专利名称：细菌脂多糖的新用途的制作方法
细菌脂多糖的新用途技术领域：
本发明涉及细菌脂多糖(Lipopolysaccharide， LPS)即内毒素 (endotoxin)的一种新用途，具体说就是将细菌脂多糖制备成用于预防和/或治疗中风、结 石、痛风的药物，背景技术：
当今人类社会进步，文明发达，而人类本身进化的速度远远落后于社 会进步的速度，短短几十年的历程，人类的饮食结构、生活习惯得到了大幅的提升，而劳动 强度则大幅下降，导致一系列疾病的发生率大幅增加，各类肿瘤、中风、痛风和结石等疾病 时有发生。在中国，癌症是第二死亡病因，心脑血管疾病才是第一死亡病因，中风患者比比 皆是，大多数人到了中年之后；在体内都会有结石痛风石沉积。而针对此类疾病的药物大多 有毒副作用，且疗效甚微。 一般情况下药物的主攻方向也是越疱代俎，绕过机体免疫系统而 直接作用于发病因素，往往是治标不治本。 脑中风就是由于脑血管破裂或堵塞，引起出血或血流不畅，致使脑内局部受到压
迫、血液循环不良，造成脑部部分失去功能而留下的神经症状。痛风是一种嘌呤代谢紊乱所
致的全身性疾病，其特点是高尿酸血症及痛风性急性关节炎，以单足或双足拇趾关节或踝
关节肿痛为多见，易反复发作。某些代谢产物与钙等结合沉积在组织器官内导致结石形成，
而且久治不愈。中风痛风结石三者都是瘀阻导致的疾病，活血化瘀才是治疗方向。 细菌脂多糖LPS(内毒素)增强机体非特异性免疫力及佐剂作用 少量细菌脂多糖注入机体，可产生一定程度的非特异免疫力，即由一种革兰氏阴
性菌脂多糖剌激产生的免疫力对多种微生物均有作用。它能间接增强机体非特异性防御机
能而发挥抗感染作用。 (1)增加体液防御功能；如备解素、补体、溶菌酶及干抗素等的含量均有所增加， 但体液抗菌物质量的增高有时与抗感染效应不相平行，因为抗感染能力的提高不仅限于体 液因子的增加，尚需其他因素的配合。 (2)增强单核巨噬细胞系统的活性即吞噬细胞数量增多，吞噬能力和杀菌活性 增强。动物注射脂多糖后，肝、脾体积和重量增加，肝、脾、肺、淋巴结等单核巨噬细胞系统组 织增生，细胞分裂增速。 (3)脂多糖与其他颗粒性或可溶性抗原一并注射，能使后者剌激机体产生抗体的 效价明显增高。佐剂主要作用于巨噬细胞和免疫活性细胞，从而增强免疫反应。脂多糖对 噬细胞与T淋巴细胞和B淋巴细胞均有直接或间接的激活作用，表明脂多糖具有佐剂性质。 如应用伤寒、副伤寒、破伤风类毒素及"百、白、破"三联疫苗等时，伤寒、副伤寒或百日咳杆 菌脂多糖不但作为预防接种用的菌苗，且对类毒素而言，尚可起到佐剂作用，以增强免疫效 果。 (4)中性粒细胞和血小板对细菌脂多糖LPS的解毒进入血循环的脂多糖能被中 性粒细胞所吞饮，在1 3小时内丧失引致Shwarhzman反应的能力。Skarnes (1971)发现 家兔中性粒细胞含有富于酯酶的成分，能解除内毒素的致死作用，故中性粒细胞对循环脂 多糖具有清除与解毒功能。Das等(1973)于实验家兔体内注入大肠杆菌脂多糖，10分钟 即被清除，若动物血小板减少，则清除率降低，表明血小板具有对内毒素的清除与解毒的能力。并发现革兰氏阴性菌感染的患者的血小板中含有脂多糖。Walker(1979)也认为微循环 中脂多糖的清除有赖于血小板。业已证明，对脂多糖有耐受力的家兔血浆中，血小板的凝聚 加速，凝聚的血小板易被吞噬细胞所吞噬而消除。 (5)细菌脂多糖LPS使机体获得抗肿瘤能力Du卯er(1774)发现，一位乳腺癌患者 遭细菌感染后癌症渐消，治愈感染肿块后又复发，人工再感染却又使癌消失。