经热处理的菌苗,及由这些经热处理的菌苗制备的乳剂疫苗的制作方法

专利名称：经热处理的菌苗,及由这些经热处理的菌苗制备的乳剂疫苗的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及疫苗领域，且涉及稳定乳剂疫苗的方法。具体而言，本发明涉及经 热处理的菌苗，生产经热处理的菌苗的方法及由这些经热处理的菌苗制备的猪乳剂疫苗。
背景技术：
疫苗接种越来越多地用于控制动物中的传染性疾病。佐剂常常用在疫苗里，因为 其能增加对抗原的体液和/或细胞免疫应答。疫苗经常配制为乳剂，因为乳剂能起到佐剂 的作用且具有将抗原作为储库(Cbpot)保留于注射位点的属性。乳化剂通常用于乳剂疫苗 中。除了使用乳化剂之外，乳剂疫苗的稳定性还能通过使用机械方式减少乳剂微滴大小而 达到。美国专利号5，084，269涉及佐剂制剂，其含有与矿物油组合的卵磷脂，其在宿主 动物内产生较少刺激，同时诱导增加的系统性免疫。根据美国专利5，084，269的组合物以 商标名AMPHIGEN (辉瑞公司的商标)商用。通常地，细菌抗原在加热时不稳定，甚至短时暴露于升高的温度能减少抗原的活 性。例如目前的炭疽疫苗在37°C下48小时会丧失所有生物学活性(S. Sing，N. Ahuja, V. Chauhan, Ε. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat,禾口 R. Bhatnagar ；Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6 ；295 (5) 1058-62)。发明概述本发明涉及经热处理的菌苗，生产经热处理的菌苗的方法及由这些经热处理的菌 苗制备的猪乳剂疫苗。该方法包括加热菌苗至大约35-大约80°C的温度以形成经热处理的 菌素。发明详述定义可接受抗原性活性_术语“可接受抗原性活性”指的是受到攻击之后或由通过使 用同源的活生物体的编码效力测试(codifiedpotency test)在疫苗接种的动物中诱导保 护性免疫应答的能力。菌苗-术语“菌苗”指的是可用作疫苗组分的灭活的细菌悬液。乳化剂-术语“乳化剂”指的是用于制造更稳定的乳剂的物质。乳剂-术语“乳剂”指的是两种不相混液体的组合物，其中一种液体的小滴悬于另 一种液体的连续相中。经热处理的菌苗_术语“经热处理的菌苗”指的是经过经经热处理的菌苗，其具有 的脂酶活性是热处理之前脂酶活性的50%或更低，且具有可接受抗原性活性。反相乳剂_术语“反相乳剂”指的是油包水乳剂。脂酶-术语“脂酶”指的是能引起乳化剂在乳剂疫苗中分解的酶、酯酶、脂酶和磷 脂酶。正常乳剂_术语“正常乳剂”指的是水包油乳剂。
水包油乳剂_术语“水包油乳剂”指的是其中小油滴悬于连续水相中的乳剂。室温-术语“室温”指的是从18-25°C的温度。油包水乳剂_术语“油包水乳剂”指的是其中小水滴悬于连续油相中的乳剂。发明详述本发明涉及具有减少的脂酶活性的菌苗、由这些菌苗制备的猪乳剂疫苗、及减少 菌苗的脂酶活性的方法。除了抗原性组分，一些菌苗具有脂酶活性。当具有脂酶活性的 菌苗并入乳剂中时，脂酶可分解用于制造乳剂的乳化剂。包含具有高脂酶活性的菌苗的 乳剂疫苗常常是不稳定的乳剂，包含具有低水平脂酶的菌苗的乳剂疫苗常常是稳定的。 在灭活后产生具有脂酶活性的菌苗的细菌的实例包括猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathieae)，单核细胞增多性李斯特杆菌(Listeria monocytogenes)，大肠埃希 氏菌(Escherichia coli),猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae),及钩端螺方宠 体(Leptospira)种属，如已知的病原体犬钩端螺旋体(L印tospiracanicola)、感冒伤寒 型钩端 il 旋体(Leptospira grippotyposa)、哈德焦钩端 il 旋体(Leptospira hard jo) > 出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)、布拉迪斯拉发钩端螺旋体 (Leptospira bratislava)和波摩那钩端螺旋体(L印tospirapomona)。