专利名称：槐糖脂在制备抗宫颈癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及槐糖脂的药物应用，尤其涉及利用拟威克酵母变种 (Wickerhamielladomercqiae var. sophorolipid)发酵产生的生物表面活性剂槐糖脂在制 备抗宫颈癌药物中的应用。
背景技术：
槐糖脂是一种重要的生物表面活性剂，对于它的研究始于二十世纪五、六十年代， 主要是通过微生物发酵获得。与化学合成的表面活性剂相比，槐糖脂具有表面性能优良、环 境友好等许多优点。 近年来，国外对于槐糖脂作为药物的研究，特别是抗肿瘤药物方面也已经有一些 文献报道。Scholz和Mehta.等人报道，粗品槐糖脂及槐糖脂衍生物能够抑制人类白血病细 胞株HL60和人头颈癌细胞的增殖，并且证明了槐糖脂的抗肿瘤活性与槐糖脂的乙酰基有 关，通过化学反应去掉槐糖脂的乙酰基，发现其抗肿瘤活性明显降低，但对其抗肿瘤机制没 有进一步的研究。Isoda等人报道，槐糖脂能够导致HL60白血病细胞系的细胞分化和抑制 蛋白激酶C的活性。此外，槐糖脂可用作帕金森氏病、老年性痴呆症、牛皮癣、艾滋病治疗的 免疫调节剂，还可用作抗病毒的免疫剌激。申请人也曾经对微生物产生的槐糖脂生物表面 活性剂用于抑制人肝癌细胞系和肺癌细胞系进行了初步研究，完善了槐糖脂粗提物的制备 方法，并于2006年申请了中国发明专利"一种拟威克酵母变种抗肿瘤活性槐糖脂粗提物的 制备方法，专利号ZL 200610042181. x"。然而，因各类肿瘤性质及发病机理各不相同，槐糖 脂对其作用的药理效果也不尽相同，经文献和专利检索，利用槐糖脂在制备抗宫颈癌药物 的研究方面还未见报道。 目前，宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的半数以 上，其死亡率为妇女恶性肿瘤的首位。宫颈癌早期常用的治疗方法多为广泛性全子宫切除， 对患者及家庭都会带来不良影响，晚期宫颈癌的治疗方法主要有放化疗及中医药治疗，随 着治疗时间延长，带来的毒副作用也越大。因此，研究和开发一种对人体毒性较小的治疗宫 颈癌药物有重要意义。
发明内容
针对现有技术中所述的不足，本发明要解决的问题是提供一种槐糖脂在制备抗宫 颈癌药物中的应用。 本发明所述槐糖脂在制备抗宫颈癌药物中的应用；同时还包括以槐糖脂为有效成 分的组合物在制备抗宫颈癌药物中的应用。 以本发明所述槐糖脂再添加药学上可接受的辅料或赋形剂可以制成任何一种抗 宫颈癌的药剂学上所说的剂型；本发明所述抗宫颈癌药物的剂型优选栓剂或软膏剂；其 中，所述剂型中槐糖脂的药物浓度为20ii g/ml 125ii g/ml。
上所述剂型中槐糖脂的药物浓度进一步优选30 ii g/ml 100 y g/ml。
上述剂型中槐糖脂的药物浓度最优选40 ii g/ml 80 ii g/ml 。
上述栓剂的药物制剂按照本行业已知的方法制备，在制备过程中使用常用基质， 例如脂肪性基质(可可豆脂、半合成甘油脂肪酸酯类、香果脂、氢化油类)、水溶性及亲水性 基质(甘油明胶、聚乙二醇、吐温-61、硬脂酸聚烃氧(40) S旨、水溶性壳聚糖、泊洛沙姆)。在 基质中加入吸收促进剂，如月桂氮酮类、乙酰乙酸甘油酯类、脂肪酸衍生物、P _环糊精、聚 乙烯吡咯烷酮、尿素、碳酸氢钠、己二酸等发泡剂均能增加栓剂的释药速度；在基质中加入 少量吐温-80、脂肪酸甘油酯、甘油、丙二醇，能降低脂肪的脆性，增加弹性；加入鲸蜡醇、硬 脂醇等能改善基质的黏性；加入蜂蜡、鲸蜡可提高基质的熔点。另外，在基质中加入一定的 吸收阻滞剂，如天然或氢化大豆磷脂、卵磷脂、海藻酸、羟丙基甲基纤维素、卡波姆、硬脂酸 和蜂蜡等，可延长药物作用时间，达到缓释和控释药物的目的；相对于一般栓剂而言，缓释 栓剂解决了药物制剂的"峰谷"现象——药物浓度高时可能超过适宜的治疗浓度，以致引起 不良反应的发生，药物浓度低时可能不能产生期望的疗效的问题。故我们对缓释栓剂给予 了特殊关注。 上述软膏剂的药物制剂按照本行业已知的方法制备，在制备过程中使用可药用辅
