用于药物用途的新型neurturin缀合物的制作方法

专利名称：用于药物用途的新型neurturin缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及修饰人neurturin以提高其血清半衰期和药物代谢动力学特征。尤 其，本发明涉及新型neurturin缀合物，其包含共价连接至多元醇部分，优选聚乙二醇的 neurturin或其生物活性片段。本发明还涉及具有提高的生物利用度的药物组合物，其包含 作为活性剂的新型neurturin缀合物以用于糖尿病和神经退行性疾病的治疗、处理、预防 和/或诊断。
背景技术：
胰腺β细胞分泌胰岛素以应答升高的血糖水平。与其他激素相比，胰岛素在 能量代谢的调控中起关键作用。胰岛素导致了糖原和甘油三酯的贮存及蛋白质的合成。 胰岛素刺激葡萄糖进入到肌肉和脂肪细胞。在患有I型糖尿病或LADA(成年阴性自身 ^iiSiilli^^l (latentautoimmue diabetes in adults), Pozzilli & Di Mario, 2001, DiabetesCare. 8 1460-1467)的患者中， 由于自身免疫攻击，β-细胞被破坏。由剩余的胰 岛细胞产生的胰岛素量太少导致了血糖水平的升高(高血糖症)。在II型糖尿病患者中肝 脏和肌肉细胞失去了应答正常的血液胰岛素水平的能力(胰岛素抵抗)。高血糖水平(也 和高血脂水平)依次导致了 β-细胞功能的损伤和β-细胞死亡的增加。有趣的是，在II 型糖尿病患者中β-细胞再生过程(如新生和复制)似乎没有弥补β-细胞量的损失，从 而导致总β-细胞量随着时间减少。最终，在II型糖尿病患者中外源胰岛素的应用为必需 的以用于血糖水平的充分控制。在I型糖尿病患者中，当β-细胞被自身免疫攻击破坏时，已设计了调节免疫系 统的治疗并能停止或显著降低胰岛的破坏(Raz et al. ,2001, Lancet 358 1749-1753 ； Chatenoud et al. ,2003,Nat RevImmunol. 3 123-132 ；Homann et al. ,Immunity. 2002,3 403-415)。然而，由于人β细胞再生相对缓慢，如果所述治疗与可刺激β细胞再生的治疗 相结合，可更成功进行所述治疗。因为现今的普通抗糖尿病药物无法足够好的控制血糖水平以完全预防高血糖水 平和低血糖水平的发生，糖尿病成为非常致残的疾病。血糖水平的频繁升高是有毒性的且 可导致长期并发症，例如肾病、视网膜病变、神经病变及外周血管疾病。β细胞的大量损失 也导致了由胰腺α细胞分泌的胰高血糖素的下调，其有助于危险的低血糖发病期的风险 增加。还有大量的相关病情，如肥胖、高血压、心脏病和高血脂，因此糖尿病患者处于很大的 危险中。除了患者的生活质量受到损害，糖尿病的治疗和长期并发症导致了呈不断上升趋 势的医疗保健系统的巨大财政负担。因此，在本领域中对于I型糖尿病和LADA的治疗，并 且对于晚期II型糖尿病的治疗有鉴定诱导胰腺胰岛素产生细胞再生的因子的强烈需 要。一旦胰腺功能受损，所述因子可恢复正常的胰腺内分泌功能或甚至可预防I型糖尿病、 LADA或II型糖尿病的出现或进展。Neurturin为在胚胎胰腺中表达的分泌蛋白。已显示重组的Neurturin可刺激小鼠胚胎干细胞分化成胰岛素产生细胞。此外，胰腺neurturin水平升高的转基因小鼠具有 实质性增加的胰腺β -细胞量。基于这些发现，已提出将neurturin用于糖尿病之类的胰 腺疾病的治疗(见例如WO 03/99318和WO 2005/051415，其公开内容以引用的形式并入本 文)。Neurturin为由胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、Neurturin, Artemin和 Pers印hin组成的⑶NF配体家族(GFL)的一员。成熟的neurturin为102个氨基酸单体组 成的大小为23. 6kDa的同型二聚体。每个单体含有3个链内二硫键以形成一个胱氨酸结。 另外一个二硫键连接所述单体。以前已提出将Neurturin用于神经退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病和 亨廷顿氏症、运动神经元病、脊髓损伤或听觉障碍)的治疗(W0 97/08196，WO 99/06064 ； Akerud et al. J Neurochem. 1999 ；73(1) 70-78 ；Koeberle & Ball Neuroscience. 2002 ； 110(3) 555-567 ；Bilak et al. Mol Cell Neurosci. 1999 ； 13(5) 326-336 ；Perez-Navarro etal. Neuroscience. 2000 ；98 (1) 89~96 ；Rosenblad et al,Eur J Neurosci. 1999; 11 (5) 1554-1566，其公开内容以引用的形式并入本文)。然而，发现neurturin和相关的⑶NF因子通过对流增强递送(CED)进入大鼠脑 中，其分布容积被限制(Hamilton et al.，ExpNeurol. 2001 ；168(1) :155_161)。通常必需 通过注射施用蛋白。注射后大部分蛋白质从体内快速清除，从而迫使了频繁的注射。在我们 自己的研究中，我们发现在哺乳动物中皮下和静脉注射neurturin后其生物利用度低。只 有大约10%皮下注射的neurturin进入循环。因此，在患者中难以达到对治疗有用的血液 蛋白质水平。因此，有强烈的必要来研制有增强的可利用性的neurturin变异体并研发与之相 关的方法来延长在体内的蛋白疗法的循环半衰期(生物利用度)从而不需要频繁的注射作 为活性剂的neurturin以满足患者的“用户友好”蛋白疗法的需要。因此，本发明的根本问题是提供提高其生物利用度的新的neurturin变异体和制 剂。通过提供权利要求中所述的实施方式解决所述问题。发明概述本发明涉及新型的neurturin缀合物，其包含共价连接到人neurturin蛋白产物 的多元醇部分。本发明还涉及药物组合物，其包含缀合至少一个聚乙二醇分子的至少一种 neurturin蛋白产物和/或其生物活性片段作为活性成分，及药物可接受的载体、稀释剂和 /或佐剂。在一进一步的实施方式中，本发明涉及对有需要的受试者施用药物组合物的方 法，所述药物组合物包含药物活性量的缀合至少一个聚乙二醇分子的至少一种经修饰的 neurturin蛋白产物或其生物活性片段作为活性成分，及药物可接受的载体、稀释剂和/或 佐剂。本发明还提供对有需要的受试者施用 药物组合物的方法，所述组合物包含药物活 性量的缀合至少一个聚乙二醇分子的至少一种经修饰的neurturin蛋白产物或其生物活 性片段作为活性成分、及低分子量物质、及药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