这些细菌能引起猪 的疾病，并且需要针对这些疾病进行疫苗接种。钩端螺旋体菌苗更可能具有高脂酶活性，而 猪红斑丹毒丝菌可能具有较低的、更易控制的脂酶活性。脂酶，其能分解用于制造乳剂的乳化剂，并因此引起乳剂的不稳定及分解，可能 包括一种或多种乳剂分解酶如酯酶、脂酶和磷脂酶。总体上这些酶，酯酶、脂酶和磷脂 酶被称为脂酶。菌苗的脂酶活性可使用叫做0-匹伐酸伞形酮(0-pivaloyloxymethyl umbelliferone) (C-POM)的合成底物进行测量。由脂酶引起的水解速率是对脂酶活性的测 量。该反应中由脂酶引起的水解反应速率通过脂酶活性的产物的荧光强度的增加而进行 监视。反应速率取决于所选择的确切水解测试条件，这样应当用相同测试条件产生的数据 比较由水解速率测量所得的脂酶活性水平。在几篇文章中公开了文献方法，包括Kurioka S.和 Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75 :281_289，De Silva N. S.和 Quinn P. A. (1987) J. Clin. Microbiol. 25 :729-731，及 Grau A.和 Ortiz A. (1998)Chem. Phys. of Lipids. 91 109-118)。在乳剂疫苗中，乳剂的分解引起组分的相分离。这是不需要的，因为当有相分离 时，从容器中取出的各自的剂量可能不会含有相同水平的疫苗组分。此外，乳剂的丧失能导 致乳化剂佐剂活性的丧失且导致疫苗抗原性效应的减少。减毒活病毒常常与菌苗一并包括在疫苗中。这些疫苗是有用的，因为单个疫苗能 用于制造使用一种疫苗针对不同疾病的免疫性。如果脂酶活性存在于菌苗中，其会引起乳 化剂从乳剂中的释放。该游离乳化剂能破坏并使活的疫苗病毒失活，这样导致病毒传染性 的丧失。用于疫苗的菌苗可通过培养目的细菌，以及之后灭活细菌以产生含有多种细菌组 分(包括细胞壁组分)的菌苗而形成。细菌可通过多种方法灭活，包括将其暴露于化合物 如硫柳汞、福尔马林、甲醛、二乙胺、二乙烯亚胺(binary ethylenamine，BEI)、β丙内酯 (BPL)和戊二醛。这些化合物的组合可以使用。此外，有可能用灭菌辐射以灭活细菌。现在已经发现具有这种脂酶活性的菌苗的脂酶活性可通过热处理而被减少。具体地，菌苗的脂酶活性可通过将菌苗加热至大约35-大约80°C的温度以形成经经热处理的菌 苗而被减少，所述经经热处理的菌苗具有可接受抗原性活性。热处理进行一段足够的时间， 以使经经热处理的菌苗的脂酶活性是热处理之前菌苗中所发现的50%或更低。对于优良的 乳剂疫苗稳定性，脂酶活性不必减少到零。我们已经发现具有优良保质期的疫苗可由具有 热处理前脂酶活性水平的50 %或更低的脂酶活性水平的经热处理的菌苗制备。当测试底物的水解速率被用作对菌苗脂酶活性的测量时，比较测试底物在热处理 之前的水解速率与热处理之后的水解速率。进行热处理以将水解速率减少到新鲜菌苗观察 到的水解速率的50%或更低。如果相同方法被用于测量热处理之前的活性及热处理之后的活性，则测量脂酶活 性水平的确切方法不是关键的。例如，如果测试底物的水解速率使用一种底物进行测量时， 不同底物可以产生不同的速率。然而，如果相同底物用于起始活性确定及处理后的活性确 定，相对速率仍会显示热处理的效应。有用于波摩那钩端螺旋体菌苗(9CFR§ 113. 