有机化合物的制作方法

专利名称：有机化合物的制作方法
有机化合物本发明提供了新的有效治疗受DPP-IV介导的病症的二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑 制剂。已经发现DPP-IV负责使胰高血糖素样肽-I(GLP-I)失活。由于GLP-I是胰腺胰岛 素分泌的主要刺激物并对葡萄糖处置具有直接有益效果，所以DPP-IV抑制显示出代表了 治疗诸如非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的病症的有吸引力的手段。本发明涉及游离形式或可药用酸加成盐形式的式(I A)、(I B)、(XA)、(X B)、(Y A)或(Y B)化合物(本发明的化合物)
(YB)其中R'表示 且R"表示氢、羟基、C1-C7烷氧基、C1-C8-烷酰基氧基或R5R4N-CO-O-,其中R4和R5 独立地是C1-C7烷基或苯基，未取代或被选自C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、卤素和三氟甲基的取代基取代，并且其中R4另外地是氢；或者R4和R5 —起表示C3-C6亚烷基。本发明还涉及如上所述的式(I A)、(I B)、(Χ A)、(X B)、(Y A)或(Y B)化合物， 其中R"表示氢。在优选的实施方案中，如上所述的式(I A)、(I B)、(Χ A)、(X B)、(YA)或(Y B) 化合物是基本上纯的形式。本发明的化合物可以以游离形式或酸加成盐形式存在。优选可药用盐(即无毒性 的生理学可接受的盐)，虽然其它盐也是有用的、例如在分离或纯化本发明的化合物中是有 用的。尽管优选的酸加成盐是盐酸盐，但是也可以使用甲磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐 和乙酸盐。本发明的化合物可以以具有旋光活性的异构体或非对映异构体形式存在，并且可 以通过常规技术如色谱法来分离和回收。下文列出了用于描述本发明的各种术语的定义。这些定义如同它们在本说明书通 篇中使用的那样单独地或作为较大基团的一部分应用于各术语，在特定情况中另有限制除 外。术语“烷基”指具有1-10个碳原子、优选1-7个碳原子、最优选1-5个碳原子的直
链或支链烃基。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、
己基等ο术语“烷酰基”指烷基-C (0) _。术语“取代的金刚烷基”指被一个或多个、例如两个取代基取代的金刚烷基、即 1-或2-金刚烷基，所述取代基选自烷基、-OR1或-NR2R3 ；其中RpR2和R3独立地是氢、烷基、 (C1-C8-烷酰基)、氨甲酰基或-CO-NR4R5 ；其中礼和R5独立地是烷基、未取代或取代的芳基， 且其中R4和R5之一另外地是氢或者R4和R5 —起表示C2-C7亚烷基；术语“芳基”优选表示苯基。取代的苯基优选是被一个或多个、例如两个选自例如 烷基、烷氧基、卤素和三氟甲基的取代基取代的苯基。术语“烷氧基”指烷基-0-。术语〃卤素〃或〃卤代〃指氟、氯、溴和碘。术语“亚烷基”指2-7个碳原子、优选3-6个碳原子、最优选5个碳原子的直链桥。术语"基本上纯的"在本发明的上下文中被理解为指基本上不含生物物质、例如 在血液中发现的生物物质，尤其是低于10%、优选低于1%、最优选不含这类生物物质。本发明的化合物可以例如通过包括如下步骤的方法来制备使反应活性的(2-氰 基吡咯烷子基)羰基亚甲基化合物与适当的取代的胺偶联；更具体而言，对于制备式I化合 物，该方法包括使式II化合物 其中Y是反应活性基团(优选卤素如溴、氯或碘)，与式III化合物反应，
5
NH2(CH2)-R III其中R如上述所定义，和以游离形式或酸加成盐形式回收所得的式(I A)、(I B)、(Χ A)、(X B)、(Y A) 或(Y B)化合物。制备式YA或YB化合物的前体的供选方法在专利申请WO 01/068603中有述及， 对于式XA或XB化合物而言在WO 05/095339中有述及。下述方法可用于获得专利申请WO 01/068603或WO 05/095339中所述的其中R'是-OH的化合物的0-葡糖醛酸苷形式。R'部分可以通过本领域技术人员熟知的任意方法或者通过下文对化学式IA或 IB的结构描述的方法来与化学结构连接。经由采用大鼠肝勻浆作为催化剂的制备级生物转 化，已经如下文所述制备了维格列汀的0-葡糖醛酸苷。 维格列汀(NVP-LAF237-NX或Galvus )是目前正处于U. S. FDA的调整性回顾 (regulatory review)的二肽基肽酶_4 (DPP-4)抑制剂类别的一类新的口服降血糖药(抗 糖尿病)。申请人已经出人意料地地发现维格列汀的0-葡糖醛酸苷(图AA)保持了与维 格列汀相同的活性。申请人已经出人意料地发现维格列汀的0-葡糖醛酸苷除了与维格列 汀在抑制DPP-4酶方面等效外，在抑制DPP-8或DPP-9酶方面具有较低的效力。特别出人 意料的是，取代DPP-4抑制剂的金刚烷基将提供改善的药理学特性。维格列汀的0-葡糖醛 酸苷可提供进一步的药物动力学或药理学优点，例如副作用较少、生物利用度更好。 在最优选的实施方案中，维格列汀的0-葡糖醛酸苷(图AA)是基本上纯的形式。本发明的方法可以按照常规方式进行。例如，使式II化合物与1至3当量、优选 3当量的式III伯胺反应。该反应便利地在惰性有机溶剂如二氯甲烷或环醚如四氢呋喃的 存在下进行。温度优选为约0°c至约35°C、优选约0°C至约25°C之间。
可以从反应混合物中分离出本发明的化合物和以常规方式、例如通过色谱法进行纯化。原料还可以以常规方式制得。式II化合物可以通过如下的两步反应流程制备 步骤1涉及式IV吡咯烷与略微摩尔过量的卤代乙酰卤如溴代乙酰溴或氯代乙酰 氯和碱如碳酸钾或三乙胺反应。该反应便利地在惰性有机溶剂如四氢呋喃或氯化脂族烃如 二氯甲烷的存在下、在约0°c至约25°C的温度下、优选在约0°C至约15°c的温度下进行。步骤2涉及用1至2当量的三氟乙酸酐(TFAA)使步骤1中制得的式V化合物脱 水。脱水优选在惰性有机溶剂如四氢呋喃或氯化脂族烃如二氯甲烷的存在下、在约0°c至约 25°C的温度下、优选在约0°C至约15°C的温度下进行。当用作原料的化合物的制备没有在本文中具体描述时，该用作原料的化合物是已 知的或者可以按照已知方式或类似于已知方法或类似于实施例中所述的方法由已知的化 合物制得。例如，式III的伯胺化合物是已知的，可以通过文献如Khim.-Farm. Zh. (1986)， 20 (7)，810-15中记录的方法制得。最终，本发明的化合物以游离形式获得，或者如果存在成盐基团的话作为其盐形 式获得。具有碱性基团的本发明化合物可以被转化为酸加成盐、尤其是可药用酸加成盐。 