专利名称：一种用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂及制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体地说是一种用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂及制备。
背景技术：
人用狂犬病纯化疫苗(KI)在临床使用过程中，发现其作为一种生物抗原刺激机体后，可诱发机体产生强有力的免疫反应，(抗原特异性免疫；非抗原特异性免疫)而宿主的免疫反应，对控制相关病变具有十分重要的作用。大量的文献研究资料证明人体自身免疫力低下与癌症的发生有着相当密切的联系，一旦机体免疫力降低，各种疾病可以乘隙而入。临床的资料又证明，在肿瘤病毒与人类疾病关系的研究中，只有人乳头瘤病毒 (humanpapilloma virus,HPV)与人类肿瘤的关系最为明确。1995年WHO和IARC已将HPV 确定为是宫颈癌的病因。HPV主要侵犯人皮肤粘膜的上皮组织，引起皮肤粘膜上皮的良恶性增生，墨西哥医学专家指出，人乳头状瘤病毒(HPV)潜伏期很长，女性感染这种病毒后如果发现早、诊治及时，可防止病毒诱发宫颈癌。目前HPV已分离出100多型，根据诱发病变性质的不同，将 HPV 分为13 种高危型 HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)， 低危型HPV主要包括HPV(6、11、32、40、42、43、54、MM8)。高危型HPV病毒几乎是所有宫颈癌的元凶，在细胞学和分子生物学方面也获得了人乳头状瘤病毒致癌的有力证据。大量研究表明，高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要病因，临床病理检查中，宫颈癌患者几乎100%的有高危型人乳头瘤病毒(HPV)的感染，高危型HPV(16、18)亚型与肾恶性肿瘤有关(其中肾乳头状癌的HPV(16、18)基因阳性率明显高于肾透明细胞癌和肾颗粒癌)， 证实了高危型HPV感染是肾癌的重要致癌原因，有资料证明了食管鳞癌与E6癌基因蛋白的关系。低危型HPV与某些性病有关，包括生殖器疱疹、尖锐湿疣以及宫颈糜烂、慢性宫颈炎等，其中HPV6和11是最常见的低危型HPV，90%的生殖道尖锐湿疣与之有关。目前抑制人乳头瘤病毒及治疗人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤和采用人用狂犬病纯化疫苗治疗性病的外用剂型及制备方法还尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗人乳头瘤病毒及治疗人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤和性病的喷剂及其制备方法，采用本发明除对肿瘤具有明显的治疗作用、无毒副作用外，本发明喷剂可保存人用狂犬病纯化疫苗的生物活性并对人体没有造成任何负面损伤，使局部用药成为可能，本发明所说的局部用药均指的是直接往感染病患处用药。本发明技术方案如下本发明喷剂的制备方法本发明的成份为Iml的人用狂犬病纯化疫苗，加为0.01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液至IOml制成，其中所述0. 005 0. 015g/ml壳聚糖-醋酸为IOg壳聚糖及IOOOml醋酸溶液。
制备人用狂犬病纯化疫苗的病毒株为但不限于狂犬病毒PM株、PV株、CTN株或AG
株。 用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂的制备方法，按如下步骤操作首先，配制壳聚糖_醋酸溶液1)制备0. 3 1. 0%醋酸溶液将冰醋酸3 10体积份加入至1000体积份容量瓶中，加纯水至刻度，得到体积百分浓度为0. 3 的醋酸溶液；2)制备壳聚糖-醋酸溶液称取壳聚糖10 30g加入至IOOOml容量瓶中，加上述的醋酸溶液，完全溶解至刻度，制成0. 01 0. 03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液；3)根据壳聚糖-醋酸溶液的pH值选用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或0. lmol/L的醋酸溶液调节pH至3. 8 5. 0 ；其次，配制疫苗溶液取活性单位为5IU 20IU的人用狂犬病纯化疫苗1ml，加壳聚糖-醋酸溶液稀释至IOml，获得活性浓度为5IU 20IU/10ml的疫苗溶液，根据壳聚糖-醋酸溶液的pH值选用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或0. lmol/L的醋酸溶液调节pH至3. 8 5. 0， 优选PH值为4. 9 5.0。