一类蛋白质多肽的复合分子及应用的制作方法

专利名称：一类蛋白质多肽的复合分子及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，提供了一类代谢半衰期延长、过敏源性降低的活性蛋白质或多肽的串联体。
背景技术：
随着生物技术的飞速发展，蛋白质药物已成为现代生物医药领域的重要组成部分。如促红细胞生长素、粒细胞集落刺激因子、干扰素、白介素、胰岛素以及各种疫苗等。目前已有50种以上重要的治疗药物上市，近1000种生物技术药物正进行临床试验或接受各国药监部门审评。但是蛋白质药物在体内会被快速清除，组织中大量存在的蛋白酶和肾小球滤过是药物快速清除的生理途径。为了维持一定的疗效需要大剂量频繁用药，长期的反复注射不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应。因此临床上需要研制长效的蛋白质药物。减少蛋白质药物水解，同时降低肾小球的滤过作用，这是延长药物半衰期的有效途径。聚乙二醇修饰是制备长效蛋白的方法之一。聚乙二醇是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成。不仅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、N、 二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂，具有线性(相对分子量1000 100000)或支化(相对分子量为5000 60000)的链状结构，线性PEG分子式为H-(0-CH2-CH2) n-OH。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)，线性mPEG的分子式为CH3-(0-CH2_CH2)n-0H，在多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰研究中应用最多的是mPEG的衍生物。聚乙二醇是中性、无毒、具有良好的生物相溶性的高分子聚合物，是经FDA批准的少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇即PEG具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。聚乙二醇类修饰剂的药物动力学性质因它们的相对分子量和注射给药方式而异，分子量越大，半衰期越长。经过细胞色素P450系统的氧化作用，PEG分解成小分子的PEG，经胆汁排泄。药物经过聚乙二醇修饰后，具有以下优点1、更长的半衰期；2、较少的酶降解作用；3、较少的免疫原性及抗原性；4、较小的毒性；5、用药频率减少；6、更好的溶解性等。修饰途径对蛋白和多肽主要有氨基修饰(包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰)、羧基修饰、巯基修饰等，其中主要是对N末端或赖氨酸侧链氨基进行酰化修饰。因为蛋白或许多多肽结构中存在多个氨基，所以控制和确定修饰位点及修饰程度一直是蛋白和多肽的聚乙二醇修饰中的难点，肽类化合物的合成中可以通过采用适当的保护策略来实现对氨基的定点修饰。蛋白药物的PEG修饰已有许多成功的先例，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG-干扰素、PEG-GSF、PEG-生长抑素。处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种，处于临床实验的有牛血红蛋白、降钙素、表皮生长因子、白介素-2、水蛭素(II期，BASF AG公司)、抗-TNF α抗体片段(III期，Pharmacia 公司)、超氧化物歧化酶、抗-PDGF抗体片段(II期，Celltech公司)等。经聚乙二醇共价修饰后，蛋白质药物的相对分子质量有所增加，减少了药物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的稳定性，降低免疫原性，这些改变均有利于延长药物在体内的半衰期，从而，蛋白质药物的药代动力学和药效性质得到明显改善。例如，PEG修饰的干扰素α与未修饰的干扰素α相比，半衰期延长10 20倍；超氧化物歧化酶PEG修饰前半衰期为5分钟，PEG修饰后半衰期延长至 4. 2h [Veronese FM 等，2005]。白蛋白修饰也是制备长效蛋白或者多肽的有效方法之一。近年来，采用人血白蛋白对蛋白和多肽进行修饰也取得了一些进展。中国专利局收录了其中一些研究成果。采用白蛋白修饰的干扰素、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素等的研究获得了一些有益的成果。制备活性蛋白和多肽的串联体或者其它各种形式的串联体也是增加药物半衰期的方法之一。蛋白质和多肽药物的串联体一般通过基因工程手段制备。在基因表达过程中把编码蛋白和多肽单体的基因串联起来，间隔以编码甘氨酸和丝氨酸的碱基，表达出来的蛋白或多肽串联体往往含有不同长短的甘氨酸和丝氨酸接头。如文献报道的人胸腺素α 1串联体(薛晓畅等，2001)。这种方式的弊端是可能形成新的抗原提呈位点，引起免疫反应；另外，对于接头的长短选择有较大限制，长接头将给基因表达带来麻烦，不如PEG选择方便。综上所述，围绕蛋白质和多肽分子制备新型的修饰分子对于推动蛋白多肽药物的深入开发具有很好的应用前景。为了更好地挖掘该领域的技术深度，拓展品种空间，本发明提供了一类不同于现有技术的新的修饰药物。

