专利名称：用于图像引导的递送的聚合物药物载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于聚合物囊泡(polymersomes)作为药物载体的图像引导的(image guided)药物递送。更特别地，本发明涉及生物活性试剂如治疗或诊断试剂(以下称为“药 物”)的磁共振成像(MRI)监测的或引导的递送。此外，本发明涉及用于磁共振成像(MRI)的 化学交换依赖性饱和转移(Chemical Exchange-d印endent Saturation Transfer, CEST) 造影剂(contrast agent)，特别地涉及适合用作药物载体的试剂。
背景技术：
主要定位于特定组织中的许多疾病是用全身给予的药物治疗的。标准癌症疗法 的一个公知的实例是全身化疗，由于非期望的生物分布和毒性伴随着对患者的显著的副作 用。这些药物的治疗窗口通常由以下限定，在一个方面，患病组织中最小需要的治疗浓度， 以及在另一个方面，在非靶向的器官例如肝脏、脾脏中的毒性作用。通过例如从纳米载体 (nanocarriers)局部释放细胞抑制剂(cytostatics)的局部治疗保证了与标准疗法相比 更有效的治疗和更大的治疗窗口。如果其他的治疗选择例如手术太过危险，例如对于肝癌 来说常常是这样，则局部化的药物递送同样是重要的。对于心血管疾病(CVD)中的许多适 应症，例如冠状动脉中的动脉粥样硬化，局部化的药物递送还可能成为优选的治疗选择。磁共振成像是通常在医院中用于疾病的诊断的一种重要的诊断技术。MRI容许以 极好的空间分辨率对软组织进行非侵入性的成像。作为其诊断用途的有用的延伸，还提出了 MRI用于生物活性试剂例如治疗或诊断 试剂的递送的监测。即，MRI不仅可用于治疗规划，而且可以用于在图像引导下控制局部药 物递送。这方面的一篇参考文献是Ponce等，J Natl Cancer Inst 2007 ;99 :53_63。其中， 药物，多柔比星(doxorubicin)，容纳在温度敏感的脂质体(liposome)中，所述脂质体在正 常体温是固体并且在稍高几度(41-42°C)熔化。因而，药物释放可以通过施加热量来促成， 因为这将引起脂质体的打开，因此药物释放不再由穿过脂质体壳的扩散(如果有的话)来 决定。为了通过MRI监测药物释放，锰盐被添加到制剂中作为MRI造影剂。几乎所有当前的MRI扫描都是基于本体水分子(bulk watermolecules)的成像， 本体水分子以非常高的浓度在全身所有组织中存在。如果不同的组织之间的对比不足以获 得临床信息，则给予MRI造影剂(CA)，例如钆的低分子量络合物。这些顺磁性络合物降低了 水分子的质子的纵向(T1)和横向驰豫时间(T2)。锰离子也作为T1造影剂。前述的药物载体中的锰造影剂将在它暴露于本体水分子时起作用，这可以通过 MRI检测，即，它将在热量施加之后在高于脂质的熔化转变温度脂质体壳打开时引起瞬时的 MRI对比度增强。如所描述的，在这种药物释放过程中使用的MRI实际上被用于监测实际的释放， 从而确认热敏脂质体实际地起作用。即，它仅仅提供事后的信息。进一步的，前述药物递送是在脂质体作为载体的基础上进行的。脂质体一般地特 征在于包围空腔的脂质双层。本发明是聚合物囊泡(polymersomes)领域，即，聚合物泡囊(polymeric vesicles)，特别是微囊(microvesicles)禾口纳囊(nanovesicles)。在聚合物 囊泡的基础上，与脂质体相比可以实现许多优点。聚合物囊泡被认为不太易于被巨噬细胞 摄取，因而是长循环的。并且，与脂质体相比，聚合物囊泡是更为刚性的，较低动态的(less dynamic)，以及更为多功能的。发明概述从药物载体的给予开始就监测药物载体的情况(fate)将是有利的。为了更好地解决上述期望，在一个方面，提出了用于磁共振成像(MRI)的化学 交换依赖性饱和转移(CEST)造影剂，其包含具有顺磁性试剂的聚合物囊泡，所述聚合物 囊泡包含包围空腔的聚合物壳，其中所述空腔包含质子被分析物群(a pool of proton analytes)，以及其中所述壳允许所述质子被分析物的扩散。在另一个方面，所述聚合物囊泡可以是不包含空腔的纳米颗粒。在另一个方面，提出了适合于局部化药物递送(localized drugdelivery)的药物 载体，其包含用于CEST MRI的造影剂和药物，该造影剂包含聚合物囊泡，特别是环境敏感性 聚合物囊泡。在一个进一步的方面，提出了用于生物活性试剂向对象(subject)的MRI引导的 递送的方法，包括向所述对象给予包含聚合物囊泡、并且是CEST MRI造影剂的药物载体，利 用由所述给予的药物载体所提供的CEST对比度增强来得到MR图像，以及使所述药物载体 释放所述生物活性试剂。发明详细说明广义上，本发明可以关于适合用作局部化药物递送的药物载体的、基于聚合物囊 泡的CEST造影剂来描述。所述用于局部化药物递送的药物载体的适用性可以涉及多种途 径，其中装载有药物的药物载体可以被触发来局部地释放所述药物，例如，通过施加受控的 外力或递送足够量的能量。这例如涉及环境敏感性药物载体，其可以通过环境的改变(例 如，对于PH敏感性载体来说为pH的变化，或对于热敏感性载体来说为施加局部热量)被触 发来局部地释放药物。用于局部化递送的其他方法不必须涉及热敏感性载体或PH敏感性 载体，但是涉及可以通过由热敏感性或PH敏感性之外的性质控制的激活方法而被触发来 释放药物的载体，包括但不限于，气体芯或层的存在，对外部施加的超声频率/波长和强度 敏感。CEST MRI本发明涉及CEST MRI对比度增强。