本发明的组合物适于预防或治疗胰腺疾病或神经退行性疾病，尤其胰腺自身免疫性疾病，例如I型糖尿病或LADA及II型糖尿病之类的自身免疫性糖尿病。发明详述本发明提供包含共价连接的多元醇部分(如聚乙二醇(PEG))的neurturin缀合 物，及包含所述neurturin缀合物，及其变异体、衍生物或生物活性片段的药物组合物。除非提供了特殊的定义，本文所使用的相关术语及实验室方案、技术和方法已被 其所述领域所熟知。标准的化学符号和缩写可与所述符号所代表的全名互换使用。标准的 技术可用于化学合成、化学分析、药物制剂、组合物、递送和患者的治疗。标准的技术可用于 DNA重组法、寡核苷酸合成、组织培养等。例如可使用试剂盒根据产品说明进行如本领域通 常所实现或如本文所述的反应或纯化技术。通常可依据本领域所熟知的常规方法和如各种 经本说明书引用和讨论的一般或更具体的参考文献所述进行上述技术和方案。所述术语“类似物”指结构上与neurturin类似且具有相似功能的多肽。本文所用术语“生物活性的”或“生物活性”指所述neurturin产物诱导和/或刺 激祖细胞(例如干细胞)分化成胰岛素产生细胞，及和/或促进胰岛素产生细胞(例如体内 或体外的β细胞)的保护、生存或再生。使用WO 93/06116和美国专利申请No. 08/535，681 所述的或本文实施例所述的公开的用于测定GDNF活性的标准体外测定可轻易确定本文所 公开的经修饰的neurturin蛋白产物的生物活性。本文所用的neurturin的“片段”指neurturin的一部分，其通过包括但不限于 neurturin的酶消化和化学裂解(例如CNBr)及所述多肽的物理剪切的任何方法生成。 Neurturin的片段也可通过例如重组DNA技术和氨基酸合成生成。当所述片段或前体显示出相同的neurturin生物活性时，本发明所用的 neurturin的“活性片段”或“生物活性片段”指单独或与连接到其上的相关分子或残基(例 如糖或磷酸盐残基，或所述多肽分子的聚集体)结合的所述neurturin多肽链的任何片段 或前体。所述术语“生物活性片段”也指neurturin产物的片段，其诱导和/或刺激祖细胞 (例如干细胞)分化成胰岛素产生细胞，及和/或促进胰岛素产生细胞(例如体内或体外的 β细胞)的保护、生存或再生。使用WO 93/06116和美国专利申请No. 08/535，681所述的 或本文实施例所述的公开的用于测定GDNF活性的标准体外测定可轻易确定本文所公开的 经修饰的neurturin蛋白产物片段的生物活性。本文所用术语“同源物”指来自共同祖先蛋白序列的后代的涉及neurturin的多 肽。术语“同源”适用于通过遗传复制事件而分离的蛋白质间的关系。所述术语“低分子量物质”指平均分子量在IOODa 12000Da之间，优选在 200Da 8000Da之间，最优选在约500Da 7000Da之间的物质。所述低分子量物质可为阴离子聚合物，其可为天然或合成的且其含有多种阴离子 基团(如羧酸和/或硫酸基团)。例如，所述阴离子聚合物可选自低分子量硫酸化糖、硫酸化 环糊精或硫酸化合成聚合物(如丙烯酸聚合物、芳香族聚合物和/或多元醇)。更具体的说， 所述阴离子聚合物选自低分子量肝素或肝素衍生物、类肝素硫酸盐、硫酸软骨素、葡聚糖硫 酸盐、经化学修饰的肝素衍生寡糖(list from Wang et al. (2002)，supra)、类肝素寡糖、葡 聚糖硫酸盐、硫酸化低分子糖胺聚糖、糊精-2-硫酸盐、纤维素硫酸盐和萘磺酸聚合物(例 如PR02000)、PAVAS (丙烯酸与乙烯醇硫酸的共聚物)、磺化聚合物PAMPS [聚(2-丙烯醛基-氨基-2-甲基-1-丙磺酸](Mw约为7000 12000)、硫酸软骨素、硫酸化环糊精、昆布 ^WiMM (Alban, S. in Carbohydrates in DrugDesign (Ed. Ζ. J. ffitczak, K. A. Nieforth) Dekker,New York，1997，pp209)、聚甘油硫酸盐(Turk, H.，Haag，R.，Alban，S. Bioconjugate Chem. 2004，15，162 ；)、戊聚糖聚硫酸盐(PPS)及它们的衍生物(如乳糖修饰的戊聚糖硫酸 盐、分馏PPS/低分子量PPS，墨角藻聚糖或衍生物或它们的组合)。低分子量肝素(LMWH)类似物(例如依诺肝素、达肝素或法安明)是适宜聚合物 的优选例。其可通过肝素的分馏和/或限制性酶消化或化学消化获得，且其具有优选的约 3000 约7000道尔顿的平均分子量(Weitz 1997 supra)。本文所用术语“经修饰的neurturin蛋白产物”指包含共价连接的多元醇部分的 经化学修饰的neurturin蛋白缀合物及由细胞表达的缀合物。本领域技术人员可通过本文公开方法的或通过本领域已知的任何方法制备经化 学修饰的neurturin缀合物。本发明的neurturin缀合物的所述多元醇部分可为具有直链或支链的任何水溶 性单或双功能聚(亚烷基氧化物)。通常，所述多元醇为聚(亚烷基乙二醇)，如聚(乙 二醇)(PEG)。然而，本领域的技术人员会认识到可适当的使用其他的多元醇，如聚(丙二 醇)及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。可通过缀合neurturin到水溶性聚合物来制备其他 neurturin缀合物。所述聚合物的非限制性名单包括 其他的聚环氧乙烷均聚物，如聚丙二 醇、聚氧乙烯化的多元醇、它们的共聚物和它们的嵌段共聚物。可使用有效的非抗原性材料 (如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物等)作为基 于聚环氧乙烷的聚合物的替代物。所述蛋白缀合物也可在本领域熟知的原核或真核细胞中表达。所述术语“neurturin缀合物”指包含共价连接到neurturin氨基酸的多元醇部分 (如聚乙二醇)的neurturin蛋白产物。所述氨基酸在N-末端氨基酸或其他的任何氨基酸 处可为位点特异性的。PEG缀合物可包含共价连接到所述neurturin蛋白产物的任何适合 位点的一个或多个PEG分子。本文互换使用的术语“neurturin蛋白产物”、“neurturin产物”、“neurturin蛋 白”或“neurturin”指与可导致有公布的GenBank登录号NP 004549 (SEQ ID N0:1，图3) 的氨基酸序列的neurturin前体裂解的生物活性人neurturin产物或人neurturin前体本 身有超过70 %的、优选超过80 %、更优选超过90 %和最优选超过95 %的同一性的蛋白或 肽、其变异体或衍生物。所述小鼠和人蛋白之间的同一性为约91%，且希望优选的哺乳动 物neurturin蛋白有相似的高同一性。可依据标准方案(例如，通过使用BLAST算法)确 定neurturin产物与人neurturin蛋白或前体间的同一性百分比。当在长度为100个氨基 酸中引入四个空位以协助所述比对，优选在比较的序列中以相同氨基酸残基排列的较小的 两个序列中发现的氨基酸残基百分比来计算同一性百分比。所用术语“直系同源物”指通过特化从共同的祖先基因进化而来的不同物种中的 多肽。直系同源物在进化的过程中保留相同的功能。所述术语“聚乙二醇”或“PEG”指PEG本身和其衍生物。通常以甲氧 基-PEG-OH(m-PEG)使用所述聚合物PEG，其中一个末端为相对惰性的甲氧基基团，而另一 个末端为经化学修饰的羟基基团。支链的PEG也常用。分支臂(m)的数可在3 100或更多的范围内。羟基基团还经过化学修饰。如PCT专利申请W096/21469所述的另一个分支 形式具有经化学修饰的单个末端。还有另一个分支形式具有沿着PEG骨架而非在PEG链末 端的反应基团(如羧基)。除了所述的PEG形式，也可用骨架中的薄弱连接或可降解连接 制备所述聚合物。例如，在通过引用整体并入本文的美国专利申请Ser. No. 06/026，716中 Harris已说明可用经水解的聚合物骨架中的酯连接制备PEG。所述水解可导致聚合物裂解 成低分子量片段。所述环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物在化学上与PEG密切相关，且在它的 许多应用中可使用其代替PEG。所述术语“PEG化”包含聚乙二醇分子共价附着到可为蛋白的基质上。蛋白的PEG 化广为本领域所知且已由例如Veronese，F. Μ.，Biomaterials 22 (2001)405-417进行了综 述。可使用不同的官能团和不同分子量的聚乙二醇、线性和分支PEG及不同的连接基团连 接 PEG (也见 Francis，G.E.，et al. , Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18 ；Delgado,C.，et al.， Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9(1992)249—304)。
