专利名称：：注射用羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法
技术领域：
：本发明属于药物制剂，具体涉及一种注射用羟基喜树碱纳米脂质体。
背景技术：
：羟基喜树碱具有抗癌广谱，疗效显著的特点。目前国内只有其注射液制剂在使用，并有复方羟基喜树碱的注射液制剂专利申请，96112301。羟基喜树碱的注射液存在稳定性差的缺点，易变色，该制剂在见光、热和空气后，两天后色泽加深，3个月后产生细微沉淀，主要含量下降，降解产物增加，其疗效下降，毒副作用增加。现有所谓羟基喜树碱纳米粒药物制剂的粒径均大于100纳米，其实质是脂质体，依照相关规定，它不能称为纳米制剂。因此现在尚没有真正意义上的注射用羟基喜树碱纳米脂质体。
发明内容本发明的目的在于提供一种注射用羟基喜树碱纳米脂质体，并提供其制备方法，从而实现羟基喜树碱的纳米化制剂。本发明的技术方案之一为注射用羟基喜树碱纳米脂质体，它是由下列重量份的主要原料配制而成的羟基喜树碱5,氢化豆磷脂20~60,泊活沙姆10-40,葡萄糖0.2~1，甘露醇0.2~1。其优选的是原料重量份为羟基喜树碱5，氢化豆磷脂3050,泊活沙姆10~30，葡萄糖0.3-0.6,甘露醇0.3—0.6。特别是原料重量份为羟基喜树碱5，氢化豆磷脂30~50,泊活沙姆10~30，葡萄糖0.3—0.6,甘露醇0.3—0.6。本发明的技术方案之二为注射用羟基喜树碱纳米脂质体的制备方法，它是将羟基喜树碱和氢化豆磷脂在40°C6(TC下用乙醇溶解，溶解后得到的有才几相与加泊洛沙姆水溶液混合，在50—60。C搅拌分散均匀，在1200bar压力下匀质处理，再减压回收乙醇后，加入葡萄糖和甘露醇溶解，加蒸馏水定容后过滤，所述主要原料配制而成的羟基喜树碱5，氢化豆磷脂20~60,泊活沙姆10-40，葡萄糖0.2~1，甘露醇0.2-1。由于本产品中的脂质体的粒径小于100nm，符合中国药典2005年版纳米脂质体的要求。试验结果证明本品2小时内有90%药物到达肿瘤细胞内，而普通制剂需要48小时才有卯％药物到达肿瘤细胞内，动物体内试验结果表明本品在肿瘤体内的药物农度比普通制剂要高5-8倍。其工艺简单易控制，质量稳定。图1注射用羟基喜树碱纳米脂质体制备工艺流程图。具体实施例方式实施例1处方1:羟基喜树碱500毫克，氢化豆磷脂4000毫克，泊活沙姆2000毫克，葡萄糖50毫克，甘露醇50毫克；实施例2处方2:羟基喜树碱500毫克，氢化豆磷脂2000毫克，泊活沙姆1000毫克，葡萄糖20毫克，甘露醇20毫克；实施例3处方3:羟基喜树碱500毫克，氢化豆磷脂6000毫克，泊活沙姆4000毫克，葡萄糖100毫克，甘露醇100毫克；实施例4处方4:轻基喜树碱500毫克，氢化豆磷脂3000毫克，泊活沙姆3000毫克，葡萄糖30毫克，甘露醇60毫克；实施例5处方5:羟基喜树碱500毫克，氢化豆磷脂4000毫克，泊活沙姆3500毫克，葡萄糖100毫克，甘露醇60毫克。它是将羟基喜树碱和氢化豆磷脂在40°C~60"下用乙醇溶解，溶解后得到的有才几相与加泊洛沙姆水溶液混合，在50—60。C搅拌分散均匀，在1200bar压力下匀质处理，再减压回收乙醇后，加入葡萄糖和甘露醇溶解，加蒸馏水定容3000毫升后过滤，冻干，过滤采用0.22jxm微孔膜过滤。所述泊洛沙姆水溶液的重量浓度为28.5%。注射用羟喜树碱纳米脂质体的质量标准1.性状本品为类白色粉末或类白色颗粒状。2.鉴别(1)取本品一瓶，加0.4%氢氧化钠溶溶溶解。溶道即显亮黄色并有黄色荧光另稀醋酸0.5ml荧火消失，溶液变成微黄色。(2)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间与羟基喜树碱对照品主峰的保留时间一致。(3)取本品一瓶，加注射用水溶解，取该溶液适量，在电镜下观察可见具有脂质体双层结构的纳米颗粒。3.检查(l)pH值取本品，加水制成每O.lml含羟基喜树碱mg,的溶液，依法测定(中国药典2005年做二部附录VIH)。pH值为6.0-7.0，按上述方法测定本品三批样品，PH值见表1。表l三批注射用羟基喜树碱纳米脂质体溶液的pH值批号123平均45值0811066.346.316.356.346.326.330811076.456.476.446.466.476.460811086.686.666.696.706.696.68(2)干燥失重取本品3瓶，混匀，依试测定(中国药典2005年版第二部附录VEI第一法)，含水份小于5%，按该法测定本品三批，其干燥失重分别为3.1°/。