专利名称：通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过导入Notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为 神经前体细胞(neural precursor cells )或神经细胞，特别是多巴胺能 神经元，或骨骼肌细胞的方法，还涉及用该方法所获得的神经前体细 胞、神经细胞或骨骼肌细胞和所述细胞的治疗用途以及治疗方法。
背景技术：
在晚期神经退化性病症如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS(肌 萎缩性侧索硬化症)等病中重建神经功能需要取代由细胞死亡所致的 神经细胞丧失。虽然已经使用胚胎或成体神经干细胞、ES细胞和胚胎 神经细胞在动物实验中尝试进行神经细胞移植，然而将其应用于人类 仍面临很大的障碍。使用胚胎千细胞或神经细胞涉及伦理问题，而能 否保证稳定供应也是一个问题。近来，ES细胞的已得到证实的分化能 力得到很多关注，然而除了很多伦理问题外，诱导分化为特定细胞类
型所需的费用和劳动量以及移植后形成畸胎瘤的风险是妨碍该技术稳 定应用的因素。为了使用成体神经干细胞，由于仅在中枢神经系统非
常局限的核心区中发现所述细胞故必需通过开颅术才能提取所述细 胞，因此接受再生治疗的患者也会承受巨大的风险和负担。
虽然中枢神经系统千细胞的体外分离至今已过去了近十年，M在仍不能 通过目前公认的方法分化神经干细胞及获得大量多巴胺能或胆碱能神经元 (Lorenz Studer， Nature Biotechnology Dec. Issue, p.117 (2001))。
由卡尔加里大学(加拿大)的Samuel Weiss教授和Tetsuro Shingo 领导的研究组已通过将几种酪氨酸羟化酶诱导因子的混合物(THcocktail)施用于小鼠脑内而成功地有效诱导产多巴胺神经细胞的分
胆碱能神经元目前仍无先例。
运动神经元是乙酰胆碱能的，且其被认为适于治疗如ALS (肌萎 缩性侧索硬化症)的难治性疾病。在ALS中，原因不明的脊髄运动神 经元死亡导致了肌肉控制神经的丧失，从而妨碍包括呼吸肌在内全身 肌肉的运动，并导致病人在发作后2-3年之内死亡。目前，尚无对这 种病症的有效治疗方法，但正在建立大鼠ALS模型。
大多数退化性肌肉病如肌肉萎缩症是进行性的，因此骨骼肌细胞 移植可构成有效的治疗。在健康的个体中，存在于肌肉组织中的卫星 细胞补充丧失再生力的骨骼肌，但是在进行性肌肉疾病中，所述细胞 数量减少且再生力相应较低。因此，虽然骨骼肌细胞或其前体细胞的 移植可作为治疗方法，但目前仍不存在有效的治疗方法。
在中枢神经系统发育期间，从相对同质的神经前体细胞或神经干 细胞诱导分化神经元和神经胶质细胞。存在这样一种适当的机制，即
胞亚型，而其它细胞保持未分化状态。具体地，先分化细胞对其周围 细胞发送特定信号从而阻止细胞再分化为先分化细胞自身的类型。该 机制已知为侧抑制(lateral inhibition),在果蝇中，已分化为神经元 的细胞表达"Delta"配体，而其周围细胞表达Delta受体"Notch",配 体和受体的结合确保周围细胞不分化为神经细胞(Notch信号传导)。 Delta-Notch系统似乎也在脊髄细胞中起作用(参见例如Chitnis， A.， Henrique, D., Lewis, J.， Ish-Horowicz， D., Kintner, C.: Nature, 375， 761-766 ( 1995))。
一般认为借助膜蛋白Notch的细胞相互作用在发育过程中发挥主 要作用，由此均一细胞群体产生多种不同的类型，特别是依靠通过邻 近细胞的配体刺激，Notch诱导了能够抑制bHLH(碱性螺旋-环-螺旋) 神经分化因子如Mashl、 Mathl和neurogenin的HES1或HES5的表 达，从而抑制分化为与邻近细胞相同类型(参见例如Kageyama等，Saibo Kogaku [Cell Engineeringl Vol. 18， No. 9， 1301-1306 ( 1999))。 目前对Notch细胞内通路存在如下i人识。当Notch首先被邻近细 胞表面上的配体激活时(Delta, Serrate, Jagged )，其细胞内结构域 被剪切掉(Artavanis-TsakonasS等Science ( 1999 ) 284: 770-776 和Kageyama等，Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.l8， No.9， 1301-1306 ( 1999))。在剪切了 Notch的细胞内结构域之后，其在核定 位信号(NLS)辅助下从细胞膜移至核并在细胞核中与DNA-结合蛋 白RBP-jk构成复合物(Honjo T.: Genes Cells (1996) 1: 1-9和 Kageyama等，Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.18 ， No.9 ， 1301-1306 ( 1999))。 RBP-jk本身是转录的DNA-结合抑制物，且在不 存在活化的Notch时，其结合HES1基因(是分化抑制因子)的启动 子，由此阻断其表达；然而， 一经形成RBP-Jk和Notch细胞内结构 域间的复合物，该复合物即转而发挥活化HESl基因的转录的作用(参 见JarriaultS.等Nature ( 1995) 377: 355-358， Kageyama R等: Curr. Opin. Genet. Dev. ( 1997) 7: 659-665和Kageyama等，Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.18, No.9， 1301-1306 ( 1999))。这导 致HESl表达和HESl-诱导的分化抑制。换言之，已经确信Notch借 助HESl而抑制分化(参见Kageyama等，Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.l8， No.9， 1301-1306 ( 1999))。
同样在哺乳动物中，已经很清楚Notch介导的基因表达的调节在 保持神经前体细胞或神经干细胞中和在神经分化的高度多变的过程中 是重要的，且Notch通路对神经系统外的细胞分化也是非常重要的(参 见Tomita K等:Genes Dev. (1999) 13: 1203-1210和Kageyama 等，Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.18 ， No.9， 1301-1306( 1999 ))。 另外，已经预期了 HES-非依赖性Notch通路的存在、Notch信号对 转录水平的负调节和对蛋白水平的负相互作用(参见Goh， M.， Saibo Kogaku
CelEngineering] Vol.18, No.9, 1291-1300 (1999))。而且， 前述所有公开内容教导或提示Notch信号传导在抑制分化方面发挥 作用。不能通过重建来治疗的中枢神经疾病实际上包括人群中多种不同 的具有高发病率的疾病，从损伤诱导的脊髄损伤或脑血管损伤或能导 致失明的青光眼，至神经退化症如帕金森氏病。因此对治疗所述疾病 的神经再生方法的研究是非常紧迫的社会需要，而本发明人的研究结 果确信是应用于人类的一个突破。在门诊病人中通过骨髄穿刺可很容 易地提取骨髄基质细胞，且由于其高增殖性，其可在相对短的时期内 得以大量培养。而且，如果神经从自体骨髄干细胞构建，则可实施自 体移植，故可以预期巨大的优势。不产生免疫排斥将免除使用免疫抑 制剂，故此能使治疗更安全。
而且，由于骨髄干细胞可获自骨髓库，从供应角度来看，该方法 实际上是可行的。如果所述细胞可用于生成神经细胞(迄今为止尚无 有效方法)，则可以在再生医学领域中期待主要效果。
ALS (肌萎缩性侧索硬化症)是一种不明原因脊髄运动神经元细 胞死亡的疾病，其中细胞死亡导致肌肉控制神经的丧失，从而妨碍包 括呼吸肌在内全身肌肉的运动，并导致病人在发作后2-3年之内死 亡，然而目前尚无有效治疗方法。从自体骨髄干细胞构建乙酰胆碱能 神经元将可以进行自体移植，这将提供显著的甚至可治疗ALS的优 势。
目前尚无肌肉疾病如肌肉萎缩症(骨骼肌的退行性疾病)的有效 治疗方法。由于骨格肌细胞从自体骨髄干细胞构建将能允许实施自体 移植，故也能对所述疾病提供显著的优势。使用所述细胞生成骨骼肌 细胞(迄今为止尚无有效方法)，则可以在再生医学领域中期待主要效 果.
