专利名称：λ干扰素在抗人类免疫缺陷病毒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗病毒药物领域，具体地说，本发明涉及一种新型干扰素一_入 干扰素(interferon lambda, IFN-Ji)在抗人类免疫缺陷病毒(HIV-1)中的应用。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病因，病 人以CD4+T细胞减少为主要特征，同时伴有反复机会感染、恶性肿瘤以及中枢 神经系统退行性病变。在HIV/AIDS疫情爆发的二十七年间，全球约有6500万 人感染了 HIV，其中2500万人己经死亡。如果不对HIV/AIDS疫情采取防治措 施，它将演化为一场历史性的灾难，估计到本个十年结束时将产生数百万的新感 染人数。
由于HIV主要入侵CD4+T细胞和单核-吞噬细胞，且依赖感染细胞内多种 活性分子而大量复制，使宿主CD4+T细胞数量剧减和功能受损，导致严重免疫 缺陷。据此，以设计若干治疗方案①阻断或抑制HIV对细胞内成分的利用； ②给予IL-2、 IL-12,抑制促炎细胞因子产生，扩增CD4+和CD8+T细胞；③应 用高活性抗体及转录病毒治疗(HAART),通过终止病毒感染所致免疫缺陷并 一定程度促进免疫功能重建，可明显改善HIV感染者预后，降低机会性感染率 和早起死亡率；④应用治疗型疫苗，增强机体抗HIV应答，减少抗病毒药物用 量。目前美国FDA批准25种抗逆转录病毒药物，但很多抗病毒药物由于毒副作 用和长期应用的耐药性而限制了其临床应用，如临床上常用于齐多夫定 (zidovudine)有骨髓抑制反应，奈韦拉平(nevirapine)对肝功能损害，蛋白酶抑制剂 茚地那韦(indinavir)有严重的消化道症状，等等；同时也发现在进行HAART疗 法时出现HIV-1的耐药毒株，极大地影响了治疗效果。因此，抗病毒药物研究 具有重要的实际意义，寻找一种高效、安全、副作用少的抗病毒药物的研究势在 必行。实践证明，干扰素(IFN)是抗病毒感染的第一道防线，I型和II型干扰 素不仅可抑制病毒和肿瘤，而且还能参与天然免疫反应和获得性免疫反应。最近干扰素家族增添一位新成员III型干扰素即IFN-人，己发现其与其他型干扰素一 样具有抗病毒作用，如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等， 通过激活干扰素信号通路，导致抗病毒蛋白的产生，这些蛋白包括双链RNA活 化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKR)、 2'- 5'寡腺苷酸合成酶(OAS)基因家族和Mx 蛋白，从而发挥抗病毒效能。但IFN-X抗HIV作用经科技査新还未见报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种X干扰素在体外抗人类免疫缺陷病毒感 染中的应用(一种X干扰素在抗人类免疫缺陷病毒中的应用)，该干扰素细胞毒 性弱，抗HIV-1作用显著，且具有多种抗病毒途径，抗HIV-1作用与其他型别干
扰素相似。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
1、 IFN-X的获得IFN-:U从2均为含178个氨基酸、分子量19.8kDa的蛋白质， 其制备参见文献(Kotenko SV, Gallagher G, Baurin VV, ef a/. Nat Immunol, 2003, 4(1): 69-77)，且IFN-M/X2已商品化，本实验所用IFN-;UA2购于PeproTech公司， SDS-PAGE和HPLC分析其纯度达98X以上；
2、 IFN-X对HIV-1靶细胞一人巨噬细胞的毒性分化成熟的人巨噬细胞加入 不同浓度(浓度从lng/ml到1000ng/ml)的IFN-X1A2，培养72小时，通过MTS法 检测IFN-X1/X2的细胞毒性作用，选择无毒或弱毒浓度的IFN-Xl/人2进行随后的抗 HIV-1作用研究；
3、 IFN-Xl/a2抗fflV-l活性的测定
(1) IFN-X抗HIV-1在人巨噬细胞中的感染IFN-X1/X2 (100ng/ml)预处理分 化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1R5型(为单核细胞/巨噬细胞嗜性的毒株) 毒株Bal、 Jago禾口JRFL ( J Virol， 1992, 66: 2588-93; J Virol, 2002, 76: 9407-19， P24 蛋白含量均为30吗/106个细胞)分别感染2小时，后用DMEM(Dulbecco，s Modified Eagle Medium)培养基洗三次，再加入含10X胎牛血清的DMEM (V/V)培养基， 37°C， 5%C02 (V/V)培养；于感染后第8天光镜下观察细胞形态，并收集感染 后第8天的细胞上清，应用同位素^P标记HIV逆转录酶法和ELISA法分别检测 HIV-1病毒逆转录酶(RT)和P24蛋白，来判断IFN-人抗HIV-1作用；
(2) IFN-X抗HIV-1在人巨噬细胞中的感染的效果IFN-X1/X2 (100ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒株感染2小时，后用DMEM培养 基洗三次，再加入含10X胎牛血清的DMEM(V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V) 培养；分别于感染第4天、第8天和第12天收集细胞上清，应用同位素"P标记HIV 逆转录酶法检测RT，来判断IFN-X抗HIV-1作用的时间效果；不同浓度IFN-人1/X2