料或赋形剂，例如黏合剂(如预胶化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素)、填料(例如乳
糖、蔗糖、甘露醇等)、润滑剂(例如硬脂酸、聚乙二醇、硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解
剂(例如淀粉、羧甲基纤维素钠)或者润湿剂(例如十二烷基硫酸 钠)。 为了更好地理解本发明的实质，下面以槐糖脂的药理实验及其结果来说明槐糖脂
作为抗宫颈癌药物的应用。 本发明所述槐糖脂以如下方法制备(详见专利号ZL 200610042181. x中的相关描 述) (1)菌禾中选择拟威克酵母变禾中(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 ; (2)斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1. 5 2. 0%的琼脂，25 35t:条件下，静止培养24 48小时； (3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于20 100ml含有质量体积比为4 14%的葡萄糖和1 8%的菜籽油的基本无机盐培养基中， 25 35t:条件下，振荡培养24 48小时，制得种子液； (4)扩大培养以5 10%的体积比的接种量，将种子液接种于100 1000ml含
有质量体积比为4 14%的葡萄糖和1 8%的菜籽油的基本无机盐培养基中，25 35°C 条件下，振荡培养96 288小时； (5)收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇 瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以4000 7000转/分钟将所述粘稠物质离心，收集沉淀部 分，即为槐糖脂粗提物； (6)减压蒸馏将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度50 7(TC，压力0.2 0. 8Kg/cm2，真空度为0. 02 0. 08Mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分；
(7)收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在50 10(TC，真空度0.02 0. 08Mpa条件下，真空干燥12 24小时，制得固体槐糖脂。 以上述方法制得的固体槐糖脂进行体外抗宫颈癌细胞试验，具体方法如下
1、实验材料 1.细胞 肿瘤细胞人宫颈癌Hela细胞系贴壁细胞； 2.培养液含10%胎牛血清的DMEM完全培养液。 n、实验条件 生物安全三级实验室 ni、实验步骤及结果 1. MTT法测定槐糖脂作用后肿瘤细胞的存活率，计算槐糖脂对宫颈癌细胞半数致 死浓度(IC5。);结果显示当终浓度分别为5ii g/ml、10ii g/ml、15ii g/ml、20ii g/ml、25ii g/ ml、30ii g/ml、35ii g/ml、40ii g/ml的槐糖脂样品，分别作用于宫颈癌细胞24h，细胞的存活 率随样品浓度的增加而降低(表1)，并且在0 ii g/ml到40 ii g/ml的浓度范围内，细胞的存 活率与样品浓度呈负相关，当样品浓度大于40 ii g/ml时，细胞全部死亡(图1)。槐糖脂对 人宫颈癌Hela细胞系的IQ为20. 33yg/ml。
表1 :MTT法测定槐糖脂作用后宫颈癌细胞存活率
作用浓度 (ug/mL)0510152025303540
100.096.0887.3680.7871.8674.9762.397.33-1.89
细胞存活±±:h±±±±±土