101)、出血黄疸钩端螺旋体菌苗 (9CFR§ 113. 102)、犬钩端螺旋体菌苗(9CFR§ 113. 103)、感冒伤寒型钩端螺旋体菌苗 (9CFR§ 113. 104)及哈德焦钩端螺旋体菌苗(9CFR§ 113. 105)抗原性活性的编码测试 (9CFR§ 113. 101，§113.102，§113.103，§113. 104，及 §113.105)。对于这些种属，可接 受抗原性活性可定义为在疫苗接种的仓鼠中诱导保护性免疫应答的能力，使得当仓鼠用同 源活细菌进行攻击时，至少75 %的免疫接种的仓鼠在模式中存活，而至少80 %的未免疫接 种的仓鼠不能存活。就抗原而言，哈德焦钩端螺旋体，可接受抗原性活性可定义为在已经用 包含细菌抗原哈德焦钩端螺旋体免疫接种的牛中疫苗诱导针对哈德焦钩端螺旋体的血清 学凝集的几何平均滴度> 40的能力。对于其他菌苗，可接受抗原性活性定义为受到攻击之 后或由通过使用同源活的生物体的效力测试在疫苗接种的动物中诱导保护性免疫应答的 能力。热处理可在一定的温度范围上进行，可进行一段不同长度的时间。一般地，加热在 大约35-大约80°C进行大约20分钟-大约24小时而完成。当菌苗加热到更高温度时，如 大约75-大约80°C，加热时间为时间范围的短的情况。当加热在更低温度下完成时，加热 进行一段更长的时间。另一种温度和时间的组合是在大约60-大约70°C的温度下加热大 约9-大约10小时。另一种温度和时间的组合是在大约65-大约70°C的温度下加热大约 5-大约8小时。另一种温度和时间的组合是在大约65-大约70°C的温度下加热大约1小 时。另一种温度和时间的组合是在大约55-大约65°C的温度下加热大约5-大约8小时。热处理后，菌苗具有比新鲜制备菌苗低的脂酶活性，但还可以以相同的方式配制 成新鲜制备的菌苗。这样，经热处理的菌苗可以通过生产疫苗的普通方法并入疫苗。可通过组合所需的菌苗和油相以及乳化剂或多种乳化剂而形成乳剂疫苗。然后对 此组合进行剧烈搅拌以形成乳剂。合适的搅拌方法包括均质化及随后的微流体化。防腐剂 和赋形剂还可于乳化作用前包括在组合之内。疫苗可包括菌苗和病毒抗原二者。在制备包括菌苗和病毒抗原的疫苗时，将菌苗、 任何要包括的病毒抗原、乳化剂或多种乳化剂、以及可选地防腐剂和佐剂与油相组合，并进 行乳化。在乳剂形成后，制剂的PH可使用NaOH或HCl溶液调整到合适的pH。用于疫苗用 途，通常可取的是PH接近中性以避免注射位点的刺激。通常pH为大约7. 0-大约7. 3。
合适的用于乳剂疫苗形成的油相包括不可代谢油以及可代谢油。不可代谢油包括 矿物油，如白色矿物油及轻矿物油。可代谢油包括蔬菜油、鱼油和合成的脂肪酸甘油酯。可用于制备本发明的乳剂疫苗的乳化剂的实例为磷脂、山梨坦酯、聚乙氧山梨坦 酯以及甘露醇衍生物，其为常见的疫苗乳化剂。磷脂乳化剂包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷 脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸及卵磷脂(例如AMPHIGEN )。山梨坦酯乳化剂包括脱水山梨醇 单月桂酸酯(例如Span 20和Arlacel 20)，脱水山梨醇单油酸酯(例如Span 80 ^P Arlacel 80)，脱水山梨醇单棕榈酸酯(例如Span 40和Arlacel 40)，及脱水山梨醇单 硬脂酸酯(例如Span 60和Arlacel 60)。聚乙氧山梨坦酯包括聚乙氧脱水山梨醇单月 桂酸酯(例如Tween 20andTween 21)，聚乙氧脱水山梨醇单油酸酯(例如Tween 80)， 聚乙氧脱水山梨醇单棕榈酸酯(例如Tween 40)，及聚乙氧脱水山梨醇单硬脂酸酯(例如 Tween 60)。甘露醇衍生物乳化剂包括甘露醇十八酸酯。Span 、Arlacel 和Tween 为 ICI Americas的商标。