这种方法用于通过利用从选定的磁预饱和的 质子向本体水分子的化学交换依赖性饱和转移(CEST)来产生由MRI所测定的图像对比。与顺磁性化学位移试剂(paramagnetic chemical shift reagent, ParaCEST)结 合的CEST是一种这样的方法，其中CEST造影剂的发生顺磁位移的质子群的磁化通过射频 (RF)辐射的施加而被选择性地饱和。通过质子交换这种饱和度向本体水分子的转移引起 CEST造影剂的环境中可激发的水质子的数量降低。因而，观察到本体水信号强度的降低，其 可以用来产生MRI图像中的(负)对比度增强。获得高CEST效率的一种方法是基于利用含有顺磁性位移试剂(例 如，Na[Tm(dotma) (H2O)])的溶液的大量水分子，其中“H4dotma”代表α，α ‘， α，〃 α “‘-四甲基-1，4，7，19-四乙酸，dotma代表该配体的相应的四重去质子化的四阴离子形式，以提供被化学位移的并因而可以选择性地通过RF脉冲来饱和的质子群。如果 这种系统被包封在载体，在此是聚合物囊泡中，则磁饱和度可以转移到在载体外面的、没有 被化学位移的本体水分子。磁化转移的量和由此对比度增强的程度由水扩散穿过载体的壳 的速率(即，水交换速率)、以及由载体内的水的量来决定。
最佳水交换速率与载体内部的质子群和载体外部的本体水之间的化学位移差直 接相关。在聚合物囊泡内部的水分子上诱导的顺磁位移由两个主要的组分组成由水分 子和位移试剂之间的直接偶极相互作用产生的化学位移(Sdip),和由体磁化率效应(bulk magnetic susceptibilityeffect)引起的化学位移(δ bms)。总体的顺磁位移是这两种组 分的总和δ = δ dip+ δ bms (1)δ bms对于球形颗粒是零，但是它对于各向异性颗粒可以是显著的。非球形颗粒在 磁场中受力，其使得它们按磁力线排列。对于脂质体来说，已经证明，如果它们带有与磷脂 膜相连的顺磁性分子，则总顺磁位移可以进一步提高。关于利用非球形脂质体的CEST的一篇参考文献是Terreno，Ε.等.Angew. Chem. Int. Ed. 46，966-968 (2007)。聚合物囊泡术语“聚合物囊泡”在本文中一般用于表示包含聚合物壳的纳囊或微囊，所述聚合 物壳围起空腔。这些泡囊优选地由嵌段共聚物两亲物组成。这些合成两亲物具有类似于脂 质(lipids)的两亲性(amphiphilicity)。借助于它们的两亲性特性(具有更为亲水的头 部和更为疏水的尾部)，所述嵌段共聚物将自组装成类似于脂质体(liposomes)的头尾和 尾头双层结构(bilayer structure)。与脂质体相比，聚合物囊泡具有大得多的分子量，数均分子量一般为从1000到 100，000，优选从 2500 到 50，000，更优选从 5000 到 25000。术语“更为亲水的”和“更为疏水的”以相对含义使用。即，两者都可以是亲水性 的或疏水性的，只要嵌段之间的极性差异对于形成上述聚合物囊泡是足够的。然而，考虑到 产生其中可以容易地结合水的空腔，优选聚合物的更为亲水性的末端本身是亲水性的。 进一步的，考虑到用作药物载体，希望的是疏水性的药物也可以结合到聚合物囊 泡中。为此，优选的是聚合物的疏水末端本身是疏水性的。嵌段共聚物的两亲性特性优选地以嵌段共聚物的形式实现，所述嵌段共聚物包含 由更为亲水的单体单元(A)制成的嵌段以及由更为疏水的单元(B)制成的嵌段，所述嵌段 共聚物具有通用结构AnBm，η和m是从5到5000的整数，优选10到1000，更优选10到500。 还可想像的是，一个或多个进一步的单元或嵌段被加入进来，例如，具有中间亲水性的单元 C，从而产生具有通用结构AnCpBm的三元共聚物，η和m是如上文所定义，ρ是从5到5000 的整数，优选10到1000，更优选10到500。任何所述嵌段本身都可以是共聚物，即，包含分 别具有需要的亲水性或疏水性特性的不同的单体单元。优选的是，所述嵌段本身是均聚的。 任何嵌段，特别是更为亲水的嵌段，可以带有电荷。电荷的数量和类型可以取决于环境的 ρΗ。在任何所述嵌段上的正电荷和/或负电荷的任何组合都是可行的。考虑到试剂对于医学诊断和治疗的可用性，优选的是聚合物嵌段由药学上可接 受的聚合物制成。关于此点实例是例如，US 2005/0048110中公开的聚合物囊泡，和WO2007/075502中公开的包含热响应性嵌段共聚物的聚合物囊泡。聚合物囊泡材料的进一 步的参考文献包括 W02007081991、WO 2006080849、US 20050003016, US 20050019265 和 US-6835394。可以设想的是，聚合物囊泡样结构可以基于嵌段共聚物，例如嵌段三元共聚物，其 内在地具有形成包围空腔的壳的性质，产生。在本发明中，聚合物囊泡的使用促成了几种优点的产生。对于用作CEST MRI造影剂，壳的聚合物特性导致结合各种期望的单元的可 能性。因而，例如，为了实现提高的对比度增强，聚合物本身可以通过加入金属聚合物 (metallopolymer)单元、具有金属的聚合单元的富集、或这两者来变为顺磁性的。这是指， 例如，通过将含有镧系元素的脂质包括在聚合物囊泡结构中，或通过使用含有镧系元素的 共聚物的富集。关于金属聚合物的一般参考文献是D. Wohrle5A. D. Pomogailo "Metal Complexes and Metals in Macromolecules"Wiley-VCH :ffeinheim,2003 禾口 R.D.Archer “Inorganic and Organometallic Polymers，，Wiley-VCH :New York,2001。