，2.6%和2.9%。(3)平均粒径取本品1瓶，加蒸馏水5ml溶解，用激光粒度分析仪测定溶液。测得三批样品的粒度结果见表2。表2.三批注射用轻基喜树碱二L纳米脂质体的平均粒度批号平均丰立径(nm)081106810811070811087873(4)有关物质本品中有关物质一个即喜树碱，考虑到在稳定性试验中有可能产生分解产物，为此采用归一化法测定有关物质与分解产物，测定方法如下。取本品适量用流动相溶解并定为至100ml，取上述溶液20p注入色谦仪，记录色谦图至主峰保留时间的2倍，扣除溶剂峰面积，按各杂质峰面积的和与总峰面积的比值计算有关物质与分解产物的含量。按上述方法测定三批本品，其有关物质与分解产物见下表3.表3三批注射用鞋基喜树碱纳米脂质体有关物质含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(5)无菌本品为供静脉注射用，必须无菌，因此制订无菌检查，方法为取本品2瓶，分别加灭菌水制成(lml中含0.2mg的羟基喜树碱纳米脂质体的溶液，依法测定(中国药典二部，附录XIH)三批样品匀符合规定。4.含量测定采用高效液相色谱法测定。用十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲酸一水(60:40)为流动相，检测波长为382nm，理论塔板数按羟基喜树碱计算，应不低于3000,外标溶液的制备，取羟基喜树碱对照品约25mg,精密称定，置之度外50ml容量瓶中，用曱醇定容，取l.Oml用流动相定容到50ml摇匀，作为外标溶液。测定法取样品10瓶，分别用流动相溶解并定容至100ml，作为供试品溶液，将外标溶液和供试品溶液用0.8ixm^L孔滤膜滤后，超声脱气l分钟，吸注入HPLC中，记录色谱图，按外标法，以主峰面积计算供试品溶液中羟基喜树碱的含量，按该法测定三批样品含量分别为98.38%,99.71%和100.86%。5.包封率测定取本品一瓶，加水10.0ml溶解，并定量移至离心管中，在4°C，4万转/分，离心2小时，取出上清液于25ml容量瓶中，用甲醇定容。取20p注入HPLC中，记录色谱图；另外称取约20mg羟基喜树碱对照品，粒度稳定，用曱醇定容至50ml,容量瓶中，取l.Oml用甲醇稀至25ml，取1.0ml用流动相定容至50ml，取20p注入HPLC中，记录色谱图。(总药一游离药)包封率％=-x100%总药按上述方法测得三批样品的的包封率分别为98.77%，97.68和98.51%。注射用羟基喜树纳米脂质体对肿瘤细胞(Bel-7402)的作用本试验采用MTT法测定注射用羟基喜树碱纳米脂质体对人肿瘤细胞Bel-7402的抗肿瘤作用，结果见表4。表4注射用羟基喜树碱纳米脂质体对人肝癌Bel-7402的抗肿瘤作用纳米脂质体制脂质体制剂剂抑制率(％)浓度(m浓度(pg/ml)g/m)5096.81252593.262.512.589.431.256,2581.315.6253.12580.07.81251.562573.93.906250.7812551.71.9531250.39062536.40.9765625普通注射剂抑制率抑制率浓度(H(%)(%)g/ml)93.225086.591.712584.089.062.579.585.431.257080.215.62578.171.17.812562.053.73.9062540.335.81.95312537.5以上试验结果说明在约60%抑瘤率的情况下纳米脂质体制剂比普通的注射剂要低得多，只有普通注射剂的约1/7。羟基喜树碱纳米脂质体制剂的ICso为0.751,脂质体制剂的ICso为1.85,而普通注射剂为ICs。为5.86。ICso(普通注射液)/IC5o(纳米脂质体)=7.8倍ICso(脂质体制剂)/IC5()(纳米脂质体)=2.46倍注射用羟基喜树碱纳米脂质体对棵鼠人肝癌SMM-7724的抗肿瘤作用。1.试-险方法取生长旺盛的瘤组织切成1.5mrr^左右，在无菌条件下，接种于棵小鼠右侧腋窝皮下。棵小鼠移植瘤用游标长尺测量直径，待肿瘤生长至50-200rm^后将动物随机分组，给药两周后，处死动物分离肿瘤称重，并计算抑瘤率。2.