发明内容
一、本发明的出发点和要解决的问题当前，蛋白质和多肽药物的长效化、减少过敏、增加水溶性等方面仍然是本领域值得深入研究的目标。为了达到长效，就应该从减少药物在肾小球的滤过和减少蛋白酶降解入手。根据现有文献经验，如聚乙二醇化的重组人粒细胞集落刺激因子(商品名 Neulasta)、聚乙二醇化的重组人干扰素(商品名配乐能)、聚乙二醇化的门冬酰胺酶(商品名Oncaspar)等产品都是通过用聚乙二醇修饰的方式来延长药物半衰期或者减少过敏原性的。可见，增大分子质量是延长药物半衰期或者减少过敏原性的有效方式之一，这已经成为一个规律。传统的增加药物半衰期的方式是采用单甲氧基聚乙二醇进行修饰，或者基因工程法进行白蛋白修饰，或者基因工程法制备蛋白或多肽的串联体。在现有文献的基础上，我们设计采用聚乙二醇等高分子聚合物作为连接功能团来制备活性蛋白和多肽串联体，借此在同一个产物分子上同时体现聚乙二醇的修饰和蛋白串联体的制备。本发明的这种设计能够显著增加目标蛋白或多肽分子的单分子质量，借以增加被修饰蛋白或多肽的半衰期并减少抗原性。
这种方案一方面可以使蛋白质获得高分子聚合物修饰后带来的优点(如增大分子量、减少过敏等)；同时，相对于基因工程方法制备串联体来说，通过这种化学连接制备蛋白或多肽串联体，具有工艺简单、高分子聚合物柔性接头不增加串联体分子抗原性等优
点ο二、修饰物的选择(一)修饰剂方面1、修饰剂种类用作蛋白和多肽修饰的大分子可以来源于广泛的生物材料，如聚烯醇类化合物、 聚醚类化合物、二乙烯基醚与马来酸酐共聚物、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、氧化乙烯和甲醛共聚物、聚环氧化物、乙二酸和丙二酸共聚物，以及这些物质的衍生物等等。在众多可选修饰剂中，聚乙二醇是目前本领域内公认的常用修饰剂。1991年PEG 修饰的腺苷脱氨酶面市后，已陆续有PEG修饰的门冬酰胺酶、干扰素-a-加和干扰素-a_2b 经FDA批准用于临床。因此，选用PEG修饰技术是本发明的优选方案之一。聚乙二醇与蛋白质或多肽分子间的连接是靠聚乙二醇末端的衍生基团实现的。在聚乙二醇修饰药物的实践中，发生修饰反应的端基不限于末端羟基，如醛基、羧基、氨基、对甲苯磺酸酯基等都可以引入到聚乙二醇的羟基末端。在聚乙二醇功能化的过程中，可以将聚乙二醇的末端羟基转化为相同的功能基，也可以转化为不同的功能基，前者叫做同端基遥爪聚乙二醇(homotelechelic PEG)，后者叫做异端基遥爪聚乙二醇(heterotelechelic PEG)。2、修饰剂的端基PEG末端的醇羟基化学性质不活泼，为保证其与药物活性基团间有适宜的反应速率，需引入上述基团对醇羟基进行活化，以利于与蛋白质的和ε_氨基的反应。 按PEG与蛋白质氨基形成的连接键类型，活化PEG主要有(1)烷基化PEG (alkylating PEGs，通过烷基键连接)，如醛基化PEG(PEG aldehyde)、PEG-三氟乙基磺酸酯(2.2， 2-trifluoroethanesulfonyl, PEG-T)和环氧烷基化 PEG(PEG 印oxide)。醛基化 PEG 可通过氰基硼烷还原、与R-NH2形成khiff氏碱得到，适于活性中心含有带正电荷的大分子药物。但反应速率较低，有时需反应Mh，长时间的反应有可能使不稳定的蛋白质失活， PH对反应的选择性有重要影响，pH5左右时醛基化PEG只与a-NH2反应。PEG-T是另一种可保持含有正电荷活性中心蛋白质活性的PEG修饰剂，但反应专属性不强、定性困难， 环氧烷基化PEG的反应速度也较慢，且其开环生成的羟基有可能与蛋白质发生副反应。 (2)酰化PEG(aCylating PEGs，通过酰胺键连接)，其中大多是羧酸化PEG与N-羟基琥珀亚胺(hydroxysuccimidc)所形成的活性酯(PEG-O-X-COOSu)，目前较常用的是PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(PEG-succhnimidyl succinate, PEG-SS)和PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯(PEG-succinimidyl carbonate, PEG-SC)。研究表明，-COOSu 基团与 PEG 连接的最后一个烷氧基长度对其与氨基或水的反应活性有显著影响，如PEG-0-CH2-CH2-CH2-C00SU 的水解半衰期为23h，而PEG-0-CH2-C00SU仅为0. 75h。此外，用氯甲酸酯活化的PEG与用琥珀酰亚胺活化的PEG相比，修饰反应速率低，可控性强，修饰可具有一定的选择性， 在水相-有机相体系中的反应也较容易。另外，一些常用的活性端基如PEG乙烯基磺酸(PEG-Vinylsulphone)、PEG-碘乙酰胺基、PEG-马来酰胺和PEG-正吡啶二硫化物 (PEG-Orthopyridyldisulfide)可修饰游离的半胱氨酸，PEG-酰胼(PEG-Hydrazide)可以修饰寡糖侧链，PEG-异氰酸酯(PEG-Isocyanate)用来修饰羟基或氨基。其它可供选择的活性端基还有马来酰亚胺顺丁烯二酰亚胺、硝基苯基碳酸酯、3-(2-吡啶二巯基)丙酸η-羟基琥珀酰亚胺酯、异氰酸、酰胼、琥珀酸、对甲苯磺酸等。3、修饰剂来源上述活性聚乙二醇有些已经商品化，另外一些可按照明确的参考文献进行制备。 