肿瘤"自行" 消退绝非仅此一例。为控制恶性感染，科利(Coley，1893)用杀死的灵杆菌及化脓性链球菌 滤过液治癌，称Coley疗法。卡斯韦尔(Carswell)和奥尔德(Old) (1975)发现注射脂多糖 LPS及卡介苗的兔血清中有TNF。 细菌脂多糖使机体的非特异性抵抗力加强对志愿者和动物研究表明，脂多糖激活 巨噬、T、 B、 NK和K细胞等免疫活性细胞，并激活补体、凝血和激肽系统等体液调节系统，增 强机体抗病菌、病毒及原虫感染的能力。这很大程度上源于脂多糖诱生的TFNs、ILs、TNF和 CSFs(集落剌激因子)等。 综上所述，细菌脂多糖(LPS)既是致病因子，又可对机体发挥有益的生物学活性。 目前比较清楚的由LPS剌激产生的细胞因子有TFNs、ILs、CSFs、TNFs和TGFs(转化生长因 子类)，它们介导了LPS(或类脂A)的生物学效应。不少学者正在寻找低毒或无毒内毒。
发明内容本发明的目的是提供细菌脂多糖的新用途，即在制备溶解人体内血 栓、结石、痛风石药物中的应用。 所述细菌脂多糖(Lipopolysaccharide， LPS)为革兰氏阴性细菌的细胞壁成分， 又叫内毒素，革兰氏阴性细菌的死菌体，是预防和/或治疗中风、结石、痛风的药物，可在 制备人体溶解血栓、结石、痛风药物中应用，所述预防和/或治疗中风、结石、痛风的药物， 为包括冻干粉针的注射液类型，其中以假单胞菌的内毒素为主，因其毒性最低，现已证明， 按每公斤体重的最小致热剂量比较，不同菌株之间稍有差异伤寒沙门菌是O. 1-1. 14yg/ kg， E. coli是1. 0ii g/kg，假单胞菌为50—70 ii g/kg。 人类的免疫系统因为与微生物斗争而进化，也因为与微生物斗争而存在。人体的 免疫系统功能也因与微生物斗争而发展壮大，试验证明，细菌脂多糖能非特异地影响感染 过程。致病性增强或减弱取决于感染的微生物，注射脂多糖的剂量和途径，以及脂多糖处理 和感染开始之间的间隔时间。对一些与产脂多糖完全无关的病原体增加抵抗力，如寄生虫 (锥虫，疟原虫)，真菌(念珠菌，根霉菌，芽生菌，组织胞浆菌，隐球菌)，病毒(流感，鼠疫， 脑炎，新城病)，革蓝氏阳性菌(葡萄菌，肺炎球菌，链球菌)，革蓝氏阴性菌(克雷伯杆菌， 假单胞菌，沙门菌，大肠杆菌)以及分枝杆菌等。感染前几小时给脂多糖，抵抗力增强，如果 临给病原体前给脂多糖，试验动物对感染更敏感。在大多数动物体内注射异物时，如果一起 或稍前稍后注射脂多糖，它就会起抗体反应剌激物作用，加速对异物特异的IgG， IgM抗体 的产生，起免疫佐剂的作用。现已证明，细菌脂多糖预处理增强宿主抵抗力的机制是早期非 特异的，与抗体依赖的晚期有明显区别。这涉及不同体液和细胞间的相互作用，由此引起的 单核吞噬系统激活和随之有效地从机体内清除感染因子最为突出。 本发明第一方面探索出了细菌脂多糖的一种新用途，即利用细菌脂多糖(内毒 素)剌激机体免疫系统，激活巨噬细胞的吞噬功能，化解血栓结石痛风石等。需要的时候， 可在上述药物中加入一种或几种药学上可接受的辅料，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、免疫 佐剂等。
