “B”的两组。根据患者的自主性状态(以此反映该个体的生理状况)确定了 两 个层次(stratification) AGGIR(Autonomie Gerontologique Groupes IsoRessources [Gerontological autonomy, iso-resources groups])分数等于 2 或 3 的 个体组成了第一层次，AGGIR分数等于4或5的个体组成了第二层次。研究产品Actimel 产品是一种商业化产品。对照产品是具有与产品Actimel 相同的感官品质、酸度、能量值和口感但不含 有乳酸发酵剂的产品。这两种产品装在标有字母代码(A或B)的IOOml无标记瓶中。这两种产品的特征总结在下面的表一中。表一
产品脂类 g/100 g糖类 g/100g蛋白质 g/100 g能 量 KJ/100 g活性成分(干 酪乳杆菌)浓 度Actimel 1.5+/-0.514.5 +/- 0.52.5 +/- 0.580-85>108 cfu/ml对照1.5 +/- 0.514.5 +/- 0.52.5 +/- 0.580-85< 1 cfu/ml研究过稈选择访视结束时，保留既有之前定义的所有纳入标准又没有之前定义的任一排除 标准的个体。要求他们在研究开始前的7天中(第-7天至第O天)直到访视V4 (第49天)时 戒除食用发酵乳制品(酸乳、白乳酪(fromage blanc)、新鲜乳酪(petits suisses，未熟化 的奶油乳酪)和大豆酸乳)。采集血液样品以测定基础抗流感抗体效价。在第O天进行纳入和随机分组的访视(V2)。从第O天开始，个体每天食用随机分配的研究产品(A或B)，早饭一瓶100ml，晚餐 一瓶100ml，连续食用49天。在第28天(V3)时，通过三角肌的肌内注射对个体接种流感疫苗。所用的疫苗 (Vaxigrip)是灭活的裂解病毒疫苗，每剂中含有以下毒株的血细胞凝集素各15 μ g 两种A 型毒株(一种Hmi毒株和一种H3N2毒株)和一种B型毒株；每剂中所述毒株的血细胞凝 集素各15 μ g。此疫苗不含有佐剂。所述HlNl毒株是New Caledonia/20/99毒株，所述H3N2毒株是 California/7/2004 毒株，所述 B 毒株是 Shangai/361/2002 毒株(根据 2005-2006 季 WHO 北半球疫苗接种建议)。在其后的每次访视中(分别在第49天(V4)、第118天(V5)和第178天(V6)时进
6行)，采集血液样品以测定疫苗接种所产生的针对疫苗中存在的每一毒株具有特异性的血 清抗体。还进行医学检查，并且每次都记录自前次访视以来出现的生理状况或实施的治疗。抗体分析在V1、V4和V5访视时，从所有个体的前臂静脉中采集血液样品(1管7ml)。将样品 装入干燥的管中，之后离心以分离血清。将每份血清样品等分到冻存管中(每管500μ1)， 以在-20°c到-80°c保存直至进行分析。由法国巴黎巴斯德研究所的centre national de reference (CNR)[国家参比中心]对流感病毒进行分析；。所用的测试是血细胞凝集抑制(HAI)测试，根据WHO的建议(WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance :WH0/CDS/CSR/NCS/2002-5)实施。该测 试是基于测试血清中所含的特异性针对每一病毒毒株的抗血细胞凝集素抗体与表达在病 毒表面的血细胞凝集素结合从而阻止这些病毒与红细胞结合的能力。在不存在特异性抗体 时，观察到红细胞与病毒形成网络(培养孔均一地红色)。另一方面，在特异抗体存在下，观 察到孔底部的红细胞沉淀。为了消除由血清而非流感病毒引起的非特异性血细胞凝集，将每个血清样品通过 与RDE(破坏受体的酶)一起孵育而进行处理，然后吸附到鸡红细胞上。每个血清样品连续 稀释两倍，分到培养皿中并与标准病毒悬液(每50 μ 1中4个血细胞凝集素单位)一起孵 育。然后加入豚鼠红细胞，以显示未被抗体中和的病毒血细胞凝集素的存在情况。同时分析来自CNR[国家参比中心]的血细胞凝集抑制测试阳性对照和阴性对照， 对每一测试进行验证。将抗体效价表示为仍具有血细胞凝集抑制作用的最高稀释度的倒数。统计学分析对以下群和亚群进行数据分析-“意向处理”(Intention To Treat, ITT)群包括该研究中随机分组并接受了至 少一种研究产品的所有个体；-根据AGGIR层次和性别区分的亚群。以5%的双侧显著性阈值进行该测试。5%至10%的显著性阈值被认为指示了倾 向性。实验设计是有“产品”和“对照”两个组的平行组。考虑到本研究的目的，此研究的主效应是“产品”。同时，还研究了 “AGGIR分数”、BMI、年龄和基础抗体效价的效应。就抗体效价而言，已知这一参数呈对数正态分布。为了进行参数分析，必须对抗体 效价进行对数转换，因此对抗体效价对数的正态性进行了验证和讨论。参数分析是根据共变量的性质对变量和/或共变量进行分析的常规高斯模型。还对变量和/或共变量进行非参数分析(Friedman检验)。分析中考虑以下共变量“AGGIR分数”、BMI、年龄和基础抗体效价。产品间的数据比较通过卡方检验或者Fisher精确检验来进行，Fisher精确检 验在未遵循卡方检验之条件的情况使用。同时采用logistic回归模型将各种影响因素 (“AGGIR分数”、BMI、年龄和基础抗体效价)考虑在内。对每个分层变量组(“AGGIR分数”)进行相同的分析。