可在水溶液中用如例如，在WO 00/44785中所述的PEG化试剂，优选使用分子量在 5 40kDa之间的NHS激活的线性或分支PEG分子进行PEG化。也可依据Lu，Y. et al.， Reactive Polymers 22 (1994) 221-229 在固相中进行 PEG 化。依 M Felix, Α. Μ. , et al. , ACS Symp. Ser 680 (Poly (ethyleneglycol)) (1997) 218-238可在N-末端氨基酸处进行选择性PEG化。在固相合成期间通过偶联N-PEG 化氨基酸衍生物到所述肽链的N-末端氨基酸可完成选择性N-末端PEG化。在固相合成期 间通过偶联N-PEG化氨基酸衍生物到所述增长链可完成侧链的PEG化。可在如上所述的固 相合成中或通过将活化的PEG试剂使用于氨基脱保护肽的液相合成来组合处理N-末端PEG 化和侧链PEG化。适合的PEG衍生物为具有优选的平均分子量为约5 约40kDa，更优选为约20 约40kDa，和最优选为约30kDa的活化的PEG分子。所述PEG衍生物可为线性或分支的PEG。活化的PEG衍生物为本领域已知及在例如Morpurgo, M.，et al.，J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363-368中所述的PEG-乙烯砜。直链和支链PEG类型适合于PEG化片段的制 备。活性PEG试剂的例子为碘-乙酰-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜。(m优选从约 450到约900的整数，且R为线性或分支的、具有1 6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙 基、异丙基等，其中优选甲基。本文所用术语“PEG”或“PEG部分”旨在包括但不限于线性和分支的PEG、甲氧基 PEG、水解或酶解的PEG、悬挂式PEG (pendant PEG)、树枝状PEG、PEG和一个或多个多元醇的 共聚物、及PEG和PLGA(聚(乳酸/乙醇酸))的共聚物。所述术语“PEG化的neurturin”或“通过“PEG化”修饰的neurturin”或“包含聚 乙二醇部分的neurturin缀合物”指通过共价连接PEG部分形成所述PEG化蛋白的方法制 备的neurturin蛋白产物。所述术语“药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂”指一种或多种药物和生理可接 受的化合物(例如赋形剂和辅助物)，其辅助将活性成分加工成可用于药物的制剂。可在 Remington's Pharmaceutical (Maack Publishing Co. ,Easton,Pa.)白勺MfilK巾胃
的情况。所述术语“未修饰的对照neurturin蛋白产物”指与相关的经修饰的neurturin蛋白产物来源相同的、作为对照使用的neurturin蛋白产物。本文所用术语“变异体”指相对于天然多肽，如下文进一步所述的含有一个或多个 取代、添加、删除和/或插入的多核苷酸变异体。所述术语“变异体”也包含异种来源的同 源多肽。通常而言，neurturin变异体保留完全的、或其绝大比例的、或至少一部分的生物 活性(例如，可使用如下所述的具体测定确定)。本文所用术语“变异体”也包含本领域熟 知的、提供功能等效分子的neurturin，其可通过取代、添加或删除改变蛋白序列来修饰。后 者包括改变的序列，其中通过在序列内的残基取代功能等效的氨基酸残基导致了生物学沉 默的交换。通过在编码多肽的DNA中引入适当的核苷酸变化或通过所需多肽的体外化学合成制备neurturin变异体。本领域技术人员应了解可使用删除、插入和取代获得显示 neurturin生物活性的蛋白产物变异体。本领域技术人员熟知一个或多个选定氨基酸残基的所述删除、插入或突变的诱变 技术(例如，美国专利No. 4518584，其公开内容以引用的形式并入本文)。在一优选的实施方式中，在成熟的人neurturin中的氨基酸47 69之间，优选 51 65之间(如图3所示的氨基酸141 164之间，优选147 160之间)的区域引入氨 基酸的变化。所述氨基酸变化包含所述区域中至少一个精氨酸残基的删除或取代，例如精 氨酸残基51、52、54、56、57、58、60、61和/或65。优选精氨酸被中性或酸性氨基酸取代，例 如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。特别优选被谷氨酸取代，例如R51E、R52E、 R54E、R56E、R57E、R58E、R60E、R61E和R65E或包含至少2个所述取代的neurturin变异体。另外和/或还可用赖氨酸取代例如上文指定区域中的氨基酸残基，尤其是精氨酸 残基以便于偶联多元醇部分。因为在成熟的人neurturin中没有赖氨酸，所述改变允许用 多元醇部分进行位点特异性修饰。特别优选在上文指定区域中被赖氨酸取代，例如R51K、 R52K、R54K、R56K、R57K、R58K、R60K、R61K 和 R65K 或包含至少 2 个所述取代的 neurturin 变异体。Neurturin取代变异体具有移除人或小鼠neurturin氨基酸序列的至少一个氨基 酸残基及在其位点中插入的不同残基。所述取代变异体包括等位基因变异体，其特征在于 是，可导致或不导致氨基酸变化的种群中自然发生的核苷酸序列变化。出人意料的是，本发明研究者发现，与包含无缀合neurturin的药物组合物相比， 所公开的药物组合物具有其活性成分_所述缀合的neurturin和/或其生物活性片段的提 高的生物利用度。本发明证明，neurturin蛋白缀合多元醇(如PEG)显著提高neurturin 产物的血清半衰期和生物利用度。如果采用皮下注射，neurturin产物的生物利用度的提 高可反过来降低注射位点处所述制剂的积累或加工，且以这种方式提高局部的耐受性。本发明提供了用与未修饰的对照neurturin相比低许多的剂量对患者使用本发 明的neurturin缀合物的方法以具有治疗效果。这与“用户友好蛋白疗法”的需要相符，且 也可导致生产活性剂和/或药物组合物的较低成本。与未修饰的neurturin相比，本发明的neurturin缀合物在水溶液中也有更高的 溶解性，这可导致活性剂配制的简化。作为进一步的优势，缀合多元醇(如PEG)到neurturin可降低对于neurturin的 免疫原性，及因此形成的中和抗体或抗活性剂的过敏反应。