本发明制备的药物可以制成水针、粉针等适用于注射的药物形式，其中以水针为 优选剂型。 本发明第二方面提供了一种需要治疗疾病的临床治疗方案，上述细菌脂多糖药 物在使用时，可在上臂皮下注射，也可在病灶部位肌肉注射，一般隔日使用一次，六次为一 疗程，根据个人体质和病情可再增加两三个疗程，所述治疗包括治愈、、缓解、减轻或补充治疗。 本发明第三方面提供了一系列的治疗注意事项和处理方法，避免药物不良反应发 生，增强患者的依从性。 本发明第四方面提供了制备药物的基本方法，即将细菌脂多糖制备成用于预防和 /或治疗中风结石痛风等疾病的药物，制备方法如下 1.菌种革兰氏阴性细菌，包括假单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、变形杆 菌等，主要以假单胞菌为主。
2.扩大培养将检定好了的菌种接种于试管或三角瓶普通营养肉汤中，置于37°C 培养18小时左右，经纯粹检验合格后即可使用。根据需要量，可采用发酵罐或玻璃瓶进一 步扩大培养，取样作纯粹检验，合格者使用；若有杂菌污染，则菌液要废弃。
3.收集菌泥对上述扩大培养的合格培养物，离心收集菌体。并用生理盐水洗涤 菌体三次，离心收集菌泥，冷冻保存备用。 4. 1.将菌泥经酶消化提取制得细菌脂多糖。制成每毫升含细菌脂多糖O. 5毫克的 浓度。 4. 2.将菌泥稀释成约每毫升50亿菌体的浓度，按0. 5_1. 0%的比例加入甲醛(按 100% )，封口并混合均匀后置37t:保温杀菌24-48小时。然后做无菌检验，离心清洗甲醛， 用生理盐水配成约每毫升20亿菌体的液体。 5.将上述4. 1. ，4. 2.制备好了液体，无菌操作分别分装于安瓶中，贴标做好记录，
置于2—8t:低温存放。 6.安全检验选择健康且未经感染过的小白鼠，按使用剂量三倍的剂量注射3-5
只，观察io天，均应健活。 7.效力检验选择健康且未经感染过的小白鼠，按正常使用剂量注射三次后，测
定小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数。与对照组作比较测定。
8.物理性状检查经上述检验合格后，还需逐瓶进行物理性状检查等等。 含细菌脂多糖的菌体注射液，在上述浓度内，动物试验证明是安全有效的，临床验
证治疗中风痛风结石疾病显效率的100%，中风疾病患者康复程度可达5_9成，结石痛风
患者治愈率可达75%。具体实例细菌脂多糖(内毒素)对组织细胞的选择性不强，不同革兰氏阴性细 菌的内毒素引起的病理变化和临床症状大致相同致死性、热原性、弥漫性血管内凝血等， 大剂量细菌脂多糖可引起免疫耐受性。为了缓冲了菌体脂多糖的毒性，又增强了脂多糖类 等的免疫佐剂活性，避免免疫耐受发生，含脂多糖的菌体注射液为最佳选择。研究表明大 分子及多分子混合物不易产生耐受，Helge等发现，结合在膜上的脂多糖免疫小鼠，比用等 量的纯脂多糖免疫小鼠产生的反应强得多，纯脂多糖引起的反应以IgM为主，而结合在膜 上的脂多糖引起的反应以IgG为主。所述细菌脂多糖注射液，包括皮下注射，肌肉注射，胸腔腹腔盆腔注射等。所述细菌脂多糖注射液每次使用量为50-1000 g，或5-150亿革兰 氏阴性菌菌体.，每日使用一次或隔日使用一次。所述细菌脂多糖注射液若在病灶部位接近 病灶部位给药，但要偏离血栓部位10-20厘米给药，可提高疗效。