有了这些活性基团的引入方法，制备同端基或者异端基聚乙二醇就很容易了。如可以采用袁明龙等报道的方法制备PEG-对甲苯磺酸酯(中国专利，申请号98124012. 7)，可以采用 Zalipsky 报道的方法制备 PEG-NH2 (Zalipsky S, GiIon C, Zilkha A.Eur Polym J. 1983， 19 :177)，可以采用Kern等人报道的方法制备聚乙二醇酯(Kern W，Iwabuchi S，Sato H， Bohmer V. Makromol Chem, 1979，180 :2539)，可以采用 Gecheler 等报道的方法制备聚乙二醇羧酸(Geckeler K,Bayer E. Polym Bull, 1979,1 :691)，而聚乙二醇末端羟基的醛基化可以通过 Harris 等人报道的方法实现(Harris J Μ, Hundley NH，，Shannon TG, Struch EC. J Org Chem, 1982,47 :4789 ；Harris JM, J Macromol Sci. Reb Macromol Chem Phys C25, 1985,325 ；Harris JM,Yalpani Μ,Van Alstine JM,Struch EC Case MG,Paley MS,Brooks DE. J Polym Sci,PolymChem Ed，1984，22 :341)；异端基遥爪聚乙二醇的制备一般以同端基遥爪聚乙二醇为原料，如hlipsky和Barany的报道提供了一种制备异端基遥爪聚乙二醇的方法(Zalipsky S, BaranyG. polymerPrepr986, 27 1) ；Yukio 等也报道了一种不同的制备异端基要抓聚乙二醇方法，他们用含有指定功能基的引发剂来引发环氧乙烷聚合，首先在PEG的α末端引入氨基和醛基，引入氨基时用乙氰作为引发剂，由于氰基的吸电子效应， 乙氰表现出极强的酸性，因此它很容易用于丁基锂、萘化钾等烷基金属金属化。当用具有缩醛部分的醇钾盐(3，3_ 二氧乙基丙醇钾)作为引发剂来引发环氧乙烷聚合，可以定量地得到α末端带有缩醛部分的PEG，然后用弱酸处理，缩醛转化为醛基。α-氨基或者α醛基聚乙二醇制备后，用醇钾盐处理，得到醇盐，再用亲核试剂经过各种方式的变体很容易得到异端基遥爪聚乙二醇(Yukio N, KazumoriK, Vasao K. Polym Pr印r，1997，38 :529)。同端基或者异端基遥爪聚乙二醇可以通过但不限于上述方法获得，这已经是现有技术手段能够实现的。在本发明中采用同端基遥爪聚乙二醇时，制备的复合分子中PEG的两个活性端往往分别连接在两个生物活性基团相同或者相似的位点上。而异端基遥爪聚乙二醇在本发明中也有独特的用处，它可以使复合分子中的连接功能团上的两个不同的连接基团分别连接在两个活性功能团的不同位点上，同样能够达到本发明中制备活性功能团串联体的目的。4、修饰剂分子大小的选择修饰剂的分子量是影响修饰产物生物活性和其它药学和药理学特性的因素之一。 修饰产物的大小会影响目标复合分子的药代动力学特性，主要是影响肾小球滤过和蛋白酶降解。肾小球滤过膜的通透性很高，内皮细胞、基底膜、和上皮细胞共同的阻碍作用形成了滤过器，是具有大小和电贺选择性的分子筛(S^hacryl S-200)。只对血浆中的有形成分和大分子几乎没有通透性。对于大分子，随体积的增加，滤过速度急剧下降。水和直径小于 3. Onm的中性物质可以自由通过。就分子量而言，菊粉为5500，是自由通透的上限。分子量达到70000道尔顿时，几乎没有滤过发生。较大的物质，如血浆白蛋白分子量为66000道尔顿，直径3. Onm，被滤出的极少，在肾小球滤液内的浓度仅有血浆浓度的0. 02%。由于裂孔带由负电荷，与相同体积和重量的阳离子比较，阴离子较不易通透。因此，从肾小球滤过角度出发，分子量小于70000道尔顿的分枝或线型修饰剂均有可能改变被修饰物在肾小球的滤过率。而修饰物分子量的增大显然可以更加充分地减少蛋白酶对蛋白质和多肽的降解， 从而增加半衰期。但在另一方面，当修饰剂分子量增大时，修饰产物的活性一般是呈下降趋势，如已经上市的聚乙二醇化干扰素α - 和α -2b，后者采用12000道尔顿的修饰剂，而前者修饰剂分子量为40000 ；PEG修饰后后者的比活性保留修饰前的30%，而前者修饰后活性只保留了修饰前的3%左右。从本发明的目的上来说，不同分子量大小的修饰剂均能达到制备本发明目标物质 (即采用高分子修饰剂来制备蛋白质或者多肽分子的串联物)的目的，因此修饰剂分子量大小不是限制本发明的因素。尽管如此，本发明就不同的蛋白质或者多肽分子的修饰，对修饰剂的分子量大小做了综合考虑。对于一些相对于人体而言是强过敏原的外源性蛋白和多肽优选分子量2000 50000道尔顿的修饰剂，更有选的是分子量10000 40000道尔顿的修饰剂；对于人体的自身蛋白质或者多肽分子，修饰时优选使用分子量1000 60000道尔顿的修饰剂，更有选的是平均分子量为5000 40000道尔顿的修饰剂。本发明实施过程中，修饰剂的更优化选择是选用了平均分子量为5000 30000、 活化端基为醛基的同端基遥爪聚乙二醇衍生物。用于制备这种修饰剂的不同分子量大小的聚乙二醇均可以在现今市场上购买获得或者定制获得，而聚乙二醇的醛基化反应可以通过本发明专利前文中提到的Harris等人提供的方法制备获得。( 二)生物活性蛋白质或者多肽1.