率(％)0.002.658.122.772.卯2.848.661,583.94 2. CPE法结合MTT法确定药物对正常宫颈细胞的无毒浓度药物取6个浓度即 1000ii g/ml，500ii g/ml、250ii g/ml、125ii g/ml、62. 5ii g/ml、30ii g/ml，进行细胞毒性测 定，每浓度做4个复孔，结果显示最大无毒浓度为125 ii g/ml 。 3.药物的最大无毒浓度对上述宫颈癌Hela细胞系的药效测定取浓度为125 y g/ ml药液，做4个复孔，观察对上述肿瘤细胞的抑制作用。试验设正常宫颈细胞对照。结果显 示该浓度药物对这株肿瘤细胞有完全抑制作用，而正常细胞生长正常。
4.倒置显微镜观察槐糖脂作用前后宫颈癌细胞形态变化以终浓度分别为0 ii g/ m1、5 ii g/ml、 10 ii g/ml、 15 ii g/ml、20 ii g/ml、25 ii g/ml、30 ii g/ml、35 u g/ml、40 u g/ml的槐 糖脂样品分别作用于宫颈癌细胞24h，在倒置显微镜下观察结果显示，正常宫颈癌细胞增殖 活跃并可见各期分裂相，细胞之间排列紧密，形态呈不规则多角形或圆形，轮廓清晰，核呈 圆形或椭圆形，并可见多核和巨大核细胞，核仁多个，形状不规则；经槐糖脂作用后的宫颈 癌细胞，随着槐糖脂浓度增大，相邻细胞之间界限变得不明显，部分细胞皱縮变圆，并且皱 縮细胞数目随着槐糖脂浓度增大而增多，核仁变得不明显，当样品浓度达到40ii g/ml时， 宫颈癌细胞基本上全部皱縮，体积縮小，细胞表面突起小球体，形似酵母菌出芽，核仁消失， 并可见小球体和碎片悬浮于培养液中(图2)。 上述实验表明，所述槐糖脂有效抑制宫颈癌的药物浓度为20ii g/ml 125 y g/ ml ;优选的有效抑制宫颈癌的药物浓度为30ii g/ml 100ii g/ml ;最优选的有效抑制宫颈 癌的药物浓度为40 ii g/ml 80 ii g/ml。
本发明所述的槐糖脂抗宫颈癌药物制剂价格低廉，且用量少，抗肿瘤效果显著，对 人体无任何毒副作用，临床上可以部分甚至全部替代手术切除、化疗等治疗方法，极具应用 前景。
图1MTT法测定槐糖脂作用后宫颈癌细胞存活率 显示细胞的存活率随样品浓度的增加而降低，并且在0 ii g/ml到40 y g/ml的浓度 范围内，细胞的存活率与样品浓度呈负相关，当样品浓度大于40 ii g/ml时，细胞全部死亡。
横坐标为槐糖脂作用浓度(y g/ml)，纵坐标为细胞存活率。
图2槐糖脂作用前后宫颈癌细胞形态变化 其中A未加槐糖脂的正常的宫颈癌细胞B终浓度为25ii g/ml槐糖脂作用后的宫 颈癌细胞C终浓度为40 ii g/ml槐糖脂作用后的宫颈癌细胞 显示正常宫颈癌细胞增殖活跃并可见各期分裂相，细胞之间排列紧密，形态呈不 规则多角形或圆形，轮廓清晰，核呈圆形或椭圆形，并可见多核和巨大核细胞，核仁多个，形 状不规则；经槐糖脂作用后的宫颈癌细胞，随着槐糖脂浓度增大，相邻细胞之间界限变得 不明显，部分细胞皱縮变圆，并且皱縮细胞数目随着槐糖脂浓度增大而增多，核仁变得不明 显，当样品浓度达到40yg/ml时，宫颈癌细胞基本上全部皱縮，体积縮小，细胞表面突起小 球体，形似酵母菌出芽，核仁消失，并可见小球体和碎片悬浮于培养液中。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明。
实施例1 :槐糖脂的制备 (1)菌禾中选择拟威克酵母变禾中(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 ; (2)斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1. 