中风患者在脑溢血发生 15天之后方能使用细菌脂多糖注射液；中风或其他因素引起脑溢血发生后，患者成为植物 人，患病15天之后方能使用细菌脂多糖注射液；患者处于疲劳、饥饿、感冒状态时，不能使 用细菌脂多糖注射液；所述细菌脂多糖注射液切不可注入血管内直接进入血液，可与其他 药物联合使用；所述细菌脂多糖注射进入体内，一星期后再配合腥膻发物饮食，可起到事半 功倍的疗效，特别是更年期患者一定要配合腥膻发物治疗疾病，腥膻发物包括雄鸡、鲤鱼、 牛羊肉、海鲜、韭菜、扁豆、南瓜、紫苏、生姜、啤酒、甜酒等，也包括从动植物中纯化的发物成 分如各种血凝素；所述细菌脂多糖注射进入体内，许多痛风患者一星期后出现3-7天耳鸣 甚至耳聋现象，或细菌脂多糖注射进入体内，4-一7天内中风患者脑部会有异样的动静，紧 接着瘫痪的部位会有异样的感觉如麻木、疼痛、蚁行感等，或细菌脂多糖注射进入体内，注 射部位出现红肿发热及硬块，是正常的免疫反应，属正常情况，是转好的前兆；，无需处理 会自然消失，第二次注射要偏离上次注射的红肿部位，不然会引起更大的发热红肿甚至全 身反应 本发明的制备方法是，即将细菌脂多糖制备成用于预防和/或治疗中风结石痛风 等疾病的药物，制备方法如下 1.菌种革兰氏阴性细菌，包括假单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、变形杆 菌等，主要以假单胞菌为主。
2.扩大培养将检定好了的菌种接种于试管或三角瓶普通营养肉汤中，置于37°C 培养18小时左右，经纯粹检验合格后即可使用。根据需要量，可采用发酵罐或玻璃瓶进一 步扩大培养，取样作纯粹检验，合格者使用；若有杂菌污染，则菌液要废弃。
3.收集菌泥对上述扩大培养的合格培养物，离心收集菌体。并用生理盐水洗涤 菌体三次，离心收集菌泥，冷冻保存备用。 4. 1.将菌泥经酶消化提取制得细菌脂多糖，制成每毫升含细菌脂多糖0. 5毫克的 浓度。 4.2.将菌泥稀释成约每毫升50亿菌体的浓度，按0.5_1.0%的比例加入甲醛(按 100% )，封口并混合均匀后置37t:保温杀菌24-48小时。然后做无菌检验，离心清洗甲醛， 用生理盐水配成约每毫升20亿菌体的液体。 5.将上述4. 1，4.2.制备好了液体，无菌操作分别分装于安瓶中，贴标做好记录，
置于2—8t:低温存放。 6.安全检验选择健康且未经感染过的小白鼠，按使用剂量三倍的剂量注射3-5
只，观察io天，均应健活。 7.效力检验选择健康且未经感染过的小白鼠，按正常使用剂量注射三次后，测 定小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数。与对照组作比较测定。
8.物理性状检查经上述检验合格后，还需逐瓶进行物理性状检查等等。本发明 以含菌体脂多糖的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)注射液作临床应用，药物的组 方20亿死菌体/ml ， NaCl 0. 9 % ，苯甲醇0. 6 % ， pH7. 2磷酸盐缓冲液。药物为深圳卫武光明 生物制品厂生产，使用的产品批号为980308， 20030502， 20031005， 20040701。本发明人于2006年至2007年在河北张药集团试制了几批样品，批号为20071205也用于临床试验.主 要针对中风痛风结石患者，以自愿为原则，历时近十载，相关病例数十例，初步统计显示治 疗显效率达100%，中风患者缓解康复程度达5-9成，结石痛风患者治愈率达75%以上。
药物的临床应用试验病例如下 例1. 1999年。向工程师，男，61岁，深圳宝安区人，中风瘫痪在床三年，言语不清， 口眼歪斜，流口水，背部有直径为5-8厘米的肉疮两个，使用铜绿假单胞菌注射液三针之 后，唾液被嘴包住了 ，使用十针后，能独立坐稳和站立，右腿有迈步的意向，但不能行走。