AMPHIGEN 为辉瑞公司的商标。通常，疫苗配制为正常的水包油乳 剂，但也可能制备反相油包水乳剂。多种佐剂如Quil A、胆固醇、磷酸铝和氢氧化铝及防腐剂如硫柳汞可用于疫苗中。 Quil A为提取自南美洲皂树(Quillaja SaponariaMolina)树皮的皂角苷的经纯化混合物。 Quil A直接作用于免疫系统以激活敏感性的一般状态。这样，其诱导体液和细胞介导应答。 亲脂链使得抗原和佐剂的相互作用传递至细胞溶胶而以内源途径进行加工。Quil A常常 与胆固醇一同使用，因为当以合适比例添加时胆固醇消除了不那么需要的副作用。胆固醇 与Quil A形成不可溶复合体，当胆固醇结合于Quil A时，其形成螺旋样结构，这样暴露了 分子的糖单元，有助于刺激免疫应答。常常将猪病毒抗原添加至含有菌苗的疫苗。这种手段的一个优势是一种疫苗可用 于产生对几种疾病的免疫性，而无需几种不同疫苗的剂量达到相同结果。灭活病毒和减毒 活病毒都可用于疫苗中。在引起猪疾病的病毒中可用的是猪腺病毒、猪环状病毒、猪疱疹病 毒、假狂犬病病毒、传统猪瘟热病毒、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪细小病 毒、猪呼吸性冠状病毒、猪生殖和呼吸道病毒、猪流感、传染性肠胃炎病毒及水疱性口炎病
ο如果脂酶活性存在于菌苗中，其可引起乳化剂从乳剂中释放。此游离的乳化剂可 破坏活病毒的被膜，并使活疫苗病毒失活，因此导致病毒传染性的丧失。这样，对菌苗的热 处理帮助稳定乳液，并保持其佐剂作用，还保持病毒的病毒传染性。提供以下实施例以用于进一步阐明，但无意限制所要求保护的发明的范围。步骤步骤1浊度的测定浊度通过光散射法以浊度单位(N印helometric Units, NU)进行测定。由规定条 件下样品散射的光的强度与由标准参照悬液散射的光强度比较。散射的光的强度越高，样 品的浊度越高。光源射向样品，在光源方向90°处测量光散射。通过测量福尔马胼悬液的 光散射而校准设备。浊度计设备的校准将蒸馏水通过具有0. 2 μ m孔径的膜滤器进行过滤制备超滤水。通过在容量瓶中， 将1. OOg硫酸胼(NH2) H2SO4溶解于超滤水并以超滤水稀释至IOOml而制备第一种溶液。通过在容量瓶中，将10. OOg六亚甲基四胺(hexamethylenetetramine)溶解于超滤水并以超 滤水稀释至IOOml而制备第二种溶液。通过将5. Oml第一种溶液和5. Oml第二种溶液混合 来制备福尔马胼悬液。让混合物在大约24°C下静置24小时。混合物用超滤水稀释至IOOml 以形成具有400NU浊度的储备浊度悬液。通过将10. OOml储备浊度悬液用超滤水稀释到 IOOml而制备40NU的福尔马胼浊度悬液。进一步的校准溶液是通过稀释储备溶液来制备 的。浊度的测量要测量的样品用超滤水稀释，以使浊度下降到浊度计的校准范围内。测量浊度并 以下面等式计算原始浊度 其中M为以NU计的经稀释样品的浊度D为稀释水的体积，以mL计
0为原始样品体积，以mL计步骤2脂酶分析脂酶活性使用0-匹伐酸伞形酮作为荧光发生底物进行测定。脂酶催化此非荧光 底物的水解产生羟基甲醚(它在水溶液条件下不稳定)。不稳定羟基甲醚的分解产生乙醛 和荧光产物伞形酮。监视所产生伞形酮的荧光强度，作为时间的函数，提供脂酶酶活性的敏 感的动态测量。0-匹伐酸伞形酮(Molecular Probes产品号P35901)溶液在纯DMSO中制备， 储备液浓度为5mM ；未使用的溶液于_20°C，避光储存。5mM 0-匹伐酸伞形酮溶液用58mM TRIS-HCl缓冲液(pH 8.0)稀释到750 μ m，将所得的溶液预热至37°C。菌苗样品或对照缓 冲液/基质在室温下以6500X重力离心10分钟以形成沉淀和上清。