优选，本发明的neurturin蛋白产物为人neurturin或其生物活性片段。优选经 重组技术制备neurturin蛋白产物，因为所述方法能达到高纯度蛋白的高产量且不限于在 细菌、植物、哺乳动物或昆虫细胞系统中表达的产品。重组neurturin蛋白产物包括蛋白的糖基化形式和非糖基化形式。一般而言，重 组技术包括分离编码neurturin蛋白产物的基因、在合适的载体和/或细胞类型中克隆所 述基因、根据需要修饰所述基因以编码所需的变异体，并表达所述基因以制备neurturin 蛋白产物。另外，编码所需neurturin产物的核苷酸序列可为化学合成的。希望可使用由 遗传密码变性或等位基因的变异或改变所致的在密码子使用上不同的核苷酸序列表达 neurturin产物，以便于用选定细胞制备所述蛋白产物。Kotzbauer et al. , Nature 384 :467_470 描述了小鼠 neurturin 蛋白的 cDNA 禾口 氨基酸序列及人neurturin蛋白的cDNA和氨基酸序列，在本文中以SEQ ID NO 1识别。可通过各种方法分离或制备依据本发明的neurturin产物。在专利申请TO 97/08196中描述了用于制备neurturin产物的例示方法，其以引用的形式并入本文。在 此也描述了用于neurturin蛋白表达的各种载体、宿主细胞和培养物生长条件及合成 neurturin蛋白产物变异体的方法。在专利No. EP 0 423 980公开了适于在大肠杆菌中表 达neurturin蛋白的其他载体，其公开内容以引用的形式并入本文。蛋白neurturin的生物活性形式为二硫键连接的二聚体，其可通过纯化的 neurturin的分子量确定。在细菌系统中表达后提取的物质实质上无生物活性，并以单体的 形式存在。重折叠是必需的以制备有生物活性的二硫键连接的二聚体。用于细菌系统中表 达的neurturin的重折叠和成熟的适当方法与在W0 93/06116中所述的基本相似。用于测 定neurturin活性的标准体外测定与在W0 93/06116和美国专利申请No. 08/535, 681中所 述的测定GDNF活性的测定也基本相似，且其以引用的形式并入本文。将惰性、无毒、高降解性的聚合物-聚乙二醇(PEG)(也称作聚氧化乙烯(PE0))共 价连接到neurturin在生物技术和医药上有重要的应用。Neurturin的PEG化导致了导致 持久的持续时间的改良的药物代谢动力学，提高了安全性(例如较低的毒性、免疫原性和 抗原性)、提高疗效、降低用药次数、提高药物溶解度和稳定性、降低蛋白分解作用、及便于 控制药物释放。本发明涉及经酰基或烷基连接连接到至少一个聚乙二醇分子的neurturin蛋白 产物(例如原核表达neurturin的衍生物)或其变异体的使用，及连接到一个或多个的聚 乙二醇分子的neurturin或其变异体的使用。可通过本领域已知的任何PEG化反应进行 PEG 化。见，例如 Focus on Growth Factors, 3 (2) :4_10，1992 ;EP 0 154 316，其公开内容 以引用的形式并入本文；EP 0 401 384;和本文引用的与PEG化相关的其他刊物。与不含有PEG化的neurturin的药物组合物相比，本发明的药物组合物在哺乳动 物中(例如在人中)具有提高的活性成分的生物利用度(见图2)。所述PEG化的neurturin 优选以在活性成分的生物利用度上提供至少2倍的，优选至少5倍的并更优选至少10倍的 提高的量存在。可通过本申请的实施例所示确定生物利用度的提高。更具体而言，将含有指定量 或剂量的活性成分的组合物与含有相同剂量但未PEG化的活性成分的药物组合物进行比较。在皮下施用给实验动物(例如，小鼠)后可从血浆浓度确定两种组合物的生物利用度。 优选，经至少120分钟，优选240分钟且最优选24小时的时间段后测量所述血浆浓度(见 图2)。可使本发明的药物组合物适应于通过任何有效途径的施用，例如通过口腔、鼻腔、直肠、肺、局部、透皮或肠外途径的施用。因此，所述组合物可为固体或液体组合物，例如片 齐 、胶囊、粉末、乳膏、凝胶剂、软膏、溶液、乳液、悬浮液、冷冻干燥物等。但优选通过注射或 输液施用所述组合物，更优选通过注射，例如通过皮下或静脉注射。所述药物组合物优选水 溶液。除所述活性成分和可选择的低分子量物质(如阴离子聚合物)之外，所述药物组 合物可包含药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂，例如缓冲液、张力调节剂、稳定剂、填充 齐U、崩解剂、增稠剂等。所述药物组合物包含治疗有效量或剂量的活性成分。所述治疗有效剂量依赖于活 性成分的类型、待治疗疾病的类型和种类及施用的类型。对于含有neurturin作为活性成 分的肠外组合物来说，所述治疗有效剂量优选在约0. OOlmg/天 500mg/天的范围内，更优 选从约0. 05mg/天 约IOOmg/天，最优选从约0. Olmg/天 约5mg/天。优选将所述组合物施用给哺乳动物，尤其是人。因此，所述组合物适合于人用和兽 用药品。所述组合物尤其适合于神经退行性疾病或胰腺疾病的预防和/或治疗，尤其是胰 腺自身免疫性疾病(如I型糖尿病和LADA、或II型糖尿病)。可通过本领域技术人员已知的任何适当方法，优选肠内或肠外或局部直接给胰腺 施用本文所述的neurturin缀合物。可依据体重、体表面积或器官大小的因素计算具体的 剂量。本领域技术人员常规进行确定涉及上述各组合物的用于治疗的适当剂量所需的计算 的进一步优化，且其在常规进行的任务的范围内。可通过将建立的确定所利用剂量的测定 与适当的剂量响应性数据结合使用来确定适当的剂量。将由主治医师考虑改变药物作用的 各种因素(例如患者的年龄、健康状况、体重、性别和饮食，任意感染的严重性，施用时间及 其他临床因素)确定涉及用于治疗上述适应症的方法的最终给药方案。随着研究的进行， 与治疗各种疾病的适当剂量水平有关的进一步信息将出现。预见本文所述的neurturin缀合物的连续施用或持续给药对特定的治疗而言是 有优势的。虽然经机械手段(例如用输液泵)可完成连续的施用，希望也可实施其他连续 或几乎连续施用的方式。例如，化学衍生或包裹导致了蛋白的缓释形式，其具有以基于确定 的给药方案的预计量持续存在的效果。因此，neurturin蛋白产物包括衍生的或以另外方 式制备的蛋白以完成所述连续施用。在一进一步优选的实施方式中，可将neurturin缀合物直接递送给祖细胞(例如 干细胞)以在体外或在体内刺激胰岛素产生细胞的分化。在本发明的实施方式中，可优选 以0. lng/ml 500ng/ml之间，更优选lng/ml 100ng/ml之间，甚至更优选20 80ng/ml 之间且最优选50ng/ml的浓度添加neurturin缀合物。可以单独治疗或与其他药物制剂的联合治疗使用本文所公开的neurturin缀合 物。例如，可与适合用于治疗或预防胰腺疾病和/或肥胖症和/或代谢综合征的其他药物 制剂一起，尤其可与适合用于刺激和/或诱导祖细胞分化为胰岛素产生细胞的其他药物制 剂一起施用。另外，可与具有免疫抑制活性的药物制剂一起使用，例如，在W02005/51415中公布的抗体、多肽和/或肽或非肽低分子量物质。与野生型人neurturin相比，本发明的另一实施方式为包含至少一个氨基酸 (例如1、2、3或4个氨基酸)变化的人neurturin变异体。如上详述，相对于天然的人 neurturin,人neurturin变异体可包含一个或多个取代、添加、删除和/或插入。