优 选地，所述金属聚合物包含一种类型或不同类型的、具有高磁矩的顺磁性金属离子，例如镧 系元素离子。特别适合的镧系元素有，例如，钆、铽、镝、钬、铒、铥和镱。关于含有镧系元素 的金属聚合物的一篇参考文献是 M. J. Allen, R. Τ. Raines, L. L. Kiessling，Journal of the American Chemical Society 2006，128，6534-6535。金属离子可以是聚合物主链的一部 分，或其可以经由连接体(linker)连接到聚合物链，所述连接体将聚合物链连接到包封所 述金属的配体。适合的包封配体的一篇参考文献是P. Caravan, J. J. Ellison, Τ. J. McMurry, R. B. Lauffer, Chemical Reviews 1999,99,2293-23520CEST效应可以通过共聚物的嵌段的性质和/或聚合物层的厚度来调节，因为这些 参数影响跨膜的水交换速率；例如，聚合物的两亲性特性可以用来影响穿过所述聚合物囊 泡的质子交换速率。这一般可以通过改变更为亲水的嵌段和更为疏水的嵌段的长度的比来 进行。与常规的脂质体相比，聚合物囊泡被认为具有长循环的优点，因为它们不易于发生巨 噬细胞摄取(uptake)。根据本发明，在CEST MRI造影剂中聚合物囊泡的使用进一步导致如果所述造影剂 用作药物载体而可以具体地阐明的优点。例如，借助于聚合物囊泡结构的极好的多功能性， 可以选择将药物和顺磁性试剂加入聚合物囊泡空腔中(并因而具有相同的药物和顺磁性 试剂的分布)，或者可以选择分离这两者，产生所述药物和试剂的不同分布，例如如果药物 被包括在空腔中，而顺磁性试剂被包括在聚合物壳中。或者，例如，通过在空腔中提供亲水 性药物，和在壳中提供疏水性药物可以具有药物组合。聚合物囊泡是半透性的(semipermeable)。一般地，这是指壳的性质是选择性地 可透过的，有时也表示为半透性的，或者部分可透过的或差异性地可透过的。它表明一种结 构，其在它不是完全开放的壁、并优选主要是闭合的壁的意义上基本上是闭合的，(在这种 情况下，是包围空腔的壳)，其容许某些分子或离子通过扩散穿过它。如果选择聚合物使之是生物可降解的、环境敏感的，或两者都符合，则可以有益地 使用聚合物囊泡的多功能性，即，选择共聚合嵌段的确切化学结构的一般自由度。以下将参 考用作药物载体的特别优点解释这一点。本发明明智地组合了在药物递送中利用CEST MR造影剂的优点和聚合物囊泡的理
6想性质。与脂质体相比，聚合物囊泡是化学上更为稳定的，较少渗漏的，较低倾向于干扰生 物膜，以及由于它们更低的临界聚集浓度是较低动态的。这些性质导致更低的调理素作用 (opsonisation)和更长的循环时间。含有聚乙二醇_聚乳酸的可水解的二嵌段共聚物的聚合物囊泡已经用作多柔比 星的递送系统，参见，例如，Ahmed，F. ；Discher, D. E. Journal of Controlled Release 2004,96, (1)，37-53。来自加载多柔比星的聚合物囊泡的多柔比星的释放可以通过pH触 发。参见 Ahmed 等.，Molecular Pharmac eutics 2006，3，(3)，340-350。聚合物囊泡的体 内稳定性可以按需要为特定的应用调节。虽然药物递送过程可以被外部诱导，但是在本发明之前所应用的方法中，药物递 送过程本身不能被成像，这导致治疗介入的不充分的总体控制。例如，装载了基于卟啉的荧 光团的聚合物囊泡可以用作NIR发射探针用于大鼠中的体内光学成像。参见Ghoroghchian 等.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 2005,102， (8)，2922-2927。然而，光学成像的一个主要缺点是光的有限的穿透深度，这在当前阻碍了光学成 像从动物向人类的转移。本发明中使用的CEST对比度增强非常适合于进行人类体内MR成像。本发明的试剂非常适合于在药物释放之前加载有生物活性化合物的聚合物囊泡 的空间分布的分析。此外，CEST MR信号的强度与释放的药物的量成比例，其容许在体内定 量控制递送的药物剂量。在患病的位点处来自聚合物囊泡的药物释放可以通过刺激(例 如，利用RF或超声波的局部加热，pH，(生物可降解的)聚合物链的(酶促)水解(由于对 那些具有响应性的二嵌段共聚物的加入))来触发。本发明的其他优点包括，对比度增强可以随意打开和关闭。此外，CEST效应可以 通过共聚物的(生物可降解的)嵌段的性质和/或聚合物层的厚度来调节，因为这些参数 影响跨膜的水交换速率。在两种质子群，即聚合物囊泡内的群和在其周围环境中的群之间 的化学位移差异，可以通过前述的在聚合物双层内加入顺磁性化合物，例如含有镧系元素 的脂质或含有镧系元素的共聚物，来放大。与脂质体不同，聚合物囊泡提供了另外的优点， 它们容许加入良好限定的金属聚合物或富金属的聚合物，而不是每个两亲性分子单个顺磁 性络合物。这是高度有益的，因为在捕获水和本体水之间的化学位移差异与顺磁性化合物 的量成比例。这些各种优点都有助于基于聚合物囊泡作为CEST造影剂的本发明所提供的图像 引导的治疗和分子MR成像的机遇。对于聚合物囊泡和其制造的进一步的背景，参考Antonietti等.，Adv. Mater.2003，15，No. 16 禾口 Soo 等· ，J. Pol. Sci. Part B =Polymer Physics, Vol. 42， 923-938(2004)。