其中所述人用狂犬病纯化疫苗可以为溶液型或冻干型。其中所述冰醋酸采用分析纯或化学纯。其中所述纯水采用重蒸馏水。本发明的喷剂用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的宫颈癌、人乳头瘤病毒感染引起的生殖器疱疹或生殖器尖锐湿疣、人乳头瘤病毒感染引起宫颈糜烂、人乳头瘤病毒感染引起的慢性宫颈炎。本发明的喷剂为外用剂型。本发明具有如下有益效果1.使用带有正离子并能在酸性条件下可完全溶解的壳聚糖作为粘附剂，使人用狂犬病纯化疫苗完全溶解，并使本发明的喷剂喷出之后具有好的气雾性，从而使药物喷出后均勻覆盖于病灶粘膜表层，有利于机体对药物的吸收。2.本发明外用喷剂及制备方法着重对由HPV感染引起的宫颈癌患者、生殖器疱疹和尖锐湿疣患者、宫颈糜烂、慢性宫颈炎，HPV感染人群进行跟踪治疗(Tc亚群检测、HPV检测及临床症状的改善)，均取得良好的临床效果。3.采用本发明主要成分为人用狂犬病纯化疫苗，通过对人宫颈癌Hela人源性肿瘤细胞的体外MTT法检测实验证明本发明主要成份人用狂犬病纯化疫苗对肿瘤细胞的直接杀伤作用。通过裸鼠移植性肿瘤抑瘤实验得知主要成份人用狂犬病纯化疫苗局部注射对裸鼠异种移植瘤人宫颈癌Hela肿瘤生长显示明显抑制作用。本发明在对机体免疫调节作用中使小鼠单核细胞、腹腔吞噬细胞的吞噬能力增强，说明对网状内皮系统吞噬功能具有明显的激活、增强作用。所以本发明发现人用狂犬病疫苗可诱发机体产生强有力的免疫反应，HPV感染者经系统治疗后(未经其它治疗途径)，HPV检测阳转阴。4.本发明的毒理实验证明该外用剂和皮肤重复接触中致敏反应强度为弱致敏性。小鼠以及家兔急性毒性实验未见明显毒性反应。小鼠微核实验结果表明小鼠肌肉注射给药< 375U+25mg/kg剂量下未诱发骨髓嗜多染红细胞微核率的增高。
5.在本发明阴道刺激试验中，通过则定家兔或大鼠连续阴道给药后未见明显血管充血和水肿等异常改变。多次给药刺激试验也证明本发明外用剂对实验动物阴道黏膜无明显刺激反应。 6.在对家兔连续给药12周长期毒性试验中，确定出无毒性反应的用药剂量，为临床人用剂量提供了参考。
图1本发明疫苗溶液对人宫颈癌Hela细胞周期分布的影响。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，本发明并不受这些实施例的限制。制剂实施例1本发明喷剂成分按体积比计，成份为Iml的人用狂犬病纯化疫苗，加质量体积浓度为0. 01g/ml壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。具体配备方法如下1.配制壳聚糖_醋酸溶液(pH = 3. 2)(1)制备0. 3%的醋酸溶液将冰醋酸3ml (分析纯)加入至IOOOml容量瓶中，力口纯水至刻度，这里的纯水采用重蒸馏水，得到体积百分浓度为0. 3%的醋酸溶液；(2)制备质量体积浓度为0. 01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液称取壳聚糖IOg加入至上述的醋酸溶液完全溶解至1000ml，溶液不允许出现不溶性颗粒或不溶物，制成质量体积浓度为0. 01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液；(3)根据壳聚糖_醋酸溶液的PH值选用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或者体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH值至3. 2。2.疫苗溶液配制取活性单位为5IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗Iml (本实施例采用两支，每支 0. 5ml, 2. 5IU)溶液加入至IOml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗制备病毒株采用狂犬病毒PM 株，加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得活性浓度为5IU/10ml的疫苗溶液。根据疫苗溶液的PH值选用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L 的醋酸溶液调节PH值至3. 2，溶液具有澄明度。说明pH值保持在3. 8到5. 0之间，如pH值超过5. 0或低于3. 8壳聚糖与醋酸脱离，溶液变成不透明状，成份发生了改变，在使用时，喷出的溶液将不呈现雾状。制剂实施例2与实施例1不同之处在于1.配制壳聚糖-醋酸溶液(pH = 4. 9)制备0.4%的醋酸溶液采用的冰醋酸4ml为(化学纯)；用体积摩尔浓度为 0. lmol/L的氢氧化钠溶液或者体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH值至4. 