专利名称：含有与聚阴离子偶联的、衍生自cd4受体的肽的用于治疗艾滋病的共轭分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有衍生自CD4受体的肽和有机分子，例如聚阴离子性多糖的共轭分 子。该共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病(AIDS)的治疗。本发明进一步涉 及制备所述共轭分子的方法。
背景技术：
在大量血清反应阳性的HIV患者中，结合核苷(NRTI)、非-核苷(NNRTI)和/或 蛋白酶抑制剂(PI)的三联疗法导致病毒电荷降低至检测水平以下。这种功效已经导致由 HIV感染导致的死亡数目的大量减少。但不幸地，已经在80%的患者中发现了抗病毒耐药 的基因型，更忧虑地，45. 5%的病毒患者对NRTI/PI联合治疗耐受，而的病毒患者对三 种抗-HIV类的联合治疗耐受(Tamalet等人，AIDS. 2003Nov7 ；17(16) :2383-8)。由于在 70%接受治疗的患者中发现的长期三联疗法治疗的不良反应(脂肪萎缩、脂肪代谢障碍、 高三酸甘油酯血症、高胆固醇血症、神经病等)导致差的依从性和通常导致耐受的治疗的 “突然”停止，这种观察特别令人不安。因此，开发具有较少不良反应和不具有交叉抗药性的 治疗的较少的严重形式是优先考虑的，尽管市场上目前可以得到大量的药物。有鉴于此，不 同于逆转录和蛋白质水解，有必要以HIV复制步骤为靶向。在病毒性感染循环中，病毒进入细胞是重要步骤。该步骤被分成两个阶段，第一 阶段是病毒与细胞表面在特定宿主受体水平相互作用，接着病毒遗传物质渗透入靶细胞。 关于HIV，在粘附和进入机理中涉及的分子伴侣已很好地确定。从病毒角度考虑，gpl20包 膜糖蛋白是本质上决定病毒/细胞相互的复合物。该蛋白质最初与宿主细胞的跨膜糖蛋 白(⑶4)结合。这种相互作用导致gpl20中构象的改变，gpl20暴露出特定的表位，称为 ⑶4-诱导(CD4i)，因此建立趋化因子受体(基本上为CCR5和CXCR4)的结合位点。因此， CCR5和CXCR4在细胞表面充当gpl20共受体。第二种相互作用导致gpl20/gp41蛋白质复 合体的重组和细胞/病毒膜融合的开始。通过使用的共受体的类型定义HIV病毒的细胞趋向性。更具体地说，所谓的X4或 “T-嗜性(T-tropic)”病毒倾向于感染在它们的表面表达CXCR4的细胞株，例如T淋巴细 胞。所谓的R5或“M-嗜性(M-tropic) ”病毒使用共受体CCR5且主要感染巨噬细胞和单核 细胞。R5或X4型病毒的存在通常与完全不同的艾滋病发展阶段相关(对R5无症状阶段， X4病毒的出现通常与不利的疾病发展结果相联系，提示共受体CXCR4的使用是艾滋病发病 机理的重要因素)。由于gp 120带有对CCR5和CXCR4识别的结构决定因素，所以R5和X4 病毒代表两种分开的靶标。除了上述的受体，HIV能够与其它在细胞表面发现的分子，特别是硫酸乙酰肝素 (HSs)结合。Hk是属于糖胺聚糖家族(GAGs)的多糖。它们大量存在于细胞表面和间质基 质(interstitial matrices)中，固定于特定糖蛋白的细胞外区域。在化学上与肝素(因其 抗凝性质使用的另一种GAG)相关，凭借它们结构和功能的多样性，IBs不同于其它生物大分子。由于它们与多种不同蛋白质结合的能力，它们的结构、稳定性和/或反应性通过相互 作用被修饰，所以它们与大量现象相关。尤其是，它们识别大量的病原体，其中之一是HIV， 因此充当结合受体。在HIV中，仍然是gpl20带有HS识别位点。发明人以前的工作发现HIV与肝素(或HS)结合的能力特定于X4模式株，由于R5 型病毒仅非常轻微地与多糖相互作用(Moulard等人，J. Virol. 74，1948-1960，2000)。这些 结果提示HS可能涉及到某些与细胞趋向性有关的特定性质，例如靶细胞的性质，X4菌株的 更大的致病性和在感染的无症状阶段，潜在X4病毒的贮液囊的建立。