专利名称：重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及术后血栓防治药物领域，尤其涉及一种重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体及其制备方法。
背景技术：
在正常生理情况下，凝血-抗凝和纤溶-抗纤溶机制互相平衡，保证 血液在体内正常流动，既不形成血栓，也不至于出血。血栓形成与血栓 溶解机制的失衡使得血栓不适当地形成或者形成后不能被有效清除，导 致组织或器官缺血/坏死；另一方面，抗凝/纤溶过度也会导致出血的发 生。
人工心脏瓣膜置换术后容易形成血栓，通常患者需终生实施抗凝治 疗，这给患者带来了极大的不便和危险。如何解决术后血栓形成并减少 或不用抗凝药物已成为目前研究的焦点。组织型纤溶酶原激活物 (tissue-type Plasminogen Activator, tPA)是机体诱导纤溶激活、 促进血栓溶解的重要因子，也是近年来研究和使用较多的新一代溶栓 剂。目前，人重组tPA作为生物制剂在临床广泛应用于冠心病急性心肌 梗塞、脑栓塞、肺梗塞等的溶栓治疗。现有TPA制剂虽然有着较好的临 床疗效，但其价格昂贵，患者需终身用药，治疗费用高昂，给患者带来 巨大经济负担。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的主要目的在于提供一种重组tPA基 因-壳聚糖纳米粒复合体。
本发明的第二个目的在于提供一种重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复 合体的制备方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，包括壳聚糖纳米粒和重 组tPA基因质粒。
所述壳聚糖纳米粒和重组tPA基因质粒的质量比为1: 1。
所述重组tPA基因质粒含有重组tPA基因、启动子、终止子和筛选 标记基因表达盒。
所述重组tPA基因由1686个碱基组成，其石威基序列如SEQ ID: NO. 1 所示。
一种重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体制备方法，包括以下步骤
1) 壳聚糖纳米粒的制备a)配制壳聚糖醋酸溶液；b)在上述壳 聚糖醋酸溶液中滴入聚乙烯醇水溶液，并在常温下^i力搅拌；c)在所 述搅拌后所得的溶液中滴入丙酮，并磁力搅拌；d)在滴入丙酮并搅拌 后所得的溶液进行均浆处理，得到壳聚糖纳米粒悬液；e)将上述壳聚 糖纳米粒悬液进行真空冷冻，并千燥成粉末；
2) 重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体的制备a)将上述壳聚糖 纳米粒粉末溶于水中，得到壳聚糖纳米粒悬液；b)待上述壳聚糖纳米 粒悬液溶解后，进行过滤除菌；c)在所述除菌后得到的壳聚糖纳米粒 悬液中加入重组tPA基因质粒形成重組tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体。
所述重组tPA基因质粒含有重组tPA基因、启动子、终止子和筛选 标记基因表达盒。
所述重组tPA基因由1686个碱基组成，其碱基序列如SEQ ID NO. 1 所示。
所述步骤l)中壳聚糖醋酸溶液中醋酸与壳聚糖的质量比为1.5: 1。
所述步骤1)中聚乙烯醇水溶液的浓度为10mg/ml，所述聚乙烯醇 水溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为1: 2。
所述步骤2)中，具体是将壳聚糖纳米粒粉末溶于三蒸水中，得到 浓度为2mg/ml的壳聚糖纳米粒悬液。
在步骤2 )中所述重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体中壳聚糖纳米 粒与重组tPA基因质粒的质量比分别为1: 1。
5本发明所述重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体采用壳聚糖这种富 含反应活性位点的天然阳性高分子材料作为纳米构建材料的原料包裹 基因质粒，所得纳米微粒不但无毒、生物相溶性高、生物可降解、可控 制释放、提高生物利用度，而且可吸附带负电荷的基因药物并防止体内
DNA酶的降解，作为水溶性高分子，可解决基因载体制备和转染过程中 的沉淀问题，并可能增加基因治疗的靶向性和增强细胞的穿透性等功 能，以此作为转染用超微载体，有着传统载体系统不可比拟的优越性。
在瓣膜置换术的同时将本发明所述重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复 合体注射于瓣膜对应的心室肌肉内，解决了靶向性问题，会获得包括心 肌细胞在内的多细胞的tPA表达；心肌细胞纤溶活性增强，并显著减少 瓣膜置换术后血栓形成的发生，另外，它可及时消除或避免凝血块的形 成，从而达到避免换瓣术后在瓣周围形成血栓并影响瓣膜功能，TPA仅 仅激活纤溶系统并使已形成的纤维蛋白水解和消除血栓，不影响机体总 -的凝血状态，这样就可能防止因长期使用抗凝剂发生出血等并发症。
本发明所述重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，其用于肠胃外给 药时，可将其制成肌肉注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