可如上所 述制备neurturin变异体。在一优选的实施方式中，在成熟的人neurturin的氨基酸47 69之间，优选51 65之间(如图3所示的氨基酸141 164之间，优选147 160之间)的区域出现氨基酸 的变化。所述氨基酸变化包含所述区域中至少一个精氨酸残基的删除或取代，例如精氨酸 残基51、52、54、56、57、58、60、61和/或65。优选精氨酸被中性或酸性氨基酸取代，例如甘 氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。特 别优选被谷氨酸取代，例如R51E、R52E、R54E、 R56E、R57E、R58E、R60E、R61E和R65E或包含至少2个所述取代的neurturin变异体。也优选人neurturin的变异体，其中另外和/或还可用赖氨酸取代上文指定区域 中的氨基酸残基，尤其是精氨酸残基，从而便于所述neurturin变异体位点特异性缀合到 多元醇基团。特别优选在上文指定区域中被赖氨酸取代，例如R51K、R52K、R54K、R56K、R57K、 R58K、R60K、R61K和R65K或包含至少2个所述取代的neurturin变异体。本发明的Neurturin取代变异体移除人neurturin氨基酸序列的至少一个氨基酸 残基，及在其位点中插入的不同残基。所述取代变异体包括等位基因变异体，其特征在于 是，可导致或不导致氨基酸变化的种群中自然发生的核苷酸序列变化。本发明进一步提供了对有需要的受试者施用药物组合物的方法，其中所述组合物 包含药物活性量或剂量的缀合至少一个多元醇(如PEG)的至少一种neurturin蛋白产物 或所述缀合的neurturin的生物活性片段作为活性成分，及药物可接受的载体、稀释剂和/ 或佐剂。本发明甚至进一步提供了对有需要的受试者施用药物组合物的方法，其中所述组 合物包含药物活性量或剂量的至少一种经修饰的neurturin蛋白产物或其生物活性片段 作为活性成分，及低分子量物质，及药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。附图简述下列附图和实施例说明本发明且其为如下述要求保护的本发明的非限制性实施 方式。基于下列


的因素本发明的许多其他方面和优势对本领域技术人员而言是显 而易见的。图1 细胞培养物中的PEG化的neurturin的生物活性所述报告细胞系经受了递增浓度的neurturin或用PEG缀合的neurturin (PEG 化的neurturin)。针对所测试制剂的最终浓度(在x轴上以ng/ml表示，图1A和1B) 标绘所得的报告基因活性(在y轴上以相对光单位(RLU)表示)。使用两组单独制备的 未修饰的neurturin作为实验对照(PeproTech ；Lot0805112和Lot0106112),并将它们 的相对活性与三种 PEG 化缀合物(单-mPEG-NHS-neurturin、单-mPEG-CHO-neurturin 和单-CES0310-neurturin)相比较。给定的值为至少3个孔的平均值士S. D。所述不 同测试计算出的 EC5Q 为Neurturin (Lot0805112,未修饰的蛋白)EC5(1 = 2. 2ng/ml， neurturin(Lot0106112,未修饰的蛋白):EC50 = 1. 2ng/ml,单-CES0310-neurturin EC50 = 12ng/ml (图 1A)，及 neurturin(Lot0106112,未修饰的蛋白):EC50 = 3. 8ng/ml,单-mPEG-NHS-neurturin :EC5(I = 9. 7ng/ml,和单-mPEG-CHO-neurturin :EC5(I = 7. 4ng/ ml (图 IB)。B 2 丨、鼠,Φ打·輸代編裤(PK)赚图 2A 和 2B 示在给小鼠施用 0. 050mg/kg Bff (图 2A)或 0. 50mg/kgBff(图 2B)的 neurturin或PEG化的neurturin后在不同时间点以ng/ml表示的neurturin血浆浓度。 通过neurturin ELISA测定确定所得的血浆水平。时间点O显示用ELISA测定的小鼠血清 中neurturin的平均背景信号。由从未处理小鼠的12份血清(图2A)或11份血清(图 2B)单独测量的值计算背景值。其他的示值为从三个动物测量的血清水平的平均值士S. D。 图2A示源于两个单独实验(单-NHS-neurturin_Exp. 1和-_Εχρ· 2)的neurturin缀合 物单-NHS-neurturin的PK数据。图2B示源自另一个实验的数据，其中用0. 50mg/kg Bff 单-NHS-neurturin处理小鼠。就覆盖全部所测时间点的曲线下面积(AUC)分析而言，设置所述基准为 0. 6ng/ml (在时间点0处的平均背景值)Neurturin未修饰的蛋白18. 8ng * min/ ml,单-mPEG-NHS_neurturin_Expl :409ng * min/ml,单-mPEG-NHS_neurturin_Exp2 918ng ★ min/ml, -CES0310-neurturin =EC50 = 142ng ★ min/ml {U 2k), R neurturin 未修饰的蛋白:324ng * min/ml,单-mPEG-NHS-neurturin :1157ng * min/ml,禾口
-mPEG-CHO-neurturin :845ng ★ min/ml( 2B)。就neurturin血清水平的曲线下面积(AUC)分析(图2A和2B)而言，设置所述基 准为0. 6ng/ml neurturin，其对应在未处理小鼠血清中确定的平均背景水平。图 3由美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布了人neurturin前体的蛋白序列(登 录号NP_004549)。用粗体标出了对应于生物及药物活性形式的成熟蛋白的序列。Ml图4A 人neurturin禾口突变的neurturin变异体的表达。对浓缩的表达neurturin 和neurturin变异体的HEK-293细胞的上清液进行Native-PAGE/Western_blot (依据成熟 人neu rturin的序列进行位置的编号，R 精氨酸，E 谷氨酸)。图4B Neurturin ELISA 使用由大肠杆菌表达的人重组neurturin的代表性的标 准曲线。图5 =Neurturin的生物活性的定量图5A细胞的neurturin生物活性测定由大肠杆菌中递增浓度的外源性人重组 neurturin组合递增血清浓度刺激的酪氨酸羟化酶报告基因活性。图5B Neurturin变异体的生物活性(n. d.未检测)图6 不同脊椎动物物种的neurturin序列的比对示成熟人neurturin的氨基酸47 69 (依据成熟人neurturin肽的序列进行位 置的编号，genbank登录号NP_004549，成熟肽氨基酸96 197)。不同于neurturin的氨 基酸变异以粗体和下划线标出(GenBank登录号在括号内)。图 7 :neurturin 表达构建体的 DNA 序列Kr-G3-H6-G3-Xa_rhneurturin (wt)将Kr-G3-H6-G3-Xa-rhneurturin(wt)克隆进pMA载体。将限制性内切酶位点和 所得的编码区的氨基酸序列与正义链和反义链的DNA序列一起显示。