9。制备质量体积浓度为0. 02g/ml的壳聚糖-醋酸溶液称取壳聚糖20g加入至上述的醋酸溶液完全溶解至1000ml，溶液不允许出现不溶性颗粒或不溶物，制成质量体积浓度为0. 02g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。2.疫苗溶液配制 取活性单位为15IU的冻干型人用狂犬病纯化疫苗Iml (本实施例采用两支，每支 0. 5ml，7.5IU)加入至IOml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒PV株。 加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得活性浓度为15IU/10ml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH值至4. 9， 溶液具有澄明度。制剂实施例3与实施例1不同之处在于1.配制壳聚糖_醋酸溶液(pH = 5. 0)制备1. 0%醋酸溶液采用的冰醋酸IOml为化学纯；用体积摩尔浓度为0. lmol/L 的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH至5. 0。制备质量体积浓度为0. 03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液称取壳聚糖30g加入至上述的醋酸溶液完全溶解至1000ml，溶液不允许出现不溶性颗粒或不溶物，制成质量体积浓度为0. 03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。2.疫苗溶液配制取活性单位为IOIU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗Iml (本实施例采用两支，每支 0. 5ml, 5IU)溶液加入至IOml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒CTN 株。加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得浓度为lOIU/lOml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH值至5. 0， 溶液具有澄明度。制剂实施例4与实施例1不同之处在于1.配制壳聚糖_醋酸溶液(pH = 4. 2)制备0. 4%醋酸溶液采用的冰醋酸4ml为化学纯；用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH至4. 2。2.疫苗溶液配制取活性单位为20IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗Iml (本实施例采用两支，每支 0. 5ml,10IU)溶液加入至IOml量瓶中，其中人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒 AG株。加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得浓度为20IU/10ml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH值至 4. 2，溶液具有澄明度。制剂实施例5与实施例1不同之处在于1.配制壳聚糖_醋酸溶液(pH = 4. 9)制备0. 4%醋酸溶液采用的冰醋酸4ml为化学纯；用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH至4. 9。2.疫苗溶液配制取活性单位15IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗Iml (本实施例采用两支，每支0. 5ml, 7. 5IU)溶液加入至IOml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒PM 株。加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得浓度为15IU/10ml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0. lmol/L的醋酸溶液调节pH值至4. 9， 溶液具有澄明度。病情治疗案例一孙某某 病理诊断宫颈鳞癌前变，CINII ；经宫颈椎切术后，HPV阳性，干扰素针剂注射及干扰素药膏局部用药治疗2个月，HPV依然阳性。具体临床用量取制剂实施例4中活性浓度为20IU/10ml经本发明喷剂局部用药， 每日4次，一次一喷(140 μ 1)，用药45天，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。