本发明所述重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，与其药学上可接 受的载体一起构成用于防止心脏手术后血栓形成的药物，该载体可以是 药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如水等。
图1是重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA构建流程图2是扫描电镜(SEM)检测结果示意图3是壳聚糖-DNA复合物凝胶阻滞实验检测结果示意性反应^f全测结果示意图5是正常心肌细胞抗tPA抗体免疫组化显色呈阴性反应检测结果 示意图6是对照组置换瓣膜周及心腔内可见混合性血栓；图7是实验组12周置换瓣膜周和心腔内未见血栓形成。
具体实施例方式
本发明重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体制备方法主要包括以下 步骤
1、 耳又得重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA,下述实施例1会详细 说明；
2、 采用上述重组tPA基因质粒和壳聚糖，进行重组tPA基因-壳 聚糖纳米粒复合体的制备，下述实施例2会详细说明。
实施例1:重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA的制备
1、 主要试剂
A、 质粒pSecTag2B,购自美国Invitrogen生物/>司，
B、 感受态细胞E.Coli JM109,购自Promega公司，
C、 限制性内切酶HindIII, Kpnl, BamHI和XhoI，购自宝生物工程 有限公司，
D、 T4—DNA连才妄酶，购自New England Biolabs/^司，
E 、 QIAquick Gel Extraction Kit 、 QIAGEN PCR Product Purification Kit,购自QIAGEN/^司。
2、 方法
人工合成三个EST: tPA-l如SEQ ID NO. 2所示、tPA-2如SEQ ID NO. 3 所示和tPA-3如SEQ ID NO. 4所示，分别连接克隆载体，制备成质粒 pOTB6、 pOTB7和pCMV-SP0RT6。
采用三对引物tPA-lF (SEQ ID NO. 5 )和tPA-lR (SEQ ID NO. 6 )、 tPA-2F ( SEQ ID NO. 7 )和tPA-2R ( SEQ ID NO. 8 )、 tPA-3F ( SEQ ID NO. 9 ) 和tPA-3R (SEQ ID NO. 10)分别扩增上面描述的所述质粒pOTB6、 pOTB7 和pCMV-SP0RT6，扩增tPA-l和tPA-3的PCR程序为:94。C预变性4min， 94°C 45sec， 55°C 45sec， 72°C lmin，共25个循环，最后72。C延伸 5min;扩增tPA-2的PCR程序为94。C预变性4min, 94°C 45sec， 60 °C 45sec, 72°C lmin,共25个循环，最后72。C延伸5min。
7将所得产物经QIAGEN PCR Product Purification Kit纯化后分别 用三对限制性内切酶HindiII和Kpnl、 Kpnl和BamHI、 BamHI和Xhol 进行消化，同时用限制性内切酶HindIII和Xhol消化质粒pSecTag 2B， 纯4b方法见QIAGEN PCR Product Purification Kiti兌明书。
将上述酶切产物进行琼脂糖凝月交电泳，QIAquick Gel Extraction Kit回收目的DNA片,史，纯4匕方法见QIAquick Gel Extraction Kit i兌 明书，用T4-DNA连接酶连接上述收回产物，构建出重组tPA基因质粒 pSecTag2B-tPA,构建流程见图1。
实施例2:重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体制备方法 利用实施例1制得的重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA和壳聚糖制 备重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，包括以下步骤 1 )壳聚糖纳米粒的制备
a) 配制1. 5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，其中醋酸与壳聚糖的质量比 为1.5: 1,首先量取2ml分析纯冰醋酸溶液，将其溶于38ml三蒸水中， 再称取60mg的壳聚糖粉末溶于40ml上述醋酸溶液中，即得1. 5 mg/ml 的壳聚糖醋酸溶液；
b) 将浓度为10mg/ral的20ml聚乙烯醇水溶液在磁力搅拌的条件下 緩慢滴入至40ml步骤a )所得壳聚糖醋酸溶液中，此后在常温下持续磁 力搅拌l小时；
c )将2ml分析纯丙酮溶液在磁力搅拌的条件下緩慢滴入至步骤b ) 所得溶液中，持续磁力搅拌l小时；
d) 将步骤c)所得溶液在13500rpm的条件下匀浆处理30s,即得 壳聚糖纳米粒悬液；
e) 将上述壳聚糖纳米粒悬液在20000rpm的条件下进行离心处理2 小时，弃上清，收集沉淀后，用真空冷冻干燥仪将壳聚糖纳米粒悬液冻 干成粉末备用；
2)重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体的制备
a)称取10mg壳聚糖纳米粒冻干粉溶于5ml三蒸水中，得浓度为