图 8 抗 neurturin 抗体 ELISA抗neurturin抗体ELISA 左侧使用抗neurturin IgG的标准曲线，右侧使用抗 neurturin IgG/I# 的标准曲线。应注意讨论了本发明的一个或多个方面的所有优选的实施方式也涉及所有其他 的方面。说明了本发明的多用途，但其不限于下列实施例。 实施例实施例 1 :neurturin 的 PEG 化通过称为PEG化的方法将聚乙二醇基团(PEG)缀合到neurturin上。所述技术 广泛用于治疗蛋白的修饰且对任何本领域的技术人员而言所述方案是熟悉的。在本发明 中，通过连接单个PEG分子到同型二聚体两个亚基中的一个的N-末端氨基酸上来制备单 PEG化的neurturin缀合物。制备了两个不同的单PEG化的neurturin缀合物，其在所连接 PEG的大小和结构及缀合所述PEG到所述蛋白的制备方法上不同。使用约5kDa的线性PEG 试剂(mPEG-succinimidylsuccinat ；NOF, Japan)制备本文以“单-mPEG-NHS-neurturin” 公开的缀合物。所谓“NHS法”为可溶性蛋白PEG化的最常用方法。另外，使用5kDa的线 性聚乙二醇丁醛(Nektar，082M0H01)以生成以“单-mPEG-CHO-neurturin”公开的缀合 物。在特定的实验条件下，NHS酯或NHS醛与蛋白和肽的游离氨基基团有效地反应。在 以“单-CES0310-neurturin”公开的另一个缀合物中，使用现有技术已知的PEG化方法 将neurturin同型二聚体的一条链上的N-末端氨基酸缀合到约5kDa的有六分支臂的 PEG 上(见，例如但不限于 DE 2005 100 04157. 0、EP 1 631 545 A2 ；W0 04/108634 ；W0 07/025763 ；CA2528667)。Neurturin不含有赖氨酸残基，因此希望上述的PEG化反应主要 导致了经neurturin同型二聚体的N-末端氨基酸的反应氨基基团的N-末端PEG化。使用 本领域任何技术人员已知的标准生物化学方法确认PEG化产品的质量(大小和纯度)。实施例2 :PEG化的neurturin綴合物或其变异体的生物活性使用基于细胞的报告物测定评估了所述neurturin缀合物的生物活性。确定 neurturin缀合物或其PEG化缀合物能多强地激活在表面表达neurturin受体的细胞系中 的报告基因构建体。在测定中发现相对于未修饰的neurturin，两种PEG化的neurturin缀 合物的活性降低了 3 10倍(图1A和1B)。用neurturin报告基因构建体稳定转染在细胞表面表达neurturin受体的人成神 经细胞瘤细胞系TGW(JCRB0618)。所述报告基因构建体包含荧光素酶基因，其在其他的调控 元件之间且受重复的血清应答元件(SRE)的转录控制。在所述细胞中，应答MAPK通路的激 活(例如通过neurturin结合到其表面受体)以刺激荧光素酶的表达。在96孔板中进行 所述测定。通过添加荧光素底物到孔中，并在分析读数器上(Molecular Devices)以发光 模式运行以进行读取来测量荧光素酶活性。实施例3 :PEG化的neurturin綴合物或其变异体的提高的生物利用度利用在小鼠中的PK研究评估PEG化的neurturin缀合物的相对生物利用度(图 2A和2B)。在所述实验中，皮下注射所述蛋白到小鼠的颈部区域。随后，在递送所述蛋白后 在规定的时间点使用特定的neurturin ELISA测定确定neurturin的血清浓度(图2A和2B)。如使用未经neurturin处理的小鼠的血清进行检测(O值点)，在小鼠血清存在下所述 neurturin ELISA测定的灵敏性为相对的高背景信号所限。在进行0. 050mg/kg体重(BW) 的未修饰的neurturin的注射后，在任何时间点都未发现neurturin血清水平显著超过所 述背景水平。相反，当使用相同量的PEG化的neurturin时，无关PEG修饰的种类，都可检 测到注射蛋白血清水平的显著提高(图2A)。当将未修饰的neurturin的注射量提高10倍 (0. 5mg/kg Bff)时可在时间点60、90、120和180分钟时在血清中明显检测出所述蛋白(图 2B)。使用T检验及计算的ρ值<0.05确认观察的显著性。另外，以0.5mg/kg BW剂量给 定的PEG化的neurturin衍生物的血清水平比未修饰的蛋白高几倍(图2A和2B)。相对于未修饰的neurturin，本文所示的neurturin缀合物始终体现出较高的血 清水平。总之，neurturin的PEG化显著提高了neurturin的生物利用度。实施例4 :Neurturin变异体通过基于PCR的定点诱变用酸件的谷氨酸残基取代位于neurturin的碱性插入区 (patch)内(成熟蛋白的氨基酸51 65)的碱性精氨酸残基。简言之，通过基于PCR的诱 变并使用不匹配的引物引入所需突变R51E、R52E、R54E、R56E、R57E、R58E、R60E、R61E、R63E 或R65E (依据成熟neurturin肽的序列进行位置的编号，GenBank登录号NP_004549，成熟 肽氨基酸96 197，在图3中也显示所述序列，R 精氨酸，E:谷氨酸)以修饰具有额外的 N-末端真核分泌信号肽的成熟人neurturin的编码序列。纯化所得质粒，并通过测序检查编码序列的正确性。经侧翼的HindIII和XhoI克 隆位点将所述编码序列克隆进PCDNA3. 1+质粒(Invitrogen Cat. No. V790 20)以用于真 核表达。在每一个175cm2组织培养皿上的用25ml培养基培养的HEK-293细胞中瞬时转染 所述载体及作为转染对照的空对照载体和GFP表达载体以用于真核表达。在转染后48小 时进行每一个培养基的收集，并通过使用超滤柱浓缩培养基上清液至约0. 4ml。使用用于检测的neurturin 特异性抗体通过native-PAGE/Western_blot首次 控制了 wt人neurturin和突变的变异体的表达(见图4)。使用在大肠杆菌中表达的人重 组neurturin作为对照。图4A示人野生型neurturin (wt)及除R63E外的所有经修饰的neurturin变异体 以相似量表达。与wt neurturin相似，所述neurturin变异体的表观质量在20 25kDa 之间的范围内。通过neurturin特异性ELISA确定表达的neurturin的产量。简言之，在微孔上 包被兔抗neurturin抗体以用于从含有neurturin的浓缩培养基上清捕获neurturin。在 洗涤后，使用缀合生物素的羊抗neurturin抗体，再使用缀合过氧化物酶的链霉亲和素，通 过发光读出器定量捕获的neurturin。使用在大肠杆菌中表达的人重组neurturin建立标 准曲线(见图4B)。此外，用特定的细胞测定定量表达的neurturin变异体的生物活性。所述测 定原理基于 Tanaka et al.，2002，2003 的实验(Tanaka M, Xiao H, Kiuchi K. Heparin facilitates glial cell line-derivedneurotrophic factor signal transduction. Neuroreport. 