这些盐例如与无机酸、例如矿物酸如硫酸、磷酸或氢卤酸或与有机羧酸形成。优选的是与盐 酸形成的盐。鉴于游离化合物和盐形式的化合物之间的密切关系，无论何时在本文中提到化合 物时还涉及相应的盐，条件是这在所述情况中是可能的或适当的。化合物、包括它们的盐还可以以其水合物形式获得，或者包括其它用于其结晶的 溶剂。本发明还包括药物组合物、例如可用于抑制DPP-IV的药物组合物，其包含可药用 载体或稀释剂以及治疗有效量的式I化合物或其可药用酸加成盐。在另一项实施方案中，本发明提供了抑制DPP-IV的方法，该方法包括给需要该治 疗的哺乳动物施用治疗有效量的本发明化合物或其可药用酸加成盐。在另一项实施方案中，本发明提供了治疗受DPP-IV抑制介导的病症的方法，该方 法包括给需要该治疗的哺乳动物施用治疗有效量的上述本发明化合物或其可药用酸加成盐. ο本发明还涉及本发明的化合物或其可药用盐的用途，例如在制备用于预防或治疗与DPP-IV水平升高相关的疾病或病症的药物中的用途。如上所述，所有的式(I A)、(I B)、(Χ A)、(X B)、(Y A)或(Y B)化合物及其相应 的可药用酸加成盐均可用于抑制DPP-IV。本发明的化合物及其相应的可药用酸加成盐抑 制DPP-IV的能力可以采用Caco-2DPP-IV试验来证实，该试验测定了受试化合物抑制来自 人结肠癌细胞提取物的DPP-IV活性的能力。人结肠癌细胞系Caco-2获自美国典型培养物 保藏中心(ATCCHTB 37)。如 Reisher 等人在 Proc. Natl. Acad. Sci.，第 90 卷，第 5757-5761 M (1993) ΦΙΙ^ "Increased expression of intestinal cell line Caco-2" ^ifei^ 所述使细胞分化以诱导DPP-IV表达。由溶解于IOmM Tris HC1、0. 15MNaCl、0. 04t. i. u.抑 肽酶、0. 5% nonidet-P40，pH 8. 0中的细胞将其在4°C于35，OOOg离心30分钟以除去细胞 碎片制备细胞提取物。试验通过向微量滴定板的孔中添加20 μ g溶解的Caco-2蛋白来进 行，所述 Caco-2 蛋白在试验缓冲液(25mM Tris HCl pH 7. 4、140mM NaClUOmM KC1、1%牛 血清清蛋白)中稀释至125 μ 1的终体积。于室温孵育60分钟后，通过添加25 μ IlmM底物 (H-丙氨酸-脯氨酸-ρΝΑ ；ρΝΑ是对硝基苯胺)启动反应。反应在室温下进行10分钟，然后 加入19 μ 1体积的25%冰醋酸以终止反应。受试化合物通常以30 μ 1添加物加入，试验缓 冲液的体积被减至95 μ 1。采用游离ρΝΑ在试验缓冲液中的0-500 μ M溶液产生游离对硝基 苯胺的标准曲线。生成的曲线是线性的，用于底物消耗的内插(催化活性以所裂解底物的 nmoles/min表示)。通过在Molecular Devices UV Max微量滴定板读数器中测定405nm 的吸收度确定终点。采用4-参数逻辑函数、由8-点剂量响应曲线计算受试化合物作为DPP-IV抑制剂 的效力，以IC5tl表示。本发明的化合物及其相应的可药用酸加成盐抑制DPP-IV的能力还可以通过采用 Kubota 等人在 Clin. Exp. Immunol.，第 89 卷，第 192-197 页(1992)中题为"Involvement of dipeptidylpeptidase IV in an in vivo immuneresponse，，的论文中所述测定法的变 通方法在人和大鼠血浆中测定受试化合物对DPP-IV活性的影响来证实。简言之，将5 μ 1血 浆加入到96-孔平底微量滴定板(Falcon)中，然后添加5μ 1在孵育缓冲液(25mM HEPES, 140mMNaCl、l% RIA-级BSA，pH 7.8)中的80mM MgCl20于室温孵育60分钟后，通过添加 10 μ 1含有0. ImM底物(H-甘氨酸-脯氨酸-AMC ；AMC是7-氨基-4-甲基香豆素)的孵育 缓冲液启动反应。将板用铝箔覆盖(或保持在暗处)，于室温孵育20分钟。反应20分钟 后，采用CytoFluor 2350荧光计(激发380nm，发射460nm ；灵敏度设置4)测定荧光。受试 化合物通常以2μ 1添加物加入，试验缓冲液的体积被减至13μ 1。采用AMC在试验缓冲液 中的0-50 μ M溶液产生游离AMC的荧光-浓度曲线。生成的曲线是线性的，用于底物消耗 的内插(催化活性以所裂解底物的nmoles/min表示)。与前面的试验一样，采用4-参数逻 辑函数、由8-点剂量响应曲线计算受试化合物作为DPP-IV抑制剂的效力，以IC5tl表示。鉴于其抑制DPP-IV的能力，本发明的化合物及其相应的可药用酸加成盐可用于 治疗受DPP-IV抑制介导的病症。根据上述和文献中的所见内容，可以预计本文公开的化 合物可用于治疗诸如非胰岛素依赖型糖尿病、关节炎、肥胖、同种异体移植物移植和降钙 素-骨质疏松症的病症。此外，基于胰高血糖素样肽(例如GLP-I和GLP-2)的作用以及它 们与DPP-IV抑制的关联，可以预计本文公开的化合物可用于例如产生镇静或抗焦虑作用 或者减弱术后的分解代谢改变和对应激的激素响应或者降低心肌梗塞后的死亡率和发病率，或者可用于治疗与可以受GLP-I和/或GLP-2水平介导的上述作用有关的病症。更具体而言，例如，本发明的化合物及其相应的可药用酸加成盐改善了对口服葡 萄糖攻击的早期胰岛素响应，因此可用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病。本发明的化合物及 其相应的可药用酸加成盐改善对口服葡萄糖攻击的早期胰岛素响应的能力可以按照如下 方法在抗胰岛素性大鼠中测定在测试当天使已经饲喂高脂肪膳食(饱和脂肪=57%卡路里)达2-3周的雄性 Sprague-Dawley大鼠禁食约2小时，分成8-10只一组，口服给予10 μ mol/kg在CMC中的受 试化合物。在受试化合物直接进入受试动物的胃后30分钟时，施用lg/kg的口服葡萄糖丸。 在各时间点从长期颈静脉导管获得血样，对其分析血糖和免疫反应性胰岛素(IRI)浓度以 及血浆DPP-IV活性。通过双抗体放射免疫测定(RIA)方法、采用来自Linco Research (St. Louis, MO)的特异性抗鼠胰岛素抗体分析了血浆胰岛素水平。RIA的检测下限为0.5 μ U/ mL，分析内和分析间变异为5%以下。数据表示为对照动物平均值的增加％。通过口服施用， 受试化合物各自放大了早期胰岛素响应，这导致了抗胰岛素性测试动物中葡萄糖耐量的改 善。获得了如下结果本发明的化合物及其相应的可药用酸加成盐将被施用以治疗受DPP-IV抑制介导 的病症的精确剂量依赖于多种因素，包括宿主、所治疗病症的性质和严重性、施用方式和所 用的具体化合物。