(浓度范围从lng/ml到1000ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒株感染2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加入含10X胎牛血清的DMEM
(V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；于感染第8天收集细胞上清，应用 同位素"P标记HIV逆转录酶法检测RT，来判断IFN-X抗HIV-1作用的剂量效果；
(3) IFN-X与其他干扰素比较抗HIV-1作用IFN-X1从2 (100ng/ml)、
IFN-ot( 1 OOOIU/ml) 、 IFN陽卩(1 OOOIU/ml) 、 IFN-y( 1 OOOIU/ml)以及IFN陽X1/X2 (100ng/ml) 联合预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒株感染2小时，后用 DMEM培养基洗三次，再加入含10。/a台牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C, 5%C02 (V/V)培养；于感染第8天收集细胞上清，应用同位素^P标记HIV逆转 录酶法检测RT，来比较各种干扰素抗HIV-1的作用；
(4) IFN-X对HIV-1病毒感染前、感染中和感染后的抗病毒作用a)HIV-l病毒 感染前:实验操作见前(1); b)HIV-l病毒感染中:IFN-X1/X2 (100ng/ml)分别 和HIV-1 Bal毒株同时感染分化成熟的人巨噬细胞2小时，后用DMEM培养基洗三 次，再加入含10。/。胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5。/oC02(V/V)培养； 分别于感染第4天、第8天和第12天收集细胞上清，应用同位素"P标记HIV逆转录 酶法检测RT判断抗病毒作用；c)HIV-l病毒感染后:HIV-1 Bal毒株感染分化成熟 的人巨噬细胞2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加入含IFN-X1/;U (100ng/ml) 的10。/。胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；每隔4 天更换含IFN-;U/X2 (100ng/ml)的DMEM培养基；分别于感染第4天、第8天和 第12天收集细胞上清，应用同位素^P标记HIV逆转录酶法检测RT判断抗病毒作 用。
本发明与现有抗病毒干扰素相比，具有以下优点和效果
1.抗病毒作用时间快，HIV-1感染后第8天，IFN-X1/X2 (100ng/ml)抑制病毒 复制和感染的效果最佳，而且IFN-W在病毒感染后第4天即能抑制病毒的复制 和感染；随着药物浓度的增加(从lng/ml到1000ng/ml)， IFN-X抑制病毒复制作用明显增加；
2. 抗HIV-1病毒作用具有多途径，对HIV-1感染前、感染中和感染后的人巨噬 细胞均有明显抑制作用，表明该药可用于HIV-1感染的治疗；
3. 与现有抗HIV-1作用的干扰素(IFN-a， IFN-卩和IFN，)抗病毒作用相近， 抑制HIV-1逆转录酶活性均能达到70%以上，而且IFN-X1众2联合应用也具有抗 病毒效果，抑制HIV-1逆转录酶活性达80% 。
图l IFNA对人巨噬细胞的毒性作用分化成熟的人巨噬细胞加入不同浓度的 IFN-X1/X2(浓度从lng/ml到1000ng/ml)，培养72小时，通过MTS法检测IFN-W/X2
的细胞毒性作用。
图2 IFN-X对HIV-1感染所产生的多核巨细胞形成的影响 IFN-X1/X2 (100ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 R5型毒株Bal、 Jago 和JRFL (P24蛋白含量均为30ng/l()S个细胞)分别感染2小时，后用DMEM培 养基洗三次，再加入含10%胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；于感染后第8天，光镜下观察HIV-1感染所产生的多核巨细胞的 形成。A.为未感染HIV-1的巨噬细胞；B.为感染HIV-1的巨噬细胞；C.为IFN-人 预处理后感染HIV-1的巨噬细胞。箭头所指为HIV-1感染形成的多核巨细胞。 图3 IFN-X对HIV-1 R5型不同毒株的抑制作用 IFN-X1/X2 ( 100ng/ml)预处理 分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1R5型毒株Bal、 Jago和JRFL (P24蛋白 含量均为30ng/l()S个细胞)分别感染2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加 入含10%胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；收 集感染后第8天细胞上清，应用同位素32P标记HIV逆转录酶法和ELISA法分 别检测HIV-1病毒逆转录酶(RT)和P24蛋白，**表示？<0.01。 图4 IFN-人对HIV-1感染后不同时间点的抑制作用 IFN-人1/X2 (100ng/ml)预 处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒株感染2小时，后用DMEM 培养基洗三次，再加入含10%胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02(V/V)培养；分别于感染第4天、第8天和第12天收集细胞上清，应用同位
