专利名称：一种甲型h1n1流感病毒重组蛋白疫苗制备方法的建立的制作方法
技术领域：
本发明属于人畜共患病研究领域，涉及一种人畜共患病的疫苗制备方法。选择了 公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(HlNl))cDNA序列中HA基因 为研究内容，首先根据结构生物学软件分析出HA蛋白漏在包膜外部分的序列，再根据抗原 性分析，选出免疫原性比较高的部分，利用通过基因合成方法获得基因片段构建原核表达 载体pGEX-6P-l-HA ;将阳性重组质粒转化到大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21rosseta/pGEX-6P-l-HA截短蛋白)；通过多种层析方法获得纯化后的H1N1的HA截短 蛋白，并利用所述的表达蛋白与佐剂一起共同免疫生物体，达到对H1N1病毒的预防性保护 效果。 本发明提供重组强致病性的甲型H1N1流感病毒HA重要抗原表位蛋白的表达与纯 化方法。
背景技术：
甲型H1N1流感是一种由A型猪流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，该病毒可在猪群 中造成流感暴发。2009年3月底至4月中旬，墨西哥、美国等多国接连暴发甲型H1N1型流 感疫情，接着在短短的几个月时间在全世界迅速蔓延。此次引发疫情的病毒是猪流感病毒 A(H1N1)亚型，是一种从未在人和猪身上出现过的新型猪流感病毒。截止2009年9月3日， 全球188个国家和地区发生了疫情，共报告25万病例，累计死亡病例2800多例，实际上发 病人数要远远超过报告的病例数。目前，北半球进入秋季，疫情呈快速上升趋势。从我国内 地来看，近期疫情形势也发生了一些新的变化，疫情从沿海向全国、从城市向农村扩散，由 输入为主变为本土为主，由散发病例向聚集疫情发展。目前，内地31个省份都发现疫情，每 日报告病例数呈上升趋势，近期还陆续出现了重症病例。我们面临的疫情防控形势不容乐 观。截至9月10日，我国内地31个省份累计报告甲型H1N1流感确诊病例6968例。
甲型H1N1流感的潜伏期，较普通流感、禽流感潜伏期长，潜伏期时长七天。早期症 状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛等，有些还会出现腹泻或呕吐、 肌肉痛或疲倦、眼睛发红等症状。部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过
39t:，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合症、肺出血、胸腔积液、全身血细胞减少、肾功
能衰竭、败血症、休克及Reye综合症、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。甲型H1N1流感的 蔓延给人群健康和经济社会发展带来巨大危害。疫情暴发后，我国高度重视防治防控工作， 果断决策，统一部署，采取了一系列有序有效的防控措施。秋冬季节，甲型H1N1流感会进入 一个高峰期。学校开学成为聚集性发病的重要风险因素。所以，我国防控甲型H1NI流感形 势严峻。日前，国务院对秋冬季节我国甲型H1NI流感防控工作做出了一系列重要部署。下 一阶段的防控方针是强化预防措施，严控社区传播，加强重症救治，全力减少疫情危害。所 谓"社区"，重点包括学校、医院等。我国将完善信息发布机制，制定针对人员密集流动情况 下的铁路、民航防控预案。中国首批甲型H1N1流感疫苗6月22日正式下线，在经过一系列 生物、生化实验和临床实验后，这批疫苗已经上市，并全部用于国家储备。目前，我国已成为世界上第一个可以应用甲型H1N1流感疫苗的国家。 全国范围内的疫苗接种工作正在紧锣密鼓的展开，但是由于目前国家批准的用于 H1N1的疫苗均为灭活病毒，其生产需要体外扩增病毒后灭活用于免疫的制备，其生产在数 量上受到很大的限制，疫苗将会在很短时间内便供不应求。 本发明利用原核表达系统表达纯化H1N1病毒HA蛋白核心抗原，原核表达系统以 其成本低、周期短、产量高的优势为蛋白表达纯化的首选系统，利用该系统，我们成功高效 表达了 H1N1病毒HA蛋白核心抗原，为H1N1重组蛋白疫苗的制备提供了有利的补充。
发明内容
其中所述的重组蛋白的制备方法，它包括下列步骤 1)公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(HlNl))cDNA序列 中HA基因为目的基因，通过基因合成的方法获得基因片段； 2)在原核表达载体pGEX-6P-l多克隆位点中定向插入甲型H1N1流感病毒非结构 蛋白基因HA截短蛋白的DNA序列，构建得到原核表达载体质粒pGEX-6P-l-HA截短蛋白基 因； 3)将步骤2)所说的原核表达载体质粒pGEX-6P-l-HA转化至大肠杆菌 BL21Rosseta感受态细胞，用氨苄霉素抗性筛选单个重组菌。 4)所述纯化具体是pGEX-6P-l-HA截短蛋白在大肠杆菌Rosetta中表达，克 隆接种至3ml含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37 °C ，过夜，220rpm ;将过夜培养 物l : IOO稀释至1L含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37。C，220rpm，培养5h ;加 入终浓度为0. lmM的IPTG，22°C， 180rpm，继续培养22h ;以8000g， 15min， 4°C离心收菌； 菌体用50mM Tris-cl，200mM NaCl pH8. 0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0. 5h ;用超 声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm，20min离心3次；将上清液使用GE healthcare的 Glutathione-S印harose4B柱料纯化，得到纯化融合蛋白。PSP酶切GST标签，柱料纯化，得 到除去标签的HA截短蛋白。 实验证明，纯化后HA截短蛋白可溶性极高，一年内未有聚合物出现。 本发明提供的利用PGEX-6P-1系统融合表达再经酶切处理去掉标签制得的HA截