但是，通常，当本发明的化合物或其相应的可药用酸加成盐以0.002-5、 优选0. 02-2. 5mg/kg体重的日剂量或者对于大多数较大灵长类动物而言以0. 1-250、优 选I-IOOmg的日剂量经肠施用、例如经口服施用或者经胃肠道外使用、例如经静脉内施用、 优选经口服施用时，受DPP-IV抑制介导的病症被有效地治疗。典型的口服剂量单位为 0.01-0.75mg/kg，每日1-3次。通常，最初施用小剂量，逐步增加剂量至确定所治疗宿主的 最佳剂量。剂量上限由副作用决定，并且可以通过对所治疗宿主的试验得以确定。本发明的化合物及其相应的可药用酸加成盐可以与一种或多种可药用载体和任 选的一种或多种其它常规药物佐剂合并，经肠施用、例如以片剂、胶囊剂、胶囊形片剂等经 口服施用或者经胃肠道外使用、例如以无菌可注射溶液或混悬液经静脉内施用。经肠和胃 肠道外施用的组合物可以通过常规方式制备。包含本发明化合物的适宜制剂的实例在专利 申请 W02005/067976 或 WO 2006/078593 中有述及。因此，本发明还涉及药物组合物，其包含游离形式或可药用酸加成盐形式的权利 要求1-4任一项的化合物或本文所述的化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂。本发明的药物组合物是适于经肠(例如经口服或直肠)、透皮和胃肠道外施用于 哺乳动物、包括人来治疗受DPP4活性介导的病症的药物组合物。这类病症包括葡萄糖耐量 降低、2型糖尿病和肥胖。因此，本发明的药理活性化合物可用于制备药物组合物，所述组合物包含有效量 的该化合物与适于经肠或胃肠道外应用的赋形剂或载体的结合物或混合物。优选的是包含 活性成分和下述成分的片剂和明胶胶囊剂a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而 言还包含c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要的话，还包含d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射组合物优选是含水等张溶液或混悬液，栓剂有利地由脂肪乳剂或混悬剂制备。所述组合物可以被灭菌和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化齐U、 溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可以含有其它有治疗价值的物 质。分别按照常规的混合、制粒或包衣方法制备所述组合物，其含有约0. 1-75%、优选约 1-50%的活性成分。适于透皮应用的制剂包括治疗有效量的本发明化合物和载体。有利的载体包括可 吸收的药理学可接受的溶剂以帮助穿过宿主的皮肤。特征性地，透皮装置是绷带剂的形式， 包含背膜、含有化合物和任选的载体的储库、任选的速率控制屏障(历经延长了的时间以 受控和预定的速率递送化合物至宿主皮肤)和确保该装置于皮肤上的手段。因此，本发明提供了用于治疗受二肽基肽酶-IV抑制介导的病症、优选葡萄糖耐 量降低、2型糖尿病和肥胖的如上所述的药物组合物。本发明还提供了如上所述的药物组合物在治疗受二肽基肽酶-IV抑制介导的病 症、优选葡萄糖耐量降低、2型糖尿病和肥胖中的用途，其中本发明的化合物(如权利要求 1-4任一项所定义)与其它治疗剂如一种或两种另外的活性剂组合施用，所述其它治疗剂 如下文所述。药物组合物可以含有单独的或与其它治疗剂组合的治疗有效量的如本文(如权 利要求1-4)定义的本发明化合物，例如各自为本领域报道的治疗有效剂量。这类治疗剂包 括a)抗糖尿病剂，例如胰岛素、胰岛素衍生物和模拟物；胰岛素促分泌剂，例如磺 脲类，例如格列吡嗪、格列本脲和亚莫利阿玛尔；促胰岛素磺酰脲受体配体，例如氯茴苯 酸类，例如那格列奈和瑞格列奈；蛋白酪氨酸磷酸酶-IB(PTP-IB)抑制剂，例如PTP-112 ； GSK3(糖原合酶激酶-3)抑制剂，例如 SB-517955、SB-4195052、SB-216763、NN-57-05441 和NN-57-05445 ；RXR配体，例如GW-0791和AGN-194204 ；钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白抑 制剂，例如T-1095 ；糖原磷酸化酶A抑制剂，例如BAYR3401 ；双胍类，例如甲福明；α -糖苷 酶抑制剂，例如阿卡波糖；GLP-I (胰高血糖素样肽-1)、GLP-1类似物如Exendin-4 (艾塞那 肽-4)和GLP-I模拟物；和DPPIV (二肽基肽酶IV)抑制剂，例如维格列汀；b)降血脂剂，例如3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，例如 洛伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、维洛他汀(velostatin)、 氟伐他汀、达伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀和rivastatin (雷司他汀)；角鲨烯合酶抑制 剂；FXR(法呢醇X受体(farnesoid X receptor))和LXR(肝X受体)配体；考来烯胺；贝特 类(fibrates)；烟酸胆汁酸结合树脂，例如考来烯胺；贝特类；烟酸和其它GPR109激动剂； 胆固醇吸收抑制剂，例如依泽替米贝；CETP抑制剂(胆固醇酯转移蛋白抑制剂)，和阿司匹 林；c)抗肥胖剂，例如奥利司他、西布曲明和大麻素受体I(CBl)拮抗剂，例如利莫那 班；和
d)抗高血压剂，例如髓袢利尿剂，例如依他尼酸、呋塞米和托塞米；血管紧张素转 化酶(ACE)抑制剂，例如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培 哚普利、喹那普利、雷米普利和群多普利；Na-K-ATP酶膜泵抑制剂，例如地高辛；中性内肽 酶(NEP)抑制剂ACE/NEP抑制剂，例如奥马曲拉、山帕曲拉和法西多曲；血管紧张素II拮 抗剂，例如坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙坦和缬沙坦，特别是缬沙坦；肾 素抑制剂，例如地替吉仑、占吉仑、特拉吉仑、阿利吉仑、RO 66-1132和R0-66-1168 ； β -肾 上腺素能受体阻滞剂，例如醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、 普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔；影响收缩力的物质，例如地高辛、多巴酚丁胺和米力农； 钙通道阻滞剂，例如氨氯地平、苄普地尔、地尔硫革、非洛地平、尼卡地平、尼莫地平、硝苯地 平、尼索地平和维拉帕米；醛留酮受体拮抗剂；和醛留酮合酶抑制剂；e)过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂，例如非诺贝特、吡格列酮、罗格列酮、替 格他唑(tesaglitazar)、BMS-298585、L-796449、在专利申请 WO 2004/103995 中具体描述 的化合物(即实施例1-35的化合物或在权利要求21中具体列出的化合物)或在专利申请 WO 03/043985中具体描述的化合物(即实施例1_7的化合物或权利要求19中具体列出的 化合物)，尤其是(R)-1-{4- [5-甲基-2- (4-三氟甲基-苯基)-噁唑-4-基甲氧基]-苯磺 酰基} _2，3- 二氢-IH-吲哚-2-甲酸或其盐。