药物载体药物载体将被引入到要经历MRI的人的身体中。这将例如通过注射到血流中，或 通过其他方法将载体弓I入体液中实现。药物是用于疾病或病症的治疗、治愈、预防或诊断，或另外用于增强身体或精神良好状态的化学物质。本发明预见的所述经引导的递送将主要用于治疗试剂(即，严格意义 上的药物，目的是用于疾病或病症的治疗或预防)，但是对于为诊断目的给予的试剂也是有 用的。虽然其他生物活性试剂，即不是治疗性或诊断性的那些，例如功能性食品成分，一般 将不进行经引导和/或经监测的递送，但是如果希望，这可以利用本发明来进行。本发明的最佳用途是在靶向治疗剂(即，意图靶向递送的药物)的情况下获得的， 因为这样的递送本性上将最受益于由本发明所实现的监测。例如，这涉及在肿瘤的治疗中 要定点递送的试剂，涉及在心血管疾病例如冠状动脉中的动脉粥样硬化的治疗或预防中的 试剂，或涉及抗血栓形成试剂(例如，用于局部溶解血布(blood cloths))或需要穿越血脑 屏障的试剂如神经调节剂，这可以用于神经病症，例如癫痫症、阿尔茨海默氏病、帕金森病 或中风的治疗。来自靶向的药物递送的引导和监测的益处也可以应用于靶向的诊断试剂。 与靶向的治疗剂类似，在这方面癌症也是位点特异性递送可具有重要性的领域。适合用于本发明的生物活性试剂包括生物学活性试剂，包含治疗药物、内源分子， 和药理学活性试剂，包含抗体；营养分子；诊断试剂；和用于成像的其他造影剂。如在本文 中使用的，活性试剂包括活性试剂的药理学上可接受的盐。本发明的基于聚合物囊泡的药物载体可以包含亲水性或疏水性的生物活性试剂。 亲水性生物活性试剂可以包封在所述载体的含水室中，或者其可以与颗粒壳的更为亲水的 部分结合，或者其分布可以涉及这些选择的组合，而疏水性的生物活性试剂可以加入到载 体的疏水性区域中，例如在聚合物囊泡的壳中。核酸、碳水化物和一般地蛋白质和肽是水溶 性的或亲水性的。例如，还设想了作为小分子、脂质、脂多糖、多核苷酸和反义核苷酸(基因 治疗试剂)的生物活性试剂。因而可以加入的这种生物学活性试剂包括非肽、非蛋白质药 物。在本发明的范围内可以加入聚合性质的药物，但是也可以加入具有低于1500g/mol、或 甚至低于500g/mol的相对小的分子量的药物。因此，在本发明的情境中设想用作生物活性试剂的化合物包括具有治疗或预防效 果的任何化合物。它可以是影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的化合物，能够引起 生物学作用例如免疫反应的化合物，或可以在一种或更多种生物过程中起到任何其他作用 的化合物。相对小的肽可以通过氨基酸的数目来命名(例如，二肽、三肽、四肽)。具有相对小 数量的酰胺键的肽还可以称为寡肽(最多50个氨基酸)，而具有相对高数量(超过50个氨 基酸)的肽可以称为多肽或蛋白质。除了作为氨基酸残基的聚合物之外，某些蛋白质可能 进一步特征在于所谓的四级结构，一种不一定通过酰胺键化学连接、而是通过本领域技术 人员一般已知的力例如静电力和范德华力结合的许多多肽的簇合物(conglomerate)。在此 使用的术语肽、蛋白质或其混合物将包括所有以上提及的可能性。通常，在其生物学活性的基础上选择蛋白质和/或肽。取决于所选的聚合物的类 型，可通过本发明的过程获得的产品高度适合于蛋白质和肽的控制释放。在一个特定的实 施方式中，所述蛋白质或肽是生长因子。可以有益地包含在加载的聚合物中的肽或蛋白质或包含肽或蛋白质的实体 (entities)的其他实例包括但不限于免疫原性(immunogenic)肽或免疫原性蛋白质。除了水溶性的生物活性试剂之外，还可以加入其他水溶性的化合物，例如，抗氧化 剂、离子、螯合剂、染料、成像化合物。
优选的治疗试剂处在癌症(例如，抗肿瘤)和心血管疾病领域。制备适合于纳米颗粒或聚合物囊泡制剂的亲脂性药物衍生物的方法是本领域已 知的(参见，例如，描述治疗试剂向磷脂的脂肪酸链的共价连接的US 5，534，499)。本发明 中的药物还可以是前体药物。药物可以存在于所述载体的室的内部、外部、或内部与外部中，例如在聚合物囊泡 的空腔中和/或壳中。药物的分布与包含在药物载体中的任何其他试剂如顺磁性化学位移 试剂或顺磁性试剂的分布无关。可以使用药物的组合，并且任何这些药物都可以存在于药 物载体的所述室的内部、外部或内部与外部，例如在聚合物囊泡的空腔中和/或壳中。环境敏感件载体这是指例如具有聚合物壳的聚合物囊泡，其中所述壳的完整性可以被外界的作 用，例如热量、PH影响，包含气体芯和/或气体层的聚合物囊泡，对外部施加的超声频率/波 长和强度敏感的聚合物囊泡。这样的聚合物囊泡可以通过施加合适的环境条件在希望的时 间和地点被触发来释放药物(其释放可以借助CEST效应来监测)。此外，这可以用于在身 体中的内在地具有所述合适的条件的部位释放药物或诊断试剂(并监测释放)。作为这种 条件的一个实例，提到的是肿瘤细胞中通常降低的PH。环境敏感性还可以是指生物可降解的聚合物。这可以用于例如产生CEST MRI造 影剂和特别是基于其的药物载体，其在人体中存在的环境下具有预定的寿命。在它们的寿 命结尾，它们将降解并作为结果，CEST效应消失并因而将不出现(从而容许间接确定药物 载体的降解)。本发明优选地提供热敏感性的载体。这意味着所述载体的物理或化学状态取决于 它的温度。可以使用任何热敏感性载体，其中所述载体可以包裹感兴趣的分子并且在身体温 度(即，37°C)是完整的，但是在对象可以忍受的任何其他的非身体温度被破坏。本发明的 载体包括但不限于热敏感性微米颗粒和纳米颗粒、热敏感性聚合物囊泡、热敏感性纳囊和 热敏感性纳米球，都基于聚合物。