病情治疗案例二 周某某病理诊断宫颈鳞癌，II期B ；术后化疗两个周期，HPV检测为阳性。具体临床用量取制剂实施例5中活性浓度为15IU/10ml的本发明喷剂外用，每日 4次，一次一喷(140 μ 1)，20天为一个疗程，共两个疗程，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。病情治疗案例三安某临床诊断生殖器疱疹，HPV阳性；具体临床用量取制剂实施例3中活性浓度为lOIU/lOml的本发明喷剂外用，每日4次，一次一喷(140 μ 1)，20天为一个疗程，共三个疗程，停药后疱疹消失，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。病情治疗案例四田某某临床诊断生殖器尖锐湿疣，HPV阳性；具体临床用量取制剂实施例4中活性浓度为20IU/10ml的本发明喷剂外用，每日 6次，一次一喷(140 μ 1)，20天为一个疗程，共四个疗程，停药后疣体干瘪部分脱落，停药20 天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。病情治疗案例四许某某临床诊断宫颈糜烂，HPV阳性；具体临床用量取制剂实施例1中活性浓度为5IU/10ml的本发明喷剂外用，每日 6次，一次一喷(140 μ 1)，20天为一个疗程，共四个疗程，停药后检查宫颈粘膜恢复正常，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。病情治疗案例四白某临床诊断慢性宫颈炎，HPV阳性；具体临床用量取制剂实施例2中活性浓度为15IU/10ml的本发明喷剂外用，每日 6次，一次一喷(140 μ 1)，30天为一个疗程，共四个疗程，停药后炎症消失，停药20天后做 HPV检测，结果显示为阳转阴。实验实施例本发明对肿瘤细胞的起到直接杀伤的作用通过如下实验可以得到进一步了解。实验实施例1对人源性肿瘤细胞的体外MTT法检测实验实验试剂与药品
本发明外用喷剂，根据实际需要选用不同的活性浓度。阳性对照药氟尿嘧啶注射液，批号050806，为上海旭东海普药业有限公司产品。细胞株 Hela(人宫颈癌细胞)由中国医科院药物研究所培养传代。仪器BI0RAD 550型酶标仪实验方法四氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT]还原法。收集生长良好的肿瘤细胞，于96孔培养板内接种，培养24小时后加药。受试样品培养4天。用550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长405nm下测定个孔的吸光度(OD) 值。实验数据经处理得到半数抑制浓度(IC50)。实验结果显示本发明所采用的主要成分为人用狂犬病纯化疫苗对HelaIC5ci <0. lIU/ml。表明了本发明主要成份为人用狂犬病纯化疫苗对人源癌细胞均有体外增殖抑制作用。实验实施例2利用流式细胞仪对人宫颈癌Hela细胞周期分布产生影响的测试。实验试剂与药品本发明疫苗溶液，根据实际需要选用不同的活性浓度。细胞株采用实验实施例中的Hela细胞。结果提示人用狂犬病疫苗对人宫颈癌Hela细胞周期分布产生影响，人用狂犬病纯化疫苗可使人宫颈癌细胞周期阻滞于G2/M期，提示人用狂犬病纯化疫苗对肿瘤增殖抑制作用与诱导肿瘤细胞周期阻滞有关，参见图1。药物可通过诱导G2/M期周期阻滞抑制肿瘤细胞增殖(图谱的第二个峰为周期阻滞抑制峰)。实验实施例3本发明疫苗溶液对人宫颈癌Hela裸鼠异种移植瘤生长抑制作用。受试药物制剂实施例1中疫苗溶液，活性单位为5IU/ml。实验材料1.裸鼠，北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号SCXK (京)2007-0001。2.人宫颈癌细胞株Hela，自体外培养细胞接种于裸鼠成瘤。发明人传代保存。3.饲养小鼠颗粒料，由沈阳实验动物颗粒饲料厂提供。4.对照药阿霉素批号060303B，提供单位浙江海正药业股份有限公司，用生理药水稀释0. lmg/ml备用。实验方法选择肿瘤生长良好的荷瘤动物，颈椎脱白处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成直径2-3mm的瘤块，套管针接种于裸鼠腋部皮下。7天后可见肿瘤生长。用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，按瘤体积大小分层分组。每组7只动物。设阴性对照组(不给药)，本发明疫苗溶液0. 2ml肿瘤局部给药1组，本发明疫苗溶液0. Iml肿瘤局部给药加0. Iml肌肉注射给药1组，本发明疫苗溶液0. lml.O. 2ml,0. 4ml肌肉注射给药各1组。阿霉素5mg/ kg腹腔注射给药作为阳性对照。自分组当日开始给药，每日1次，给药20天。