在每种情况中，特别是在化合物权利要求和实施例的终产物中，终产物、药物制剂 和权利要求的主题通过引用这些出版物和专利申请在此引入本申请。因此，本发明涵盖了包含如下物质的药物组合物i)权利要求1-4任一项的化合物；和ii)至少一种选自如下的化合物a)抗糖尿病剂，b)降血脂剂，c)抗肥胖剂，d)抗高血压剂，e)过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂，ii) 一种或多种可药用载体。Patel Mona在Expert Opin Investig Drugs，2003，12 (4)，623-633 的图 1-7 中描 述了其它具体的抗糖尿病化合物，该文献引入本文作为参考。本发明的化合物可以与其它 活性成分同时、在其之前或之后施用，分别通过相同或不同施用途径或者在同一药物制剂 中一起施用。通过代码、通用名或商品名鉴别的治疗剂的结构可以获自标准纲要《默克索引》 (The Merck Index)的现行版本或数据库如 Patents International (例如 IMS World Publications)。其相应的内容引入本文作为参考。因此，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明化合物与治疗有效 量的其它治疗剂的联合，所述其它治疗剂优选选自抗糖尿病剂、降血脂剂、抗肥胖剂或抗高 血压剂，最优选选自如上所述的抗糖尿病剂或降血脂剂。本发明还涉及用作药剂的如上所述的药物组合物。本发明还涉及如上所述的药物组合物或组合产品在制备用于治疗受二肽基肽酶-IV抑制介导的病症、优选葡萄糖耐量降低、2型糖尿病和肥胖的药物中的用途。本发明的化合物及其相应的可药用酸加成盐可以配制成经肠和胃肠道外施用的 药物组合物，其含有有效治疗受DPP-IV抑制介导的病症的量的活性物质，该组合物是单位 剂量形式并且该组合物包含可药用载体。本发明的化合物(包括其亚范围各自的化合物和实施例各自的化合物)可以以对 映异构纯的形式(例如ee > 98%、优选> 99% )或与E对映异构体一起、例如以外消旋形 式施用。上述剂量范围是以本发明的化合物为基础的(不包括E对映异构体的量)。下述实施例显示了本发明所囊括的代表性化合物及其合成。然而，应当清楚地理 解，它们仅用于解释说明的目的。I.实施例11-[(3_羟基-1-金刚烷基)氨基]乙酰基-2-氰基-吡咯烷，(S) (INN:维格列 汀)或 NVP-LAF237 Α. 1-氨基金刚烷-3-醇
可以对Khim. -Farm. Zh. (1986)，20 (7)，810-15中找到的合成进行略微改变。
历经 30 分钟向 96%浓硫酸(2IOmL ；3，943mmol)和 65%硝酸(21. OmL ；217. Ommol) 的快速搅拌的、澄清无色的、冰水冷却的混合物中分小批加入21. 0g(112. Ommol) 1_金刚烷 基胺HCl (99%)。在添加盐酸金刚烷基胺时出现略微冒泡，该反应是略微放热的。将该冒 泡的黄色溶液在冰_水温度下搅拌约2小时，然后于室温搅拌30小时。然后将该澄清淡黄 色反应物倾入约IOOg冰中，所得溶液为澄清的绿-蓝色。将溶液置于冰水浴中，搅拌30分钟。然后历经45分钟分小批加入约550g 89%纯 的K0H(8，74mol)。在此添加过程中，该反应放热，达到80°C并产生大量棕色NO2气体。在添 加结束时，反应物是浓稠的，含有白色固体(产物和盐)。然后将所得白色糊状物倾倒在布 氏漏斗/硅藻土垫上，用1. 2升CH2Cl2洗涤。然后从水层萃取出CH2Cl2层，用Na2SO4干燥。 然后过滤该溶液，浓缩(旋转蒸发仪/泵)，得到1-氨基金刚烷-3-醇，为白色固体。B. 1-氯乙酰基-2-氰基吡咯烷历经45分钟向20. Og (180. Ommol)氯代乙酰氯和97g(0. 70mmol)碳酸钾在150mL 四氢呋喃中的机械搅拌的溶液中滴加20. Og L-脯氨酰胺(180. Ommol)在500ml四氢呋喃 中的溶液。然后将反应物于室温机械搅拌另外2小时。然后过滤反应物以除去钾盐，滤液 用Na2SO4干燥。然后通过过滤除去Na2SO4,向无色滤液中一次性加入三氟乙酸酐(25. OmL, 0. ISOmmol)。然后将反应物于室温机械搅拌1小时，通过旋转蒸发仪浓缩所得的澄清黄/ 橙色溶液。通过向浓缩的油中添加乙酸乙酯并通过旋转蒸发仪再次浓缩，除去过量的三氟 乙酸酐。该除去操作进行3次。使所得油在乙酸乙酯与水之间分配。然后将产物萃取入乙酸乙酯中，然后用乙酸 乙酯将水层洗涤2次。然后将所合并的有机层依次用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得到1-氯乙酰基-2-氰基吡咯烷，为黄色固体。C. 1-「(3_羟某-1-金刚烷某)t[某1乙酰某-2-氰某-吡咯烷，(S)向标题A 化合物(1-氨基金刚烷-3-醇(5. 80g, 34. 7mmol)在 CH2Cl2 (68. OmL)中 的非均勻溶液中加入9. 6g(69mmol)K2CO30然后用冰_水浴冷却该非均勻混合物，历经30 分钟滴加3. 0g(17mmol)标题B化合物(1-氯乙酰基-2-氰基吡咯烷)溶于25. OmL CH2Cl2 中的溶液。将所得混合物于0°C搅拌2小时，于室温搅拌6天。然后浓缩该反应物，得到 黄色糊状物质，将其用SIMS/Biotage快速色谱系统和甲醇在二氯甲烷中的7%溶液作为洗 脱剂在硅胶上纯化，得到游离碱形式的标题化合物，为白色结晶固体(熔点138°C -140 13CNMR(ppm) = 119. 59)。A. P. NVP-BQS867 (维格列汀的O-葡糖酵酸苷)和NVP-BRU563 (标记的维格列汀的 0-葡糖酵酸苷)的牛物催化合成图4-1显示了 NVP-LAF237在大鼠肝勻浆催化下的酶促葡糖苷酸化的反应流程。
(i)图I-I NVP-LAF237的生物转化
3. 1.大鼠肝勻浆的制备