热敏感性纳囊一般具有最多IOOnm的直径。在本发明的情境中，大于IOOnm的、典 型地高达5000nm的泡囊被认为是微囊。词语泡囊描述了任何类型的微囊或纳囊。热敏感 性纳米球包括但不限于不小于5纳米的球。纳米球一般不合有空腔，即，在本发明的这个实 施方式中，CEST效应应该完全通过被包含在纳米球中的顺磁性化学位移试剂本身的化学位 移的质子来实现。这对于定位纳米球是有用的。对于监测药物释放，将优选使用其CEST效 应受到药物释放影响的载体。因此，包含空腔的聚合物囊泡是优选的。热敏感性聚合物囊泡包括具有延长的半衰期的那些，例如，聚乙二醇化的聚合物 囊泡。在本说明书中，壳的半透性一般是指它容许MR被分析物通过扩散穿过它的能力。 因此，被分析物(例如，水，或其他包含质子的小分子)与壳(例如，两亲性聚合物双层)的 组合是使得所述被分析物能够通过扩散穿过所述壳，而其他分子，例如化学位移试剂或亲 水性药物不能穿过所述膜。关于具有半透性壳的环境敏感性载体的参考文献是例如US6，726，925、US 2006/0057192、US 2007/0077230A 1 和 JP 2006-306794。特别地进一步参考 Ahmed，F. ；Discher, D.E.Journal of ControlledRelease 2004,96, (1),37-53 ；Ahmed, F.； Pakunlu, R. I. ；Srinivas, G. ；Brannan, A. ；Bates, F. ；Klein, Μ. L. ；Minko, Τ. ；Discher, D.Ε. Molecular Pharmaceutics 2006,3, (3),340-350 ；禾口 Ghoroghchian, P. P. ；Frail, P. R. ；Susumu, K. ；Blessington, D. ；Brannan, Α. K. ；Bates, F. S. ；Chance, B. ；Hammer, D. Α. ；Therien, Μ.J.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 2005，102，(8)，2922-2927。基于本发明的描述，对这些公开物的参考 将使得本领域的技术人员能够利用环境敏感性聚合物囊泡执行CEST对比度增强。用于本发明的热敏感性聚合物囊泡在约37°C即人体温度理想地保持它们的结 构，但是在较高的温度，优选仅稍微升高高于人体温度，并且优选还高于热病身体温度 (pyrexic body temperature)，被破坏。一般地，约42°C是用于热诱导的(局部)药物递送 的高度有用的温度。热量可以以任何生理上可接受的方式施加，优选通过利用能够诱导高 度局部化的高热(hyperthermia)的聚焦的能量源。能量可以通过，例如，微波、超声波、磁 感应、红外线或光能来提供。也可以使用本领域中的任何常规方法进行本发明的聚合物囊泡内的药物或其他 生物活性试剂的夹带。在制备本发明的聚合物囊泡组合物时，可以使用稳定剂例如抗氧化 剂和其他添加剂，只要它们不干扰本发明的目的。实例包括N-异丙基丙烯酰胺的共聚物 (Bioconjug. Chem. 10 :412_8 (1999))。基于包围空腔的半透性壳的聚合物囊泡和其他潜在的载体一般将是球形的。对于 在本发明中使用，优选的是使这样的球形载体变为非球形的。例如，对于聚合物囊泡来说， 这通过使所述聚合物囊泡经历相对于高渗缓冲溶液，即与处在聚合物囊泡的内部的溶液相 比具有更高渗透压的缓冲溶液，的渗析过程来进行。这种渗析引起水从聚合物囊泡的内部 向本体溶液(bulk solution)的净扩散。这降低了聚合物囊泡的总内体积。因为聚合物囊 泡的表面积保持恒定，所以体积减少迫使聚合物囊泡变形并呈现非球形形状，例如，碟形、 雪茄形，或任何其他非球形形状。顺磁性化学位移试剂在本发明中，顺磁性位移试剂可以以任何方式包含在载体中或载体上。优选的是 通过在载体的空腔中包含位移试剂和质子群两者，使所述位移试剂与质子群发生充分的相 互作用。所述一种或多种顺磁性化学位移试剂基本上可以是任何顺磁性试剂，其适合于使 含有它的溶液或分散体的相对大数量的水分子，相对于周围的本体水分子的质子，成为关 于它们的MR共振频率发生化学位移的质子群。由于聚合物囊泡包含从根本上容许质子与 它们的直接环境交换的壳，所以由选择性的RF脉冲所产生的饱和度将转移到加载的热敏 感性药物载体的环境。因而，在进行磁共振成像时，热敏感性药物载体的直接环境将显示与 其他本体水分子相比降低的信号强度，并由于降低的信号强度因而容许检测造影剂的直接 环境。顺磁性化学位移试剂将包含顺磁性化合物，即具有顺磁性性质的任何化合物。优选 地，所述顺磁性化合物包含顺磁性金属离子，即，通过螯合配体络合的金属离子。顺磁性金 属离子是本领域技术人员已知的，不需要在此进行说明。例如，前和后过渡金属，明确地包 括铬、锰、铁，以及镧系元素，例如，钆、铕、镝、钬、铒、铥、镱。所述顺磁性的化学位移试剂将包含螯合结构，其能够强烈地结合到顺磁性金属并容许所述金属与水或与其他适合的质子源发生相互作用。对于适合的螯合结构，参考 P. Caravan等·，Chem. Rev.，99，2293-2352 (1999)。优选地，水至少短暂地与顺磁性试剂的 金属配位。对于顺磁位移机理，参考 J. A. Peters 等· ,Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectr.，28， 283-350(1999)。在一个实施方式中，螯合结构本身还包含可交换的质子，例如，羟基、胺或 酰胺质子。