素32P标记HIV逆转录酶法检测RT， *表示P<0.05, **表示P<0.01 。 图5不同浓度IFN-X对HIV-1感染的抑制作用不同浓度IFN-:U/入2 (浓度范 围从lng/ml到1000ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒 株感染2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加入含10%胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；于感染第8天收集细胞上清，应 用同位素32P标记HIV逆转录酶法检测RT，伞表示P〈0.05，"表示P〈0.01。 图6 不同型别干扰素抗HIV-1感染作用的比较 IFN-Xl/人2 (100ng/ml)、 IFN-a(1000IU/ml)、 IFN-(3(1000IU/ml)、 IFN-y(1000IU/ml)预处理分化成熟的人巨 噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒株感染2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加 入含10%胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；于 感染第8天收集细胞上清，应用同位素"P标记HIV逆转录酶法检测RT， *表示 P<0.05， ^表示P〈0.01。
图7 IFN-X对HIV-1病毒感染前、感染中和感染后的人巨噬细胞的影响 IFN-AJ/X2 (100ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时后HIV-1 Bal毒株 感染2小时(感染前)，或IFN-;U/人2 (100ng/ml)分别和HIV-1 Bal毒株同时感 染分化成熟的人巨噬细胞2小时(感染中)，或HIV-1 Bal毒株感染分化成熟的 人巨噬细胞2小时，再加入含IFN-X1A2 (100ng/ml)的含10%胎牛血清DMEM (V/V)培养基(感染后)，37°C， 5%C02 (V/V)培养；按上述3种处理方式进 行并分别于感染第4天、第8天和第12天收集细胞上清，应用同位素^P标记 HIV逆转录酶法检测RT， *表示？<0.05,"表示P〈0.01。
具体实施例方式
实施例l: IFN-1对人巨噬细胞的毒性作用
分化成熟的人巨噬细胞加入不同浓度的IFNAl/人2，培养72小时，通过MTS 法检测IFN-X1/X2的细胞毒性作用，结果显示，IFN-人l/入2浓度从lng/ml至lj 1000ng/ml对人巨噬细胞毒性均小于10y。，统计分析无显著差异，因此可认为 IFNA1/X2对人巨噬细胞无毒性(图O。实施例2: IFN-X体外抗人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染
IFN-Xl/人2 (100ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 R5型 毒株Bal、 Jago和JRFL (P24蛋白含量均为30ng/1(^个细胞)分别感染2小时，后 用DMEM培养基洗三次，再加入含10X胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；于感染后第8天，光镜下观察，HIV-1感染组巨噬细胞呈现 典型的多核巨细胞形态，IFN-X处理组多核巨细胞明显少于病毒对照组(图2)。
收集感染后第8天细胞上清，应用同位素"P标记HIV逆转录酶法和ELISA法 分别检测HIV-1病毒逆转录酶(RT)禾口P24蛋白，结果显示，不管是HIV-1实验 室适应株还是临床分离株，X干扰素处理组RT和P24含量均明显低于病毒对照组 (图3， P<0.01)。实验结果表明IFN-X能抑制HIV-1在人巨噬细胞中的复制和感 染。
实施例3: IFN-X体外抗HIV-1感染具有时间效应
IFN-;U/人2 (100ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal 毒株感染2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加入含10X胎牛血清的DMEM
(V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；分别于感染第4天、第8天和第12 天收集细胞上清，应用同位素"P标记HIV逆转录酶法检测RT。结果显示，感染 后第8天抑制HIV-1感染效果明显(图4， P<0.01)，而且IFN-入1处理组在感染后 第4天即可抑制HIV-1 RT复制，且优于IFN-X2处理组(图4， P<0.05)。说明IFN-X 抑制HIV-1在人巨噬细胞中的复制和感染呈现有时间关系。
实施例4: IFN-X体外抗HIV-1感染具有剂量效应