2002 0ct28 ；13 (15) 1913-6 ；Tanaka Μ, Xiao H, Hirata Y, Kiuchi K. A rapidassay for glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturinbasedon transfection of cells with tyrosine hydroxylasepromoter luciferase construct. Brain Res Brain Res Protoc. 2003May ； 11 (2) :119_22.)，显示 了通过 neurturin在人TGW成神经细胞瘤细胞系中稳定表达对酪氨酸羟化酶(TH)报告基因构建 体进行的诱导。简言之，用含有neurturin的样品处理过表达酪氨酸羟化酶(TH)报告基 因构建体的TGW细胞导致了由neurturin信号转导MAPK通路的诱导。所述报告基因构建 体包含受重复的血清应答元件(SRE)控制的荧光素酶基因。荧光素酶的表达依赖于MAPK 通路的激活。在96孔板中进行所述测定。通过荧光素的添加并用发光读出器分析来测量 neurturin介导的荧光素酶的表达。显示使用在大肠杆菌中表达的人重组neurturin作为标准并与递增的血清浓度 组合定量neurturin的生物活性的代表性实验示于图5A。图5B示野生型重组人neurturin及除R63E外的所有neurturin变异体以相似量 表达，导致了 1. 2 1. 7g/l之间的所述蛋白浓度，且与具有0. 32 0. 89ng/ml之间的EC5(1 的野生型重组人neurturin相比，所有表达的变异体在体外显示了相似的生物活性(见图 5B)。用于比较的大肠杆菌中的人重组neurturin显示了可能由样品中一部分未正确折叠 的neurturin的导致的EC50为2. 20ng/ml的较弱的效力(见图5B)。因此，图5显示了在neurturin “踵”(heel)区的修饰(例如将带负电荷的酸性氨 基酸引入到碱性插入区中)通常不损害neurturin的生物活性。出人意料的是现有技术显 示在“踵”(heel)区的从碱性氨基酸到酸性氨基酸的修饰干扰neurturin的生物活性(见 如上所述的与其他的GFL的序列和结构比较)。表达neurturin变异体R63E的失败显示在所述位置从精氨酸到谷氨酸的变化是 不容许的。然而，不导致氨基酸电荷完全改变的其他修饰是功能性的。已知的neurturin 同源物的序列比较显示R63E变异体存在于鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus)、短尾猊 (Monodelphisdomestica)禾口原鸡(Gallus gallus)的人 neurturin 同源物中。在位置 52、 57,58和61处的精氨酸残基的天然变异体也存在于不同的neurturin同源物中(见图6)。研究者用赖氨酸取代在“踵”(heel)区的碱性精氨酸以建立具有提高的生物利用 度的生物活性neurturin变异体。因为精氨酸和赖氨酸在结构上是相关的，预计所述交换 仅最小限度的影响neurturin分子的结构。所述改变能经所示蛋白的区域中的赖氨酸侧链 的伯胺进行neurturin的位点特异性的定向PEG化以容许氨基酸实质上改变，因此其对生 物活性不重要。因为在成熟的天然人neurturin序列中不存在赖氨酸，所述反应为高特异 性的。通过优化反应条件(例如PH、温度和反应时间)使活化的PEG与其他胺的反应最小 化。通过在“踵” (heel)区的碱性插入区内安排PEG修饰达到了两个目的(i)在最小化对 蛋白活性的影响的同时，可获得蛋白PEG化的益处(经降低的肾清除、降低的免疫原性、提 高的蛋白稳定性而提高的生物利用度)。(ii)预计所述区域的PEG化可通过防止与带有负 电荷的细胞表面蛋白聚糖的相互作用来保护碱性插入区，也预计其可提高蛋白的生物利用 度。在第一步中，可通过基于PCR的定点诱变修饰成熟人neurturin的编码序列，优化 了所述序列的人密码子的使用(具有用于真核分泌的额外的N-末端信号肽)和额外的纯 化标签(具有用因子Xa裂解所述纯化标签的额外位点的六个重复的组氨酸残基)。在此， 将在精氨酸残基51、52、54、56、57、58、60、61、63或65处的密码子与赖氨酸残基的密码子互换。在本发明所得的称为Kr-G3-H6-G3-Xa-rhneurturin的表达构建体包括下列特 征 Kr 小鼠的含有kringle的跨膜蛋白2的DNA序列、氨基酸1 26、以人密码子 使用(氨基酸序列MGTPHLQGFLLLFPLLLRLHGASAGS ;SEQ ID NO 2)优化的用于细胞质分泌 的信号肽(GenBank登录号NP_082692)。
G3 以人密码子使用(氨基酸序列GGG ；SEQ ID NO 3)优化的甘氨酸间隔区的 DNA序列。
H6 以人密码子使用(氨基酸序列HHHHHH ；SEQ ID NO 4)优化的用于纯化目 的的6个组氨酸标签的DNA序列。·Xa:以人密码子使用(氨基酸序列IEGR;SEQ ID NO 5)优化的因子Xa蛋白酶 识别位点的DNA序列。因子Xa蛋白酶切割精氨酸后的C-末端。
rhneurturin 以人密码子使用(氨基酸序列ARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYAS DETVLFRYCAGACEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHELSARECACV SEQ ID NO :6)优化的成熟的重组人neurturin的DNA序列。在各自的neurturin变异体 表达构建体中通过赖氨酸密码子AAG取代在位置51、52、54、56、57、58、60、61、63或65处的
单个精氨酸密码子。在图7 中示克隆进 pMA 载体的 Kr-G3-H6-G3-Xa-rhneurturin(wt)的完整 DNA 序 列；SEQ ID NO :7。实施例5 :neurturin变异体的PEG化将所得构建体克隆进原核表达载体pcDNA3. 1+中，将其转染进HEK-293细胞以用 于如上所述经修饰的neurturin变异体的表达。通过引入纯化标签的方法由超滤和由亲和层析纯化表达的neurturin变异体。通过如上所述的native-PAGE/Western-blot和neurturin活性测定检查所得的 neurturin变异体制剂的结构、纯度和生物活性。将以足够产量表达和以可接受的纯度纯化的生物活性neurturin变异体用于用 不同的单分散PEG的共价修饰。所述PEG优选2. 5 30kDa的大小，为线性或分支的，且用 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯激活。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯自发地与伯胺发生反应提 供了蛋白的有效PEG化。其他的PEG衍生物例如但不限于不同大小的分子、非单分散分子， 或具有不同的分支样式的分子，且也可使用缀合化学。在反应后，在引入的蛋白酶位点通过因子Xa裂解纯化标签，并通过大小排除和/ 或亲和层析纯化PEG-neurturin变异体。本领域熟知大量其他的纯化标签和蛋白酶位点/重组蛋白酶组合，并可替换所述 His标签和/或因子Xa位点/因子Xa裂解点。另外，可从无纯化标签的真核表达系统的上清 或者过表达细菌的上清或裂解物通过色谱法纯化含有引入的PEG化位点的所述neurturin 蛋白。通过如上所述的SDS-PAGE/Western-blot、native-PAGE/Western-blot 和 neurturin活性测定检查所得的neurturin变异体制剂的结构、纯度和生物活性。在皮下施用50iimol/kg s. c给小鼠或大鼠后，体内测定了在体外显示足够生物活性的纯化的PEG-neurturin变异体的药物代谢动力学表现。在施用后的基准处及0. 25、 0. 5、1、1. 5、2、3、4、6 和 8 小时处通过 neurturin ELISA 确定血浆 neurturin 浓度。通过6天的、每天一次皮下施用50iimol/kg给neo STZ大鼠，测试了相比wt neurturin显示提高的生物利用度的选定PEG-neurturin变异体的体内效力。与媒质对 照和wt neurturin组相比，每天测定血糖并在6天的处理后测定胰腺胰岛素含量以测定