将两份15g和一份Ilg冷冻大鼠肝脏解冻并切成小片。向每份肝脏中添加0. 5体 积当量的冰冷0. 9% NaCl溶液并在Dispomix搅拌机中混合后，在“Potter S”组织勻浆器 (Braun Biotech Inc.，Melsungen，德国)中在冰水冷却下通过以100%搅棒速度将特富 龙杵上下移动3次从而将组织勻浆化。将勻浆填充至最终重量为81g，在装配有JA-10转 子的 Avanti J-HC 型 Beckmann Coulter 离心机(Fullerton, CA, USA)中以 10，000rpm(= 17, OOOxg)于4-6离心30分钟。上清液用作酶源。4. 2.制备规模的生物转化340mg规模的NVP-LAF237 f維格列汀V的葡糖苷酸化条件是
NVP-LAF2375mM、UDP-葡糖酸酸盐(Yamasa Co.，日本东京)20mM、MgCl220mM、HEPES, ρΗ 8. 5160mM、大鼠肝勻浆20% ν/ν,总体积224ml，于37°C孵育5小时，再于30°C孵育14小时。 反应在50ml Nunc试管中进行，所述试管各自填充有20ml反应混合物，在具有5cm振动半 径的微生物实验室振荡器上以170rpm振摇。通过添加224ml乙腈并于20°C混合10分钟从而终止制备级反应。于SOOOrpm(转 子JA-10)离心15分钟后，将沉淀混悬于乙腈在去离子水中的50ml 50% ν/ν溶液，再次离 心。将所合并的上清液于25°C减压浓缩至50ml。将浑浊的浓缩物于5000rpm离心，上清液 经纤维玻璃过滤后，进行制备型HPLC。对于·丨13Cg isNl标记的NVP-LAF237 (50mg规模)的葡糖苷酸化，生物转化
条件与340mg规模的NVP-LAF237相同，不同的是UDP-葡糖醛酸盐的浓度是80mM、大鼠肝勻浆的浓度是30% v/v、nunc试管的填充体积是16. 5ml、总体积是33ml、反应时间是4小时 和振摇速度是200rpm。通过向每支试管中添加16. 5ml乙腈、在冰上孵育15分钟、然后混合从而终止反 应。于17，00011)111(转子从-10)离心15分钟后，将沉淀重新混悬于乙腈在去离子水中的 20ml 50% ν/ν溶液中，再次离心。对于最终的净化，将所合并的上清液于30°c减压浓缩至 10ml、再次稀释至25ml终体积、离心。将沉淀重新混悬于5ml去离子水，离心后，合并后两 次的上清液并进行制备型hplc。转化的测定/分析型HPLC-DAD将340mg批量的nvp-laf237的19h样品 50 μ 1和[13c515n]标记的nvp-laf237批量的4h样品25 μ 1各自与200 μ 150%乙腈水溶液 混合，在sigma 4k15c冷冻离心机中离心。通过分析型rp18-hplc-dad(来自瑞士巴塞尔安 捷伦技术公司(agilent technologies)的 hplc-dad 1100 系列；具有 chromolith guard cartridge rp-18e 5x4. 6mm (merck)白勺 chromolith performance rp-18e 100x4. 6mm 型号 的两个连接的柱；流速2ml/分钟；流动相a :3mm h3po4水溶液，流动相b 乙腈；梯度为历经 5分钟由3%至15% b ；在200-400nm的dad检测)分析上清液。转化基于葡糖醛酸苷和 nvp-laf237的205nm处的uv-吸收峰面积。5.e.代谢物的纯化a)a) nvp-bqs867_nx_2将一部分(5ml或约10% )生物转化原料用于制备nvp-bqs867_nx_2批量。向该 体积中加入35ml iomm nh4ac水溶液和8ml甲醇。用稀乙酸调节ph至7。然后将该混合物 用作制备型液相色谱法的进样溶液。制备型液相色谱法-质谱法系统由waters autopurification系统(waters corp. milford，ma, usa)和2525泵、2767样品管理器、2996光电二极管检测器、515补充泵 (make-up pump)、zq2000 质谱仪禾口 masslynx 4. o 禾口 fractionlynx 4. o 软件组成。使用 atlantis dc18，5 μ m，19mmxl00mm 柱(waters)；流速 20ml/min ；流动相 a : iomm nh4ac水溶液，ph7. o ；流动相b :ch3cn/ch30h 4:1，iomm nh4ac ；梯度程序:0 分钟，5% b ；2 分钟，5% b ;7 分钟，20% b ；7. 1-12 分钟，95% b ；12. 1-14 分钟，5% b ；进样体积 l_5ml。 分离柱洗脱液，取很小一部分与补充液2-丙醇/h20/hc00h400 100 1在线混合，导入 质谱仪的离子源中；其余部分进入记录范围为200-600nm的dad检测器，然后进入样品管理 器用于分级采集。质谱仪装配有在正esi模式中使用的esci接口。施加3kv毛细管电压和30v锥 孔电压；质量范围250-550da。基于时间由5. 3至6. 7分钟收集目标级分。合并来自12次hplc运行的目标级分， 于30°c减压除去有机溶剂，剩余溶液于-80°c和0. 2mbar下冷冻干燥，得到15mg，为几乎无 色的冻干物。通过hplc-dad和hplc-ms测定纯度(参见第2. 2. 2部分)除了盐(乙酸铵)和 水外，nvp-bqs867-nx-2批量的纯度> 97%。b)b)nvp-bru563-nx~l (稳定的标记的葡糖醛酸苷)将等体积的20mm nh4ac溶液加入到水提取物中以形成iomm的nh4ac浓度。用稀 乙酸将该混合物调节至ph7. 0，然后用作制备型液相色谱的进样溶液。
制备型液相色谱法_质谱法系统在2. 1. 3. 1中进行了描述。使用 Atlantis Prep dC18 OBD，5 μ m，30mmxl50mm柱(Waters)；流速40ml/min ；流 动相 A =IOmM NH4Ac 水溶液；流动相 B :CH3CN/CH30H4 1+lOmM NH4Ac, pH 7. 0 ；梯度程序0 分钟，5% B ；2 分钟，5% B ；7 分钟，20% B ；7. 1-12 分钟，95% B ；12. 1-14 分钟，5% B ；进样 体积2-6ml。按照与2. 1. 3. 1中所述相同的方式分离柱洗脱液。质谱仪装配有在正ESI模式中使用的ESCi接口。施加3kV毛细管电压和30V锥 孔电压；质量范围100-1000Da。 基于时间由7. 0至9. 0分钟收集目标级分。合并来自12次HPLC运行的目标级分， 于30°C减压除去有机溶剂，剩余溶液于-80°C和0. 2mbar下冷冻干燥，得到63mg，为几乎无 色的冻干物。通过HPLC-DAD和HPLC-MS测定纯度(参见第2. 2. 