蛋白质或者多肽药物的活性反应官能团PEG与多肽或蛋白质的修饰反应属于亲核反应。多肽或蛋白质C端的a-COOH、 N端的α-ΝΗ2及赖氨酸(Lys)、门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸 (Cys)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)、甲硫氨酸(Met)、组氨酸(His)等9种氨基酸的侧链在一定的介质环境中较易离子化而呈现亲核性，亲核活性由大到小依次为R-S- > R-NH2 > R-COO- = R-O-0 Cys的巯基是最易被修饰的氨基酸残基，但Cys在蛋白质中的总量很少，通常位于蛋白质的二硫键和活性中心。Lys占蛋白质中所有氨基酸总量的10%，且较少参与构成多肽或蛋白质的活性中心。目前，PEG通常修饰的位点是大分子表面Lys残基上的氨基，包括α-NH2或 εΝΗ2。例如干扰素α-加进行的PEG修饰结果表明，94%的修饰位点都集中在干扰素的 Lys31、Lysl21、Lysl31、Lysl34等4个残基上，其余6%位于Lys70和Lys83。这种修饰反应位点的不确定性使得修饰产物是混合物，给终产品质量控制带来困难。当每个多肽或者蛋白质分子上有多个可供修饰位点时，如果采用具有两个活化基团的修饰物进行修饰时， 得到的产物比较复杂，会出现多种模式的修饰产物。蛋白质和多肽分子上另一个理想的修饰目标是N端第一个氨基酸的氨基。在硼氢化钠存在时，带醛基的PEG会和伯胺发生还原氨化反应。醛基和其它的亲电活性基团不同，它只和胺基反应。虽然醛基的反应活性比NHS活性酯低，但是它具有反应条件温和(pH 6-9. 5，反应6 M小时)，易于使PEG和蛋白质或其它材料的表面连接。因此，在较低的PH下，带有醛基的PEG会对蛋白质的N端进行选择性反应，形成均一的修饰物结构。在此思路下完成的长效人粒细胞集落刺激因子产品已经在美国上市，商品名为Neulasta。本发明中优选的修饰位点确定为蛋白质或多肽分子的N端第一个氨基酸的氨基， 优选的修饰剂是端基为醛基的同端基遥爪聚乙二醇衍生物。2.目标蛋白质和多肽分子按照本发明的思路，在被修饰物具有可被修饰的活性基团前提下，任意一种蛋白质或者多肽分子都可以制备成本发明所描述的串联体。凡是以本发明提到的高分子聚合物及其衍生物为连接物的活性蛋白质或多肽串联体都在本发明的保护范围内。进一步地，凡是以同端基遥爪聚乙二醇及其衍生物或者异端基遥爪聚乙二醇及其衍生物为连接物的活性蛋白或多肽串联体都在本发明的保护范围内。在本发明实施过程中，优选的蛋白质和多肽分子是目前已经商品化的药物或试剂级蛋白质或者多肽，包括重组人干扰素家族各种分子、人粒细胞集落刺激因子、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人促红细胞生成素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-11、人肿瘤坏死因子α、微生物来源的天冬酰胺酶、人血管内皮抑素、人角化细胞生长因子、人胸腺素α 、人胸腺素α 2、组织型人纤溶酶原激活剂、人血小板生成素、人脑利钠肽、水蛭素、人干细胞因子、肠降血糖素及其类似物、胰高血糖素、鲑鱼降钙素、支原体精氨酸脱亚胺酶、人精氨酸酶、酸性或碱性成纤维细胞生长因子、腺苷脱胺酶、人表皮生长因子、神经生长因子、 血小板源性生长因子、超氧化物歧化酶、人生长激素以及上述蛋白或者多肽的突变体等。这里述及的突变体是指与原型蛋白质或者多肽分子具有相同或者相似作用的蛋白质或多肽分子突变体，包括氨基酸的删减或者突变。上述蛋白质和多肽分子的结构和性质均可以通过现有文献查询系统获得，其制备工艺也已经有公开文献。因而这些蛋白质和多肽分子本身的制备技术不是本发明的内容， 这些分子都可以通过商业渠道获得，也可以依据参考文献中的多肽化学合成技术或者蛋白质基因工程表达技术获得，属于公知技术范畴。本发明中具有生物活性的单体蛋白质或者单体多肽的目标范围包括但不限于上述蛋白质或者多肽以及它们的突变体。三、修饰反应和修饰后分离( 一 )修饰反应根据修饰剂端基的种类选择不同的修饰条件，这对于本领域的技术人员是不难作出判断的。本发明实施过程中使用最多的是端基为醛基的同端基遥爪聚乙二醇进行修饰。反应缓冲体系采用醋酸缓冲液，PH值选择4. 0，氰硼氢化钠的浓度为0. 1沈％，蛋白或多肽浓度为l-10mg/ml，蛋白或多肽与修饰剂的摩尔比为2 5 1，室温下搅拌2 16小时后加入甘氨酸至终浓度为4%，终止反应。为了更高效地获得反应产物，本发明在具体实施过程中可根据目标蛋白和多肽的等电点对反应缓冲液的酸碱度进行调整，以规避开蛋白质或多肽的等电点，一般反应缓冲体系的pH为4. 0 5. 0。(二)修饰混合物的分离PEG修饰后的混合物，其分子量差异较明显，优先选用凝胶层析进行分离。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。交联葡聚糖、聚丙烯酰胺生物凝胶介质化学惰性较好且有不同大小孔径，适应不同分子量的蛋白质的分级分离，但这些凝胶的机械强度差，很难用于大规模条件下的分离。 近年来，Sepharcryl, Superdex等几种机械强度较好的凝胶得到广泛应用。这些凝胶均有商品化的实物，都可以用于本发明中反应混合物的分离。本发明分离实验在kphacryl S-200层析柱上进行，平衡缓冲液选用与反应缓冲体系相同的弱酸性溶液即醋酸缓冲液(PH4. 0 5. 0)，并在缓冲液中加入0. IM的NaCl来减少蛋白的非特异性吸附。经过分子筛层析分离后，蛋白或多肽分子的串联体可以很好的从反应混合物中分