如发明人所见，HIV-HS的相互作用发生在gpl20水平，病毒粘附和进入的所有 原始阶段均涉及gpl20。相互作用的位点位于gpl20的区域，称为可变环3 (V3)。X4菌株 (isolates)的V3环与R5菌株的V3环相比富含碱性氨基酸，导致与肝素样低聚糖更好的相 互作用。在此所述的本发明是基于在CD4存在下gpl20_肝素相互作用非常具有潜力的观 察。然而，该作用依赖于使用的病毒株，且基本上发生在gpl20仅单独地与Hk微弱地相互 作用的浓度。发明人以前的工作已显示⑶4诱导的位点构成补充的与肝素或把8相互作用的位 点(VivSs 等人 J. Biol. Chem. 279，54327-54333，2005)。因此，抑制剂(mCD4_!B)，下面将描 述其生物作用，包含在⑶4识别位点与gpl20连接的肽(mCD4)。它能触发gpl20中构象的 改变，导致CD4i表位的暴露。然后，根据
图1，共价结合低聚糖(HS)能识别CD4i位点。人们很多年前就知道某些聚阴离子例如肝素(HP)和硫酸葡聚糖(DS)，但不是硫 酸软骨素(CS)，能抑制HIV引起的细胞感染 st6JA等人，Mol Pharmacol. 1997Jul ；52(1) 98-104)。尽管如此，但是特别由于它们的抗凝作用，它们不在临床上使用(Flexner C等人， Antimicrob Agents Chemother. 1991Dec ；35 (12) :2544-50)。近来研究显示该抑制作用的 分子机理与聚阴离子和V3环的相互作用相关(Moulard M等人，J Virol. 2000Feb ；74(4) 1948-60)。
此外，各种研究已经探寻使用可溶的⑶4抑制病毒与在HIV靶细胞表面表达的⑶4 的相互作用。已发现该溶液是无效的，由于通过与病毒的结合，溶液⑶4暴露表位⑶4i，因 此促进病毒与CCR5或CXCR4共受体的相互作用，这在某些情况下增加感染(Schenten D.等 人，1999. J Virol. 73 :5373-80)。从国际专利WO 03/089000可知衍生自⑶4受体的肽，当与聚阴离子联系时，具有 抗-HIV活性。尤其是，推荐根据NajjamS.等人的文章给出的说明可以制备肽和聚阴离子 结合的化合物(Cytokine 1997,9(12) 1013-1022)(参见实施例部分I. 1节)。
发明内容
在本发明中，发明人已经获得衍生自⑶4受体的活化肽，其可能直接地和共价地 连接至有机分子，例如聚阴离子性多糖。该活化作用要求将特定氨基酸残基插入至天然肽 (native peptide) 0特别地，发明人已经发现在衍生自⑶4受体的肽的序列中的一个和唯 一的氨基酸赖氨酸残基的存在对获得本发明的活化肽极其重要。此外，该唯一的氨基酸赖 氨酸残基必须在衍生自CD4受体的肽序列中的定义明确的位置。设计在确定的位置含有单 一氨基酸赖氨酸残基的mini⑶4肽允许在mini⑶4上选择性和直接地引入所需的功能。
为了简化以mCD4为基础的轭合物的合成，发展了设计带有单一衍生/偶联位点的 miniCD4的想法。我们的策略允许在miniCD4正确合成、折叠、纯化和表征之后，经大型板的 接头(linker)和化学过程偶联大量有机化合物。该策略让我们能够完美地制备定义轭合 物。本领域技术人员可能争辩存在用于在肽的序列内选择的氨基酸的特定标记和衍 生的方法。然而，在miniCD4序列内的多个半胱氨酸残基的存在限制了某些经典方法的使 用，这些经典方法通常在固相肽合成中使用，用于选择性的修饰/衍生所选的氨基酸(见图 10)。就此而言，在选择的赖氨酸侧链上引入马来酰亚胺基是不可能的。的确，在最终TFA裂解中硫醇化清除剂的应用和正确合成和折叠miniCD4肽所需 的基于谷胱甘肽化(gluthation)的条件，排除当肽依然连接于载体上时在选择的赖氨酸 上引入马来酰亚胺功能(fonction)(或其它硫醇化敏感性衍生分子)的机会。事实上，其 排除例如，在mCD4-聚阴离子共轭步骤应用强马来酰亚胺/SH的策略。