6%的 琼脂，25t:条件下，静止培养24小时； (3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于20ml 含有质量体积比为4%的葡萄糖和1 %的菜籽油的培养基中，25°C条件下，振荡培养24小 时，制得种子液； (4)扩大培养以5%的体积比的接种量，将种子液接种于100ml含有质量体积比 为1%的菜籽油的培养基中，251:条件下，振荡培养96小时； (5)收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇 瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以5000转/分钟将上述粘稠物质离心，收集固态部分，即为 槐糖脂粗提物。 (6)减压蒸馏将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度60°C ，压力0. 4kg/cm2，真空 度为0. 04Mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分； (7)收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在7(TC，真空度0. 04Mpa条件下，真 空干燥16小时；制得固体槐糖脂。
实施例2 :槐糖脂的制备
(1)菌禾中选择拟威克酵母变禾中(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 ; (2)斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1. 6%的 琼脂，3(TC条件下，静止培养36小时； (3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于50ml 含有质量体积比为8%的葡萄糖和3X的菜籽油的培养基中，3(TC条件下，振荡培养36小 时，制得种子液； (4)扩大培养以7%的体积比的接种量，将种子液接种于500ml含有质量体积比 为3X的菜籽油的培养基中，3(TC条件下，振荡培养200小时； (5)收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇 瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以6000转/分钟将上述粘稠物质离心，收集固态部分，为槐 糖脂粗提物。 (6)减压蒸馏将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度70°C ，压力0. 8kg/cm2，真空 度为0. 08Mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分； (7)收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在IO(TC ，真空度0. 08Mpa条件下， 真空干燥24小时；制得固体槐糖脂。
实施例3 :槐糖脂样品制备 采用实施例1的方法提取的拟威克酵母变种抗肿瘤活性槐糖脂粗提物lg，用10ml 无水乙醇溶解后，配成浓度为100000 iig/ml的槐糖脂母液，用DMEM完全培养液稀释至 10 u g/ml、20u g/ml、30u g/ml、40u g/ml、50u g/ml、60u g/ml、70u g/ml、80u g/ml的浓度 或1000ii g/ml、500ii g/ml、250ii g/ml、125ii g/ml、62. 5ii g/ml、30ii g/m1，0. 22践膜过滤 除菌即可。 实施例4 :槐糖脂粗品作为抗宫颈癌药物的应用