2部分)除了盐(乙酸铵)和 水外，NVP-BRU563-NX-1批量的纯度> 98%。B. F.结构鉴定分析1.NMR 光谱法将化合物溶于5 μ 1 DMS0-d6中，填充入Imm直径的NMR管中。由NVP-BQS867获得 ID-1H 光谱和 2D 同-和异核光谱(COSY, HSQC, HMBC, R0ESY)。由 NVP-BRU563 测得 1H 光谱。 所有光谱在Bruker DRX600光谱仪上采用1Hl13C, 15N}Microliterprobe于300° K记录。由 NVP-BQS867 在 BRUKER DRX600 光谱仪上采用 5mm 13C(1H) Cryoprobe 测得 13C 光谱。2. 2. HPLC-质谱法液相色谱仪由装配有Waters Acquity 2996 PDA检测器的WatersUPLC Acquity(Waters)组成。柱Acquity UPLC BEH C18 ；1. 7ym ；1. Ox 150mm(Waters)；流速 0. Iml/分钟；洗脱液A :H20/TFA 100 0. 1 ；洗脱液B 乙腈/TFA 100 0. 1 ；梯度:0分钟， 5%B ； 1 分钟，5% B ； 11 分钟，40% B ； 13-16 分钟，95% B ；30°C;UV_ 检测200_350nm，分辨率 2. 4nm ；进样体积5 μ 1。将物质以约0. 3mg/ml的浓度溶于水/乙腈9 1中。通过210nm 处的UV以预期峰的面积进行纯度评价。将柱洗脱液直接导入MS的离子源中。使用装配有正离子模式的电喷雾接口的TSQ Quantum AM质谱仪(Thermo，San Jose, CA, USA)。采用Xcalibur软件2. 0版进行操作。使用25个单位的鞘气(sheath gas) 设置和5个单位的辅助气(auxiliary gas)，施加3kV的喷射电压。将加热的金属毛细管维 持在 300°C;质量范围 200-800Da。MS/MS 参数碰撞气(collision gas) 1. 5mTorr 氩气；碰 撞能(collision energy) 25V。II. G.结果Α. 1.生物催化合成对于所述两种制备级反应而言，分析型HPLC-DAD给出以下转化值340mg NVP-LAF237批量的转化值为66 %，[13C515N]标记的NVP-LAF237批量的转化值为94 % (50mg) ο2.葡糖醛酸苷的纯化如上述部分中所述，通过制备型HPLC-MS由5ml获自生物转化的含水培养物提取 物得到15mg 0-葡糖醛酸苷NVP-BQS867-NX-2。由340mgNVP_LAF237的完整制备级反应分 离出4批NVP-BQS867-NX(NX-1至NX-4)，总量为295mg 0-葡糖醛酸苷。
3.结构阐明NVP-BOS867-NX-2 ^Ι 、兒元[M+H]+ 是 480. 1，提示分子量为 479。这与 NVP-LAF237的葡糖醛酸苷是一致的。MS/MS产物离子光谱显示了葡糖醛酸苷(m/z 304)和 葡糖醛酸(m/z 286)的损失。根据NMR光谱清楚地阐明了 NVP-BQS867-NX-2的结构(图3_1)。NVP-BQS867的 NMR光谱与NVP-LAF237相比的主要差异主要是获自葡糖醛酸苷部分的共振。葡糖醛酸的 端基异构1’共振的力-(4.42 111)和13C位移(96.4ppm)显示后者与氧键合，不与氮键合。 H-I，至C-3的HMBC相关性和H-I，至H-2和H-4的ROESY相关性清楚地证实了图3_1中所 示的结构。所有NMR数据和相关性的解释均产生了仅仅一种结构，该结构与MS结果(MW = 479，m/z MH+ = 480. 1)相符。所有1H-和13C位移以及相关的同_和异核相关性的概述显 示在表3-1中。由[U-吡咯烷，氰基-13C5,吡咯烷-15N]标记的NVP-LAF237经生物合成获得的化合 ^NVP-BRU563-NX-3思示T与NVP-BQS867-NX相同的光谱特性，对于稳定标记而言 预期的例外是MH+486. 2比NVP-BQS867-NX的MH+高6Da，在MS/MS产物离子光谱中一些碎 片也发生了位移。(i)

图11-1，具有表3-1和1H光谱中所用编号方案的NVP-BQS867的结构 (b)表 11-1，NVP-BQS867 结构的 1H-和 13C 归属 另一种优选的化合物是；
在最优选的实施方案中，图BB的化合物是基本上纯的形式。这种0-葡糖醛酸苷化合物(图BB)可以通过采用本文所述的方法得到。专利申请TO 01/068603或WO 05/095339中描述了由其中R'是-OH获得原料化合物的方法。盐可以是HCL盐。(HCl)=为盐酸盐。所有的终产物的HCl盐通过使HCl穿过游 离碱在四氢呋喃中的0. 1摩尔溶液直至溶液明显呈酸性、然后除去溶剂(旋转蒸发仪/泵) 而制得。氨基-金刚烷原料是文献中已知的，或者可以如下制得3, 5- 二甲基土金刚烷基胺的制备在J. Med. Chem, 25 ；1 ； 1982 ；51-56中有述及。3-乙基-1-金刚烷基胺的制备在T. Med. Chem, 25 ；1 ； 1982 ；51-56中有述及。3-甲氧基-1-金刚烷基胺可以如下制备历经30分钟向氢化钾(0. 680gm ;5. 95mmol)在15. Oml四氢呋喃中的搅拌的、 冰-水冷却的混悬液中滴加1-氨基金刚烷-3-醇(1. OOg ；5. 95mmol)和15. Oml四氢呋喃 的混合物。然后将所得混合物搅拌另外30分钟，然后历经1分钟滴加碘甲烷(0. 370ml ； 5.95mmol)。然后将所得不透明白色反应物于室温搅拌18小时。然后将混合物用50ml 二 氯甲烷稀释，过滤以除去无机杂质。然后浓缩滤液，采用SIMS/Biotage装置和在二氯甲烷 中的19%甲醇和氢氧化铵作为洗脱剂在硅胶上纯化，得到3-甲氧基-1-金刚烷基胺， 为不透明油状物。3-「「(釘脑某)聽1氧某1-1-氡,縣__&成:历经10分钟内向I-氨基金刚烷-3-醇(5. OOg ；30. Ommol)和碳酸钾(6. 20g ； 45mmol)在150ml四氢呋喃中的混合物中滴加氯甲酸苄基酯(4. 70g，33. Ommol)。然后将混 合物于室温搅拌2小时，然后在乙酸乙酯与水之间分配。然后将产物萃取入乙酸乙酯中，水 层用乙酸乙酯(IOOml)洗涤两次。然后将所合并的有机层依次用100ml 2N氢氧化钠水溶 液、水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩(旋转蒸发仪/泵)，得到1-苄基氨甲酰基金 刚烷-3-醇，为白色固体，85%收率。向1-苄基氨甲酰基金刚烷-3-醇(1. OOg, 3. 32mmol)和异氰酸叔丁基酯(380 μ 1， 3. 32mmol)在30ml 二氯甲烷中的澄清溶液中通过注射器加入三甲基甲硅烷基氯(20. 