该技术不仅可用于临床治疗领域还可用于预期在未来会成为重要 领域的人造器官等工程学领域。如果能在细胞培养水平容易地制备神 经细胞或肌细胞，则可设想用于生成杂合人造器官等。
发明概述
本发明提供了体外诱导骨髄基质细胞分化为神经细胞或骨骼肌细 胞的方法，所述方法包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞中，其中最终得到的分化细胞是已导入Notch基因和/或 Notch信号传导相关基因的骨髓基质细胞分裂的结果。本发明还提供 了一种用于神经变性疾病和骨骼肌退行性疾病的新治疗方法，该方法 使用由前述方法获得的神经前体细胞，神经细胞或骨骼肌细胞。 附图
简述
图，l是代替图的显微照片(相差显微镜)，显示了根据本发明诱 导分化的神经细胞。
图.2是代替图的免疫荧光照片组，显示了根据本发明诱导分化的 神经细胞对MAP-2抗体、神经丝抗体和巢蛋白(nesdn)抗体的阳性 反应。
图.3是代替图的免疫荧光照片组，显示了根据本发明诱导分化的 神经细胞对针对神经递质合成酶酪氨酸羟化酶(TH )和神经递质或神 经递质-相关肽嚢泡乙酰胆碱转运体(vesicular acetylcholine transporter (VAChT))、神经肽Y(NPY)、 P物质(SP)、谷氨酰胺 (Glu)、降钩素基因相关肽(CGRP)和血管活性肠肽(VIP)的抗 体的阳性反应。
图.4是代替图的两个免疫荧光照片，显示了 GDNF处理前后， 根据本发明诱导分化的神经细胞的酪氨酸羟化酶阳性的变化(多巴胺 能神经元分化率)。
图，5显示了 GDNF处理前后，根据本发明诱导分化的神经细胞 的酪氨酸羟化酶阳性的变化(多巴胺能神经元分化率)。
图.6是代替图的一对免疫荧光照片，显示了神经营养蛋白(NTs; 2.5SNGF)处理前后，根据本发明诱导分化的神经细胞的嚢泡乙酰胆 碱转运体阳性的变化(乙酰胆碱能神经元分化率)。
图.7显示了神经营养蛋白(NTs; 2.5SNGF)处理前后，根据本 发明诱导分化的神经细胞的嚢泡乙酰胆碱转运体阳性的变化(乙酰胆 碱能神经元分化率)。
图，8是代替图的显微照片(相差显微镜)，显示了根据本发明诱 导分化的骨骼肌细胞。图.9是代替图的另一显微照片(相差显微镜)，显示了根据本发 明诱导分化的骨骼肌细胞。该照片显示了图.8的骨骼肌随时间的增 加。
图.10是代替图的共焦激光显微照片，显示了根据本发明诱导分 化的骨骼肌细胞的多核特性。核显示为绿色和肌动蛋白纤维显示为红 色。
图.11是显示了将由本发明分化诱导方法获得的多巴胺能神经元 植入大鼠帕金森氏病模型紋状体的治疗效果的两个图。
图.12是代替图的免疫荧光照片组，显示了植入紋状体的细胞不 是神经胶质细胞而是神经细胞和多巴胺能神经元。
图.13是代替图的放大免疫荧光照片组，显示了植入紋状体的细 胞是神经细胞和多巴胺能神经元。
图.14a 14f显示了分离的骨髄基质细胞(MSC)的特征。图.14a 显示大鼠(MSC)的FACS分析结果。该细胞表达CD29 ( pi-整联蛋 白)，CD90 (Thy-1)和CD54 (ICAM)，而不表达CD34 (造血干细 胞标记物)或CDllb/c (巨噬细胞相关标记物)。图.14b和14c是未 处理的大鼠MSC (b)和未处理的人MSC (c)的相差显微照片。图， 14d~14f为人MSC中CD29 ( d )、 CD90 (e)和CD34 (f)的免疫组 织化学照片。MSC为CD29和CD90阳性的，但却是CD34阴性的。 条带代表50 pm。
图.15a-15h显示了 NICD (Notch细胞内结构域)转染后的表 现型。图，15a显示了 NICD转染前(泳道l)和NICD转染后(泳道 2)大鼠MSC中Notch细胞外结构域(ECD)和细胞内结构域(ICD) 的RT-PCR结果。因为在未处理的MSC中检测到了 ECD，故天然表 达少量内源性Notch。然而，在NICD转染之后，ECD下调和NICD 稍上调。图.15b 15g是未处理的大鼠MSC (b， d， f)和NICD-转 染的大鼠MSC (c， e， g)中GLAST (b, c )、 3-PGDH (d， e)和 巢蛋白(f, g)的免疫组织化学照片。条带在b， c， d和g中代表50 jim而在e和f中代表80 nm。图.15h显示了未处理的大鼠MSC(MSC)和NICD-转染的大鼠MSC (NICD)的3-PGDH启动子活 性。3-PGDH的全长型和截短型(M1965)均显示了 NICD转染后启 动子活性增加了 9 ~ 10倍(p<0.01 )。
图.16显示了用不同营养因子处理时，MAP-2ab+细胞转化率。当 营养因子导入未处理的或用对照载体转染的大鼠MSC时，均未检测 到MAP-2ab+细胞。导入三种营养因子(FSK+6FGF+CNTF )显示出 最高神经细胞生成率(96.5%)，而缺少这三种因子的任何一种都会导 致较低的转化率。
图.17a 17q显示了诱导的神经细胞的分析结果。图.17a ~ 17c 是从大鼠MSC ( a, b )和人MSC ( c )中诱导的神经细胞的相差显微 照片。条带在图.17a中表示200 而在图.17b和17c表示50nm。 图.17d 17g和17i 17k是在导入营养因子后，大鼠MSC(f， g， i， j， k)和人MSC (d， e) (5日)中神经元标记物和神经胶质标记物 的免疫组织化学照片。在人MSC中观测到了标记物MAP-2ab (d) 和神经丝-M(e)，而卩3-微管蛋白(f)和TuJ-l (g)在大鼠MSC中 表达。大鼠或人类细胞都不与神经胶质标记物GFAP(I)， GalC(j) 和04(k)反应，条带在d， e和f中表示lOOfim，在g中表示60jim 而在在i k中表示100 nm。图.17h显示了神经细胞的Brd-U标记。 MAP-2ab阳性细胞(Alexa Fluor 488-标记的，绿码)未整合Brd-U
(AlexaFluor546-标记的，红色码)。图.171显示了 MAP-2ab大鼠样 本(1)和GFAP大鼠样本(2 )的蛋白印迹分析结果。泳道1为蛋白 印迹而泳道2为丽春红S染色。未处理的MSC( M )既不表达MAPJab 也不表达GFAP。在导入营养因子后第5日(N), MSC为MAP-2ab 阳性，但仍为GFAP阴性。将脑(B )作为MAP-2ab和GFAP 二者的 阳性对照。图.17m 17q显示了从大鼠MSC ( m )诱导的神经细胞和 从人MSC (n, p)诱导的神经细胞膜片箝测试的结果，与未处理的 MSC (o， p)相比，诱导导致了整流K+电流的显著增加，其在大鼠 MSC ( m )和人MSC ( n )中分别达到约1600 pA和4000pA。图.17q 显示了记录于图，17n中的人MSC的相差显微照片。图.18是一对显示了未处理的大鼠MSCs (MSC)、 NICD-转染的 大鼠MSC ( NICD )和神经诱导的大鼠MSC (诱导的)的Neuro D和 GFAP的相对启动子活性的图。
图.19a~ 19m显示了移植至大鼠帕金森氏病模型的结果。图.19a 显示了营养因子诱导后大鼠MSC中下述神经递质的百分比"氨基丁 酸(GABA); 0.3±0.1，血管活性肠肽(VIP); 0.5±0,1， 5-羟色胺(Ser); 2.0±0.4，谷氨酸(Glu); 2.3±0.7， P物质(SP ); 2.4±0.9, TH; 3.9±0.6, 嚢泡乙酰胆碱转运体(VACht); 5.2±2.4，降钩素基因相关肽(CGRP); 5.3±0.8,神经肽Y(NPY) 6.1±1.6。通过随后施用GDNF， TH-阳 性细胞百分比显著增加至41.0±14.1 (G-TH)。图.19b和19c显示了 营养因子诱导后和然后GDNF处理后的人MSC中TH表达。人MSC 表现出与大鼠MSC相同的反应，在GDNF处理后TH-阳性细胞明显 增加。条带在b中表示100 nm而在c中表示30 nm。图.19d显示了 大鼠MSC中Nurr-l的RT-PCR结果.与营养因子单独"i秀导(N)的 细胞相比，在施用GDNF(Ng)后可观察到增加的Nurr-l上调。图.19e 显示了大鼠MSC中TH的蛋白印迹。在MSC中导入营养因子(N) 后TH表达较弱，但在导入GDNF ( Ng)后则增加。肾上腺髄质(A ) 作为阳性对照。泳道1为蛋白印迹而泳道2为丽春红S染色。图.19f显 示了将大鼠MSC植入紋状体后的行为效果。该图显示了 MSC组
(▲-▲ )， N画MSC组()和G-MSC組(■-■ ) ( *: 0.01<p<0.05; **: p<0.01)中阿朴吗啡诱导的旋转。图.19g 19k是在移植入G-MSC 組中后第IO周时，紋状体中神经丝-M(s)、 TH(h)、 DAT(i)、 GFAP
(j)和04(i)的免疫染色照片。这些标记物的信号全部用Alexa546 标记(红码)。首先用GFP标记移植的大鼠MSC。在g， h和i中观 测到成双的GFP-神经丝、GFP-TH和GFP-DAT，而在GFAP染色或 04染色时不能观测到。条带代表50fim。图.191是一组显示了 GFP-标记的大鼠MSC ( G-MSC组)整合至紋状体中的一组截面图。将在 TH免疫组织化学(红色)后通过图中点所标记的区域显示共焦图像。 条带代表50 jim。图.19m显示了在移植GDNF-处理的人神经MSC后大鼠中阿朴吗啡诱导的旋转。显示了直至移植后4周的来自5只大鼠 (平均旋转0.44±0.2)的结果(每种颜色代表一只大鼠)。 发明详述
本发明人研究了通过导入在骨髄基质细胞形态发生初期中发挥中 心作用的基因刺激骨髄基质细胞，并检测了所述刺激对诱导骨髄基质 细胞分化的影响。具体地，通过导入Notch基因和Notch信号传导基
质细胞时在确定细胞命运中发挥作用)，可以"重新设定(reset)，，骨 髓基质细胞。
重要的是注意到尽管Notch基因和Notch信号传导相关基因涉及 抑制细胞诱导分化机制，完全意料不到地发现是将导入Notch基因 和Notch信号传导相关基因与其它诱导分化的刺激联合，也能诱导分 化已经导入了 Notch基因和Notch信号传导相关基因的特定细胞(而 不是与已经导入了 Notch基因和Notch信号传导相关基因的细胞接触 的细胞)。未证实在本发明分化诱导方法中导入Notch基因和Notch 信号传导相关基因能导致骨髓基质细胞的发育分化重新设定。然而， 通过将该基因导入与根据本发明的其它分化诱导步骤联合，结果能够法。
根据联合步骤(包括导入Notch基因和Notch信号传导相关基因) 的重复实验，本发明人首先成功地有效诱导骨髄基质细胞体外分化为 神经细胞或骨骼肌细胞。而且，已经证实了通过将用分化诱导方法获 得的神经细胞植入大鼠帕金森氏病模型或大鼠视神经损伤相关性视网 膜模型或视神经退化模型，植入的神经确实可以保留并发挥功能，由 此完成了本发明。
令人惊奇的是，通过将Notch基因和Notch信号传导相关基因导 入骨髓基质细胞，通过施用确信与促进神经分化有关的多种因子和细 胞因子，和通过增加被认为是分化开始的一般引发因子的细胞内 cAMP，可以成功地在体外培养条件下将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞。我们不仅证实了神经细胞特异性MAP-2和神经丝的表达， 还证实了神经递质合成酶酪氨酸羟化酶的表达和神经递质如乙酰胆 碱、神经肽Y和P物质的产生。
另一方面，已有人指出由5-氮胞苷(5-AZC)造成的一个或非常 少的几个基因的脱甲基化和活化导致了向成肌细胞的转变(参见 TaylarSM, Jones PA: Cell 17: 771-779， 1979和Nabeshima Y.， Seitai no Kagaku 47 (3 ): 184-189， 1996)。因此，我们将前述Notch基因 和Notch信号传导相关基因导入神经细胞与采用5-氮胞苷(5-AZC ) 处理的前述脱甲基化联合起来。具体地，通过釆用前述脱甲基剂的基 因脱曱基化作用而消除被抑制的表达从而重新设置骨髄基质细胞，随 后导入Notch和Notch信号传导相关基因，并将该基因导入的细胞与 无该基西的骨髓基质细胞共培养，最后用细胞内cAMP的增多剂处理 细胞，其中细胞内cAMP被认为是启动分化的一般引发子，我们成功 地通过体外培养将Notch和Notch信号传导相关基因导入的细胞诱导 分化为骨骼细胞。在最终所得细胞中发现了特征性多核肌管形成和横 紋化，且肌肉-特异性蛋白质即肌细胞生成素和Myf5的表达也在 mRNA水平得到证实。
根据本发明的一个方面，提供了将骨髄基质细胞体外诱导分化为 神经细胞或骨骼肌细胞的方法，所述方法包括将Notch基因和/或 Notch信号传导相关基因导入细胞，其中所得分化细胞是导入了 Notch 基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髄基质细胞的细胞分裂子代。
根据本发明的另一个方面，提供了将骨髄基质细胞体外诱导分化 为神经前体细胞的方法，包括如下步骤
(1) 从骨髄分离骨髄基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养 基中培养细胞；和
(2) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进 一步培养细胞以生成神经前体细胞。
分离的骨髄基质细胞可以是人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的神经前体细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了表达神经前体细胞标记物
GLAST, 3PGDH和巢蛋白的神经前体细胞。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髄基质细胞体外诱导分 化为神经细胞的方法，包括如下步骤
(1) 从骨髄分离骨髄基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养 基中培养细胞；
(2) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进 一步培养细胞，和
(3) 在培养基中加入环AMP-增多剂(augmenting agent)或环AMP 类似物，和/或细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以生成神经细胞，
其中所得分化细胞是导入了 Notch基因和/或Notch信号传导相关 基因的骨髄基质细胞的细胞分裂子代。
标准基本培养基可以是伊格尔氏a改良的最低必需培养基(Eagles alpha modified minimum essential medium), 血清可以是月台牛血清。
Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的导入可通过使用哺乳 动物表达栽体的脂转染法实施。