短蛋白，可以在大肠杆菌中成功表达，表达量与前人的结果类似，相对于真核表达，原核表
达制备工程化抗体技术相对简单，成本更低； 本发明的有益效果是 1.本发明的有益效果之一是生物安全性高。本发明所用的检测抗原是重组蛋白， 制备过程中不涉及活病毒，因此没有活病毒逃逸、扩散的潜在危险。 2.本发明的有益效果之二是生产成本低。本发明所提供的甲型H1N1流感抗体检 测方法和检测试剂盒所需抗原是甲型H1N1流感病毒的HA的重要抗原表位。该蛋白可以通 过重组大肠杆菌BL21Rosseta/HA截短蛋白在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。
图1、显示PGEX-6P-1载体图谱。 图2、 HA截短蛋白融合蛋白小量表达鉴定SDS-PAGE电泳图。其中1为未诱导菌
4株；M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、14. 4KD ;2
为1号诱导后菌株；3为2号诱导后菌株；4为3号诱导后菌株； 图3、显示的是纯化后的HA截短蛋白融合蛋白SDS-PAGE电泳图。其中1为纯化后 的融合蛋白；M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、 14. 4KD ; 图4、酶切后除掉标签的HA截短蛋白SDS-PAGE电泳图。其中1为酶切后不带标 签的HA蛋白；M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、 14. 4KD。 专利
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例1甲型H1N1流感病毒HA截短蛋白基因原核表达载体的构建 BamHI及Sail酶切PUC57-HA截短蛋白和载体pGEX_6P_l，回收HA截短蛋白基因
和载体pGEX-6P-l ;然后用T4DNA ligase连接，22度水浴1小时，转化大肠杆菌Rossetta
感受态细胞，37— C培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37t:培养5
小时后，菌体0D值约0. 6时加IPTG至终浓度lmM，经小量表达鉴定，挑取阳性克隆。 实施例2甲型H1N1流感病毒HA的大量诱导表达和蛋白纯化 pGEX-6P-l-HA截短蛋白在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100ug/
ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37t:，过夜，220rpm;将过夜培养物1 : IOO稀释至IL含有
100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37。C，220rpm，培养5h ;加入终浓度为0. lmM的IPTG，
22。C，180rpm，继续培养22h ;以8000g， 15min， 4°C离心收菌；菌体用50mM Tris-Cl， 200mM
NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，O. 5h ;用超声破碎仪超声至溶液澄清，
12000rpm， 20min离心3次；将上清液使用GE healthcare的Glutathione-S印harose4B柱
料纯化，得到纯化融合蛋白。PSP酶切GST标签，柱料纯化，得到除去标签的HA截短蛋白。
权利要求
一种甲型H1N1流感病毒重组蛋白疫苗制备方法的建立。
2. 根据权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其特征是，包括但不限于以H1N1病毒HA，NA， NP， Ml， M2， NS1， NEP， PA， PB1， PB1-F2， PB2为模板设计并表达的全长、部分蛋白或经过突变 获得与突变前蛋白具有相似或相同免疫原性的融合及非融合重组蛋白。
3. 根据权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其特征是，可以是全长蛋白或部分蛋白单独 作为免疫原，也可以是几种蛋白组合成为免疫原或者是通过基因工程方法将几种抗原表位 融合表达作为免疫原。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，包括但不限于使用原核或真核表达载 体利用原核或真核表达系统进行蛋白表达、纯化的方法。
全文摘要
本发明属于人畜共患病研究领域，涉及一种人畜共患病的疫苗制备方法。选择了公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中HA基因为研究内容，首先根据结构生物学软件分析出HA蛋白漏在包膜外部分的序列，再根据抗原性分析，选出免疫原性比较高的部分，利用通过基因合成方法获得基因片段构建原核表达载体pGEX-6P-1-HA；将阳性重组质粒转化到大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21 rosseta/pGEX-6P-1-HA截短蛋白)；通过多种层析方法获得纯化后的H1N1的HA截短蛋白，并利用所述的表达蛋白与佐剂一起共同免疫生物体，达到对H1N1病毒的预防性保护效果。
文档编号A61P31/16GK101716340SQ200910272549
公开日2010年6月2日 申请日期2009年10月28日 优先权日2009年10月28日
发明者华权高, 沈鹤霄 申请人:武汉华美生物工程有限公司