82mg/ml的壳聚糖纳米粒悬液；
b )上述壳聚糖纳米粒悬液溶解后经0. 22腿滤膜过滤除菌后保存至 4'C冰箱备用；
c )步骤b )得到的除菌壳聚糖纳米粒悬液中加入重组tPA基因质粒， 再加入生理盐水，旋涡振荡后室温静置30min，即形成重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体悬液，其中壳聚糖与重组tPA基因质粒的质量比分 别为1: 1。
下一步，可以对取得的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体悬液进 行其他分析，比如
实施例3: 对实施例2制得的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体 进行表征分析
1) 重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体粒径大小和Zeta电位的测 定在室温条件下,用Zetasizer 3000仪(Malvern diges t ion mixture was determined spectrophotomet- Instruments, Southborough ， MA ) 进行检测。重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体的形态学观察通过扫 描电镜(SEM)枱r测。扫描电镜(SEM)检测结果见图2,粒径大小30-50nm 左右，大小分布均匀，包封完好，分散性良好，符合实验要求。
2) 重组tPA基因质粒包封率的测定①利用紫外分光光度计测定 所制备的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体悬液中重组tPA基因质粒 的含量。②通过高速离心(40000rpra，20min)收集上清溶液，再用紫外 分光光度计测定其中的重组tPA基因质粒含量。③将离心前测得的重组 tPA基因质粒含量减去离心后上清中的重组tPA基因质粒含量，所得即 为已包裹在纳米粒里面的重组tPA基因质粒含量。重组tPA基因质粒包 封率的测定结果为86. 2%。
3) 壳聚糖纳米粒载体对基因的保护作用分别取3ug棵重组tPA 基因质粒和含有相同重组tPA基因质粒含量的纳米粒悬液，分别与3ul 的Dnase I在37。C的水浴条件下反应2min，再加入2ul的终止液在65 。C的水浴条件下终止消化反应，凝胶电泳看结果。用DNA酶消化后，凝 胶电泳结果显示如图3，纳米对所包裹的重组tPA基因质粒产生保护性效果。
实施例4:重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体预防心脏瓣膜置换术 后血栓形成的效果
1. 材料健康普通家狗12只，体重25-40KG，雄性，8-24月龄。 将其随机分为对照组6只和实—睑组6只。
2. 方法
2.1狗三尖瓣膜置换术和转基因治疗
对照组于常规体外循环下行单纯三尖瓣置换术；实验组于三尖瓣置 换术后将已制备好的纳米基因药物于三尖瓣对应的右心室前壁心肌壁 间多点注射，药物浓度为lmg DNA/lml/只，注射范围2 x 2cm2。与此同 时在注射局部行超声波治疗(频率lkHz,强度0. 5w/cm2，时间30min)。 各组于术前在肝素化之前分别取静脉血10ml行凝血酶原时间和纤溶二 聚体测定观察凝血状态和纤溶活性。术后给予抗生素和常规喂养，观察 生命体征，于术后1周、2周、4周、8周和12周取静脉血测定凝血酶 原时间和纤溶二聚体，同时在基因注射局部相对应的胸壁表面行超声波 治疗(条件同前)。
2. 2标本制作及检测
观察期结束或动物死亡后，取其心脏作大体观察，取左、右心房和 心室壁以及基因注射处心肌组织、肺、肾和肝组织用10%多聚曱醛固定， 常规石蜡包埋，做HE染色和免疫组化染色，观察病理改变和检测转基 因效果；采用间接法冲企测组织内tPA抗原的表达， 一抗为羊抗人tPA多 克隆抗体；二抗为兔抗羊多克隆抗体，操作按试剂说明书进行。
2. 3统计学处理
采用t检验检测两组间结果的差异，当P< 0. 05为统计学上差异具
有显著性。
3. 结果
3. 1转基因效果检测
抗tPA抗体免疫组化方法4全测显示，实验组被转染并表达tPA的阳性信号主要分布于注射基因药物的右心室前壁局部心肌组织，愈近注射 区表达信号愈强，远离注射区逐渐减弱。心肌间质部分成纤维细胞、血 管内皮细胞等可见阳性反应，参见图4。左心室和心房心月几组织未见阳 性反应。此外，肺脏、肝脏和肾脏偶见部分小血管内皮细胞呈弱的阳性 信号，其余细胞均为阴性反应。对照组心脏及其它脏器均为为阴性反应，
参见图5。
3.2 各组动物术后状况
术后共观察12周，对照组共6例，存活时间28—59天，平均存活 40. 33 ±9. 67天；观察期前死亡的动物主要症状为食欲差，体重明显减 轻，咳痰和呼吸困难等，心功能衰竭是主要死亡原因。实验组6例，存 活时间均达到观察期12周(84天)。动物的一般情况良好，术后一周左 右出现轻度食差和体重减轻，经治疗和调理后恢复正常，实验组与对照 组相比存活时间明显延长(p<0. 01)。
3. 3 心脏及其它脏器病理观察
大体动物死亡后观察心脏，各组心包膜局部可见轻度粘连，沿血 流方向切开心脏，见瓣膜缝合良好，无瓣周漏现象。对照组瓣膜表面均 有不同程度的血栓形成，血栓常从瓣环与瓣叶交界处开始沿瓣膜房室两 面向瓣中央发展，阻碍瓣膜活动，参见图6;严重者血栓向上发展填充 右房；向下发展，沿右室至肺动脉。实验组6例瓣膜表面及心腔内均未 见血栓形成参见图7。各组心肌无明显肉眼改变。