合适地，所述顺磁性化学位移试剂包含与螯合结构配位的镧系元素离子，例如， 衍生自1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10四乙酸(H4dota)、1，4，7，10-四氮杂环十二 烷-α，α，，α”，α ”，-四甲基_1，4，7，10-四乙酸(H4dotma)和容许顺磁性试剂中轴 向配位的水分子的相关配体的大环镧系元素(III)螯合物。在这点上，参考Aime等.， Angew. Chem. Int. Ed.，44，5513-5515 (2005)。许多相同的、相似的或不同的螯合单元可以 组合在树枝状的或聚合的结构中，提供树枝状的或聚合的化学位移试剂。利用树枝状的 或聚合的顺磁性化合物的一个一般优点是可以实现顺磁性金属络合物的高有效浓度，而 不会使溶液的渗透压提高到使用单核顺磁性化合物的情况那样高。在此参考E. Terreno, A. Barge, L. Beltrami, G.Cravotto，D.D.Castelli，F.Fedeli, B.Jebasingh，S.Aime, ChemicalCommunications,2008，600-602。优选地，所述顺磁性化学位移试剂是水溶性的。适合的化学位移试剂是本领域的 技术人员已知的。CEST造影剂不需要任何特定的化学位移试剂，只要所述位移试剂和质子 群具有足够的相互作用来产生发生化学位移的质子群。优选地，所述顺磁性位移试剂是包含金属离子和基于多齿螯合配体的配体的金属 络合物。更优选地，所述化学位移试剂与质子群的相互作用是以配位的形式提供。因而，优 选的是，所述金属络合物的所述金属的至少一个配位位点保持空缺，以用于与至少一个水 分子的配位。适合的水溶性化学位移试剂的实例是[Ln (hpdo3a) (H2O) ] (1)、[Ln (dota) (H2O) Γ (2)、[Ln (dotma) (H2O) Γ (3)、[Ln (dotam) (H2O)]3+(4)禾Π [Ln(dtpa) (H2O) (5)，包括 其衍生物和相关的化合物，Ln是镧系元素离子。优选地，所述顺磁性化学位移试剂是镧系元素络合物，例如以下的式1-5 其中所述镧系元素是Eu3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、yb3+,优选是 Tm3+ 或 Dy3+。所述顺磁性化学位移试剂一般以ImM到2000mM、优选IOmM到lOOOmM、更优选50mM 到200mM的量包含在试剂中。上述含金属化合物可以溶解、乳化、悬浮在所述空腔或以任何其他形式均勻或非 均勻分布在所述空腔，即聚合物囊泡的内室中。做为选择，其可以通过至少一个共价键或非 共价键、或它们的任何组合连接到所述聚合物囊泡的外室。此外，相同的或至少一种不同的 含金属化合物可以同时地存在于任何所述室中。可以设想的是，如果药物本身包含合适的金属，则顺磁性试剂和所述药物是同一 种物质。另外的对比度增强试剂 本发明的造影剂可以包含T1、T2或T/降低试剂。在这点上，参考Aime等.，Journal of the American Chemical Society，2007，129，2430-2431。这样，T” T2 或 T2* 与 CEST 造 影剂实现了一体化(all-in-one)构思。 热敏感性药物载体的内部和本体水质子之间的化学位移差异可以通过给所述热 敏感性药物载体的膜提供另外的顺磁性试剂来进一步提高，所述另外的顺磁性试剂不必是 化学位移试剂。因而，非球形载体在磁场中的取向受到影响，前述体磁化率效应被增强。所 述另外的顺磁性试剂优选是两亲性化合物，其包含镧系元素络合物(在两亲化合物的更为 极性的一侧)，并具有非极性尾部，该尾部基于疏水分子相互作用具有优先地结合到热敏感性药物载体表面的脂质双层中并与之对齐的倾向。例如，这些两亲性顺磁性络合物可以是 聚合物囊泡壳的聚合性质产生了以下可能性，即聚合物本身可以通过加入金属聚 合物单元、具有金属的聚合单元的富集、或这两者而变为顺磁性的。这是指，例如，如前文阐 述的通过将基于镧系元素的脂质包括在聚合物囊泡结构中，或通过使用基于镧系元素的共 聚物的富集。
在可选的与膜相关的顺磁性试剂中的镧系元素离子可以与造影剂的空腔内的镧 系元素相同或不同。
如根据本发明提供的，所述顺磁性的化学位移试剂可以被包封在热敏感性药物载 体中。这样，产生了水质子群，其与围绕所述载体的本体水相比具有不同的化学位移。这些 发生化学位移的水质子的磁共振可以用具有足够窄的带宽的RF脉冲来饱和。由于在造影 剂内部的水分子与围绕所述造影剂的本体水分子快速地交换，所以这种饱和度被转移到所 述本体水。因此，当在实践中使用时，在基于热敏感性药物载体的CEST造影剂的位置处， 周围的水(g卩，在优选的体内使用中体液)将在CEST增强的MR图像中作为低强度 (hypointense)区域是可见的。对于CEST增强的MRI，我们是指常规的MRI，其中，在激发之 前，可交换的水共振已经被选择性地饱和。用于饱和的RF脉冲一般具有几赫兹到几百赫兹 的带宽。所述脉冲的合适频率通常是从模型或临床前的CEST-MRI研究先验(a priori)已 知的，但也可以在实际的临床MRI检查期间优化。因而，本发明的载体在所述载体被打开之前的任何时间点是通过MRI可检测的。 如果他们另外包含T1或T2造影剂，则还可检测载体打开时的药物释放步骤(只要壳是闭合 的并且饱和质子的交换可以通过扩散发生，那么CEST对比度增强就将发挥作用，T1或1~2对 比度增强将在使这些造影剂能与本体水(即，体液，当所述试剂通过所述壳的打开被释放 时)发生相互作用时显示其作用)。