不同浓度IFN-X1/X2 (浓度范围从lng/ml到1000ng/ml)预处理分化成熟 的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒株感染2小时，后用DMEM培养基洗三次， 再加入含10。"胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养； 于感染第8天收集细胞上清，应用同位素"P标记HIV逆转录酶法检测RT。结 果显示，10ng/ml即可明显抑制HIV-1的复制和感染(P<0.05)，且随着剂量增 加，抑制效果更加明显(图5， P<0.01)。说明IFN-入抑制HIV-1在人巨噬细胞 中的复制和感染呈现有剂量效应。 实施例5:比较IFN-1与其他IFN抗HIV-1感染作用
IFN-Xl/人2 ( 100ng/ml ) 、 IFN誦a(1000IU/ml) 、 IFN-p(1000IU/mi;)、IFN-Y(1000IU/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal毒株感染2 小时，后用DMEM培养基洗三次，再加入含10X胎牛血清的DMEM (V/V)培 养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；于感染第8天收集细胞上清，应用同位素34 标记HIV逆转录酶法检测RT。结果显示，IFN-;U/X2抗HIV-1作用与其他型别 干扰素抗HIV-1作用一致，均能明显抑制HIV-1复制，抑制HIV-1 RT活性达到 70%以上；IFN-;U/X2联合应用也具有明显抗HIV-1作用，抑制HIV-1 RT活性达 80% (图6， P<0.05)。说明IFN-X抑制HIV-1在人巨噬细胞中的复制和感染作 用与其他干扰素抑制HIV-1作用类似，而且IFN-X还可联合应用抗HIV-1在人巨 噬细胞中的复制和感染。
实施例6: IFN-入对HIV-1病毒感染前、感染中和感染后的人巨噬细胞的影响
HIV-1病毒感染前
IFN-X1A2 (100ng/ml)预处理分化成熟的人巨噬细胞24小时，HIV-1 Bal 毒株感染2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加入含10%胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；分别于感染第4天、第8天和第 12天收集细胞上清，应用同位素"P标记HIV逆转录酶法检测RT。结果显示， 感染后第4天IFN-人1从2即可抑制HIV-1感染，而且感染后第8天抑制HIV-1感 染效果明显(图7， P<0.01)。 HIV-1病毒感染中
IFN-人l/人2 (100ng/ml)分别和HIV-1 Bal毒株同时感染分化成熟的人巨噬细 胞2小时，后用DMEM培养基洗三次，再加入含10%胎牛血清的DMEM (V/V) 培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；分别于感染第4天、第8天和第12天收 集细胞上清，应用同位素32P标记HIV逆转录酶法检测RT。结果显示，IFN-;U从2 (]00ng/ml)感染后第4天就能抑制了 HIV-1感染，但感染后第8天和第12天 IFN-;U依然能够明显抑制HIV-1感染，而IFNA2却不能抑制HIV-1的感染(图 7， P<0.01)。
HIV-1病毒感染后
HIV-1 Bal毒株感染分化成熟的人巨噬细胞2小时，后用DMEM培养基洗三 次，再加入含IFN-M/X2 (100ng/ml)的10%DMEM (V/V)培养基，37°C， 5%C02 (V/V)培养；每隔4天更换含IFN-;U从2(100ng/ml)的含10%胎牛血清的DMEM(V/V)培养基；分别于感染第4天、第8天和第12天收集细胞上清，应用同 位素32P标记HIV逆转录酶法检测RT。结果显示，IFN-X1/X2感染后第4天就能 抑制HIV-1的感染，随着时间推移，IFN-X1/X2抑制HIV-1感染作用更明显(图 7， P<0.01)。
说明IFN-X抑制HIV-1在人巨噬细胞中的复制和感染具有多途径(病毒感染 前、病毒感染中及病毒感染后)。
上述所有实例试验均重复三次，且分化成熟的人巨噬细胞来源于3个不同 的供体。
权利要求
1、一种λ干扰素在抗人类免疫缺陷病毒中的应用。
2、 一种X干扰素在体外抗人类免疫缺陷病毒感染中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种λ干扰素在抗人类免疫缺陷病毒中的应用。抗HIV感染的IFN-λ能抑制HIV-1在人巨噬细胞中的感染和复制，体现在(1)IFN-λ1/λ2预处理分化成熟的人巨噬细胞，后HIV-1R5型毒株分别感染细胞，用DMEM培养基洗，再加含10％胎牛血清的DMEM培养基培养；(2)感染后，IFN-λ处理组多核巨细胞形成明显少于病毒对照组；检测培养上清中HIV-1逆转录酶和包膜蛋白P24，发现IFN-λ处理组明显低于病毒对照组。分别在感染后检测培养上清中HIV-1RT，感染后抑制HIV-1效果明显，IFN-λ处理组在感染后抑制HIV-1RT活性具有明显的时间和剂量效应关系。IFN-λ抗HIV-1作用与其他干扰素作用相近，具有抗病毒效果。IFN-λ对HIV-1病毒感染前、感染中和感染后的人巨噬细胞，均显示出明显抑制病毒复制作用。
文档编号A61P31/00GK101574515SQ20091006224
公开日2009年11月11日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者炜 侯, 杨占秋, 旭 王, 霍文哲 申请人:武汉大学