0 μ 1， 0. 17mmol)。然后将反应物于室温搅拌18小时，浓缩(旋转蒸发仪)，用SIMS/Biotage装置 和乙酸乙酯在己烷中的20 %溶液作为洗脱液在硅胶上进行纯化，得到3-[[(叔丁基氨基) 羰基]氧基]-ι-苄基氨甲酰基金刚烷，为白色固体，定量收率。向在1-升Parr氢化烧瓶中的3_ [[(叔丁基氨基)羰基]_氧基]苄基氨甲酰 基金刚烷(1. 50g,3. 75mmol)和10%钯/碳(400mg)在乙醇(150ml)中的混合物中加入氢 (50psi)。然后将该不透明黑色混合物振摇24小时。然后将反应物经硅藻土过滤以除去钯 催化剂，浓缩(旋转蒸发仪/泵)，得到3-[[(叔丁基氨基)羰基]氧基]-1-氨基金刚烷， 为澄清油状物，99%收率。4_「「「(甲氧基苯基)氨基1羰基1氧基1-1-氨基金刚烷的合成方法基本上是 3_ [[(叔丁基氨基)羰基]氧基]-1-氨基金刚烷的方法，不同的是在第二步中，等量的异 氰酸4-甲氧基苯基酯代替异氰酸叔丁基酯，1,2- 二氯乙烷代替二氯甲烷用作溶剂，以及反 应物于50°C搅拌18小时。得到最终的胺中间体，为油状物。3_「「(苯基氨基)羰基1氧基1-1-氨基金刚烷的合成方法基本上是3_[[(叔丁 基氨基)羰基]氧基]-ι-氨基金刚烷的方法，不同的是在第二步中，等量的异氰酸苯基酯 代替异氰酸叔丁基酯，1，2_二氯乙烷代替二氯甲烷用作溶剂，以及反应物于50°C搅拌18小时。得到最终的胺中间体，为澄清油状物。2-氨基金刚烷-5-醇的制备方法与实施例1相同，不同的是原料是2-氨基金刚 烷而不是ι-氨基金刚烷。亲核体3-乙酰氧基-1-氨基金刚烷的合成方法基本上是3-[[(叔丁基氨基)羰 基]氧基]-1-氨基金刚烷的方法，不同的是采用1.2eq乙酰氯、3. Oeq.吡啶、0. Ieq 4_ 二 甲氨基吡啶和1，2 二氯乙烧，将它们均于室温搅拌24小时，从而进行1-苄基氨甲酰基金刚 烷-3-醇的标准酰化。得到最终的胺，为粘稠油状物。3-「「「( 二异丙某)Ii某1氧,某1-1-M某金_1烷的合成方法某本卜.是 3-[[(叔丁基氨基)羰基]氧基]-1-氨基金刚烷的方法，不同的是在第二步中，等量的二 异丙基氨甲酰氯代替异氰酸叔丁基酯，1，2_ 二氯乙烷代替二氯甲烷用作溶剂，以及反应物 于85°C搅拌18小时。得到最终的胺中间体，为灰色固体。3-「「「(环P1某)氨某1羰某1氧某1 -1-氨某金刚烷的合成方法某本卜.是3-[[(叔 丁基氨基)羰基]氧基]-ι-氨基金刚烷的方法，不同的是在第二步中，等量的异氰酸环己 基酯代替异氰酸叔丁基酯，1，2-二氯乙烷代替二氯甲烷用作溶剂，反应物于50°C搅拌18小 时。得到最终的胺中间体，为粘稠澄清油状物。3-乙氧基-1-金刚烷基胺(澄清油状物)的制备方法与3-甲氧基-1-金刚烷基 胺相同，不同的是使用碘乙烷(1.3当量)代替碘甲烷。制剂实施例可以如下制得各自含有50mg活性成分NVP-BQS867的片剂组成(对10,000片片剂而言)活性成分500. Og乳糖500. Og马铃薯淀粉352. Og明胶8. Og滑石粉60. Og硬脂酸镁10. Og二氧化硅(高分散性)20. Og乙醇适量将活性成分与乳糖和292g马铃薯淀粉混合，将混合物用明胶的醇溶液润湿，过筛 制粒。干燥后，混入其余的马铃薯淀粉、滑石粉、硬脂酸镁和高分散性二氧化硅，将混合物压 制成各自重145. Omg、活性成分含量为50. Omg的片剂，如果需要的话，可以提供断裂口以更 细微地调节剂量。III.实施例2 生物学实验缩略语列表 IV.材料和方法A.A.仪器在硅化处理的管(Life Systems Design，Merenschwand，瑞士)中对所有含有 蛋白质和肽的溶液进行操作。采用CyBi-Well 96-通道吸液管管理器(CyBio AG, Jena,德国)将化合物溶液以及酶和底物溶液转入384-孔培养板(黑色Cliniplate;目录号 95040020Labsystems 0y, Finland)中。1. 1.FI测定仪器对于采用AMC为染料进行的荧光强度(FI)测定，使用了 UltraEvolution读 数器(TECAN，Maermedorf，瑞士)。该仪器转配有分别对于荧光继发和发射采集而言的 350nm(20nm带宽)和500nm(25nm带宽)带通过滤器(bandpath filter)的组合。为了增 加信躁比，使用适宜的分色镜。所有过滤器和分色镜均购自TECAN。采用Safire2读数器(TECAN，Maermedorf，瑞士)和使用RhllO染料进行FI测定。 Safire2是基于单色仪的仪器，485nm和535nm波长分别用于荧光激发和发射采集。在激发 和发射通路中带宽均设置为20nm。通过每次测定三次快闪激发了各孔中的荧光团。2.由平均数据计算IC=倌将来自单独实验运行的数据求平均值，采用Origin 7. 5SR6 (OriginLabCorporation,Northampton,MA,USA)程序绘图。使用 Origin，内置非线 性回归程序将平均数据拟合为如下‘逻辑’方程y = A2+(Al-A2)/(l+(x/IC50)"p)(等式 1)其中y是抑制剂浓度χ下的抑制，Al是最低抑制值，即0%，A2是最大抑制值， 即100%。指数P是Hill系数。B. IC=倌的测定对于测定IC5tl值，于室温在384-孔培养板中进行实验。所有的最终实验体积均为 30μ1。将受试化合物溶于90% (v/v)DMSO/水中，在水(含有0.05% (w/v)CHAPS)中稀释 至预期实验浓度的三倍。对每次测定，每孔加入10 μ 1水/CHAPS (士受试化合物)，然后加 入10 μ 1蛋白酶溶液(用实验缓冲液稀释；最终实验浓度参见§实验条件)。于室温孵育 1小时后，通过添加10 μ 1底物溶液(最终浓度参见§实验条件)启动反应。11个最终化 合物浓度是 0. 9ηΜ、3ηΜ、9ηΜ、30ηΜ、90ηΜ、300ηΜ、900ηΜ、3 μ Μ、9 μ Μ、30 μ M 禾Π 90 μ M 或 3ηΜ、 10ηΜ、30ηΜ、100ηΜ、300ηΜ、1 μ Μ、3 μ Μ、10 μ Μ、30 μ Μ、100 μ M 和 300 μ Μ。从线性发展曲线获 得化合物对酶活性的作用，由两个读数测定，第一个读数在加入底物(t = 0分钟)后立即 读取，第二个读数在1小时(t = 60分钟)后读取。采用非线性回归分析软件(XLfit，4. 0 版；IDBusiness Solution Ltd.，Guildford，Surrey，UK)、由抑制百分数对比于抑制剂浓度 的图计算得IC50值。C.实验条件下文针对各实验列出了有关酶、底物和缓冲液的所有条件。1. -DPP-2 ( 二肽基肽酶 2)酶覆盖氨基酸30-492的人DPP-2 ；在昆虫细胞中表达并从中纯化(杆状病毒表 达系统)底物Nle-Pro_AMC，购自 Biosyntan(www. biosyntan. de)，产品号 4572酶浓度0. 03nM底物浓度2 μ M实验缓冲液IOOmM柠檬酸钠，ρΗ 5. 5,0. 05% (w/v) CHAPS
