专利名称：非聚集的病毒制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒制剂，在该制剂中聚集被减至最少。
背景技术：
病毒可用于例如在基因治疗中递送基因。这样的病毒包括逆转录病毒、腺病毒、腺 伴随病毒和单纯疱疹病毒。例如，W000/28059中公开了递送功能性胸苷激酶的腺病毒，用 于与治疗脑肿瘤及预防其复发有关的治疗中。需要了解的是，对于治疗的用途，必须满足多种的调节要求。在生产用于基因治疗 的病毒方面需要严格的控制，并且病毒制剂的稳定性和效价是关键的考虑方面。
W000/28059和US6544769公开了甘油作为一种病毒制剂的稳定剂。US7235391 公开了甘油作为一种病毒制剂的添加剂，用于在冰冻温度下或冰冻温度之上长期保持稳定 性。还公开了多种其他添加剂，包括多种膨胀剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、缓冲剂等。US6544769公开了 一种含有病毒与蔗糖、甘油、氯化镁和聚山梨酯80的组合物。这 样的一种表面活性剂的存在可导致微团产生。该表面活性剂还会溶解蛋白质。Tris可被用 作一种缓冲剂。磷酸盐缓冲系中通常存在离子物质例如氯化镁。生产、纯化及保存腺病毒载体的方法会提供多个机会用于发生病毒蛋白修饰，这 些修饰有可能导致腺病毒聚集并降低生物活性。对于纯化的腺病毒，聚集已经被报道是浓 度、温度、PH和保存容器的函数。常规的分析方法无法将天然的单体病毒与聚集的颗粒团 区分开。
发明内容
本发明是基于这样的发现，即在表达胸苷激酶的腺病毒中，尤其是如W000/28059 中所述，聚集是一个难题并可导致失去效价，但这是可以避免的。根据本发明的一个方面，一种组合物含有一种病毒、一种多元醇和一种两性离子 化合物。所述病毒优选为一种腺病毒。通常而言，所述腺病毒表达胸苷激酶。所述多元醇 优选为甘油。所述两性化合物优选为HEPES。本发明的组合物可以是非离子的和/或无盐的。它还可以是无血清的。根据本发明的另一个方面，一种用于病毒聚集的测定法，包括确定所述病毒颗粒 的粒度，例如其中所述颗粒与一种多元醇混合或者在本发明的组合物中。该测定法优选通 过动态光散射(DLS)(也被称为光子相关光谱(PCS))进行，并且使得可以在生产和纯化过 程中分析天然形式的病毒颗粒，因此能够监测可能的颗粒聚集形成。
具体实施例方式通常而言，根据本发明的组合物可含有如上文参考的现有技术中描述的类型形式 的化合物或具有上文参考的现有技术中描述的类型的化合物；这些出版物每篇的内容均通 过引用纳入本文。
所述病毒可以是野生型病毒或重组病毒。本发明可利用各种各样的病毒。这些病 毒包括腺病毒、痘病毒、疱疹病毒和慢病毒。优选一种可表达异源基因产物的腺病毒载体类 型。所述基因产物可适合用于治疗，例如用于切除脑肿瘤后。如本领域普通技术人员熟知的，该病毒制品可通过密度分级例如使用盐梯度得 至IJ。所述病毒还可以用色谱纯化方法(例如阴离子交换和分子筛)与切向流过滤(TFF)结 合进行纯化和配制。所述多元醇可在该阶段或者在之前加入。已知有多种多元醇，但优选甘油。甘油 在制剂中的浓度优选至少2重量％或2体积％，更优选至少5重量％或5体积％，例如最高 达30重量％或30体积％。