所述方法还可包括，在步骤(2)和(3)间，在一个预定的时期 选择已经导入了基因的细胞的步骤。
环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素，其浓度可以是 0.001 nM~100 jiM。
细胞分化刺激因子可选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，睫 状神经营养因子(CNTF)及其混合物。
细胞分化刺激因子的浓度可以是0.001 ng/ml~ 100照/ml。
分离的骨髄基质细胞优选为人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的神经细胞。 而根据本发明的另一方面，提供了表达神经细胞标记物P-微管蛋 白同种型3和TuJ-1的神经细胞。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的方法，包括如下步骤
(1) 从骨髄分离骨髓基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养基 中培养细胞；
(2) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进 一步培养细胞，和
(3) 在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或细胞 分化刺激因子，并进一步培养细胞以生成神经细胞；
(4) 在添加了血清的标准基本培养基培养获自步骤(3)的神经细 胞；和
(5) 在培养基中加入神经胶质源性神经营养因子(GDNF)，和环 AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或除神经胶质源性神经营养因子 之外的细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以获得多巴胺能神经元，
其中所得多巴胺能神经元是导入了 Notch基因和/或Notch信号传 导相关基因的骨髄基质细胞的子代。
步骤(4)中的标准基本培养基可以是伊格尔氏a改良的最低必需 培养基。
步骤(4)中的血清可以是胎牛血清。
步骤(5)中的环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。 步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物的浓度可以是0.001 nM ~ 100 jiM。
步骤(5 )中除神经胶质源性神经营养因子以外的细胞分化刺激因 子可选自碱性成纤维细胞生长因子(bFG)、血小板衍生生长因子-AA (PDGF-AA)及其混合物。
步骤(5)中神经胶质源性神经营养因子的浓度可以是0.001 ng/ml ~ 100 jig/ml，优选为1 ng/ml ~ 100 ng/ml。
步驟(5 )中除神经胶质源性神经营养因子以外的细胞分化刺激因 子的浓度可以是0.001 ng/ml ~ 100 ng/ml。
分离的骨髓基质细胞优选是人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的多巴胺能神经元。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髄基质细胞体外诱导分
化为乙酰胆碱能神经元的方法，包括如下步骤
(1) 从骨髓分离骨髄基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养 基中培养细胞；
(2) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进 一步培养细胞；
(3) 在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或细 胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以生成神经细胞；
(4) 在添加了血清的标准基本培养基中培养获自步骤(3)的神经 细胞；和
(5) 在培养基中加入神经生长因子(NGF)，和环AMP-增多剂或 环AMP类似物，和/或除神经生长因子外的细胞分化刺激因子，并进 一步培养细胞以获得乙酰胆碱能神经元，
其中所得乙酰胆碱能神经元是导入了 Notch基因和/或Notch信号 传导相关基因的骨髓基质细胞的子代。
步骤(4)中的标准基本培养基可以是伊格尔氏a改良的最低必需 培养基。步骤(4)中的血清可以是胎牛血清。
步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。步 骤(5)中的环AMP-增多剂或环AMP类似物的浓度可以是0.001 nM ~ 100 nM。
步骤(5 )中除神经生长因子以外的细胞分化刺激因子可选自碱性 成纤维细胞生长因子(bFG)、血小板衍生生长因子-AA (PDGF-AA) 及其混合物。
步骤(5 )中神经生长因子的浓度可以是0.001 ng/ml ~ 100 ng/ml， 优选为1 ng/ml ~ 100 ng/ml。
步骤(5)中除神经生长因子以外的细胞分化刺激因子的浓度可以 是0.001 ng/ml ~ 100 fig/ml。
分离的骨髄基质细胞优选是人类细胞。而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的乙酰胆碱能 神经元。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分
化为骨骼肌细胞的方法，包括如下步骤
(1) 从骨髓分离骨髄基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养
基中培养细胞；
(2) 在培养基中加入脱甲基剂，并进一步培养细胞；
(3) 在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或细 胞分化刺激因子，并进一步培养细胞，
(4) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进 一步培养细胞，
(5) 将导入了所述基因的细胞与没有导入所述基因的未处理骨髓 基质细胞共培养；和
(6) 在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，并进一 步培养细胞以获得骨骼肌细胞，
其中所得分化细胞是导入了 Notch基因和/或Notch信号传导相关
基因的骨髄基质细胞的子代。
标准基本培养基可以是伊格尔氏a改良的最低必需培养基，血清
可以是胎牛血清。
脱甲基剂可以是5-氮胞苷，其浓度为30 nmo1/1 - 300 nmo1/1。 步骤(3)中环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。 步骤(3 )中的环AMP-增多剂或环AMP类似物浓度可以是0.001
nM ~ 100 nM。
细胞分化刺激因子可选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血 小板衍生生长因子-AA (PDGF-AA)、 heregulin，及其混合物，其浓 度可以是0.001 ng/ml ~ 100 jig/ml。 Notch基因和/或Notch信号传导相 关基因的导入可通过使用哺乳动物的表达栽体的脂转染法实施。
所述方法还可包括，在步骤(4)和(5)间，在一个预定的时期 选择已经导入了基因的细胞的步骤。步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。 步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物的浓度可以是0.001 nM~ 100 ^M。
分离的骨髓基质细胞优选是人类细胞。
而根据本发明的另 一方面，提供了用前述方法制备的骨格肌细胞。
而根据本发明的另 一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、 紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述神经前 体细胞施用于发现有疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域， 其中神经前体细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述神经前体细 胞在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物 组合物中的用途。
而根据本发明的另 一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、 紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述神经细 胞施用于发现疾病、紊乱或症状的患者的中枢神经系统区域，其中神 经细胞的存在表现出对疾病、紊乱或症状的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述神经细胞在 制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物组合 物中的用途。
而根据本发明的另 一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、 紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述表达神 经细胞标记物p-微管蛋白同种型3和TuJ-l的神经细胞施用于发现有 疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其中神经细胞的存在 表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另 一方面，提供了治疗有效量的表达神经细胞标 记物P-微管蛋白同种型3和TuJ-l的前述神经细胞在制备用于治疗患 有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途。
而根据本发明的另 一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、 紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述多巴胺能神经元施用于发现有疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域， 其中神经细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述多巴胺能神 经元在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药 物组合物中的用途。
而根据本发明的另一方面，所述疾病、紊乱或病症可以是帕金森
氏病
而根据本发明的另 一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、 紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述乙酰胆 碱能神经元施用于发现有疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区 域，其中神经细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述乙酰胆碱能 神经元在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的 药物组合物中的用途。
所述疾病、紊乱或病症可选自ALS (肌萎缩性侧索硬化症)和阿 耳茨海默氏病。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗患有与肌肉退化相关的疾 病、紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述骨 骼肌细胞施用于患者的肌肉退化区域，其中骨骼肌细胞的存在表现出 对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述骨骼肌细胞 在制备用于治疗患有与肌肉退化相关的疾病、紊乱或病症的患者的药 物组合物中的用途。
所述疾病、紊乱或病症可以是肌肉萎缩症。
在本说明书全文中，术语"骨髄基质细胞"是指存在于骨髄中而不 存在造血系统中的并具有分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等的潜 能的细胞。骨髄基质细胞可通过CD29((31-整联蛋白)、CD90(Thy-l) 和CD54 (ICAM-1)阳性和CD34 (造血干细胞标记物)和CDllb/c (巨噬细胞标记物)阴性而得以鉴别。如本说明书全文中所使用的与诱导分化相关的术语"有效地"是 指通过本发明的分化诱导方法可将所选择的骨髄基质细胞以高转化率 最终转变为神经细胞或骨骼肌细胞。本发明的分化诱导方法的效率为
50%或更高、优选75%或更高、更优选80%或更高、更优选85%或 更高，更优选90%或更高和最优选95%或更高。
如本说明书全文中所使用的术语"神经前体细胞"是指导入Notch 基因和/或Notch信号传导相关基因后即刻可得的骨髄基质细胞，更具 体地，它们是导入营养因子前的细胞。
如本说明书全文中所使用的术语"神经细胞"是指形态学特征为 细胞体和两类突触(树突和轴突)，生物化学特征为与针对p-微管蛋 白同种型3和TuJ-l的抗体反应的神经元。
神经细胞的特征是分泌神经递质、神经递质合成酶或神经递质-相关性蛋白，例如，酪氨酸羟化酶(TH)，嚢泡乙酰胆碱转运体，神 经肽Y和P物质(SP )
酪氨酸羟化酶是多巴胺能神经元的标记物，而囊泡乙酰胆碱转运 体是乙酰胆碱能神经元(通常是运动神经元)的标记物。
如本说明书全文中所使用的术语"神经胶质细胞，，是指在中枢神经 中，在神经元和其突触间发现的星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶 质和上皮细胞。
神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的标记物， 04是少突胶质细胞的标记物。
如本说明书全文中所使用的术语"骨骼肌细胞"是指肌纤维或肌 肉纤维，且其是骨骼肌的单个肌细胞，在形态学上。其特征为具有肌 管形成和横紋化的非常长、细、多核的细胞，而在生物化学上，其特 征在于表达转录调节因子如肌细胞生成素和Myf5.