宫颈癌细胞培养 采用实施例3的方法得到的槐糖脂样品，以人宫颈癌Hela细胞系、含10%胎牛血 清的DMEM完全培养液为实验材料，利用MTT法测定槐糖脂作用于宫颈癌Hela细胞系后细 胞的存活率，计算槐糖脂对宫颈癌细胞半数致死浓度(IC5。) ；CPE法结合MTT法确定药物对 细胞的无毒浓度；药物的最大无毒浓度对人宫颈癌Hela细胞系药效测定等方法，进行槐糖 脂体外抗肿瘤试验。具体实验步骤如下 1. MTT法测定槐糖脂作用后肿瘤细胞的存活率，计算槐糖脂对宫颈癌Hela细胞半 数致死浓度(IC5。)； (1)收集细胞将处于对数生长期的肿瘤细胞1000r/min离心5min，弃上清，用 DMEM完全培养液稀释成细胞悬液，计数，浓度为1.0X105cells/ml ; (2)样品处理细胞取50 L细胞悬液加入96孔细胞培养板中，培养24h后每 孔分别加入50ii L浓度为1 Oil g/ml 、20 ii g/ml 、30 ii g/ml 、40 ii g/ml 、50 ii g/ml 、60 ii g/ml 、 70 ii g/ml、80 ii g/ml的槐糖脂样品，使其终浓度为5 y g/ml、 10 y g/ml、 15 y g/ml、20 y g/ ml、25ii g/ml、30ii g/ml、35ii g/ml、40ii g/ml，每组样本6个复孔，并设细胞对照组(只加细 胞和培养液)和空白对照组(只加培养液，无细胞)；
(3)置37 °C ， 5 % C02孵箱中培养24h ;
(4)加入10 ii LMTT (5mg/ml)，继续培养4h ; (5)加入100 L SDS溶液，37°〇，5% C02孵箱中培养过夜，使甲臢结晶充分溶解， 570nm测0D值并计算细胞存活率； 2. CPE法结合MTT法确定药物对正常宫颈细胞的无毒浓度；
3.药物的最大无毒浓度对上述宫颈癌Hela细胞系的药效测定；
4实验结果 (1)将槐糖脂粗品稀释成lOii g/ml、20ii g/ml、30ii g/ml、40ii g/ml、50ii g/ml、 60ii g/ml、70ii g/ml、80ii g/ml的样品，与细胞悬液按照等体积混合，故作用于细胞的槐 糖脂样品终浓度分别为5 ii g/ml 、 10 ii g/ml 、 15 ii g/ml 、 20 y g/ml 、 25 y g/ml 、 30 y g/ml 、 35ii g/ml、40ii g/ml，分别作用于宫颈癌细胞24h，细胞的存活率随样品浓度的增加而降低 (表l)，并且在Oil g/ml到40iig/ml的浓度范围内，细胞的存活率与样品浓度呈负相关， 当样品浓度大于40yg/ml时，细胞全部死亡(图1)。槐糖脂对人宫颈癌Hela细胞系的 IC5。为20. 33 g/ml。而申请者之前在对槐糖脂对肝癌细胞的作用研究时发现其IC5。值是 28. 66i!g/ml，说明槐糖脂对宫颈癌细胞作用效果比对肝癌细胞好一些，此实验同时说明因 为各类肿瘤性质及发病机理各不相同，槐糖脂对其作用的药理效果也不尽相同。
(2)药物取6个终浓度艮卩1000 ii g/ml ，500 ii g/ml 、250 ii g/ml 、125 ii g/ml 、 62. 5 g/ml、30 y g/ml，进行细胞毒性测定，每浓度做4个复孔，结果显示最大无毒浓度为 125 li g/ml。 (3)取125 g/ml药液，做4个复孔，观察对上述肿瘤细胞的抑制作用。试验设正 常细胞对照。结果显示该浓度药物对这株肿瘤细胞有完全抑制作用。
实施例5 :槐糖脂粗品作为抗宫颈癌药物的应用 (1)收集细胞将传代5次的处于对数生长期的肿瘤细胞1000r/min离心5min，弃 上清，用DMEM完全培养液稀释成细胞悬液，计数，细胞浓度分别为lX105cellS/ml
(2)加样品和细胞取1ml加入24孔细胞培养板中，继续培养24h ;每孔中分别加 入1ml浓度为10 g/ml、20 u g/ml、30 u g/ml、40 u g/ml、50 u g/ml、60 u g/ml、70 u g/ml、 80 ii g/ml的样品使其终浓度为5ii g/ml、10ii g/ml、15ii g/ml、20ii g/ml、25ii g/ml、30ii g/ ml、35 g/ml、40 y g/ml，处理24h，倒置相差显微镜观察细胞形态的变化。并设细胞对照组 (只加培养液和细胞)和空白对照组(只加培养液，无细胞)。 