此外，我们的前-mCD4 (post-mCD4)合成衍生物策略能够快速筛选不同的接头，无 需进行mCD4肽的多重肽树脂(multiple on-peptide resin)衍生化、分裂和折叠。更重要地，mini⑶4序列内衍生位点(赖氨酸)的正确位置(例如，位置5)提供 聚阴离子化合物的最佳方位，该聚阴离子化合物靶向CD4i的HSBS和共受体结合位点(见 图 11)。因此，本发明提供能生成大量潜在抗病毒衍生物的活化肽。这些衍生物由含有⑶4 肽的共轭分子组成，CD4肽特别地通过接头偶联至有机分子，例如聚阴离子性多糖。该方法在治疗上有利地抑制病毒粘附于细胞，由于它直接靶向病毒，而非细胞本 身。因此，初看之下缺乏观察到的与连接至共受体的药物的细胞作用。另外，考虑到涉及各 种病毒趋向性的位点的保留，本发明的化合物应当与不同病毒株的gpl20相互作用。而且， 尽管可能误导认为耐受没有发生，该新型化合物不应导致耐受的容易出现。的确，gpl20的 ⑶4位点必须保持完整以便继续结合至⑶4，就像结合至聚阴离子性多糖涉及的碱性残基 用于与共受体相互作用。这两个位点中的一个突变将导致病毒减弱感染性。最后，在本发 明的框架内，可以开发化合物完整合成的版本，因此保证大量可用的制剂，其是均勻的和完 美定义的。偶联方法是简单、快速和定量的。因此，根据第一方面，本发明涵盖含有衍生自⑶4受体的肽的共轭分子，所述肽通 过接头偶联至有机分子，其中■所述衍生自⑶4受体的肽含有下列通用序列(I)Xaaf-Pl-Lys-Cys-P2-Cys-P3-Cys-Xaag-Xaah-Xaai-XaaJ-Cys-Xaak-Cys-Xaa1-Xaam，(I)其中-P 1代表3至6个氨基酸残基，-P2代表2至4个氨基酸残基，-P3代表6至10个氨基酸残基，-Xaaf代表N-乙酰半胱氨酸(Ac-Cys)或3_巯基丙酸(TPA)，-Xaag代表Ala (丙氨酸)或Gln (谷氨酰胺)，
-Xaah代表Gly (甘氨酸)或(D) Asp (天冬氨酸)或kr (丝氨酸)，-Xaai代表Ser或Hi s (组氨酸)或Asn (天冬酰胺)，-Xaaj代表联苯丙氨酸(Bip)、苯基丙酸或β -萘基丙氨酸，-Xaak 代表 Thr (苏氨酸)或 Ala，-Xaa1代表Gly、Val (缬氨酸)或Leu (亮氨酸)，且-Xaam 代表-NH2 或-0H，所述在Pl、P2和P3中的氨基酸残基是天然或非天然的，相同或不同的，所述Pl、 P2和P3的残基都与Lys残基不同，且P1、P2和P3具有共同或非共同的序列，且■所述有机分子具有下列通用结构(II)
其中-η代表0至10之间的整数，特别地，11是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，有利地，η 是0、1、2、3、4 或 5，-X代表无机反离子(couterion)，例如Na+、K+、Li+或Mg2+，或有机反离子，例如 R3NH+, R4N+,其中R彼此独立地代表烷基，有利地为Na+，-m代表所述分子的负电荷的数目，-R1是相同或不同的基团且代表氢原子或0-保护基GP，-R2代表氢原子或0-保护基GP'，其中GP和GP'相同或不同，-R3是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸盐、磷酸根或任何阴离子，-R4是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸盐、烷基或酰基，-R5是相同或不同的基团且代表氢原子、烷基或酰基，-A 代表选自下列通式的基团_ (CH2) p-NH-CO- (CH2) ,-、- (CH2-CH2) - (O-CH2-CH2) p-NH-C0-(CH2) - 0 ) p-NH-C0-O^H2-CH2-O)「O^H2-CH2)-或-O^H2-CH2) - (O-CH2-CH2) P-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-,其中ρ代表1至10之间的整数且q代表1至10之间的 整数，有利地，A代表通式-(CH2) 5-NH-C0- (CH2) 2-的基团，且-Z代表卤原子，巯基或马来酰亚胺基，所述接头的一个末端共价结合至存在于衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中的 氨基酸残基Lys的游离氨基(-NH2)，且所述接头的另一个末端共价结合至有机分子的Z基团。