例2.2000年。覃中尉，男，40岁，深圳某部队，痛风患者，长期服用秋水仙碱等药 物，使用铜绿假单胞菌注射液三针之后，出现了耳鸣的现象，刚开始本发明人不知所措，后 经多方查证，才得知是耳蜗结缔组织里有痛风石，患者耳鸣了 5天左右，最后停止了用药。
例3. 2003年。席，男，62岁，湖南省安乡县人，脑溢血中风偏瘫，患病一月后在家疗 养，使用铜绿假单胞菌注射液，使用三针后，痉挛的右臂舒展开了，弯曲紧张的手指也舒缓 了，第四针之后，他的大指和中指开始有意识的活动了。 一月后因高血压的其他并发症而死 亡。 例4.2004年。夏，男，56岁，湖南省安乡县人，口眼歪斜，嘴角向右歪出近1厘米， 患病三月后使用铜绿假单胞菌注射液，使用两针后，脑内出现了异动现象，口眼歪斜开始好 转，共使用了六针之后，面部几乎已看不出异样了 。 例5. 2004年。张，男，58岁，湖南省安乡县人，53岁时中风，有后遗症，语言有轻微 障碍，右手不能拿笔写字，也不能拿筷子吃饭，使用铜绿假单胞菌注射液十针后，语言功能 得到了提高，右手能写字和拿筷子吃饭了。他同时又是一个痛风患者，注射铜绿假单胞菌注 射液三针之后，耳聋了 3天，十针之后痛风部位再未见疼痛了 。 例6.2004年。曾，女，41岁，湖北人，子宫左侧附件肿瘤，直径约4厘米，左侧肾有 四颗直径约0.2厘米的结石，右肾有一颗结石。本发明人直接在肿瘤附近部位给药，患者于 第四针时，吃了雄鸡发物，导致肿瘤结石等部位疼痛难忍，赶忙去医院检查，结果是肿瘤直 径为2. 4X 1. 8厘米，由以前的空心瘤变成了实心瘤(良性)，结石也有明显松动，后来继续 用药五针，肿瘤结石全部消退。注该患者平常很少打针吃药，免疫系统功能强健。
例7.2006年。杨，女，43岁，湖南省津市人，右肾有一颗0. 5厘米结石，双肾都有泥 沙型结石，患病多年，吃药无数，不见痊愈，本发明人在患者的背部双肾位置，使用铜绿假单 胞菌注射液十针后，结石已全部清除，两年多未见复发。 例8. 2006年。程，男，48岁，湖南省澧县人，痛风患者，右脚踝关节肿痛，本发明人 直接在肿痛部位注射铜绿假单胞菌注射液，仅用了两针，即治好了踝关节肿痛。后来又按此 方法治好了其他几例痛风患者。 例9.2009年。唐，男，55岁，湖南省津市人，中风两次，第一次比较轻微，导致左边 手脚不灵光。第二次中风较重，已全身不能动弹，一月后，本发明人使用铜绿假单胞菌注射 液进行治疗，第一针药注射后，注射部位不见红肿，这是更年期的现象，不得已本发明人让 患者吃多种发物，配合治疗，后来才逐见好转能翻身，能坐稳，能认人和讲话，能拿勺子吃 饭，能扶着行走，能扶拐杖行走，能上桌拿筷子吃饭，能独立上厕所。共使用了 30针铜绿假 单胞菌注射液，治疗了两月时间。
权利要求
一种细菌脂多糖的新用途，其特征是细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是预防和/或治疗中风、结石、痛风的药物，可在制备人体溶解血栓、结石、痛风药物中应用。
2. 根据权利要求1所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述细菌脂多糖亦包括 所有灭活的革兰氏阴性菌的菌体，其中以假单胞菌属的菌体为主。
3. 根据权利要求1或2所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述预防和/或治 疗中风、结石、痛风的药物，为包括冻干粉针的注射液类型。