结果显示，在倒置显微镜下观察时，正常宫颈癌细胞增殖活跃并可见各期分裂相， 细胞之间排列紧密，形态呈不规则多角形或圆形，轮廓清晰，核呈圆形或椭圆形，并可见多 核和巨大核细胞，核仁多个，形状不规则；经槐糖脂作用后的宫颈癌细胞，随着槐糖脂作用 浓度增大，相邻细胞之间界限变得不明显，部分细胞皱縮变圆，并且皱縮细胞数目随着槐糖 脂浓度增大而增多，核仁变得不明显，当样品浓度达到40 g/ml时，宫颈癌细胞基本上全 部皱縮，体积縮小，细胞表面突起小球体，形似酵母菌出芽，核仁消失，并可见小球体和碎片 悬浮于培养液中(图2)。 实施例6 :槐糖脂作为抗宫颈癌药物栓剂制备 将聚乙二醇400 (PEG 400) 600g，聚乙二醇6000 (PEG6000) 200g，硬脂酸聚烃氧酯 200g，一起水浴融化，搅匀，慢慢加入实施例1制取的槐糖脂O. 4g，边加边搅拌，搅匀后，注 入预先用液体石蜡涂抹过的栓模，待凝固后，铲去多余部分，启模，用蜡纸逐个包装即可，共制500粒。 实施例7 :槐糖脂作为抗宫颈癌药物缓释栓剂制备 称取8g羟丙基甲基纤维素(HPMC)于100ml纯水中自然溶胀，过夜。使其成8% HPMC溶液。称取0. lg实施例1制得的槐糖脂粗品过6号筛，加入30g甘油、3g无水乙醇， 搅拌使其溶解。称取233g硬脂酸聚烃氧酯，7(TC水浴加热，待熔化后边搅拌边缓慢加入上 述主药溶液，搅拌均匀，冷却至50°C 。逐滴加入8% HPMC溶液23. 52g，搅拌均匀，静置，除气 泡、灌模、凝固、刮平，得栓剂100枚，包装，置阴凉处。按《中国药典》对栓剂及缓释制剂的 相关要求对该缓释阴道栓进行考察，该制剂的各项质量标准均符合要求。
实施例8 :槐糖脂作为抗宫颈癌药物软膏剂的制备 取实施例1制取的槐糖脂0. 4g加入液状石蜡125g加热至80°C ，另取甘油50g，羟 苯乙酯lg，加蒸馏水至875g，也加热至80°C ，然后将油相加入水相中，边加边搅拌至冷，装 入塑料软管，每管装入量为25g，即得槐糖脂软膏剂。
实施例9 :槐糖脂作为抗宫颈癌药物液体洗剂制备 取实施例1制取的槐糖脂O. 4g，加入二甲亚砜至1000g，使槐糖脂溶解，装入100ml 塑料瓶中，即得。 实施例10 :以槐糖脂为有效成分的组合物作为抗宫颈癌药物栓剂的制备
将聚乙二醇400 (PEG 400) 600g，聚乙二醇6000 (PEG 6000) 200g，硬脂酸聚烃氧酯 200g， 一起水浴融化，搅匀，慢慢加入实施例1制取的槐糖脂0. 4g和鸦胆子0. 5g，边加边搅 拌，搅匀后，注入预先用液体石蜡涂抹过的栓模，待凝固后，铲去多余部分，启模，用蜡纸逐 个包装即可，共制500粒。 实施例11 :以槐糖脂为有效成分的组合物作为抗宫颈癌药物缓释栓剂的制备
称取8g羟丙基甲基纤维素(HPMC)于100ml纯水中自然溶胀，过夜。使其成8% HPMC溶液。称取0. lg实施例1制得的槐糖脂粗品及0. 125g鸦胆子分别过6号筛，加入30g 甘油、3g无水乙醇，搅拌使其溶解。称取233g硬脂酸聚烃氧酯，7(TC水浴加热，待熔化后边 搅拌边缓慢加入上述主药溶液，搅拌均匀，冷却至50°C 。逐滴加入8% HPMC溶液23. 52g，搅 拌均匀，静置，除气泡、灌模、凝固、刮平，得栓剂100枚，包装，置阴凉处。按《中国药典》对栓 剂及缓释制剂的相关要求对该缓释阴道栓进行考察，该制剂的各项质量标准均符合要求。
实施例12 :以槐糖脂为有效成分的组合物作为抗宫颈癌药物软膏剂的制备
取实施例1制取的槐糖脂0. 4g和鸦胆子0. 5g，加入液状石蜡125g加热至80°C 。 另取甘油50g，羟苯乙酯lg，加蒸馏水至835g，也加热至80°C ，然后将油相加入水相中，边加 边搅拌至膏状，装入塑料软管，每管装入量为10g，即得槐糖脂软膏剂。