优选地，P3含有至少一种碱性氨基酸，所述碱性氨基酸甚至更优选为精氨酸。在 CD4受体片段该位置上的碱性残基的存在有助于其结合至gpl20蛋白质。因此，发明人更喜 欢将至少一种碱性氨基酸引入至P3，优选精氨酸。因此这样保持碱性部分，该碱性部分在 PH 7-8不发生衍生化，但是已发现其有助于将mini⑶4肽结合至gpl20蛋白质。
在本申请中，术语“mini⑶4肽”、“⑶4肽”和“mini⑶4”可交换地用于指定含有上 面定义的通用序列(I)或由上面定义的通用序列(I)组成的衍生自CD4受体的肽。本发明需要衍生自⑶4受体的肽在它的通用序列⑴中包括在通用序列⑴定义 的位置中的一个和唯一的氨基酸赖氨酸(Lys)残基。通用序列(I)中的Cys残基允许用于折叠回mini⑶4的三个二硫桥键的形成。当3-巯基丙酸(TPA)在通用序列(I)的肽的N-末端位置时，使其可能减少N-末 端障碍并克服胺基的存在。因此，根据一个优选的具体实施方案，代表在通用序列⑴中的TPA。在通用序列(I)中，fed代表Bip、Phe或β -萘基丙氨酸。联苯丙氨酸增加与 糖蛋白gpl20在腔内的接触，⑶4受体的Wie 43位于腔内。然而，当分析mini⑶4/gpl20 复合物的结构时，具有Wie的本发明的mini⑶4肽可以更好的模拟⑶4(Huang CC等人， Structure. 2005May ； 13 (5) :755-68)。因此，根据另一个优选的具体实施方案，Xaaj代表I^he。衍生自⑶4受体的通用序列(I)的肽具有α螺旋结构，接着是β-折叠 (betasheet)。氨基酸 Xaag-fciah-XaaLfciaj-Cys-Xaak-Cys-fcia1 以主要途径参与和 gpl20 的 结合。这些肽拥有与sCD4(可溶性CD4)相似的IC50 (对gpl20的亲和力)。衍生自⑶4受体的通用序列(I)的肽可以通过常规的固相化学合成技术制 备，例如根据Fmoc固相肽合成方法制备(“Fmoc solid phase peptide synthesis, a practicalapproach，，，W. C. Chan 禾口 P. D.White 编辑，Oxford University Press, 2000)禾口 / 或通过基因重组制备。优选，衍生自⑶4受体的具有通用序列(I)的肽的序列选自序列SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 2，有利地为 SEQ ID No. 1。在本发明中，术语“接头”是指通过如下所定义的双官能团化合物与衍生自⑶4受 体的肽和有机分子偶联获得的接头。因此，接头的长度随使用的双官能团化合物而变化。特别地，接头将有利地选自其中kl代表1至10之间的整数，因此为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，其中k代表2至M之间的整数，有利地为2、4、8 或 12，有利地为1、2、3、5和10，
权利要求
1.含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头偶联至有机分子，其中 ■所述衍生自CD4受体的肽含有下列通用序列(I)Xaaf-PI-Lys-Cys-P2~CyS-PS-CyS-Xaas-Xaah-Xaa1-Xaaj-CyS-Xaak-CyS-Xaa1-Xaam, (I) 其中-Pl代表3至6个氨基酸残基， -P2代表2至4个氨基酸残基， -P3代表6至10个氨基酸残基，-Xaaf代表N-乙酰半胱氨酸(Ac-Cys)或3_巯基丙酸(TPA)，-Xaah 代表 Gly 或(D)Asp 