通过将15 μ LlOOmM TRIS-HCl缓冲液(pH 8.0)与15 μ L来自菌苗样品或对照缓冲液/基质的上清在室温下混 合在小体积96孔板(Corning 3393，黑色聚苯乙烯非结合表面，半面积)的测定孔中进行反 应；在37°C下预孵育10分钟；然后通过加入20 μ L的750 μ m 0-匹伐酸伞形酮或对照缓冲 液/基质起始反应。所得反应混合物含有53mM TRIS-HCl缓冲液(pH8. 0)和0或300 μ m 0-匹伐酸伞形酮。在一小时时间段内间隔30-45秒测量荧光强度(Spectramax Gemini XS, 37°C，λ ex = 360nm, Aem = 460nm, PMT敏感性装置‘基质，，每孔读数6次)。反应速率由所 得过程曲线的斜率确定。步骤3猪红斑丹毒丝菌制备物的浊度测量猪红斑丹毒丝菌制备物的浊度用分光光度计在600nm波长处测量。结果以光学单 位(optical units, 0U) 艮告。
实施例实施例1通过热处理减少脂酶活性制备硫柳汞灭活的钩端螺旋体集合，其包括以下种属犬钩端螺旋体、出血黄疸钩 端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体，来自各自的菌苗。将组合的菌苗的六份样品在4°C、37°C、45°C、56°C、65°C和80°C储存过夜(大约12小 时)。储存于4°C的样品用作未处理对照。在37°C、45°C、56°C、65°C和80°C储存12小时的 样品为经热处理的样品。储存之后，根据步骤2的方法测量测试底物在各菌苗存在下水解 的速率。样品的水解速率除储存于4°C的样品的水解速率乘以100为储存后残余的各菌苗 的原始脂酶活性。以下图表显示储存温度和储存后残余的原始脂酶活性百分比。 制备了两个布拉迪斯拉发钩端螺旋体系列。这些系列使用硫柳汞进行失活，然后 进行热处理在65°C下8小时。在处理前以及处理中每两个小时取出样品。脂酶活性在每个 时间点根据步骤2的方法确定。取出样品时，测量测试底物在每个样品存在下的水解速率。 样品水解速率除以起始水解速率乘以100为热处理后残余的各菌苗的原始脂酶活性。以下 图表显示取样时间和那时残余的原始脂酶活性百分比。 实施例2制备实验疫苗制剂培养犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺 旋体、波摩那钩端螺旋体、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、猪红斑丹毒丝菌和猪细小病毒的培养 物。每种钩端螺旋体培养物的浊度以浊度单位(NU)进行测量。红斑丹毒丝菌培养物的浊 度以光学单位(OU)进行测量。细菌用硫柳汞进行灭活以形成菌苗。每种钩端螺旋体菌苗 在65°C下热处理8小时以减少脂酶活性。猪红斑丹毒丝菌菌苗不进行热处理。钩端螺旋体 菌苗与灭活的猪细小病毒及灭活的猪红斑丹毒丝菌相组合，然后与AMPHIGEN 、佐剂、防腐 剂、稀释缓冲液混合，使得每2ml剂量的疫苗含有下表所示的组分。抗原浓度 实施例3仓鼠和猪中的效力测试将实施例2的疫苗施用于仓鼠和兔以使用标准实验室动物模型测试效力。测试仓 鼠然后用一定剂量的犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、布拉迪 斯拉发钩端螺旋体或波摩那钩端螺旋体进行攻击以测试疫苗的效力。测量存活者的数量作 为功效的表现。测量针对哈德焦钩端螺旋体的兔显微凝集滴度以显示疫苗的部分的效力。 下表显示由经热处理的钩端螺旋体菌苗制备的疫苗能够产生通过功效标准的抗原性应答。 通过比较疫苗血清学滴度与参考疫苗的滴度在兔中测试猪红斑丹毒丝菌。疫苗具 有3. 0的RP (相对效力)。PPV在血凝测定中进行测试，具有HA滴度为1024HA/. 05ml。对 于疫苗320HA/. 05ml的滴度是可接受值。实施例4疫苗的生化测试根据实施例2中列出的制剂制备具有经热处理的钩端螺旋体菌苗和其他组分的 疫苗。根据实施例2的方法从非热处理的钩端螺旋体菌苗制备类似的疫苗。两种疫苗制剂 于4°C储存0、6、12、15和18个月的时间。使用激光衍射计，在每个时间点对每种疫苗进行 颗粒大小分析。以下显示的图表显示了每种疫苗在数月的监视时间(0、6、12、15和18个月)内的