所述组合物优选是非离子的。可以不加入盐。一种糖例如蔗糖可用于本发明中，但糖的存在不是必须的。蔗糖已知为一种冷冻 防护剂，但它对于防止冷冻时的局部PH影响是重要的。这一点是重要的，因为本发明的组 合物通常将被冻干并保存于低温例如-70°C下。除了一种多元醇之外，所述新型制剂的另一组分是一种两性离子。已知许多这 样的化合物，它们适合用于意欲作为治疗用途的组合物中。优选HEPESjp 4-(2_羟乙 基)-1_哌嗪乙烷磺酸，但其他内有机胺/酸可能是适合的。该组分的浓度通常为至少ImM， 例如最高达IOmM或20mM。如下实施例用来描述本发明。实施例1分析制备用于W000/28059中描述的用途的病毒样品中聚集物的存在情况，这时 使用了一种含有5mM HEPES和20%甘油的pH 7. 8缓冲剂。在粒度分析后冷冻样品，并在一次冻融后再次进行分析。对于在含20%甘油的终 制剂缓冲剂中配制的纯化产物的情况，没有检测到样品粒度谱中的变化。然而，当在一次冰 冻和融化后对所述含聚集病毒的样品再次评价的时候，检测到了明显的粒度谱变化。从所 有其他测试样品得到了相似的结果。针对重复冻/融对一个纯化批次的粒度谱的影响进行了评价。没有检测到聚集 体，甚至在将纯化的样品进行5个冷冻和融化循环后仍没有检测到聚集。实施例2在该实施例中，粒度分布使用Mcomp 380 ZLS粒度确定体系得到。该装置在粒度 分析中使用 了 DLS(http//www. pssnicomp. com/nicomptheory. htm)将一激光束直接射 向所分析的样品并从90°角方向测量散射光强度。当激光束遇到存在于所述样品缓冲剂中 的固体颗粒的时候，会发生光的散射。在一个具体方向上散射光的强度会随时间周期性变 化，这是由于分散的颗粒在液体中向周围移动所致。粒度越小，颗粒在周围液体中移动的速 度越快，散射光强度的变化越快。颗粒半径可基于从光强相对于时间谱的波动获得的数据 进行计算。这里，来自Malvern Instruments的ZetasizerNano S粒度确定装置被用于确 定病毒粒度。该装置还利用DLS方法进行粒度分析。依据该装置的制造商，DLS可确定下 至Inm的粒度，而基于激光衍射的方法可以可靠地确定下至约IOOnm的粒度。在如实施例1中所述的终制剂缓冲剂中制成了多批次腺病毒，包括㈧在 W098/20027中描述的产品和⑶在W000/28059中描述的产品。批次⑶含有切向流过滤(TFF)之前及之后的样品。这样做是为了研究CsCl对过程中病毒颗粒稳定性和聚集的影 响。取自TFF过程后的样品中含有的CsCl量一般可忽略不计。对这些批次进行腺病毒聚集的存在情况的分析，目的是评价甘油对腺病毒粒度测量值的影响。样品中含有氯化铯(CsCl)。在将从超离心管收集的含腺病毒的带混合并在 5mM HEPES中稀释5倍后得到这些样品。为了得到阳性的聚集样品，将取自纯化过程中的样品在37°C下孵育不同时间0天、2天和7天，但未添加甘油。将甘油加入至所选样品中，得到20%的终浓度。将等体积的5mMHEPES加入至另一 组HEPES预处理的样品中。将配制进终制剂缓冲剂(20%甘油，5mM HEPES, pH 7.8)的含病毒的样品在37°C 下孵育，并且在不进行任何预处理情况下分析。还借助使用多克隆腺病毒抗体(Abcam，Cambridge，UK ;1 100稀释)的免疫沉 淀制备病毒聚集物。在粒度分析后，将所有样品冷冻并在-70°C下保存。将在37°C下孵育 7天并使用多克隆抗体免疫沉淀的样品融化后立即用来确定制剂缓冲剂对样品粒度分布的影响。应当很清楚的是，样品缓冲剂组合物可影响所得到的病毒粒度。当所述样品缓冲 剂含有20%的甘油的时候，所测量的病毒粒度为约200nm，而在TFF之前取得的样品(无甘 油)中，该粒径为约llOnm。根据文献，一个完整腺病毒颗粒的直径为约80-90nm。观察的 病毒粒度和报道的病毒粒度之间的差异(尤其在含甘油的样品的情况下)可以用样品缓冲 剂组成的影响来解释。由于甘油会使样品缓冲剂更加粘，颗粒在周围缓冲剂中的运动降低， 这会导致粒度确定不准确。