尚出来。四、本发明的方案在本发明的实施方案中，分别选用市售平均分子量分别为5000道尔顿、10000道尔顿、20000道尔顿和30000道尔顿的线型聚乙二醇为原料，采用Harris等提供的方法(参考文献见上文)，制备了不同分子量大小、端基均为醛基的同端基遥爪聚乙二醇衍生物。PEG 的醛基化活化反应在化学领域已经有数十年的历史，反应路线也多样化，属于公知技术之一，本发明不再提供具体实施例。按照本发明方案制备的端基均为醛基的同端基遥爪聚乙二醇衍生物其分子式为(0CH2CH0)-PEG-(0CH2CH0)，化学反应式如下(l)K0tBu/C6H6H0-PEG-0H+BrCH2CH(0Et)2 — (0CH2CH0)-PEG-(0CH2CH0)(2) HCl本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人干扰素α _2a(沈阳三生生物制药公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S^hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人干扰素α "2a串联体，用VSV_WISH(具体参见《中国药典》三部附录 XC)系统进行活性测定的比活性约为2X107IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人干扰素α-lb(北京三元公司产品)进行了修饰， 在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人干扰素α-lb串联体，用VSV-WISH(具体参见《中国药典》三部附录XC)系统进行活性测定，比活性为2. 1 6. OX 107IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人干扰素a _2b (北京远策药业公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人干扰素a _2b串联体，用VSV-WISH(具体参见《中国药典》三部附录XC)系统进行活性测定，比活性为1 2X 107IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人干扰素Y (上海生物制品研究所产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人干扰素Y串联体，用VSV-WISH(具体参见《中国药典》三部附录XC)系统进行活性测定的比活性为0. 4 1. IX 107IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组复合α干扰素(美国安进公司产品)进行了修饰， 在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人复合α干扰素串联体，用VSV-WISH(具体参见《中国药典》三部附录XC)系统进行活性测定的比活性为1. 1 3. 5Χ 108IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人粒细胞集落刺激因子(美国安进公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人粒细胞集落刺激因子串联体，用《中国药典》三部附录XE方法进行活性测定， 串联体的比活性为4 5X 107IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(华北制药产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子串联体，用《中国药典》三部附录XF方法进行活性测定，结果比活性为6 8X 106IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人促红细胞生成素(沈阳三生产品)进行了修饰， 在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人促红细胞生成素串联体，用《中国药典》三部附录X B方法进行活性测定，结果比活性为 4. 6 9. 8X 104IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人白细胞介素-2(辽宁卫星公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(kphacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人白细胞介素-2串联体，用《中国药典》三部附录》)方法进行活性测定，结果比活性为6 8X 106IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人白细胞介素-11(山东齐鲁药业公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人白细胞介素-11串联体，用韩蕾报道的方法[韩蕾.重组人白细胞介素 11生物学活性测定方法研究.