给药后，每周2 3次对实验动物肿瘤的长、宽径及体重进行测量记录，观察动物肿瘤生长及一般情况。20天之后将动物处死后剥离肿瘤，称瘤重，计算药物对肿瘤生长抑制率。计算肿瘤体积 (TV)及相对肿瘤体积(RTV)，比较各组动物肿瘤重量、肿瘤体积、相对肿瘤体积(RTV)等指标的统计学差别(见表1与表2)。解组织肉眼可见肿瘤周围轻度水肿，瘤组织块体积小，表面有破溃或结痂。剥离肿瘤见肿瘤壁薄，内容物为黄绿色豆渣样。肌肉给药改局部注射组的肿瘤则可见肿瘤包膜薄，瘤组织整体泛黄色，瘤组织质软，无张力。结论在实验选用的剂量范围内，本发明所采用的主要成份人用狂犬病纯化疫苗局部给药和局部肌肉注射给药对裸鼠异种移植瘤人宫颈癌Hela肿瘤生长显示明显抑制作用。表1本发明疫苗溶液对人宫颈癌Hela裸鼠异种移植瘤体重抑制作用
权利要求
1.一种用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂，其特征在于成份为Irnl的人用狂犬病纯化疫苗，加0. 01 0. 03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液稀释至IOml而制成。
2.按权利要求1所述的喷剂，其特征在于所述人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为但不限于狂犬病毒PM株、PV株、CTN株或AG株。
3.一种用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂的制备方法，其特征在于按如下步骤操作首先，配制壳聚糖-醋酸溶液1)制备0.3 1. 0%醋酸溶液将冰醋酸3 10体积份加入至1000体积份容量瓶中， 加纯水至刻度，得到体积百分浓度为0. 3 1. 0%的醋酸溶液；2)制备壳聚糖_醋酸溶液称取壳聚糖10 30g加入至IOOOml容量瓶中，加上述的醋酸溶液，完全溶解至刻度，制成质量体积浓度为0. 01 0. 03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液；3)根据壳聚糖-醋酸溶液的pH值选用体积摩尔浓度为0.lmol/L的氢氧化钠溶液或 0. lmol/L的醋酸溶液调节pH值至3. 8 5. 0 ；其次，配制疫苗溶液取活性单位为5IU 20IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗或冻干型人用狂犬病纯化疫苗1ml，加上述壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml，获得活性浓度为5IU 20IU/10ml的疫苗溶液，根据疫苗溶液的PH值选用体积摩尔浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液或0. lmol/L的醋酸溶液调节PH值至3. 8 5. 0，优选pH值为4. 9 5. 0。
4.按权利要求3所述制备方法，其特征在于其中所述冰醋酸采用分析纯或化学纯。
5.按权利要求3所述制备方法，其特征在于其中所述纯水采用重蒸馏水。
6.按权利要求1 2中任一项所述的喷剂，其特征在于所述的喷剂所治疗的疾病为人乳头瘤病毒感染引起的宫颈癌。
7.按权利要求1 2中任一项所述的喷剂，其特征在于所述的喷剂所治疗的疾病为人乳头瘤病毒感染引起的生殖器疱疹或生殖器尖锐湿疣。
8.按权利要求1 2中任一项所述的喷剂，其特征在于所述的喷剂所治疗的疾病为人乳头瘤病毒感染引起的宫颈糜烂。
9.按权利要求1 2中任一项所述的喷剂，其特征在于所述的喷剂所治疗的疾病为人乳头瘤病毒感染引起的慢性宫颈炎。
10.按权利要求1 2中任一项所述的喷剂，其特征在于所述的喷剂为外用剂型。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，具体地说是一种治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂及制备方法。按体积比计，其喷剂成份为1ml的人用狂犬病纯化疫苗，9ml的制成质量体积浓度为0.01～0.03g/ml壳聚糖-醋酸溶液；其中所述壳聚糖-醋酸溶液为10～30g壳聚糖加醋酸溶液完全溶解至1000ml。其制备先通过制备0.3～1.0％醋酸溶液再制备壳聚糖-醋酸溶液；然后取活性含量5IU～20IU的人用狂犬病疫苗溶液1体积份加入至10体积份量瓶中，加壳聚糖-醋酸溶液稀释配制疫苗溶液。本发明着重对由HPV感染引起的宫颈癌患者、HPV感染人群进行跟踪治疗(Tc亚群检测、HPV检测及临床症状的改善)以及HPV感染引起的性病、宫颈糜烂、慢性宫颈炎，均取得良好的临床效果。
文档编号A61K39/205GK102166353SQ201010114710
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者孙介光, 孙雪然 申请人:孙介光, 孙雪然