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判断标准所研究产品效果的主要标准选择的主要标准是在第4次访视时(第49天)对3种病毒毒株的流感抗体效价。这一标准的主要表现为第4次访视时抗体效价相比于基础值的变化。所研究产品效果的次要标准对3种病毒毒株中每一种所选择的次要标准是-在第4次访视时(第49天)的血清转化(与基础水平相比抗体效价至少提高4 倍的个体)，-在第4次访视时(第49天)的血清保护(抗体效价彡40的个体)。结果ITT 群抗体效价结果示于图2。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在接种每 种流感毒株疫苗后3周产生了更高的抗体效价。血清转化结果示于图3。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在接种疫 苗后3周对每种流感毒株产生了更高的血清转化率。血清保护结果示于图4。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在对每种 流感毒株进行疫苗接种后3周使得受保护个体的百分比提高。在Hmi血清型的毒株中，这 一效果表现出了统计学倾向性。MMAGGIR分数为4-5的亚群抗体效价结果示于图5。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在对每种 流感毒株接种疫苗后3周产生了更高的抗体效价。血清转化结果示于图6。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在接种疫 苗后3周对每种流感毒株产生了更高的血清转化率。H3N2血清型毒株的这一效果具有统计 学显著性。血清保护结果示于图7。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在对每种 流感毒株进行疫苗后3周使得受保护个体的百分比提高。H3N2血清型毒株的这一结果具有 统计学显著性。女性亚群抗体效价结果示于图8。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在对每种 流感毒株接种疫苗后3周产生了更高的抗体效价。血清转化结果示于图9。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在接种疫苗后3周对每种流感毒株产生了更高的血清转化率。Hmi血清型毒株的这一效果具有统计 学显著性。血清保护结果示于图10。这些结果表明，与食用安慰剂的情况相比，食用Actimel在对每 种流感毒株接种疫苗后3周使得受保护个体的百分比提高。这一效果在A型毒株中更突出 (H3N2血清型有统计学倾向性)，特别是在Hmi血清型的毒株中(统计学显著差异)。
权利要求
干酪乳杆菌物种的细菌菌株在制备用于提高疫苗接种后针对流感之保护作用的可经口施用组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其特征在于所述细菌菌株可以提高流感疫苗接种时所给予的体 液免疫。
3.权利要求1和2中任一项的用途，其特征在于所述组合物意图施用于年龄为65岁或 更高的个体。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其特征在于所述干酪乳杆菌菌株是CNCM1-1518菌株。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其特征在于所述组合物为食品或食品补剂的形式。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其特征在于所述组合物为发酵乳制品的形式。
全文摘要
本发明涉及可经口施用组合物中的干酪乳杆菌用于提高流感疫苗接种后针对流感之保护作用的用途，这通过增强所述疫苗所产生的体液应答来实现。
文档编号A61P37/02GK101918013SQ200880008664
公开日2010年12月15日 申请日期2008年2月13日 优先权日2007年2月16日
发明者拉斐尔莱·布尔代-西卡尔, 桑德里纳·萨姆森-维莱热 申请人:达能日尔维公司