实施例13 :槐糖脂缓释栓剂对宫颈癌细胞体外作用实验 (1)取实施例7制得的缓释栓剂切碎，移至100ml容量瓶，加纯净水适量，7(TC水浴 溶解，凉后定容，摇匀，备用。 (2)将溶液进行稀释，使其槐糖脂含量分别为10iig/ml、20iig/ml、30iig/ml、 40 u g/ml 、 50 u g/ml 、 60 u g/ml 、 70 u g/ml 、 80 u g/ml ，备用。 (3)收集细胞将处于对数生长期的肿瘤细胞1000r/min离心5min，弃上清，用 DMEM完全培养液稀释成细胞悬液，计数，浓度为1.0X105cells/ml ; (4)样品处理细胞取50 i！ L细胞悬液加入96 细胞培养板中，培养24h后每孔分别加入50ii L上述制得的浓度为lOii g/ml、20ii g/ml、30ii g/ml、40ii g/ml、50ii g/ml、 60ii g/ml、70ii g/ml、80ii g/ml的槐糖脂缓释栓剂样品，使其终浓度为5 y g/ml、 10 y g/ml、 15ii g/ml、20ii g/ml、25ii g/ml、30ii g/ml、35ii g/ml、40ii g/ml，每组样本6个复孑L并设细 胞对照组(只加细胞和培养液)和空白对照组(只加培养液，无细胞)；
(5)置37 °C ， 5 % C02孵箱中培养24h ;
(6)加入10 ii LMTT (5mg/ml)，继续培养4h ; (7)加入100 L SDS溶液，37°〇，5% C02孵箱中培养过夜，使甲臢结晶充分溶解， 570nm测0D值并计算细胞存活率； 结果显示，槐糖脂缓释栓剂同槐糖脂溶液相比，对宫颈癌细胞的抑制作用无明显 区别，其IC5。值均小于30ii g/ml。 实施例14槐糖脂制剂对动物宫颈癌模型的体内抑瘤实验 (1)裸小鼠宫颈癌模型的建立HeLa细胞在37t:，5XC02，含10X胎牛血清的DMEM 培养液中培养，将处于对数生长期的细胞用0. 25X胰蛋白酶消化，用无菌PBS液重悬制成 5 X 107/mL的单细胞悬液，每只裸小鼠于右侧颈背部皮下接种0. 2mL细胞悬液，共接种20 只，每天观察各注射点有无红肿破溃。 (2)抑瘤实验将20只裸小鼠随机分为2组，每组10只，实验设槐糖脂治疗组和 空白对照组。槐糖脂治疗组于接种细胞悬液2周后腹腔注射10mg/kg剂量的槐糖脂注射液 (用生理盐水配制)，3天1次，连续给药4周；而对照组则腹腔注射等体积的生理盐水。实 验中观察肿瘤体积和生长速度，实验进行4周后颈椎脱臼处死裸小鼠，称量体重和瘤重，计 算抑瘤率。 结果显示所有20只裸小鼠在实验过程中均成活，各个细胞悬液接种点未见红肿 破溃及出血表现。在细胞悬液接种的第14天，各个接种点均可见肿瘤结节，直径> 0. 5cm。 裸小鼠在给予槐糖脂后，对从裸小鼠上剥离下将的肿瘤组织的进行肉眼观察，呈结节状，灰 白色，质地偏硬，表面有假包膜，容易和周围组织剥离，用药组肿瘤横断面大部分可见中央 出现明显的坏死灶，对照组则少见坏死灶。而称量实验组和对照组小鼠体重，发现两组小鼠 并没有明显区别，而肿瘤瘤体重量却是实验组明显小于对照组。
权利要求
槐糖脂在制备抗宫颈癌药物中的应用，其特征在于，所述抗宫颈癌药物的剂型是栓剂或软膏剂；其中，所述剂型中槐糖脂的药物浓度为20μg/ml～125μg/ml。
2. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述剂型中槐糖脂的药物浓度为30i!g/ ml 100 li g/ml。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述剂型中槐糖脂的药物浓度为40yg/ ml 80 g/ml 。
全文摘要
本发明公开了一种槐糖脂在制备抗宫颈癌药物中的应用，其中，所述药物的剂型是栓剂或软膏剂，剂型中槐糖脂的药物浓度为20μg/ml～125μg/ml。本发明的制剂价格低廉，且用量少，抗肿瘤效果显著，对人体无任何毒副作用，临床上在某些方面可以替代手术切除、化疗等治疗方法，极具应用前景。
文档编号A61P35/00GK101703514SQ20091023062
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者宋欣, 曲音波, 李慧 申请人:山东大学