或 kr， -Xaa1 代表 Ser 或 His 或 Asn,-Xad代表联苯丙氨酸(Bip)、苯基丙酸或β-萘基丙氨酸，-Xaak 代表 Thr 或 Ala，-Xaa1 代表 Gly、Val 或 Leu，且-Xaam 代表-NH2 或-0H，所述在P1、P2和P3的氨基酸残基是天然或非天然的，相同或不同的，所述P1、P2和P3 的残基都与Lys残基不同，且P1、P2和P3具有共同或非共同的序列，且 ■所述有机分子具有下列通用结构(II)其中-η代表0至10之间的整数，特别地，η是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，有利地，η是0、 1、2、3、4 或 5，-X代表无机反离子，例如Na+、K+、Li+或Mg2+，或有机反离子，例如R3NH+、R4N+,其中R彼 此独立地代表烷基，-m代表所述分子的负电荷的数目，-R1是相同或不同的基团且代表氢原子或0-保护基GP，-R2代表氢原子或0-保护基GP'，其中GP和GP'相同或不同，-R3是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸根、磷酸根或任何阴离子，-R4是相同或不同的基团且代表氢原子、硫酸根、烷基或酰基，-R5是相同或不同的基团且代表氢原子、烷基或酰基，-A 代表选自下列通式的基团_ (CH2) p-NH-CO- (CH2) ,-、- (CH2-CH2) - (O-CH2-CH2) p-NH-C0-(CH2) - 0 ) p-NH-C0-O^H2-CH2-O)「O^H2-CH2)-或-O^H2-CH2) - (O-CH2-CH2) P-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-,其中ρ代表1至10之间的整数且q代表1至10之间的 整数，有利地，A代表通式-(CH2) 5-NH-C0- (CH2) 2-的基团，且-Z代表卤素原子、巯基或马来酰亚胺基，所述接头的一个末端共价结合至存在于衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中的氨基 酸残基Lys的游离氨基(-NH2),且所述接头的另一个末端共价结合至有机分子的Z基团。
2.根据权利要求1所述的共轭分子，其中所述衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的 肽的序列选自序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2。
3.根据权利要求1或2所述的共轭分子，其中所述接头选自OO其中k代表2至M之间的整数，O其中kl代表整数1、2、3、5和10，OOH'N、OOOOOOO当Z代表巯基时，且选自OO或O、sVO^^^弋或O"N9当Z代表马来酰亚胺基团或卤素原子。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的共轭分子，其中基团R1都相同。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的共轭分子，其中基团R1选自氢原子、甲基或苄基。基c
6.根据权利要求1-5任意一项所述的共轭分子，其中基团R2选自氢原子或对甲氧苄
7.根据权利要求1-6任意一项所述的共轭分子，其中所述共轭分子选自下列分子
8.含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头偶联至有机分子，其中 ■所述衍生自CD4受体的肽含有如权利要求1所定义的通用序列(I)，且 ■所述有机分子代表选自肝素或硫酸乙酰肝素的聚阴离子，其中糖醛酸部分可以是葡 萄糖醛酸或艾杜糖醛酸，聚合度dp为2- ，其中基本上所有聚阴离子的游离羟基被O-保护 基GP"取代，这些GP"基团相同或不同，且其中所述聚阴离子被修改从而其带有选自卤原 子、巯基或马来酰亚胺基的官能团，所述接头的一个末端共价结合至存在于衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中的氨基 酸残基Lys的游离氨基(-NH2),且所述接头的另一个末端共价结合至有机分子的官能团。