颗粒大小分布。在第0天对新鲜制备的含有经热处理的钩端螺旋体菌苗的疫苗进行颗粒大小分 析 从非热处理的钩端螺旋体菌苗制备的疫苗(上部的图)显示了颗粒大小的增加， 表示乳剂分解。从经热处理的钩端螺旋体菌苗制备的疫苗(下部的图)显示了整个18个 月中颗粒大小的保持，表示乳剂稳定。实施例5PPV 血凝测定(Hemaglutination Assay, HA)—开始就HA滴度和溶血滴度测试实施例2中所列的由非热处理的钩端螺旋体菌 苗和经热处理的钩端螺旋体菌苗制备的疫苗制剂(实施例2列表中的疫苗含有所有列出的 抗原——用于所有工作的相同疫苗)。不同时间点HA滴度的稳定性。HA测定通过调整样 品pH至11-11. 2以从氢氧化铝胶中提取PPV(猪细小病毒)病毒而进行。然后离心样品并 收集上清用于测定。将豚鼠红细胞加入96孔板中用作凝集指示物。样品上清在相同的两 行间依次稀释2倍，起始稀释为1 5。平板在5士3C下孵育16-24小时。每孔血凝的程度 以0-4计分。在最后的稀释含有2分或以上时记录滴度。在测试未热处理的疫苗时，发现 此疫苗引起溶血。溶血滴度是观察到溶血的最高稀释。经热处理的疫苗不产生溶血。以下图表显示随时间的平均HA滴度和溶血滴度。CTC为具有经热处理的钩端螺旋 体菌苗的疫苗。OOP为不具有经热处理的钩端螺旋体菌苗的疫苗。图表1 随时间的PPV HA滴度随时间对OOP和CTC PPV HA的跟踪起始Imo 2mos. 3mos. 4mos. 5mos. 7mos. IOmos.
1280 640 80 0
OOP 160 1280 CTC 1280 1280
OOP 80 160 CTC O O
23
1280 1280 1280 1280
1280 1280 1280 1280
80
溶血滴度 80 160
0 0
160 0
1280 640
160 0
640 640
160 0
1280 640
160 0
权利要求
包括乳剂、经热处理菌苗的疫苗，所述经热处理菌苗包括灭活细菌的悬液，其中所述灭活细菌为布拉迪斯拉发钩端螺旋体种属和1 13种选自如下的引起猪疾病的病毒猪腺病毒、猪环状病毒、猪疱疹病毒、假狂犬病病毒、传统猪瘟热病毒、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、猪呼吸性冠状病毒、猪生殖和呼吸道病毒、猪流感、传染性肠胃炎病毒及水疱性口炎病毒。
2.根据权利要求1的疫苗，其进一步包括卵磷脂制备物和基于铝佐剂。
3.根据权利要求2的疫苗，其进一步包括油包卵磷脂制备物。
4.根据权利要求1的疫苗，其进一步包括经热处理菌苗，其包括灭活细菌悬液，其中所 述灭活细菌为1-6种选自如下的细菌种属犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、感冒伤寒 型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体和猪红斑丹毒丝菌。
5.根据权利要求4的疫苗，其进一步包含卵磷脂制备物和基于铝佐剂。
6.根据权利要求5的疫苗，其进一步包含油包卵磷脂制备物。
全文摘要
公开了经热处理的菌苗、生产经热处理的菌苗的方法以及从这些经热处理的菌苗制备的猪乳剂疫苗。
文档编号A61K39/02GK101903041SQ200880121714
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月21日
发明者M·D·古德伊尔, M·J·休特, N·L·欧伊恩, R·L·克莱布斯 申请人:辉瑞大药厂