根据本发明的诱导骨號基质细胞分化为神经细胞或骨骼肌细胞的 方法是新的，因为其包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因 导入前述细胞的步骤。另一新方面是该步骤可以与其它现有技术中的 分化步骤以指定顺序組合。本发明人将根据本发明的所述步骤的选择和最优組合组成了高度显著性的新发现。已知，骨髓基质细胞是能被 诱导分化为成骨细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞和平滑 肌细胞的间充质干细胞或前体细胞，但骨髓基质细胞是否确实能被分 化为神经细胞或骨骼肌细胞则是未知的，尽管已有大量尝试但该目标 尚未成功实现。然而不想受到任何具体理论限制，本发明人推测将
Notch基因和/或Notch基因信号传导相关基因导入前迷细胞中会导致 细胞在发育分化方面的重新设置，并能辅助其他分化诱导处理的功能。
下述实施例更详细地解释本发明，这些实施例应理解为不以任何 方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:神经诱导
从成年大鼠(Wistar大鼠)的骨髓中提取基质细胞并进行培养。 所使用的培养基为含有20%胎牛血清(14-501F, Lot #61-1012， BioWhittaker Co.)的 Minimum Essential Medium Alpha Eagle Modification ( M4526, Sigma Co,)。
在传4代后，当细胞接近80-90%汇合时，导入Notch细胞内结 构域的基因。将Notch细胞内结构域的3.1 kb EcoRI-Xbal片段插入 pCI-neo哺乳动物表达载体(#E1841) ( Promega)的EcoRI-Xbal多 克隆位点以实施重组。采用AlipofectAMINE 2000 ( 11668-027， Gibco BRL)系统实施导入。
于导入后的那一天，将G418石危酸盐(83-5027， Gibco BRL)加 至浓度为200 ng/ml然后用10天时间选择导入的细胞。
在细胞群体恢复至90%汇合后，加入5 nM毛喉素(344273， Calbiochem )、 10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B, Peprotech EC， Ltd.)和50 ng/ml睫状神经营养因子(557-NT, R&D Systems )。
约10日后分析细胞，结果如图.l所示，观测到神经细胞的特征 性形态学。诱导的细胞表现出与抗MAP-2 (MAB364， Chemicon )、 神经丝(814342， Boehringer Manheim )和巢蛋白(BMS4353 ， Bioproducts)的抗体的阳性反应，如图.2中所示。因为MAP-2和神
24经丝是神经细胞的标记物而巢蛋白是神经前体细胞的标记物，因此可 判断诱导的细胞具有神经细胞的特性。
采用抗神经递质合成酶酪氨酸羟化酶(AB151, Chemicon)和神 经递质或神经递质-相关性蛋白嚢泡乙酰胆碱转运体(AB1578, Chemicon)、神经肽Y (RIN7172， Peninsula Lab Inc. )、 P物质 (RPN1572， Amersham Inc.)等的抗体实施试验，如图.3中所示， 显示了细胞对每个抗体约有2~4%的阳性，由此也显示出存在产生神 经递质的神经细胞。
采用该步骤诱导神经细胞，在这一阶段，全部分化诱导的神经细 胞的2.9±0.5%表现出对酪氨酸羟化酶(多巴胺能神经元的标记物)的 反应，如图.5左所示。而且，如图.7左所示，全部分化诱导的神经细 胞的1.78±0.75%表现出对嚢泡乙酰胆碱转运体(通常是运动神经元的 乙酰胆碱能神经元的标记物)的反应。
实施例2:多巴胺能神经元的诱导
在包含10%胎牛血清(14画501F， Lot #61-1012， BioWhittaker Co.),还包括50ng/ml神经胶质源性神经营养因子(GDNF)(人重组 GDNF， #450-10， Peprotech EC Ltd. )、 5 jiM毛喉素(344273， Calbiochem)、 10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B ， Peprotech EC， Ltd.)和5 ng/ml血小板衍生生长因子-AA (396-HB, Peprotech EC Ltd.)的Minimum Essential Medium Alpha Eagle Modification (M4526, Sigma Co.)中培养分化诱导的神经细胞。
该步骤的结果为，与酪氨酸羟化酶反应的多巴胺能神经元增至全 部神经细胞的17.2±5.1%(参见图.5右)。如图.4中照片所示，在GDNF 处理后，用FIPC染成绿色的酪氨酸羟化酶蛋白的比率显著增加。
实施例3:乙酰胆碱能神经元的诱导
在包含10%胎牛血清(14-501F, Lot #61-1012, BioWhittaker Co.),还包含神经生长因子(2.5SNGF， #T002A， Takara )、 5 fiM毛 喉素(344273, Calbiochem)、 10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子 (100-18B, P印rotech EC, Ltd.)和5 ng/ml血小板衍生生长因子-AA(396-HB， Peprotech EC Ltd.)的Minimum Essential Medium Alpha Eagle Modification (M4526， Sigma Co.)中培养实施例1的分化诱 导的神经细胞。
该步骤的结果是，与嚢泡乙酰胆碱转运体反应的乙酰胆碱能神经 元增至全部神经细胞的20.5±0.05% (参见图.7右)。如图.6中照片所 示，在NGF (神经营养因子(Nts))处理后，用FIPC染成绿色的嚢 泡乙酰胆碱转运体蛋白的比率显著增加。
实施例4:骨骼肌诱导
从成年大鼠的骨髄(Wistar大鼠)中提取基质细胞并培养。所使 用的培养基为包含20V。胎牛血清(14-501F, Lot #61-1012， BioWhittaker Co.) 的 Minimum Essential Medium Alpha Eagle Modification ( M4526, Sigma Co.)。
在传4代后，当细胞接近80-卯％汇合时，加入3 fimol/1 5-氮胞苷， 然后毛喉素继续培养24小时。
然后将培养基换为包含5 nM毛喉素(344273, Calbiochem )、 10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B, Peprotech EC, Ltd.)和 5 ng/ml血小板衍生生长因子-AA ( 396-HB, Peprotech EC Ltd.)以及 200ng/ml的heregulin (396画HB， R&D Systems)的培养基，然后再 继续培养7日。
然后采用与实施例l相同的方法导入Notch细胞内结构域基因。
于导入后1日，加入G418硫酸盐(83-5027, GibcoBRL)至浓 度为200 ng/ml然后用10天时间筛选导入的细胞。
在细胞群体恢复至大约100%汇合后，将没有导入基因的未处理 骨髄基质细胞加入培养基中并进行共培养。
3日后，加入5 nM毛喉素(344273 ， Calbiochem )。再过几日后， 该细胞随时间增加(图.9)融合至局部呈现多核的骨骼肌细胞(参见 图.8)。采用共焦激光显微镜观测骨骼肌细胞，如图.10中所示。通过 RT-PCR证实细胞中肌细胞生成素和Myf5 mRNA的表达。电子显微 镜观察显示了骨骼肌细胞的肌纤维特征。实施例5:将采用本发明的分化诱导方法获得的多巴胺能神经元 植入大鼠帕金森氏病模型紋状体中时的治疗效果
我们检测了将采用本发明的分化诱导方法获得的多巴胺能神经元 植入大鼠帕金森氏病模型的效果。已经通过将6-OHDA (6-羟基多巴 胺)注入大鼠脑黑质中而建立了帕金森氏病模型，这些模型用于本试 验(Svendsen等，Exp. Neurol. 137: 376-388 ( 1996); Svensen等， Exp. Neurol. 148: 135-146 (1997"。已知，将阿朴吗啡施用于所述大 鼠模型可刺激旋转运动，旋转增加提示恶化，而旋转降低提示改善。
如图.ll顶部所示，通过将诱导的神经细胞植入紋状体，在9周 的观察期间，每分钟的旋转次数与紧接移植后相比几乎没有变化。在 无处理时，每分钟的旋转次数倾向于逐渐增加(未显示)，因此水平斜 率显示至少阻止了恶化。
如图.ll底部所示，通过将诱导的多巴胺能神经元植入紋状体， 每分钟的旋转次数从移植后的第一周开始降低，在大约半数动物中， 在9周后发现每分钟的旋转次数达到0或1或2，从而得到非常显著 的改善。(在9周后表现为超过8次旋转/分钟的图.11底部中的两例被 认为是表示移植失败因此未在评估中予以考虑。)
为了研究本发明注射(移植)至紋状体中的多巴胺能神经元所分 化出的细胞类型，在10周后提取紋状体组织并将其切片用于免疫組织 化学检测。
使用逆转录病毒将能发出绿色荧光的绿色荧光蛋白(GFP)的基 因整合至骨髓基质细胞染色体。因此，如图.12中免疫荧光照片所示， 诱导分化自骨髄基质细胞的神经细胞，并因此植入紋状体的多巴胺能 神经元，发射绿色荧光。
而且，将红光发射用于作为神经细胞标记物的神经丝，作为多巴 胺能神经元标记物的酪氨酸羟化酶，作为星形胶质细胞(神经胶质细 胞)标记物的GFAP和作为少突胶质细胞(神经胶质细胞)标记物的 04。
因此，GFP产生的绿光和前述标记物产生的红光叠加 成黄光，从而区分移植10周后移植的多巴胺能神经元形成的细胞类型。
如图.12所示，移植10周后几乎所有的紋状体-移植细胞分化为
神经细胞而不是神经胶质细胞。而且，从相当多数量的酪氨酸幾化酶-
阳性的神经细胞(即多巴胺能神经元)中判断，可以得出如下结论，
本发明的体外分化诱导方法将多巴胺能神经元比率增至总神经细胞的
17.2±5.1%，而前述移植进一步增加了该比率。
图.13是放大的免疫荧光照片组，显示了酪氨酸幾化酶的着色。
在图.13中，无论何种细胞类型，细胞核均为蓝色(复染)。蓝色的核
的位置显示了细胞的位置。
该步骤证实了在这些大鼠帕金森氏病模型中，将用本发明的分化
诱导方法得到的多巴胺能神经元植入紋状体中能显著地改善帕金森氏
病的症状。
下述为用于下列实施例6~11中的试验步骤。 试验歩骤
培养骨髄基质细胞
本发明人以前的文献141中描述了从Wistar大鼠骨髄中分离MSC 的方法。人MSC获自商业来源(PT-2501, BioWhittaker， Walkersville， Maryland )和健康供体(根据Kyoto University Graduate School of Medicine的Ethics Committee的指南获得)。采用前述方法
31分离人 MSC。在包含10%胎牛血清(FBS)的a-MEM (M-4526, Sigma， St. Louis, Missouri)中培养细胞。
FACS分析
采用FITC-标记的小鼠抗-CD34 ( Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California),抗-CD54，抗-CD90和抗-CDllb/c或仓鼠 抗國CD29 (PharMingen， San Diego， California )孵育大鼠MSC。用 FITC-标记的抗-小鼠或抗-仓鼠IgG，或者用未免疫小鼠血清孵育对照 组。对人MSC使用藻红蛋白-标记的小鼠抗-CD34 ，抗-CD29 ，抗-CD90 ， 抗-CD54，抗-CDllc和抗-血管性血友病(von-Willebrand)因子。对照 组包括用藻红蛋白-标记的抗-小鼠IgG染色的细胞。获取数据然后用CellQuest软件(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey) 在FACScalibur上分析。 质粒