细胞功能。实施例6 :PEG化的neurturin的免疫原件潜力人重组wt neurturin具有免疫原性潜能，其通过在施用给成年小鼠超过2周后抗 neurturin抗体的出现证明。用特定的测定检测抗neurturin抗体。简言之，在微平板上 包被重组人neurturin以捕获血清抗体。在洗涤后，使用缀合生物素的山羊抗IgG抗体或 山羊抗IgG/IgM抗体，再使用缀合过氧化物酶的链霉亲和素通过发光读出器定量捕获的抗 neurturin抗体。使用在血清中稀释的抗neurturin IgG和抗neurturin IgM以建立标准 曲线(见图8)。因药理活性蛋白的PEG化降低了它们的免疫原性潜力，通过28天的、每天一 次皮下施用50 u mol/kg给成年小鼠，测试了具有提高的生物利用度和持续效力的选定 PEG-neurturin变异体的免疫原性潜力。与媒质对照和wt neurturin组相比，每周通过抗 neurturin抗体ELISA确定抗neurturin抗体的出现。
权利要求
Neurturin缀合物，其包含共价连接到neurturin蛋白产物或其生物活性片段的多元醇部分。
2.权利要求1的neurturin缀合物，其包含由SEQID. NO 1所示的氨基酸序列编码的 多肽、或其同源物、直系同源物、变异体、类似物、衍生物、生物活性片段或生物活性突变体。
3.权利要求1或2的neurturin缀合物，其中所述多元醇部分为聚乙二醇部分。
4.权利要求1 3中任一项的neurturin缀合物，其中所述多元醇部分为单链多元醇 部分。
5.权利要求1 3中任一项的neurturin缀合物，其中所述多元醇部分为支链多元醇 部分。
6.权利要求1 3中任一项的neurturin缀合物，其中所述多元醇部分为聚烷撑二醇 部分。
7.权利要求1 6中任一项的neurturin缀合物，其具有同于或高于天然人neurturin 的体内neurturin活性。
8.权利要求1 7中任一项的neurturin缀合物，其与neurturin相比，具有至少一个氨基酸的变化。
9.权利要求8的neurturin缀合物，其中所述氨基酸变化在成熟人neurturin的氨基 酸47 69之间，优选在51 65之间。
10.权利要求8或9中任一项的neurturin缀合物，其中精氨酸残基51、52、54、56、57、 58、60、61或65中的至少一个被删除或取代。
11.权利要求10的neurturin缀合物，其中至少一个精氨酸残基被中性或酸性氨基酸 残基，例如谷氨酸取代。
12.权利要求8 10中任一项的neurturin缀合物，其中引入了至少一个赖氨酸残基。
13.药物组合物，其包含 缀合至少一个聚乙二醇分子的至少一种neurturin蛋白产物和/或其生物活性片段 作为活性成分，及 药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
14.权利要求13的组合物，其中所述neurturin蛋白产物为人neurturin蛋白产物或 其生物活性片段。
15.权利要求13或14中任一项的组合物，其中所述经修饰的neurturin蛋白产物经单 PEG化，其包含单个聚乙二醇分子链。
16.权利要求13或14中任一项的组合物，其中所述经修饰的neurturin蛋白产物经寡 或多PEG化，其包含2、3、4或多个聚乙二醇分子链。
17.权利要求13 16中任一项的组合物，其中所述经修饰的neurturin蛋白产物包含 至少一个线性聚乙二醇分子链。
18.权利要求13 16中任一项的组合物，其中所述经修饰的neurtur in蛋白产物包含 至少一个分支的聚乙二醇分子链。
19.权利要求13 18中任一项的组合物，其中所述聚乙二醇分子具有IOODa IOOOODa的、优选200Da 8000Da的且最优选IOOODa 7000Da的平均分子量。
20.权利要求13 19中任一项的组合物，其中所述聚乙二醇分子被连接到所述经修饰的neurturin蛋白产物的N-末端氨基酸。
21.权利要求13 20中任一项的组合物，其中所述聚乙二醇分子经酰基或烷基连接被 连接到所述经修饰的neurturin蛋白产物。
22.权利要求13 21中任一项的组合物，其中所述聚乙二醇分子由OH-、OCH3-或 OEt-基团终止。
23.权利要求13 22中任一项的组合物，与含有未修饰的对照neurturin蛋白产物的 组合物相比，其具有提高的活性成分的生物利用度。
24.权利要求13 23中任一项的组合物，其中所述经修饰的neurturin蛋白以在活 性成分的生物利用度上提供至少2倍的，优选至少5倍的并更优选至少10倍的提高的量存在。
25.权利要求13 24中任一项的组合物，其用于注射或输液。
26.权利要求25的组合物，其用于皮下或静脉注射。
27.权利要求13 26中任一项的组合物，其用于胰腺疾病或神经退行性疾病的预防或 治疗。
28.权利要求27的组合物，其用于I型糖尿病、LADA和II型糖尿病的预防或治疗。
29.权利要求13 28中任一项的组合物，其用于施用给哺乳动物，尤其是人。
30.人neurturin的变异体，其与野生型人neurturin相比，包含至少一个，例如1、2、3 或4个氨基酸变化。
31.权利要求30的人neurturin变异体，其中所述氨基酸变化如权利要求9 12所定义。
32.对有需要的受试者施用药物组合物的方法，所述药物组合物包含药物活性量的 缀合至少一个聚乙二醇分子的至少一种经修饰的neurturin蛋白产物或与其生物活性片段作为活性成分，及 药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
33.对有需要的受试者施用药物组合物的方法，所述药物组合物包含药物活性量的 缀合至少一个聚乙二醇分子的至少一种经修饰的neurturin蛋白产物或其生物活性片段作为活性成分，及 低分子量物质，及 药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
全文摘要
本发明涉及缀合到多元醇的neurturin蛋白产物且涉及具有提高的生物利用度的药物组合物，其包含作为活性成分的neurturin缀合物，优选PEG化的neurturin缀合物或其变异体。
文档编号A61P25/00GK101848735SQ200880114325
公开日2010年9月29日 申请日期2008年11月5日 优先权日2007年11月5日
发明者F·哈德, M·奥斯滕, M·施奈德, M·格泽, R·穆斯曼, T·西格蒙德 申请人:德弗尔奥亨股份公司