镜下实验组于心肌注射的局部可见条带状纤维组织增生及纤维 化，局部心肌间质脂肪浸润，心肌未见明显异常。对照组心腔内和瓣膜 表血栓为混合性血栓，偶伴有轻度感染可见有炎性浸润和局部血栓溶 解；部分肺脏可见肺水肿和轻度间质性肺炎性改变；部分动物可见肝、 肾等有不同程度淤血，肝细胞周围型脂肪变性，肾近曲小管上皮细胞轻 度水变性，余未见异常。
3.4 术后不同时期血D-二聚体含量变化
结果见表l。结果显示，实验组于术后1周静脉血D-二聚体含量较 对照组明显增高并维持至观察期12周结束，各观察周之间比较无显著
ii性差异(P > 0. 05 );对照组静脉血D-二聚体含量一直维持在较低的水平， 各观察期之间亦无显著性差异(P〉0. 05)。
表l:术后不同时间静脉血D-二聚体含量(jug/1, x±s)
时间(周)对照组例数实验组例数
1190. 87 ± 30. 666704. 53 ± 54.76*6
2234. 20 ±86. 906820. 92 ± 48.16*6
4291. 17 ± 51. 686806. 18 ± 127. 32*6
8147. 40 ± 0.001837. 63 ± 62.106
12712. 52 ± 148. 956
备注*实-睑组与对照组比较，P<0. 01
3. 5 术后不同时间凝血酶原时间的改变
如表2所示，术后1、 2和4周两組凝血酶原时间的比4交均无显著差 异(P〉 0. 05 )。术后8周对照组仅存活1例，凝血酶原时间为7. 10± 0. 00, 而实验组平均测得值为6. 83 ±0.59，差异不明显；12周实验组凝血酶 原时间平均为7. 02±0. 12,与本组和其它各期比较均无显著性差异(P 〉0. 05 )。
表2:术后不同时间各组凝血酶原时间(PT,秒，x土s)
时间(周)对照组例数实验组例数
17. 05 ± 0. 7866. 18 ± 0. 926
27. 53± 0. 7666. 42 ± 0. 986
47. 78 ± 1. 0467. 97 ± 1, 346
87. 10 ± 0. 0016. 83 ± 0. 596
127. 02 ± 0. 126
3.6术后不同时间血INR值的变化
表3:术后不同时间血INR值的变化
时间(周)对照组例数实验组例数
10. 64 ±0. 0660. 52 ± 0. 086
20. 62 ±0. 0460. 55 ± 0, 966
40. 63 ± 0. 0560. 60 ± 0. 016
80. 62 ± 0. 0210. 58 ± 0, 056
120. 59 ± 0. 026
12如表3所示，实验各组INR均略低于对照组，但统计学处理显示各
组间的差异没有显著性(P〉0. 05)。序列表
<110>姬尚义
<120>重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体及其制备方法
<160> 10
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 1686
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccagcc aggaaatcca tgcccgattc agaagaggag ccagatctta ccaagtgatc 120
tgcagagatg aaaaaacgca gatgatatac cagcaacatc agtcatggct gcgccctgtg 180
ctcagaagca accgggtgga atattgctgg tgcaacagtg gcagggcaca gtgccactca 240
gtgcccgtca aaagttgcag cgagccaagg tgtttcaacg ggggcacctg ccagcaggcc 300
ctgtacttct cagatttcgt gtgccagtgc cccgaaggat ttgctgggaa gtgctgtgaa 360
atagatacca gggccagctg ctacgaggac cagggcatca gctacagggg cacgtggagc 420
acagcggaga gtggcgccga gtgcaccaac tggaacagca gcgcgttggc ccagaagccc 480
tacagcgggc ggaggccaga cgccatcagg ctgggcctgg ggaaccacaa ctactgcaga 540
aacccagatc gagactcaaa gccctggtgc tacgtcttta aggcggggaa gtacagctca 600
gagttctgca gcacccctgc ctgctctgag ggaaacagtg actgctactt tgggaatggg 660
tcagcctacc gtggtaccca cagcctcacc gagtcgggtg cctcctgcct cccgtggaat 720
tccatgatcc tgataggcaa ggtttacaca gcacagaacc ccagtgccca ggcactgggc 780
ctgggcaaac ataattactg ccggaatcct gatggggatg ccaagccctg gtgccacgtg 840
ctgaagaacc gcaggctgac gtgggagtac tgtgatgtgc cctcctgctc cacctgcggc 900