9.根据权利要求8所述的共轭分子，其中所述衍生自CD4受体的具有通用序列(I)的 肽的序列选自序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2。
10.根据权利要求8或9所述的共轭分子，其中所述接头选自
11.根据权利要求8-10任意一项所述的共轭分子，其中GP"基团相同。
12.根据权利要求11所述的共轭分子，其中GP"基团为甲基或苄基。
13.根据权利要求1-12任意一项所述的共轭分子，其作为药物使用。
14.根据权利要求13所述的共轭分子，其用于艾滋病的治疗。
15.药物组合物，其含有根据权利要求1-12任意一项所述的共轭分子和药学上可接受 的载体。
16.制备根据权利要求1-13任意一项所述的共轭分子的方法，其特征在于所述方法包 括下列步骤a.用带有两个活性基团的双官能团的化合物接触如权利要求1所定义的衍生自CD4 受体的具有通用序列(I)的肽，从而两个活性基团中的一个与存在于通用序列(I)中的氨 基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键，以获得带有双官能团的第二活性基团的活化 肽，且b.用带有如权利要求1或8所定义的官能团的有机分子，或用相当于带有如权利要求 1或8所定义的巯基的有机分子的有机分子，其中所述巯基(SH)已被巯基保护基保护，接触 步骤(a)中获得的活化肽，从而所述活化肽的活性基团与有机分子的受保护或不受保护的 官能团形成共价键，以获得所述共轭分子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双官能团化合物的活性基团为N-羟基琥珀 酰亚胺酯或N-羟基-4-硫代-琥珀酰亚胺酯，所述双官能团化合物的活性基团在步骤(a) 与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述双官能团化合物的两个活性基团是不 同的，且两个基团中的一个为N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-羟基-4-硫代-琥珀酰亚胺酯。
19.根据权利要求16-18任意一项所述的方法，其中所述的双官能团化合物选自琥珀 酰亚胺基_6-[ β -马来酰亚胺丙酰胺基]己酸酯(SMPH)或NHS-PEOn-马来酰亚胺，η为2 至M之间的整数。
20.根据权利要求16-19任意一项所述的方法，其中当代表衍生自CD4受体的 肽的序列(I)中的TPA时，所述方法包括初步步骤，所述初步步骤包括用N-琥珀酰亚胺 基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)接触衍生自CD4受体的具有下列通用序列(III)的 肽PI-Lys-Cys-P2~CyS-PS-CyS-Xaas-Xaah-Xaa1-Xaaj-CyS-Xaak-CyS-Xaa1-Xaam, (III)其中Pl至P3和Xaag至Xaam如通用序列(I)中所定义，从而在所述衍生自CD4受体的具有通用序列(III)的肽的N-末端引入TPA。
全文摘要
本发明涉及含有通过接头与有机分子偶联的、衍生自CD4受体的肽的共轭分子，以及制备共轭分子的方法。该共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病的治疗。
文档编号A61P31/18GK102046203SQ200980107826
公开日2011年5月4日 申请日期2009年1月27日 优先权日2008年2月6日
发明者D·博纳夫, F·巴勒兹, H·洛尔塔-雅各布, L·洛雷-罗莫雷 申请人:原子能和能源替代品委员会, 国家科学研究中心, 巴斯德研究所, 巴黎第十一大学