根据Weinmaster等(1991 ) 39的方法对Notchl进行编号。将 m-Notchl细胞内结构域NICD(开始于氨基酸1703并终止于3，非翻 译区)，TM(氨基酸1747 ~ 2531)， M2(通过突变两个氨基酸Ala-Ala (1992和1993 )为Glu-Phe而修饰自TM ) ( NICD， TM和M2由 Dr.Masashi Kawaichi提供)17 341， mNIC A3，(氨基酸1846-2477， 由Dr.JefferyNye提供)351， RAMIC (氨基酸1703-1969,通过Notl 和AccIII酶切消化获自NICDcDNA)和TADIC(氨基酸2192-2531， 通过XhoI和XbaI酶切消化获自NICD cDNA )的cDNA亚克隆至 pCI-neo哺乳动物的表达载体(Promega， Madison, Wisconsin )。 3-PGDH (全长和M1965 二者)的荧光素酶报告质粒由Dr.Shigeki Furuya29提供，NeuroD由Ming-Jer Tsai州提供，GFAP启动子由 Caleb E Finch4"提供。采用lipofectamine 2000 ( Invitrogen ， Carlsbad, California)将这些质粒转染MSC和并才艮据厂商指南通过 G418进行选择' 神经诱导实验
对于营养因子诱导，将NICD-转化的MSC的亚汇合培养物在包 含10o/o FBS、 5 nM FSK( Calbiochem， La Jolla ， California )、 10 ng/ml bFGF ( Peprotech, London, UK)和10 ng/ml CNTF ( R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)的oc-MEM中孵育。对于GDNF处理，将 50 ng/ml GDNF (Peprotech)加至包含10% FBS的a-MEM培养基 中。
Brd-U标记
在营养因子诱导后(5日)，将Brd-U (lOjiM)加入培养基，然 后培养24小时。然后用4%多聚甲醛的PBS溶液将细胞固定并在 TOTO-3 ( Molecular Probes )复染前进行MAP-2ab和Brd-U双标记。
RT-PCR分析采用SV总RNA提取系统(Promega)分离总细胞RNA。为了 分析不同mRNA的相对表达，将cDNA的量根据来自遍在表达的卩-肌动蛋白mRNA的信号进行标准化。使用Taq聚合酶(Sigma)按标 准步骤实施PCR。循环参数为94。C变性30秒，54-68。C退火l分 钟(依赖于引物)，和72。C延伸，35个循环。
免疫细胞化学
具体步骤如前述[41。 GLAST抗体由Dr.Masahiko Watanabe181提 供，3-PGDH由Dr.Shigeki Furuya191提供。下述一抗为商业购得 巢蛋白(1: 500， PharMingen )、 MAP-2ab ( 1: 250， Sigma )、神经 丝-M(l: 200， Chemicon， Temecula， California )、 P國微管蛋白同种 型3( 1: 400， Sigma )、 TuJ-l( 1: 100， Babco， Richmond, California )、 GFAP( 1:1, DAKO, Carpinteria， California )、 04( 1: 20, Boehringer Mannheim, Germany )、 GalC (1: 30， Chemicon )、 GABA(l: 1000， Sigma )、 5-羟色胺转运体(l: 200， Chemicon )、嚢泡乙酰胆碱转运 体(l: 100， Chemicon )、谷氨酰胺(1: 100， Chemicon),神经肽Y (1: 1000, Peninsula Laboratories Inc., Belmont， California )、 TH (1: 200， Chemicon )、 VIP(l: 500， Incstar, Stillwater, Minnesota )、 CGRP(l: 1200， Amersham， Buckinghamshire, UK)、 SP ( 1: 500， Amersham)、 DAT": 200， Chemicon )。用Alexa Fluor 488-或546-缀合的二抗孵育细胞，然后进行TOTO-3碘化物复染。在共焦激光扫 描显微镜(Radians 2000， Bio-Rad， Hertfordshire, UK)下检测细 胞
报告物测定
才艮据厂商指南用lipofectamine 2000 (Invitrogen )转染细胞。转 染后48小时，采用双荧光酶检测试剂盒(Promega)检测细胞的萤火 虫和肾海鳃(Renilla)荧光酶活性。通过表达肾海鳃荧光酶的质粒将萤 火虫荧光酶值进行校正以测定转染效率。
Western-印迹分析。
制备细胞溶胞产物，然后将50 jig溶胞蛋白在5%和10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。采用碱性磷酸酶检测MAP-2 ( 1: 500， Chemicon)， GFAP(1: 500， Dako)和TH(l: 1000， Chemicon) 抗体的抗原。
电生理学方法
用CEZ-2300 (Nihon Kohden， Tokyo, Japan)膜片箝放大器于 室温(20曙25。C)检测电流。用pClamp6.0软件(Axon Instruments, Inc., Foster City, California )控制数据采集和刺激。在5 kHz滤过 信号并在10 ~ 50 kHz取样。采用吸量管(硼硅玻璃，Narishige， Tokyo, Japan)以4~8 MQ的电阻值在全细胞膜片箝构型中实施实验。为 记录延迟整流钾电流，标准细胞外溶液包含(mM ) NaCl (150 )、 KC1 ( 4 )、 CaCl2 ( 2 )、 MgCl2 ( 2 )、葡萄糖(10 )和H印es (10 )(用 NaOH调为pH 7.4)。标准吸量管溶液为(mM) KC1 (130)、 MgCl2 (5 )、 EGTA (10 )和Hepes (10 )(用KOH调为pH 7,4 )。
帕金森病模型大鼠的分析
在先的报道网中已经公开了建立该病模型的步骤。简言之，用戊 巴比妥钠(40 mg/kg,腹膜内)麻醉成体雄性Wistar大鼠(体重250-300 g)，然后将6-OHDA溶液(8 ng/4 jil 0.1%抗坏血酸盐水)注入左内 侧位前脑束(A/P--4.4 mm;距前囱的L=+l.l mm,距硬脑膜的V--7.7 mm)
将延长的对侧旋转用作目标行为，将在施用阿朴吗啡后(0.8 mg/Kg,皮下)最初30分钟表现为平均低于6旋转/分钟的大鼠排除 出去。将lxl()5细胞/8 nl以下述座标A/P=+0.5mm;距前囟L-+3.0 mm，和V--4.5 mm植入受损的紋状体。MSC组中动物数为5， N-MSC 组中为6和G-MSC组中为10。
为了移植的紋状体(术后10周G-MSC组)的免疫组织化学，用 抗神经丝-M、 TH、 DAT、 GFAP和04的抗体孵育神经胶质切片。然 后在TOTO-3碘化物复染前，通过Alexafluor 546-标记的二抗 (Molecular Probes )进行检测。
对于人MSC的移植，植入5只动物并通过每日 一次皮下注射FK506 ( 1 mg/kg， Fujisawa， Osaka, Japan)来抑制免疫。移植4 周后，检测阿朴吗啡诱导的旋转。为了在HPLC检测多巴胺，制备1 mm 厚的脑冠状切片(距前由A/P+2.5 mm~_1.5 mm;共4片)，从中线 分离，在包含10。/。FBS的a-MEM中分别培养每一面。24小时后， 收集培养基然后通过SRL Communication and Health, Tokyo, Japan 对其进行HPLC分析。所有动物试验均由东京大学医学研究生院的动 物照管和实验委员会(the Animal Care and Experimentation Committee of Kyoto University Graduate School of Medicine)批准。 统计分析
将数据表示为均数士SEM。通过用Bonferroni方法进行配对比较 的ANOVA比较数据。P值<0.05是显著性的，而<0.01是高度显著性 的。
实施例6: MSC的鉴定
将大鼠和人MSC用于下面的试验中。采用前述方法分离大鼠 MSC (Wistar)并培养4。人MSC获自健康供体或购自商业来源 (BioWhittaker )。
采用荧光活化的细胞分选术(FACS)评测大鼠MSC和人MSC 上的细胞表面标记物。MSC表达CD29( pi-整联蛋白)、CD90( Thy-1) 和CD54 (ICAM-1),而不表达CD34 (造血干细胞标记物)，CDllb/c (巨噬细胞-相关性标记物)或血管性血友病因子(人内皮细胞标记物， 数据未显示)(图.14a )。该数据与在先报道相符3' "1。通过免疫细胞 化学检测可以获得相似的结果(图.14b-f )。根据Pittenger等(1999 )31所述的方法证实来自大鼠和人MSC 二者的脂肪性、软骨形成性和成 骨性分化。这提示该细胞是间充质细胞来源(数据未显示)。
实施例7: NICD转染对MSC的效果
将NICD转染至MSC中，因为在Notch蛋白的细胞内结构域中 发现Notch信号传导活性且除去细胞外结构域能得到Notch的组成型 活性形式161。 NICD包括编码小鼠Notch的细胞外小结构域部分，跨 膜区和整个细胞内结构域171的序列，并由the Nara Institute of Scienceand Technology的Dr.Kawaichi提供。将该片段亚克隆至pCI-neo (包 含CMV启动子的哺乳动物表达载体)，然后通过脂转染法和随后的 G418选择将其转染至MSC中。
由于检测到Notch细胞外和细胞内结构域，因此未处理的MSC 表达少量内源性Notch。然而，NICD-转染的MSC仅主要表达NICD， 而未检测到细胞外结构域的(图.15a)。
在神经干细胞(NSC )和放射状胶质中存在谷氨酸转运体GLAST 和3-磷酸甘油脱氢酶(3PGDH)18' 191。其被认为与干细胞直系相关， 在胚胎发生时可作为神经元的来源[2()1。成年小鼠海马的齿状回中的溴 脱氧尿苷(Brd-U)-阳性的NSC几乎总是3PGDH免疫阳性的[191。 在NICD转染后，大鼠MSC上调这些分子以及已知为NSC和神经祖 细胞(NPC)标记物的巢蛋白二者的转录和表达211。未处理的MSC 差不多没有表现出GLAST或3PGDH的表达，但非常少部分的细胞 是巢蛋白阳性的(0.74±0.1%)。然而，在NICD转染后，这些细胞上 调GLAST， 3PGDH和巢蛋白(4.92±1.0%， p<0.01)(图.15b-g)。在 荧光酶启动子检测中，NICD转染后大鼠MSC中5，-侧翼全长(核苷 酸-3742~-1)和5，-侧翼M1965 (-1792~-1) 3PGDH活性(二者均 报道在放射状胶质和神经上皮干细胞中具有活性191 )显著增加 (p<0.01)(图.15h )。(启动子由Dr. S. Furuya， Brain Science Institute, RIKEN提供)。
在脊推动物中，NSC和神经嵴干细胞通过神经分化抑制而形成神 经胶质13' 14' 161。本发明人已经证实了将NICD插入大鼠NSC中能生 成GFAP-阳性的星形胶质细胞，但在NICD-转染的MSC发现了非常 少的GFAP-阳性细胞(数据未显示)。另一方面，已经报道了将激活 的Notchl导入小鼠前脑能在胚胎发生期间促进放射状胶质151同一性。 由于MSC在导入NICD后表达NSC和NPC相关标记物，故可以合 理地推断NICD转染使MSC将其表型变为类似于NSC和/或NPC。