ctgagacagt acagccagcc tcagtttcgc atcaaaggag ggctcttcgc cgacatcgcc 960
tcccacccct ggcaggctgc catctttgcc aagcacagga ggtcgcccgg agagcggttc 1020
ctgtgtgggg gcatactcat cagctcctgc tggatcctct ctgccgccca ctgcttccag 1080
gagaggtttc cgccccacca cctgacggtg atcttgggca gaacataccg ggtggtccct 1140
ggcgaggagg agcagaaatt tgaagtcgaa aaatacattg tccataaggt tttcgatgat 1200
14gacacttacg acaatgacat tgcgctgctg cagctgaaat cggattcgtc ccgctgtgcc caggagagca gcgtggtccg cactgtgtgc cttcccccgg cggacctgca gctgccggac tggacggagt gtgagctctc cggctacggc aagcatgagg ccttgtctcc tttctattcg gagcggctga aggaggctca tgtcagactg tacccatcca gccgctgcac atcacaacat ttacttaaca gaacagtcac cgacaacatg ctgtgtgctg gagacactcg gagcggcggg ccccaggcaa acttgcacga cgcctgccag ggcgattcgg gaggccccct ggtgtgtctg aacgatggcc gcatgacttt ggtgggcatc atcagctggg gcctgggctg tggacagaag gatgtcccgg gtgtgtacac caaggttacc aactacctag actggattcg tgacaacatg cgaccg
<210> 2
<211> 678
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
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tcgcccagcc aggaaatcca tgcccgattc agaagaggag ccagatctta ccaagtgatc 120
tgcagagatg aaaaaacgca gatgatatac cagcaacatc agtcatggct gcgccctgtg 180
ctcagaagca accgggtgga atattgctgg tgcaacagtg gcagggcaca gtgccactca 240
gtgcccgtca aaagttgcag cgagccaagg tgtttcaacg ggggcacctg ccagcaggcc 300
ctgtacttct cagatttcgt gtgccagtgc cccgaaggat ttgctgggaa gtgctgtgaa 360
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tacagcgggc ggaggccaga cgccatcagg ctgggcctgg ggaaccacaa ctactgcaga 540
aacccagatc gagactcaaa gccctggtgc taegtcttta aggcggggaa gtacagctca 600
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tcagcctacc gtggtacc 678
<210> 3
<211> 385
<212> DNA <213>人工序列
1260 1320 1380 1440 1500 1560
1620 1680
1686<400> 3
ggtacccaca gcctcaccga gtcgggtgcc tcctgcctcc cgtggaattc catgatcctg 60
ataggcaagg tttacacagc acagaacccc agtgcccagg cactgggcct gggcaaacat 120 aattactgcc ggaatcctga tggggatgcc aagccctggt gccacgtgct gaagaaccgc 180
aggctgacgt gggagtactg tgatgtgccc tcctgctcca cctgcggcct gagacagtac 240
agccagcctc agtttcgcat caaaggaggg ctcttcgccg acatcgcctc ccacccctgg 300
caggctgcca tctttgccaa gcacaggagg tcgcccggag agcggttcct gtgtgggggc 360 atactcatca gctcctgctg gatcc 385
<210> 4
<211> 642
<212> DNA <213>人工序列
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<210> 5
<211> 30
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