给药剂量空白组给注射用水，普通羟喜树碱组值按8mg/kg每周给药3次；羟基喜树碱纳米脂质体组分为高、中、低三个剂量组。即4mg/kg、2mg/kg和lmg/kg,每周给药3次。3.试验结果见表5表5注射用雍基喜树碱纳米脂质体对人肝癌SMM，7724的抑制率组别剂量给药方法动物数抑瘤率(％)空白对照0.2ml/只iv12普通羟喜注射剂8mg/kgiv669.2高剂量组4mg/kgiv694.6羟喜納米脂质体中剂量组2mg/kgiv681.7低剂量组lmg/kgiv664.3羟基喜树碱纳米脂质体在肿瘤体内的分布1.组织样品的处理组织样本的处理肿瘤组织称重后，4姿比例加重定量生理盐水、水浴中匀浆制成200mg/ml的组织匀浆，取200^1组织匀浆，加入50nl内标溶液，2ml磷酸混;旋2分钟，避光环合2小时，环合后的样品加乙腈300^1，充分混匀，起声5分钟，130000r/min离心10分钟，取离心后的上清液300^1，置于10ml离心管50°C水浴氮气流吹干，残渣以80nl流动相溶解，取20pl进样。2.标准曲线取小鼠空白肿瘤体匀浆加HPT标准品溶液，配成含量为12.5、25.0、50、100、250、500ng/ml的组织样品，按"组织样品的处理，，项下操作，残渣以8(HU流动相溶解，取20ul进样，以组织样本的HPT配制的浓度为橫坐标，HPLC色谱图的主峰面积为纵坐标纟会制标性曲线。Y=502.82X+268.08r=0.99983.试-险方法取生长旺盛的肺瘤组织切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于小鼠右侧腋下，待肿瘤生长至100—200mm3后，按8mg/Kg—次性尾静脉注射，并于0.5,1.0，2.0小时处死动物，分离肿瘤，称重，按"组织样品的处理"方法处理，用HPLC发测定个瘤体内的药物含量。结果见表6表6<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1、一种注射用羟基喜树碱纳米脂质体，它是由下列重量份的主要原料配制而成的羟基喜树碱5，氢化豆磷脂20～60，泊活沙姆10～40，葡萄糖0.2～1，甘露醇0.2～1。2、如权利要求1所述注射用羟基喜树碱纳米脂质体，其特征是所述原料重量份为羟基喜树碱5，氢化豆磷脂30-50，泊活沙姆10~30，葡萄糖0.3—0.6，甘露醇0.3—0.6。3、如权利要求1所述注射用羟基喜树碱纳米脂质体，其特征是所述原料重量份为羟基喜树碱5，氢化豆磷脂40,泊活沙姆20,葡萄糖0.5，甘露醇0.5。4、一种注射用羟基喜树碱纳米脂质体的制备方法，它是将羟基喜树碱和氢化豆磷脂在40°C60。C下用乙醇溶解，溶解后得到的有机相与加泊洛沙姆水溶液混合，在50—60。C搅拌分散均匀，在1200bar压力下勻质处理，再减压回收乙醇后，加入葡萄糖和甘露醇溶解，加蒸馏水定容后过滤，冻干，所述主要原料配制而成的羟基喜树碱5，氢化豆磷脂20-60，泊活沙姆10~40,葡萄糖0.2~1,甘露醇0.2~1。5、如权利要求4所述注射用轻基喜树碱纳米脂质体的制备方法，其特征是所述泊洛沙姆水溶液的重量浓度为28.5%。6、如权利要求4所述注射用羟基喜树碱纳米脂质体的制备方法，其特征是所述过滤采用0.22nm孩i孔膜过滤。7、如权利要求4所述注射用羟基喜树碱纳米脂质体的制备方法，其特征是所述冻干后的脂质体粒径不超过100纳米。全文摘要本发明公开了一种注射用羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法。它是将羟基喜树碱和氢化豆磷脂在40℃～60℃下用乙醇溶解，溶解后得到的有机相与加泊洛沙姆水溶液混合，在50-60℃搅拌分散均匀，在1200bar压力下匀质处理，再减压回收乙醇后，加入葡萄糖和甘露醇溶解，加蒸馏水定容后过滤，冻干。由于本产品中的脂质体的粒径小于100nm，符合中国药典2005年版纳米脂质体的要求。试验结果证明本品2小时内有90％药物到达肿瘤细胞内，而普通制剂需要48小时才有90％药物到达肿瘤细胞内，动物体内试验结果表明本品在肿瘤体内的药物浓度比普通制剂要高5-8倍。其工艺简单易控制，质量稳定。文档编号A61K9/127GK101548951SQ20091006219公开日2009年10月7日申请日期2009年5月22日优先权日2009年5月22日发明者易以木申请人:易以木