NICD-转染的MSC中的神经诱导
本发明人研究了从NICD-转染的MSC选择性生成神经细胞所需的条件。因此我们检测了已知作用于神经发生的多种因子問(神经营
养因子、白血病抑制因子、bFGF和CNTF)和毛喉素。我们发现神 经细胞的特定诱导最有效的条件是同时导入FSK、 bFGF和CNTF。 (下文中指"营养因子导入")。
在NICD转染至大鼠MSC后，将细胞培养至60 ~ 70%汇合并导 入三种营养因子(FSK+pFGF+CNTF )， 5日后96.5±0.6%的细胞为 MAP-2ab阳性(图.16，图.17a ~ d )。本发明人发现单用bFGF时 MAP-2ab-阳性率为73.2士5.1。/。而再加入FSK和CNTF时为87.5±3.1% 和83.6±3.4%。该差异不具有显著性(p>0.05 )(图.16 )。 FSK和CNTF 分别单独产生的阳性率为29.2±5.4和4.3±1.9% ( p<0.01)而同时产生 的阳性率为11.4±2.4% (图.16)。
营养因子对MAP-2ab细胞的诱导最有可能是通过抑制MSC向神 经胶质和其它细胞分化而导致的，而不是通过特异性杀死非-神经细 胞，因为在营养因子诱导后通过TOTO-3核染色几乎没有观测到死亡
细胞(数据未显示)。
营养因子自身的诱导，或在插入没有NICD的pCI-neo对照载体 后，导致无可识别的神经表型(图.16)。因此，NICD转染可能对MSC 神经诱导非常重要。
MSC神经细胞的表征
来自前述大鼠和人MSC的神经细胞显示了明确的神经元形态学 特征，所述特征包括具有丰富膨体的神经突样突起，和表达典型神经 标记物如神经丝-M，卩3-微管蛋白和Tujl (图，17a-g)。巢蛋白-阳性细 胞虽然很少，但仍能识别(2.03±0.7%)(数据未显示)。诱导的神经细 胞在用胰蛋白酶处理后传代培养时不能增殖。营养因子诱导后5日， Brd-U的掺入研究显示了 MAP-2ab阳性细胞的最小标记(图.17h )， 这提示这些神经细胞不进行有丝分裂。
在未处理的MSC中通过蛋白印迹未检测到MAP-2ab，而在营养 因子诱导后则可检测到(图.171 (1 ))。
延迟整流钾电流随发育而增高与细胞兴奋性和神经分化的成熟相关向。本发明人通过采用电位钳法在诱导的神经细胞研究了该特性。
在来自大鼠和人类的诱导的MSC中通过正电压步骤引发外向整流K+ 电流。该电流幅度显著性高于未处理的MSC中的电流(图.17m-q)。 本发明人还研究了紧接全细胞构型形成后，在电流钳条件下的静息膜 电位。神经细胞中的静息膜电位比未处理的MSC中的低(分别是-50~ -60 mV和-30~ -40 mV )。这些在MSC ^秀导的神经生理学特性与成熟 神经元中的类似。
在对神经胶质细胞的检测中，本发明人实施了免疫细胞化学，其 中釆用GFAP作为星形胶质细胞的标记物，半乳糖脑苷脂(GalC)和 04作为少突胶质细胞的标记物。大鼠或人MSC的营养因子诱导后未 发现标记物-阳性神经胶质细胞(图.17i-k)。该现象由蛋白印迹得到证 实(图.171(2)X为进一步证实神经诱导的特异性，本发明人检测了 NeuroD和GFAP的启动子活性。在未处理的大鼠MSC中，NeuroD 和GFAP的比率分别为67.2±15.3和5.16±1.36。然而，营养因子诱导 后，NeuroD活性显著性增至132.7±20.9而GFAP降至0.63±0.22(图. 18)。这些结果显示了在营养因子诱导后仅从NICD-转染的MSC特 异性诱导了神经细胞。
TH-阳性细胞的生成
神经功能与细胞类型特异性神经递质密切相关。因此，本发明人 在营养因子诱导后进行神经递质和相关蛋白的免疫细胞化学检测(图. 19a)。已知，GDNF与中脑多巴胺能神经元的发生和发展有关1361。本 发明人还检测了 GDNF的施用是否诱导神经MSC增加其酪氨酸羟化 酶(TH)-阳性细胞的比率。该比率从营养因子单独诱导后的3.9±0.6% 增至施用GDNF后的41.0±14.1% (图.19a-c )。 GDNF还诱导Nurr-l 的表达，Nurr-l是在中脑前体分化为多巴胺能神经无中发挥作用的转 录因子同(图.19d)。蛋白印迹进一步证实了这些结果(图.19e)。
将神经细胞移植至帕金森氏病模型大鼠
为了研究来自MSC的神经细胞的体内存活能力和功能，将大鼠 和人类细胞植入帕金森氏病模型大鼠紋状体。在中前脑束中单侧施用6-OHDA选择性破坏了黑质中的多巴胺能神经元，由此提供帕金森氏 病的有用模型。植入用绿色荧光蛋白(GFP)41标记的三种类型的大 鼠MSC : 1)未处理的(MSC组)，2)用营养因子诱导变成神经细 胞后(N-MSC组)，和3 )诱导后施用GDNF ( G-MSC组)。动物接 受在受损紋状体同侧植入lxl()SMSC。在细胞植入后，用IO周的时间 检测阿朴吗啡诱导的旋转行为。MSC组显示偏离受损侧的旋转，并一 直持续，而N-MSC组显示了随时间轻微恢复。相反，G-MSC组显示 了旋转行为的显著性恢复(图.19f)。移植的动物追踪观察16周，在 脑中未发现肿瘤形成。
植入脑后IO周实施组织化学检测，包括免疫组织化学检测。移植 的紋状体显示了 GFP-阳性细胞，而移植细胞为神经丝阳性的，并且 在不多的情况中，显示出用抗-GFAP或抗-04抗体标记。^艮多移植细 胞还是TH和多巴胺转运体(DAT)阳性的(图.19g-k)。 GFP-标记 的MSC中GFAP-阳性细胞的百分数为2.5±1.4%，而TH-和DAT-阳 性细胞的百分数分别为45.7±4.2%和30.7 ±0.9%。在G-MSC组的连 续切片中，发现移植细胞移入并在宿主紋状体中延伸(图.191)。在紋 状体中细胞计数大约为3.4xl04 (34%)。
将人GDNF-处理的神经MSC同样植入6-OHDA-受损大鼠的紋状 体。每日用FK 506对动物实施免疫抑制，在4周记录旋转行为。移 植导致旋转行为的显著改善(平均旋转指数，术后/前，为0."士0.2) (图.19m)。采用高效液相色谱法(HPLC)检测移植脑切片的培养 基中多巴胺浓度从而评测植入的人MSC合成和释放多巴胺的能力。 从中线将脑切片，分为植入侧和完整侧，然后分开培养。检测每侧的
培养基中多巴胺浓度并计算受损与完整侧的比率。伪操作 (sham-operated)的大鼠显示比率为0.57±0.01 ( n=3 )而移植动物的比 率为0.67±0.04 ( n-3 )。这与移植的多巴胺释放的增加(p=0.04 ) —致。 这些结果提示了从人MSC诱导的细胞能够在受损的大鼠紋状体中合 成和释放多巴胺。本发明还涉及如下项目
项目1. 一种将骨髄基质细胞(BMSC )体外诱导分化为神经细胞 或骨骼肌细胞的方法，包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基 因导入所述BMSC，其中所得分化细胞是导入了 Notch基因和/或 Notch信号传导相关基因的BMSC的子代。
项目2. —种将BMSC体外诱导分化为神经前体细胞的方法，包 括如下步骤
(l)从骨髓分离BMSC,和在添加了血清的标准基本培养基中 培养所述细胞；和
(2 )将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入所述细胞， 和进一步培养所述细胞以生成神经前体细胞。
项目3.根据项目2的方法，其中所述分离的BMSC源自人类。 项目4.用根据项目2或3的方法制备的神经前体细胞。 项目5.表达神经前体细胞标记物GLAST， 3PGDH和巢蛋白的 神经前体细胞。
项目6. —种将BMSC体外诱导分化为神经细胞的方法，包括如 下步骤
(l)从骨髄分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中 培养所述细胞；
(2 )将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入所述细胞，
和进一步培养所述细胞，和
(3)在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP)-增多剂或cAMP
类似物，和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述
神经细胞，其中所得分化细胞是导入了 Notch基因和/或Notch信号传
导相关基因的BMSC的子代。
项目7.根据项目6的方法，其中所述标准基本培养基是伊格尔氏
a改良的最低必需培养基。
项目8.根据项目6的方法，其中所述血清是胎牛血清。
项目9.根据项目6的方法，其中所述导入所述Notch基因和/或Notch信号传导相关基因通过使用能在哺乳动物表达的载体的脂转染 法实施。
项目10.根据项目6的方法，还包括，在步骤(2)和(3)间， 在一个预定的时期选择已经导入了基因的细胞的步骤。
项目11.根据项目6的方法，其中所述cAMP-增多剂或cAMP类 似物是毛喉素。
项目12.根据项目6的方法，其中所述cAMP-增多剂或环cAMP 类似物浓度是0.001 nM ~ 100 jiM。
项目13.根据项目6的方法，其中所述细胞分化刺激因子选自碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)、睫状神经营养因子(CNTF)及其 混合物。
项目14.根据项目6的方法，其中所述细胞分化刺激因子的浓度 是0.001 ng/ml ~ 100 ng/ml。
项目15.根据项目6~14任一项的方法，其中所述分离的BMSC 源自人类。
项目16.用根据项目6~14任一项的方法制备的神经细胞。 项目17.用才艮据项目15的方法制备的神经细胞。 项目18.表达神经细胞标记物p-微管蛋白同种型3和TuJ-l的神 经细胞。
项目19. 一种将BMSC体外诱导分化为多巴胺能神经元的方法， 包括如下步骤
(1) 从骨髄分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中 培养所述细胞；
(2) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞，
(3) 在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP)增多剂或cAMP 类似物，和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述 神经细胞；
(4) 在添加了血清的标准基本培养基中培养步骤(3)中得到的神经细胞；和
(5) 在所述培养基中加入神经胶质源性神经营养因子 (GDNF),和cAMP增多剂或cAMP类似物，和/或除所述GDNF外 的细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以获得所述多巴胺能神 经元，
其中所得多巴胺能神经元是导入了所述Notch基因和/或Notch信 号传导相关基因的BMSC的子代。
项目20.根据项目19的方法，其中步骤(4)中的所述标准基本 培养基是伊格尔氏a改良的最低必需培养基。
项目21.根据项目19的方法，其中步骤(4)中的所述血清是胎 牛j6l清。
项目22.根据项目19的方法，其中步骤(5)中的所述cAMP增 多剂或cAMP类似物是毛喉素。
项目23.根据项目19的方法，其中步骤(5)中的所述cAMP-增多剂或cAMP类似物的浓度是0,001 nM~ 100 nM。
项目24.根据项目19的方法，其中步骤(5)中除所述GDNF以 外的所述细胞分化刺激因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF )、 血小板衍生生长因子-AA (PDGF-AA)及其混合物。