可将Mcomp粒度确定装置设定为假设所分析的样品被配制于 具有一些预设性质的水性缓冲剂中。如果将这些预设的测量参数改变成对应于含甘油的缓 冲剂的相应参数，那么可对所得到的结果重新进行计算，以得到正确的粒度读数。已经发现，甘油似乎对观测的粒度值有影响，但还出现了对腺病毒聚集的阻止。在 于37°C下孵育O天和2天的任何分析样品中均未检测到聚集的病毒。在37°C下孵育7天 后，在预处理后立即进行粒度分析的样品中出现聚集的颗粒。然而在第7天时，配制于终制 剂中的病毒样品仍未出现可检测的颗粒聚集体。同时，当在37°C下孵育过程中在样品缓冲 剂中包含甘油时，没有可检测的病毒聚集。将样品在每个分析时间点后冷冻。当将来自笫 7天的冷冻样品融化并再次分析的时候，取自TFF之前的该预处理样品的粒度受到了影响， 而终制剂缓冲剂中的病毒似乎是完整的。加入多克隆腺病毒抗体引起了病毒颗粒聚集。在抗体处理的样品中腺病毒聚集的 存在可通过透射电子显微镜(TEM)进行确证。在未处理的对照样品中没有聚集体。然而， 在抗体处理的样品中检测到了大的聚集腺病毒簇。在配制于所述终制剂缓冲剂中的任何纯化的测试样品中均不存在聚集体。在预备 实验过程中发现，Nicomp 380 ZLS粒度确定系统的检测极限值为1 X IO11个非聚集病毒颗 粒/ml。这里，Zetasizer Nano S粒度确定装置被用于粒度分析。该装置的检测极限值也 被确证为IX IO11个病毒颗粒/ml。病毒颗粒的聚集会导致信号强度降低。
权利要求
一种组合物，所述组合物含有一种病毒、一种多元醇和一种两性离子化合物。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述病毒为一种腺病毒。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述腺病毒可表达胸苷激酶。
4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述多元醇为甘油。
5.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述两性离子化合物为HEPES。
6.根据前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物是非离子的。
7.根据前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物是经冻干的。
8.一种用于病毒聚集的测定法，所述测定法包括分析一个样品中病毒颗粒的粒度，其 中所述颗粒与一种多元醇混合；并从所述粒度确定所述样品是否基本上仅含有可接受的非 聚集颗粒。
9.根据权利要求8的测定法，其中所述颗粒在根据权利要求1-7中任一项的组合物中。
10.根据权利要求8或9的测定法，其中所述分析通过动态光散射进行。
11.根据权利要求8-10中任一项的测定法，其中所述粒度不超过200nm。
12.根据权利要求11的测定法，其中所述粒度不超过lOOnm。
全文摘要
本发明为一种含有一种病毒、一种多元醇和一种两性离子化合物的组合物。本发明还为一种用于病毒聚集的测定法，所述测定法包括分析一个样品中病毒颗粒的粒度，在所述样品中所述颗粒与一种多元醇混合；并从所述粒度确定所述样品是否基本上仅含有可接受的非聚集颗粒。
文档编号A61K9/19GK101815508SQ200880102567
公开日2010年8月25日 申请日期2008年8月11日 优先权日2007年8月11日
发明者M·诺凯莱宁, R·肖, S·伊阿-赫特图阿拉, T·门蒂莱 申请人:Ark治疗学有限公司