cccaagctta tggatgcaat gaagagaggg 30<210〉 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400〉 6
ggggtaccac ggtaggctga cccattc 27
<210> 7
<211> 26
<212> DNA <213>人工序列
<400> 7
ggggtaccca cagcctcacc gagtcg 26
<210> 8
<211〉 30
<212> DNA <213>人工序列
<400> 8
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<211> 26
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<400> 9
cgggatcctc tctgccgccc actgct 26
<210> 10
17<211> 26 <212> DNA <213>人工序列
<400> 10
ccctcgaggc ggtcgcatgt tgtcac 2权利要求
1、一种重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，其特征在于包括壳聚糖纳米粒和重组tPA基因质粒。
2、 根据权利要求1所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，其 特征在于所述重组tPA基因质粒含有重组tPA基因、启动子、终止子 和筛选标记基因表达盒。
3、 根据权利要求2所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，其 特征在于所述重组tPA基因由1686个碱基组成，其碱基序列如SEQ ID: NO. 1所示。
4、 一种重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体制备方法，包括以下步骤1) 壳聚糖纳米粒的制备a)配制壳聚糖醋酸溶液；b)在上述壳 聚糖醋酸溶液中滴入聚乙烯醇水溶液，并在常温下磁力搅拌；c)在所 述搅拌后所得的溶液中滴入丙酮，并磁力搅拌；d)在滴入丙酮并搅拌 后所得的溶液进行均浆处理，得到壳聚糖纳米粒悬液；e)将上述壳聚 糖纳米粒悬液进行真空冷冻，并干燥成粉末；2) 重组tPA基因-壳聚糖納米粒复合体的制备a)将上述壳聚糖 纳米粒粉末溶于水中，得到壳聚糖纳米粒悬液；b)待上述壳聚糖纳米 粒悬液溶解后，进行过滤除菌；c)在所述除菌后得到的壳聚糖纳米粒 悬液中加入重组tPA基因质粒形成重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体。
5、 根据权利要求4所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体制备 方法，其特征在于所述重组tPA基因质粒含有重组tPA基因、启动子、 终止子和筛选标记基因表达盒。
6、 根据权利要求5所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体制备 方法，其特征在于所述重组tPA基因由1686个i威基组成，其碱基序 列如SEQ ID NO: 1所示。
7、 根据权利要求4-6任一项所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复 合体制备方法，其特征在于步骤1)中壳聚糖醋酸溶液中醋酸与壳聚糖的质量比为1. 5: 1。
8、 根据权利要求4-6任一项所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复 合体制备方法，其特征在于所述步骤1)中聚乙烯醇水溶液的浓度为 lOmg/ml,所述聚乙烯醇水溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为1: 2。
9、 根据权利要求4-6任一项所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复 合体制备方法，其特征在于所述步骤2)中，具体是将壳聚糖纳米粒 粉末溶于三蒸水中，得到浓度为2mg/ml的壳聚糖纳米粒悬液。
10、 根据权利要求4-6任一项所述的重组tPA基因-壳聚糖纳米粒 复合体制备方法，其特征在于在步骤2)中所述重组tPA基因-壳聚糖 纳米粒复合体中壳聚糖纳米粒与重组tPA基因质粒的质量比分别为1:1。
全文摘要
本发明公开了一种重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体及其制备方法，所述重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体，包括壳聚糖纳米粒和重组tPA基因质粒，所述壳聚糖纳米粒和重组tPA基因质粒的质量比为1∶1。在瓣膜置换术的同时将本发明所述重组tPA基因-壳聚糖纳米粒复合体注射于瓣膜对应的心室肌肉内，解决了靶向性问题，会获得包括心肌细胞在内的多细胞的tPA表达；心肌细胞纤溶活性增强，并显著减少瓣膜置换术后血栓形成的发生，另外，它可及时消除或避免凝血块的形成，从而达到避免换瓣术后在瓣周围形成血栓并影响瓣膜功能。
文档编号A61K9/14GK101537191SQ20091010677
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月21日 优先权日2009年4月21日
发明者姬尚义, 军 季 申请人:姬尚义