项目25.根据项目19的方法，其中步骤(5)中所述GDNF的浓 度是0.001 ng/ml ~ 100 ng/ml。
项目26.根据项目19的方法，其中步骤(5)中所述GDNF的浓 度是1 ng/ml ~ 100 ng/ml。
项目27.根据项目19的方法，其中步骤(5)中除GDNF以外的 所述细胞分化刺激因子的浓度是0.001 ng/ml ~ 100 jig/ml。
项目28.根据项目19 27任一项的方法，其中所述分离的BMSC 源自人类。
项目29.用根据项目19~27任一项的方法制备的多巴胺能神经元。
项目30.用^l据项目28的方法制备的多巴胺能神经元。项目31. —种将BMSC体外诱导分化为乙酰胆碱能神经元的方 法，包括如下步骤
(1) 从骨髄分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中 培养所述细胞；
(2 ) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞；
(3 ) 在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP )-增多剂或cAMP 类似物，和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述 神经细胞；
(4) 在添加了血清的标准基本培养基中培养步骤(3)中得到 的神经细胞；和
(5) 在所述培养基中加入神经生长因子(NGF)和cAMP-增 多剂或cAMP类似物和/或除NGF外的细胞分化刺激因子，和进一步 培养所述细胞以获得所述乙酰胆碱能神经元，
其中所得乙酰胆碱能神经元是导入了所述Notch基因和/或Notch 信号传导相关基因的BMSC的子代。
项目32.根据项目31的方法，其中步骤(4)中所述标准基本培 养基是伊格尔氏a改良的最低必需培养基。
项目33.根据项目31的方法，其中步骤(4)中所述血清是胎牛 血清。
项目34.根据项目31的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多 剂或cAMP类似物是毛喉素。
项目35.根据项目31的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多 剂或cAMP类似物的浓度是0.001 nM~ 100 fiM。
项目36.根据项目31的方法，其中步骤(5)中所述除NGF以 外的细胞分化刺激因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小 板衍生生长因子-AA (PDGF-AA)及其混合物。
项目37.根据项目31的方法，其中步骤(5)中所述NGF的浓 度是0.001 ng/ml ~ 100 jig/ml。项目38.根据项目37的方法，其中步骤(5)中所述NGF的浓 度为1 ng/ml~ 100 ng/ml。
项目39.根据项目31的方法，其中步骤(5)中所述除NGF以 外的细胞分化刺激因子的浓度是0.001 ng/ml~ 100 jig/ml。
项目40.根据项目31~39任一项的方法，其中所述分离的BMSC 源自人类。
项目41.用根据项目31~39任一项的方法制备的乙酰胆碱能神 经元。
项目42.用根据项目40的方法制备的乙酰胆碱能神经元。 项目43. —种将BMSC体外诱导分化为骨骼肌细胞的方法，包括 如下步骤
(1) 从骨髄分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中 培养所述细胞；
(2) 在所述培养基中加入脱甲基剂，和进一步培养所迷细胞；
(3) 在所述培养基中加入cAMP-增多剂或cAMP类似物，和/ 或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞；
(4) 将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞，和
(5 ) 将导入了所述基因的所述细胞与没有导入所述基因的未 处理的BMSC共培养；和
(6 ) 在所述培养基中加入cAMP-增多剂或cAMP类似物，和 进一步培养所述细胞以获得所述骨辂肌细胞，
其中所得分化细胞是导入了所述Notch基因和/或Notch信号传导
相关基因的BMSC的子代。
项目44.根据项目43的方法，其中所述标准基本培养基是伊格尔
氏a改良的最低必需培养基。
项目45.根据项目43的方法，其中所述血清是胎牛血清。 项目46.根据项目43的方法，其中所述脱甲基剂是5-氮胞苷。 项目47.根据项目43的方法，其中所述5-氮胞苷的浓度为30nmol/1 ~ 300 ,。1/1。
项目48.根据项目43的方法，其中步骤(3)中所述cAMP-增多 剂或cAMP类似物是毛喉素。
项目49.根据项目43的方法，其中步骤(3)中所述的cAMP-增多剂或cAMP类似物浓度是0.001 nM 100jiM。
项目50.根据项目43的方法，其中所述细胞分化刺激因子选自碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子-AA (PDGF-AA)、 Heregulin,及其混合物。
项目51.根据项目43的方法，其中所述细胞分化刺激因子的浓度 是0.001 ng/ml ~ 100 jig/ml。
项目52.根据项目43的方法，其中所述导入所述Notch基因和/ 或Notch信号传导相关基因通过使用能在哺乳动物中表达的载体的脂 转染法实施。
项目53.根据项目43的方法，其中还包括，在步骤(4)和(5) 间，在一个预定的时期选择已导入了所述基因的细胞的步骤。
项目54.根据项目43的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多 剂或cAMP类似物是毛喉素。
项目55.根据项目43的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多 剂或cAMP类似物的浓度是0.001 nm - 100 nm。
项目56.根据项目43 55任一项的方法，其中所述分离的BMSC 源自人类。
项目57.用根据项目43~55任一项的方法制备的骨骼肌细胞。 项目58.用根据项目56的方法制备的骨骼肌细胞。 项目59. —种治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的 患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的项目4中的神经前体细胞 施用于发现有所述疾病、奮乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其 中神经前体细胞的存在对所述疾病、紊乱或病症具有治疗效果。
项目60.治疗有效量的项目4中的神经前体细胞在制备用于治疗 患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物組合物中的用途。
项目61.治疗有效量的项目5中的神经前体细胞在制备用于治疗 患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的 用途。
项目62. —种治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的 患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的项目17中的神经细胞施用 于发现患有涉及疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其中 神经细胞的存在对所述疾病、紊乱或病症具有治疗效果。
项目63.治疗有效量的项目17中的神经细胞在制备用于治疗患 有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用 途。
项目64. —种治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的 患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的项目18中的神经细胞施用 于发现有所述疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其中所 述神经细胞的存在对所述疾病、紊乱或病症具有治疗效果。
项目65.治疗有效量的项目18中的神经细胞在制备用于治疗患 有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用 途。
项目66. —种治疗患有涉及中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患 者的方法，所述方法包括将治疗有效量的项目30中的多巴胺能神经元 施用于发现有所述疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其 中所述神经细胞的存在对所述疾病、紊乱或病症具有治疗效果。
项目67.根据项目66中的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是帕 金森氏病。
项目68.治疗有效量的项目30中的多巴胺能神经元在制备用于 治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物 中的用途。
项目69.根据项目68中的用途，其中所述疾病、紊乱或病症是帕 金森氏病。项目70. —种治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的 患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的项目42中的乙酰胆碱能神 经元施用于发现有所述疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域， 其中所述神经细胞的存在对所述疾病、紊乱或病症具有治疗效果。
项目71.根据项目70中的方法，其中所述疾病、紊乱或病症选自 肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和阿耳茨海默氏病。
项目72.治疗有效量的项目42中的乙酰胆碱能神经元在制备用 于治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合 物中的用途。
项目73.根据项目72中的用途，其中所述疾病、紊乱或病症选自 肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和阿耳茨海默氏病。
项目74. —种治疗患有与肌肉退化相关的疾病、紊乱或病症的患 者的方法，所述方法包括将治疗有效量的项目58中的骨骼肌细胞施用 于患者的肌肉退化区域，其中所述骨骼肌细胞的存在对所述疾病、紊 乱或病症具有治疗效果。
项目75.根据项目74中的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是肌 肉萎缩症。
项目76.治疗有效量的项目58中的骨骼肌细胞在制备用于治疗 患有与肌肉退化相关的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用 途。
项目77.根据项目76中的用途，其中所述疾病、紊乱或病症是肌 肉萎缩症。参考文献
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权利要求