4. 根据权利要求3所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述细菌脂多糖注射液， 包括皮下注射，肌肉注射，胸腔腹腔盆腔注射等。
5. 根据权利要求4所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述细菌脂多糖注射液每次使用量为50-1000 ii g，或5-150亿革兰氏阴性菌菌体，每日使用一次或隔日使用一 次。
6. 根据权利要求5所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述细菌脂多糖注射液若在病灶部位接近病灶部位给药，但要偏离血栓部位10-20厘米给药，可提高疗效。
7. 根据权利要求1所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于中风患者在脑溢血发生 15天之后方能使用细菌脂多糖注射液；中风或其他因素引起脑溢血发生后，患者成为植物 人，患病15天之后方能使用细菌脂多糖注射液；患者处于疲劳、饥饿、感冒状态时，不能使 用细菌脂多糖注射液。
8. 根据权利要求1所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述细菌脂多糖注射液 切不可注入血管内直接进入血液，可与其他药物联合使用。
9. 根据权利要求1所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述细菌脂多糖注射进 入体内， 一星期后再配合腥膻发物饮食，可起到事半功倍的疗效，特别是更年期患者一定要 配合腥膻发物治疗疾病，腥膻发物包括雄鸡、鲤鱼、牛羊肉、海鲜、韭菜、扁豆、南瓜、紫苏、生 姜、啤酒、甜酒等，也包括从动植物中纯化的发物成分如各种血凝素。
10. 根据权利要求1所述的细菌脂多糖的新用途，其特征在于所述细菌脂多糖注射进 入体内，许多痛风患者一星期后出现3-7天耳鸣甚至耳聋现象，或细菌脂多糖注射进入体 内，4-7天内中风患者脑部会有异样的动静，紧接着瘫痪的部位会有异样的感觉如麻木、疼痛、蚁行感等，或细菌脂多糖注射进入体内，注射部位出现红肿发热及硬块，是正常的免疫反应，属正常情况，是转好的前兆；，无需处理会自然消失，第二次注射要偏离上次注射的 红肿部位，不然会引起更大的发热红肿甚至全身反应。
全文摘要
本发明公开了细菌脂多糖的新用途，即在制备人体溶解体内异物(如血栓、结石、痛风石)药物中的应用。研究表明细菌脂多糖能激活网状内皮系统细胞吞噬功能，提高巨噬细胞和中性白细胞的杀菌作用，并释放内源性细胞因子(补体，备解素，溶菌酶，乙型溶素，干扰素IFN，白细胞介素IL，肿瘤坏死因子TNF等)激发宿主对细菌感染的防卫，引起肿瘤坏死，亦可吞噬溶解血栓、结石、痛风石等体内异物。因此，可以以细菌脂多糖为活性成分制备成预防和/或治疗中风、结石、痛风的药物。本发明所述含细菌脂多糖的菌体注射液，经动物试验证明是安全有效的，临床验证治疗中风痛风结石疾病显效率为100％，中风患者康复程度可达5-9成，结石痛风患者治愈率可达75％。
文档编号A61K31/739GK101791318SQ20091022669
公开日2010年8月4日 申请日期2009年12月19日 优先权日2009年12月19日
发明者韩少坤 申请人:韩少坤