中国生化药物杂志.2003，M(1)]进行活性测定，结果比活性为 2. 0 6. 5X106IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对大肠杆菌天门冬酰胺酶(常州千红公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的天冬酰胺酶串联体，用底物降解法[韦玉军，高向东，吴梧桐.L-门冬酰胺酶突变体的构建及其活性测定.中国药科大学学报，2005，36 (5)]进行活性测定，结果比活性为 100 210IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人肿瘤坏死因子α (上海赛达生物药业股份有限公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200) 纯化获得了聚乙二醇连接的重组人肿瘤坏死因子α串联体，用张英起等报道的方法[张英起，赵宁，李波，刘磊，王增禄，朱宝娥，颜真，苏成芝.应用基因工程方法制备新型重组人肿瘤坏死因子α.细胞与分子免疫学杂志.2002，18 ) :402-406]进行活性测定，结果比活性为 2. 6 7. 8X108IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人血管内皮抑素(苏州中凯生物制药厂产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人血管内皮抑素串联体，用杨芳等报道的方法[杨芳，何援利，姜孝玉，刘芸，彭冬先，宗利丽.人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定.2005,25 )]进行活性测定，结果比活性为2. 6 9. 8X 105IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人角化细胞生长因子(美国安进公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的人角化细胞生长因子串联体，用《中国药典》三部附录XG方法进行活性研究表明，修饰产物能够刺激小鼠胚胎成纤维细胞生长。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人碱性成纤维细胞生长因子(北京双鹭药业股份有限公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200) 纯化获得了聚乙二醇连接的人碱性成纤维细胞生长因子串联体，用《中国药典》三部附录XG 方法进行活性研究表明，比活性为0. 4 1. 5X 105IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人表皮生长因子(深圳市华生基因工程发展有限公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的人表皮生长因子串联体，用《中国药典》三部附录XG方法进行活性研究表明，比活性为1. 2 3. 8X 105IU/mg。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人胸腺素α 1(商品名日达仙)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的人胸腺素α 串联体，用宫照龙等报道的方法[宫照龙，徐义辉，展瑞，高昱，蒋作君.胸腺素α 串联体的表达、纯化及生物学活性检测.中国生物制品学杂志，2005年，18(02) :111-114] 进行活性研究表明，修饰产物能显著促进小鼠脾细胞增殖。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人胸腺素α 2{参考苗红等学者的报道自行制备，(苗红，郭葆玉，张冉，张莉.重组胸腺素α 的表达、纯化和生物学活性.中国生物化学与分子生物学报.2003，10，19( :636 639)}进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacrylS-200)纯化获得了聚乙二醇连接的人胸腺素α 2串联体，用宫照龙等报道的方法[宫照龙，徐义辉，展瑞，高昱，蒋作君.胸腺素α 1串联体的表达、纯化及生物学活性检测.中国生物制品学杂志，2005年，18 (02) :111-114]进行活性研究表明，修饰产物能显著促进小鼠脾细胞增殖。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人组织型纤溶酶原激活剂(商品名“爱通立”)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的人组织型纤溶酶原激活剂串联体，用李宝宗报道的方法[李宝宗，郑竑，叶林柏，郜金荣，佘应龙，贺石汉，吴正辉.重组tPA及其突变体纤溶活性的比较.武汉大学学报(理学版)，2004 50(6) =765-768]进行活性研究表明，串联体能够激活纤溶蛋白酶的活性。