1.治疗有效量的神经前体细胞在制备用于治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述神经前体细胞通过包括以下步骤的方法体外产生(1)从骨髓分离骨髓基质细胞(BMSC)，和在添加了血清的标准基本培养基中培养所述细胞；和(2)将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞以生成所述神经前体细胞。
2. 治疗有效量的神经前体细胞在制备用于治疗患有涉及中枢神经 系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述神经前体细胞通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨髄分离骨髄基质细胞(BMSC)，和在添加了血清的标准 基本培养基中培养所述细胞；和(2) 将包含编码Notch细胞内结构域的序列的核酸导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞以生成所述神经前体细胞。
3. 治疗有效量的神经细胞在制备用于治疗患有涉及中枢神经系统 的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述神经细胞通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨徵分离骨髄基质细胞(BMSC),和在添加了血清的标准 基本培养基中培养所述细胞；(2) 将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞；和(3 )在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP )-增多剂和/或第一细 胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述神经细胞，其中 所得分化细胞是导入了所述Notch基因的BMSC的子代。
4. 治疗有效量的神经细胞在制备用于治疗患有涉及中枢神经系统 的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述神经细胞通过包括以下步骤的方法体外产生 (1)从骨髄分离骨髄基质细胞(BMSC),和在添加了血清的标准基本培养基中培养所述细胞；(2)将包含编码Notch细胞内结构域的序列的核酸导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞；和(3 )在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP)-增多剂和/或第一细 胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述神经细胞，其中 所得分化细胞是导入了所述核酸的BMSC的子代。
5. 治疗有效量的多巴胺能神经元在制备用于治疗患有涉及中枢神 经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述多巴胺能神经元通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨髄分离BMSC,和在添加了血清的标准基本培养基中培 养所述细胞；(2) 将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞；(3) 在所述培养基中加入cAMP-增多剂和/或第一细胞分化刺激 因子，和在添加了血清的标准基本培养基中进一步培养所述细胞；和(4) 在所述培养基中加入神经胶质源性神经营养因子(GDNF)， 和cAMP增多剂和/或除所述GDNF外的第二细胞分化刺激因子，和进一 步培养所述细胞以获得所述多巴胺能神经元，其中所得多巴胺能神经元是导入了所述Notch基因的BMSC的子代。
6. 治疗有效量的多巴胺能神经元在制备用于治疗患有涉及中枢神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述多巴胺能神经元通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨髓分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培 养所述细胞；(2) 将包含编码Notch细胞内结构域的序列的核酸导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞；(3) 在所述培养基中加入cAMP-增多剂和/或第一细胞分化刺激 因子，和在添加了血清的标准基本培养基中进一步培养所述细胞；和(4) 在所述培养基中加入神经胶质源性神经营养因子(GDNF)，和cAMP增多刑和/或除所述GDNF外的第二细胞分化刺激因子，和进一 步培养所迷细胞以获得所述多巴胺能神经元，其中所得多巴胺能神经元是导入了所述核酸的BMSC的子代。
7. 治疗有效量的乙醜胆碱能神经元在制备用于治疗患有涉及中枢 神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述乙酰胆碱能神经元通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨髓分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培 养所述细胞；(2) 将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞；(3) 在所述培养基中加入cAMP-增多剂和/或第一细胞分化刺激 因子，和在添加了血清的标准基本培养基中进一步培养所述细胞；和(4) 在所述培养基中加入神经生长因子(NGF)，和cAMP增多剂 和/或除所述NGF外的第二细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以获得所述乙酰胆碱能神经元，其中所得乙酰胆碱能神经元是导入了所述Notch基因的BMSC的子代。
8. 治疗有效量的乙酰胆碱能神经元在制备用于治疗患有涉及中枢 神经系统的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述乙酰胆碱能神经元通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨髄分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培 养所述细胞；(2) 将包含编码Notch细胞内结构域的序列的核酸导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞；(3) 在所述培养基中加入cAMP-增多剂和/或第一细胞分化刺激 因子，和在添加了血清的标准基本培养基中进一步培养所述细胞；和(4) 在所述培养基中加入神经生长因子(NGF)，和cAMP-增多 剂和/或除所述NGF外的第二细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细 胞以获得所述乙酰胆碱能神经元；其中所得乙酰胆碱能神经元是导入了所述核酸的BMSC的子代。
9. 治疗有效量的骨骼肌细胞在制备用于治疗患有与肌肉退化相关 的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述骨骼肌细胞通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨髄分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培 养所述细胞；(2) 在所述培养基中加入脱甲基剂，和进一步培养所述细胞；(3 )在所述培养基中加入cAMP-增多剂和/或细胞分化刺激因子， 和进一步培养所述细胞；(4)将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞；(5 )将导入了所述基因的所述细胞与没有导入所述基因的未处理 的BMSC共培养；和(6)在所述培养基中加入cAMP-增多剂，和进一步培养所述细胞 以获得所述骨骼肌细胞；其中所得分化细胞是导入了所述Notch基因的BMSC的子代。
10. 治疗有效量的骨骼肌细胞在制备用于治疗患有与肌肉退化相 关的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途；其中所述骨骼肌细胞通过包括以下步骤的方法体外产生(1) 从骨髄分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培 养所述细胞；(2) 在所述培养基中加入脱甲基剂，和进一步培养所述细胞；(3 )在所述培养基中加入cAMP-增多剂和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞；(4) 将包含编码Notch细胞内结构域的序列的核酸导入所述细 胞，和进一步培养所述细胞；(5) 将导入了所述核酸的所述细胞与没有导入所述核酸的未处理 的BMSC共培养；和(6) 在所迷培养基中加入cAMP-增多剂，和进一步培养所述细胞以获得所述骨骼肌细胞；其中所得分化细胞是导入了所述核酸的BMSC的子代。
11. 权利要求l-10任一项中的用途，其中所述导入所述Notch 基因或所述核酸是通过使用能在哺乳动物中表达的栽体的脂转染法实施的o
12. 权利要求3-10任一项中的用途，其中所述cAMP-增多剂是 毛喉素。
13. 权利要求3-8任一项中的用途，其中所述第一细胞分化刺激 因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF )、睫状神经营养因子(CNTF )， 及其混合物。
14. 权利要求5-8任一项中的用途，其中所述第二细胞分化刺激 因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子-AA (PDGF-AA)，及其混合物。
15. 权利要求9或10的用途，其中所述脱甲基剂是5-氮胞苷。
16. 权利要求9或IO的用途，其中所述细胞分化刺激因子选自碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)， 及其混合物。
17. 权利要求5或6的用途，其中所述疾病、紊乱或病症是帕金 森氏病。
18. 权利要求7或8的用途，其中所述疾病、紊乱或病症选自肌 萎缩性侧索硬化症(ALS)和阿耳茨海默氏病。
19. 权利要求9或10的用途，其中所述疾病、紊乱或病症是肌肉 萎缩症。
20. 前述任一项权利要求的用途，其中所述分离的BMSC源自人类。
全文摘要
本发明提供了一种通过导入Notch基因将骨髓间质细胞诱导/分化神经细胞和骨骼肌细胞的方法。即，本发明提供了一种通过导入Notch基因将骨髓间质细胞体外诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法，所述方法包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入所述细胞，其中所得分化/诱导的细胞是导入了Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓间质细胞的细胞分裂子代。本发明还提供了将分化/诱导的神经细胞进一步诱导/分化为多巴胺能神经元或乙酰胆碱能神经元。本发明还涉及用本发明的方法所获得的神经前体细胞、神经细胞或骨骼肌细胞治疗神经退化性疾病或肌退化性疾病的方法。
文档编号A61K35/34GK101584869SQ200910147488
公开日2009年11月25日 申请日期2003年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者出泽真理, 泽田元, 菅野洋, 高野雅彦 申请人:桑比欧公司