根据本发明的CEST造影剂可以以多种方式使用。它们可以用于在任何含水环境 中产生期望水平的MRI对比。它的主要用途，其也是使用热敏感性药物载体的益处体现地 最好的情况，是在体内应用时产生局部MRI对比。这可以是通过以下方式进行引入所述造 影剂，例如，通过注射到生物优选人类的血液或另一种体液中，并进行所述生物的完整或部 分身体的CEST对比度增强的MRI扫描。所产生的本体水分子的CEST对比度增强，容许位 点例如肿瘤(在此处规则的体液存在被扰动)的可视化。并且，本发明的造影剂在它们的 脂质壳中可以提供有疾病特异性分子探针，例如，通过具有拥有适合于插入载体的表面中 的疏水性尾部的化合物(例如，对于磷脂表面来说)，其中所述化合物的另一端含有希望的 配体(即，用于靶向结合的生化配体)。这容许所述造影剂优先地位于期望的或怀疑的身体位点，其然后通过MRI可以变 为可见的。这增加了本发明的药物载体用于局部化递送的适用性。本发明的CEST造影剂优选地在载体内的质子群的基础上起作用，其与所述载体 外的液体交换。这种交换可以通过水-质子传递进行，但也可以通过来自其他小到足以穿 过聚合物囊泡的壳的分子的质子传递来进行。总之，上文中描述的是用于磁共振成像(MRI)的化学交换依赖性饱和转移(CEST) 造影剂，其包含具有顺磁性试剂的聚合物囊泡。所述聚合物囊泡优选地包含包围空腔的聚 合物壳，其中所述空腔包含质子被分析物群，和其中所述壳容许所述质子被分析物的扩散。 所述基于聚合物囊泡的CEST MRI造影剂适合作为在MRI引导的药物释放中有用的药物载 体。将要理解的是，本发明不限于上文描述的实施方式和化学式。还将要理解的是，在 权利要求中，词语“包含(包括，含有)”不排除其他的要素或步骤。当涉及单数名词使用不定冠词或定冠词例如“a”、或“an”、“the”时，这包括该名词的复数，除非特别有其它声明。将参考以下的非限制性实施例和非限制性附图来说明本发明。
实施例在实施例中使用的缩写，在上文中未使用的范围内PBD是聚(丁二烯)，ΡΕ0是聚 (环氧乙烷)，HEPES是(4-(2-羟乙基)-1_哌嗪乙磺酸)。通过与后续挤出结合的薄膜水合技术来形成具有100-150nm平均直径的聚合物 泡囊。简言之，将Mn(g/mol) =PBD (2500) -b-PEO(1300),PD = 1. 04 和 fEQ = 0. 34 的聚(丁二 烯(1，2_加成)-b-环氧乙烷)溶于CHCl3中。在减压下温和地移除溶剂，获得薄聚合物膜。 该膜在含有65mM[Tm(hpdo3a) (H2O)]和5mM羧基荧光素的20mM HEPES溶液中水合。在50°C 超声处理30分钟，之后进行在真空度下的使用-177°C的液氮和50°C的水浴的三个冻融循 环，获得聚合物泡囊的单分散分布。随后，分散体通过具有1 μ m、0. 4 μ m、0. 2 μ m和0. 1 μ m 孔直径的聚碳酸酯过滤器挤出几次。聚合物囊泡的平均半径通过动态光散射来测量。嵌段 共聚物泡囊的形状用低温透射电子显微镜来研究。获得的聚合物囊泡在4°C渗析过夜来除 去在脂质膜的水合后未捕获的羧基荧光素和[Tm(hpdo3a) (H2O)]。渗析相对于具有高离子 强度的缓冲液(含有0. 3MNaCl的20mM HEPES缓冲液)来进行。作为饱和频率偏移的函数 (附图3)、作为饱和RF功率的函数(附图4)、作为时间的函数(附图5)以及作为Triton X-100浓度的函数(附图6)，研究了在内部具有[Tm(hpd03a) (H2O)]的聚合物囊泡的CEST 效应。为了这些目的，用0. 5mL的聚合物囊泡制剂填充5mm玻璃NMR管。所有CEST-MR数 据在Bruker Avance 300NMR波谱仪上在7特斯拉记录，对于可交换质子共振的选择性预饱 和使用标准连续波照射(2秒脉冲持续时间；等幅)。典型地，在以水共振频率为中心的不同 预饱和偏移频率值(100Hz间隔直到1000Hz，然后200Hz间隔直到4000Hz，然后400Hz间隔 直到10000Hz，以及600Hz间隔指直到20200Hz)获得117个单独的一维1H-MR谱，并保存在 单个2D NMR数据集中。为了重建Z-谱，在2D数据集中的每个单独的谱的水信号被积分， 并作为预饱和偏移频率的函数来标绘。由所述Z-谱，利用方程式1和2确定CEST效应CEST 效应=(M0-Ms)/M00 X 100% (方程式 1)CEST 效应=(M0-Ms) /M0 X 100% (方程式 2)在此，Ms是在特定的偏移频率(例如，造影剂的可交换质子共振频率)施加的RF 饱和脉冲之后的本体水强度。Mtl是参考实验的本体水强度，在参考实验中RF饱和脉冲在本 体水信号的相对侧对称地施加以校正非选择性饱和度，例如，直接水饱和。M00是在无穷大的 偏移频率(-200kHz)下的本体水强度。附图附
图1是基于聚合物囊泡的CEST MRI造影剂的示意图。顺磁性化学位移试剂例 如[Tm(hpd03a) (H2O)]的封装，提供了发生化学位移的并且因而可通过RF脉冲选择性地被 饱和的质子群(附图la)。磁饱和可以转移到在聚合物囊泡外部的本体水分子，因此对比 度增强的程度由水扩散通过聚合物双层的速率以及由聚合物囊泡的内腔中水的量来决定 (附图lb)。附图2是用于图像引导的药物递送的聚合物囊泡的示意图。亲水性药物和成像试 剂被包封在含水室中。疏水性的药物被结合到聚合物双层的疏水性区域中。