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为5000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人脑利钠肽(商品名“新活素”，成都诺迪康生物制药有限公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200) 纯化获得了聚乙二醇连接的人脑利钠肽串联体，用饶春明等报道的方法[饶春明，王军志， 赵阳，韩春梅，郭莹，高凯。重组人脑利钠肽质量标准与检定方法研究。药物分析杂志。2002， 22(05) =346-349]进行活性研究表明，串联体具有刺激兔动脉条收缩的活性。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为5000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对鲑鱼降钙素(北京世桥生物制药有限公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的鲑鱼降钙素串联体。用杜清友等报道的方法[杜清友，赵明，王会信，丁红梅。鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达。生物化学杂志，1997，13 (5) :531-536]进行活性研究表明，串联体具有降低大鼠血钙的作用。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人血小板生成素(沈阳三生制药股份有限公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的人血小板生成素串联体。用李朝等报道的方法[李朝，程度胜，周艳荣，陈添弥，黄培堂。一种新型血小板生成素(TPO)模拟肽的合成及功能研究。中国实验血液学杂志。2003;11(2) :128-131]进行活性研究表明，串联体能够显著提高小鼠循环血液中血小板的数量。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为5000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对水蛭素(商品名Angiomax，生产商BenVenice公司)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的水蛭素串联体。用李朝等报道的方法[陈华友，邢自力，李媛媛。凝血酶滴定法测定水蛭素活性的改进。生物技术，2002，12 (6) :24-25]进行活性研究表明，串联体能够有效地抑制血液凝固。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为5000道尔顿、双端基均为醛基的
12自制线型同端基遥爪聚乙二醇对重组人干细胞因子(商品名STEMGEN ，美国Amgen公司产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人干细胞因子串联体。用王军志等报道的方法[王军志，赵阳， 陈国庆，饶春明。重组人干细胞因子生物学活性测定的质量控制研究。中国肿瘤生物治疗杂志。2001 ；8 (4) =294-296]进行活性研究表明，UT-7细胞对重组人干细胞因子串联体具有显著依赖性。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为5000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对人胰高血糖素(商品名诺和生，美国诺和诺德公司产品) 进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的人胰高血糖素串联体。用WEN Chongwei等报道的方法[WFN Chongwei5WANG Zuoren, DU Peng, GAN Renbao, ZHU Shangquan. Secretion expression of recombinant glucagon inEscherichia Coli. SCIENCE IN CHINA(Series C),2001 ；44(3) :233-240]进行活性研究表明，人胰高血糖素串联体具有与人高血糖素相似的生物活性。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为5000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对肠降血糖素类似物Exenatide(商品名艾塞那肽，即美国的BYETTATM，Amylin Pharmaceuricals Inc产品)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的Exenatide串联体。用 Scrocchi LA 等报道的方法[Scrocchi LA, Brown TJ, Maclusdy N, et al. Glucose intolerancebut normal satiety in mice with a mull mutation in the glucagon—like peptide I receptorgene [J]. Nat Med，1996，2 (11) :1254-1258]进行活性研究表明， Exenatide串联体具有与Exenatide相似的生物活性，能够减缓小鼠胃的排空速度。