2. -DPP-IV ( 二肽基肽酶 IV)酶覆盖氨基酸39-766的人DPP-IV ；在昆虫细胞中表达并从中纯化(杆状病毒表 达系统)底物Gly-Pro_AMC，购自 Bachem (www. bachem. com)，目录号 1-1225酶浓度0.0InM底物浓度10 μ M实验缓冲液25mMTris, pH 7. 4，140mM NaCl，IOmM KCl,0. 05% (w/v)CHAPS3.-人血浆DPP-IV (人血浆中的内源性二肽基肽酶IV)酶来自男性供体血浆样品的内源性人DPP-IV底物(H-Ala-Pro)2-RhllO,室内合成酶浓度约5nM底物浓度10 μ M实验缓冲液人血浆，用缓冲液(25mMTris, pH 7.4、140mM NaClUOmM KC1、 0. 05%(w/v)CHAPS)稀释至50%血浆含量4. -DPP-8 ( 二肽基肽酶 8)酶覆盖氨基酸1-882的人DPP-8 ；在昆虫细胞中表达并从中纯化(杆状病毒表达 系统)底物Gly-Pro_AMC，购自 Bachem (www. bachem. com)，目录号 1-1225酶浓度0. 05nM底物浓度10 μ M实验缓冲液25mMTris, pH 7. 4，140mM NaCl，IOmM KCl,0. 05% (w/v)CHAPS5. -DPP-9 ( 二肽基肽酶 9)酶覆盖氨基酸1-863的人DPP-9 ；在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达 并从中纯化底物Gly-Pro_AMC，购自 Bachem (www. bachem. com)，目录号 1-1225酶浓度InM底物浓度10 μ M实验缓冲液25mMTris, pH 7. 4，140mM NaCl，IOmM KCl,0. 05% (w/v)CHAPS6. -FAP (成纤维细胞活化蛋白，α )酶覆盖氨基酸27-760的人FAP α，不包括胞浆结构域和跨膜结构域；在昆虫细胞 中表达并从中纯化(杆状病毒表达系统)底物Z-Gly-Pro-AMC，购自 Bachem (www. bachem. com)，目录号 1-1145酶浓度0.InM底物浓度8 μ M实验缓冲液IOOmMTris, pH 7. 4，IOOmM NaCl，ImM EDTA，0. 05% (w/v)CHAPS7.-PEP (脯氨酰内肽酶)酶覆盖氨基酸1-710的人PEP ；在巴斯德毕赤酵母中表达并从中纯化底物Z-Gly-Pro-AMC，购自 Bachem (www. bachem. com)，目录号 1-1145酶浓度0. 03nM
底物浓度10 μ M实验缓冲液100mMTris, pH 7. 4, IOOmM NaCl, ImM EDTA,0. 05% (w/v)CHAPS, 0. 1% (w/v) BSA。V. P.结果下表3-1至3-7概括了化合物NVP-BQS867的所有IC5tl测定结果，对于hDPP_IV、 人血浆中的内源性 DPP-IV、hDPP-8、hDPP-9、hFAP 和 hPEP。(a)表 V-1NVP-BQS867-NX_2 对人 DPP-2 的效力 (d)表 V-4NVP-BQS867-NX_2 对人 DPP-8 的效力
(e)表 V-5NVP-BQS867-NX-2 对人 DPP-9 的效力
(f)表 V-6NVP-BQS867-NX-2 对人 FAP 的效力
(g)表 V-7NVP-BQS867-NX_2 对人 PEP 的效力
权利要求
游离形式或可药用酸加成盐形式的式(I A)、(I B)、(X A)、(X B)、(Y A)或(Y B)化合物其中R′表示且R″表示氢、羟基、C1 C7烷氧基、C1 C8 烷酰基氧基或R5R4N CO O ，其中R4和R5独立地是C1 C7烷基或苯基，未取代或被选自C1 C7烷基、C1 C7烷氧基、卤素和三氟甲基的取代基取代，并且其中R4另外地是氢；或者R4和R5一起表示C3 C6亚烷基。FPA00001142720600011.tif,FPA00001142720600012.tif
2.权利要求1的式(IΑ)、(I B)、(Χ A)、(X B)、(Y Α)或(Y B)化合物，其中R"表示氢。
3.权利要求1的化合物，选自 和或在每种情况下其可药用酸加成盐。
4.权利要求1的化合物，其为 或其可药用酸加成盐。
5.药物组合物，包含权利要求1-4任一项的游离形式或可药用酸加成盐形式的化合物 以及至少一种可药用载体或稀释剂。
6.权利要求1-4任一项的化合物或其可药用酸加成盐在制备用于抑制二肽基肽酶-IV 的药物中的用途；或者抑制二肽基肽酶-IV的方法，该方法包括对需要该治疗的哺乳动物施用治疗有效量的 权利要求1-4任一项的化合物或其可药用酸加成盐。
7.权利要求5的药物组合物在制备用于抑制二肽基肽酶-IV的药物中的用途；或者 抑制二肽基肽酶-IV的方法，该方法包括给需要该治疗的哺乳动物施用治疗有效量的权利要求5的药物组合物。
8.权利要求6或权利要求7的用途或者权利要求6或权利要求7的方法，其中所述药 物用于治疗受二肽基肽酶-IV抑制介导的病症。
9.权利要求8的用途，其中所述药物用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病；或者 权利要求8的方法，其中所治疗的病症是非胰岛素依赖型糖尿病。
全文摘要
本发明涉及游离形式或可药用酸加成盐形式的式(I A)、(I B)、(XA)、(X B)、(Y A)或(Y B)化合物，其中R′表示(结构式)，且R″表示氢、羟基、C1-C7烷氧基、C1-C8-烷酰基氧基或R5R4N-CO-O-，其中R4和R5独立地是C1-C7烷基或苯基，未取代或被选自C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、卤素和三氟甲基的取代基取代，并且其中R4另外地是氢；或者R4和R5一起表示C3-C6亚烷基。式(I A)、(I B)、(X A)、(X B)、(Y A)或(Y B)化合物抑制DPP-IV(二肽基肽酶-IV)活性。因此，它们被指示在抑制DPP-IV和治疗受DPP-IV介导的病症如非胰岛素依赖型糖尿病、关节炎、肥胖、骨质疏松症和葡萄糖耐量降低的其它疾病中用作药物。
文档编号A61P3/10GK101918423SQ200880118155
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月30日
发明者M·基特尔曼, U·哈西佩 申请人:诺瓦提斯公司