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附图3示出了在310K和7T，在应用不同的预饱和功率水平之后，在缓冲溶液(20mM HEPES, pH 7. 4)中装载有65mM[Tm(hpdo3a) (H2O)]的聚合物囊泡的Z-谱(左侧)。CEST 效应对功率水平(右侧)。聚合物囊泡的内腔中的水与本体水分子的化学交换效应可以从 (M0-Ms)/1^*100% (方程式1)来估算，其中Ms是在聚合物囊泡的内部的水饱和之后水质 子信号的大小，M0是在相对的频率偏移在对照照射之下本体水质子信号的强度，以及M00是 在-200kHz的偏移频率在饱和之后水质子信号的大小。附图4显示了在310K和7T作为功率水平的函数的、装载有[Tm(hpd03a) (H2O)]的 聚合物囊泡的CEST效应。在聚合物囊泡的内腔中的水与本体水分子之间的化学交换效应 可以从(Mtl-MsVM00 X 100% (方程式1)和(Mtl-Ms)/MtlX 100% (方程式2)来估算，其中Ms 是在聚合物囊泡的内部的水饱和之后水质子信号的大小，M0是在相对的频 率偏移在对照照 射之下本体水质子信号的强度，以及M00是在-200kHz的偏移频率在饱和之后水质子信号的 大小。与附图 3 比较；44dB 9. 6E-6T ；48dB 6. 4E-6T ；52dB 1. 2E-6T。附图5显示了在323K和44dB的功率水平基于聚合物囊泡的CESTMRI造影剂的 CEST效应。CEST效应(根据方程式1)对偏移频率(左侧)。作为时间的函数的最大CEST 效应(右侧)。附图6显示了在323K在存在Triton X-100的情况下装载有[Tm(hpdo3a) (H2O)] 的聚合物囊泡的CEST效应。在移向更高浓度的Triton X-100时，CEST效应降低，表明 [Tm(hpdo3a) (H2O)]从聚合物囊泡的释放。此外，发生化学位移的聚合物囊泡内水的偏移频 率作为Triton X-100浓度的函数发生降低(右侧)。附图7显示了在不同的温度在缓冲溶液(20mM HEPES，0. 3NNaCl, pH 7. 4)中装载 有5mM羧基荧光素和65mM[Tm(hpd03a) (H2O)]的聚合物囊泡的归一化的荧光强度(λ ex = 488nm和λ em = 512nm)。在20°C，随着时间归一化的荧光强度是恒定的，并且观察到荧光 的自猝灭。在添加Triton X-100后(1240分钟后)，荧光探针被从聚合物囊泡释放并稀释 在周围介质中，荧光强度提高，从而没有观察到羧基荧光素的自猝灭。在更高的温度，荧光 的强度随着时间增加，在50°C在大约6小时后检测到荧光信号的饱和。虽然信号在50°C看 起来是饱和了，但是添加Triton X-100引起了荧光的额外提高。
权利要求
用于磁共振成像(MRI)的化学交换依赖性饱和转移(CEST)造影剂，其包含具有顺磁性试剂的聚合物囊泡。
2.根据权利要求1的造影剂，其中所述聚合物囊泡包含包围空腔的聚合物壳，其中所 述空腔包含质子被分析物群，和其中所述壳容许所述质子被分析物的扩散。
3.根据权利要求2的造影剂，其中所述空腔包含顺磁性化学位移试剂。
4.根据权利要求2或3的用于CESTMRI的造影剂，其中所述聚合物壳包含两亲性聚合 物的双层。
5.根据前述权利要求任一项的用于CESTMRI的造影剂，其具有非球形形状。
6.根据权利要求2-5任一项的用于CESTMRI的造影剂，其中所述质子被分析物群包含水。
7.根据前述权利要求任一项的用于CESTMRI的造影剂，其包含金属络合物作为顺磁 性化学位移试剂，所述金属络合物具有金属离子和基于多齿螯合配体的配体。
8.根据权利要求7的用于CESTMRI的造影剂，其中所述金属络合物的所述金属的至少 一个配位位点保持空缺以用于至少一个水分子的配位。
9.根据前述权利要求任一项的用于CESTMRI的造影剂，其在它的外表面中或在它的 外表面处包含顺磁性试剂。
10.根据前述权利要求任一项的用于CESTMRI的造影剂，其中所述聚合物壳包含选自 金属聚合物单元、金属富集单元和其混合物的多个含金属单元。
11.根据权利要求2-10任一项的用于CESTMRI的造影剂，其中所述聚合物壳是环境敏 感性的。
12.适合于局部化药物递送的药物载体，其包含根据权利要求11的用于CESTMRI的造 影剂和药物。
13.用于MRI引导的生物活性试剂向对象的递送的方法，包括向所述对象给予根据权 利要求12的药物载体，利用由所述给予的药物载体提供的CEST对比度增强来显现MR图 像，以及容许所述药物载体释放所述生物活性试剂。
14.根据权利要求1-11任一项的CESTMRI造影剂作为药物载体的用途。
15.根据权利要求14的用途，其中所述聚合物囊泡具有非球形的形状，并且不包含与 所述被分析物实质上相互作用的顺磁性位移试剂。
全文摘要
描述的是用于磁共振成像(MRI)的化学交换依赖性饱和转移(CEST)造影剂，其包含具有顺磁性试剂的聚合物囊泡。所述聚合物囊泡优选地包含包围空腔的聚合物壳，其中所述空腔包含质子被分析物群，和其中所述壳容许所述质子被分析物的扩散。所述基于聚合物囊泡的CESTMRI造影剂适合作为在MRI引导的药物释放中有用的药物载体。
文档编号A61K49/18GK101888857SQ200880119640
公开日2010年11月17日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月7日
发明者D·伯丁斯基, H·格鲁尔, J·A·皮克马特, L·L·P·梅萨格, S·兰格赖斯 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司