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对自制的重组人精氨酸酶(参见文献一李大力，郑迎迎.人工型精氨酸酶基因的克隆及其酵母表达.化学与生物工程.2006，23 ) 41-49)进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(Sephacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人精氨酸酶串联体。LA等报道的方法[Masaki ΙΚΕΜ0Τ0, Masayoshi TABATA, Toshio MIYAKE, Toshiaki Κ0Ν0, Masataka MORI, Masayuki TOTANI and Takashi MURACHI. Expression of human liver arginase in Escherichia coli[J]. Biochem. J. 1990，270，697-703]进行活性研究表明，重组人精氨酸酶串联体具有与重组人精氨酸酶相似的生物活性，能够把精氨酸降解为尿素。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为30000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对自制的重组精氨酸脱亚胺酶进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S印hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组精氨酸脱亚胺酶串联体。用Misawa S等报道的方法进行活性研究表明，重组精氨酸脱亚胺酶串联体具有与重组精氨酸脱亚胺酶具有相似的生物活性，能够把精氨酸降解为瓜氨酸。制备方法参见文献一Misawa S，Aoshima M，Takaku H，et al. High-level expression of Mycoplasma argininedeiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as an anti-tumor enzyme. J Biotechnol. 1994,361 :145_155。本发明的又一个具体方案中，采用平均分子量为20000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇对自制的重组人生长激素进行了修饰，在含有硼氢化钠的酸性条件下反应，经分子筛(S^hacryl S-200)纯化获得了聚乙二醇连接的重组人生长激素串联体。用李湛军等报道的方法[李湛军，杨化新，徐康森.聚乙二醇化重组人生长激素长效作用及在体生物活性研究.中国临床药理学与治疗学.2005，10(11) :25- ]，采纳胫骨法和体重法进行活性研究表明，重组人生长激素串联体具有与重组人生长激素具有相似的生物活性，比活性约为5. 0IU/mg。人生长激素制备方法参见文献[刘晓宏，粟永萍，李淑蓉，王蒙，艾国平，王军平，程天民.人生长激素基因的克隆、高效表达及纯化.中华实验外科杂志.2003，20 (8) :106-109]。同法制备对商品名为安苏萌的重组人生长激素进行修饰， 获得了相同活性的重组人生长激素串联体。在本发明的方案中还包括验证复合分子分子量大小的内容。方法采用SDS-PAGE 电泳，步骤参见中国药典2005年版附录IVC。浓缩胶浓度5% ；分离胶浓度12% ；上样量 5-15 μ g。电泳后在凝胶成像系统上进行扫描。由于PEG在水溶液中每个乙氧基重复基团可以结合2 3个水分子导致其流体力学半径远远大于同分子量的球状蛋白，因此用 SDS-PAGE电泳测量的聚乙二醇化蛋白分子量要大于其真实的分子量，与分子量标准相比有 “拖后”现象。这一现象在本发明的实施例中也同样出现，见图1、图2和图3。该方案的实施证明了本发明能够制备出上述蛋白和多肽分子的串联体，增大了原分子的分子量，见图 1、图2和图3。在本发明的实施例中虽然仅仅给出了 19种蛋白和多肽的串联体电泳结果， 但并不构成对本发明范围的限制，同业者可以根据本发明的描述制备出其它蛋白质和多肽分子的串联体。进一步地，在本发明的方案中还包括验证修饰后的串联体分子在动物体内代谢方面发生变化的研究内容。针对不同的蛋白和多肽分子，采用的药物代谢检测方法也不尽相同。如可以采用酶联免疫吸附试验或者放射性核素标记的方法来直接检测药物在动物或者人体内的转归，这一方法适合于大部分蛋白质和多肽，是药代动力学研究与实践领域常用的方法；也可以采用蛋白质和多肽分子的作用的底物或产物的体内浓度变化来评估蛋白质和多肽分子的代谢状况，如门冬酰胺酶、精氨酸酶和精氨酸脱亚胺酶等；还可以通过检测蛋白质或多肽引起的生理生化变化过程中的效应分子来评估蛋白质和多肽体内转归情况，如检测血钙来评价降钙素等。与上述SDS-PAGE电泳试验的内容一样，本环节提供的是一种凡例，目的是证明本发明制备的复合分子具有延长的体内半衰期的特性，本发明方案和实施例中的个例提供的内容并不构成对本发明范围的限制。PEG修饰能够增加蛋白质和多肽分子的药物代谢半衰期，这在上市的药物和众多文献中可以得到相应的认知。故此，本发明的方案中仅以精氨酸脱亚胺酶为例测定了本发明制备的药物串联体的半衰期的变化。研究选择了注射精氨酸脱亚胺酶串联体后血清内精氨酸和瓜氨酸的变化的方法，而检测血清内精氨酸和瓜氨酸可以通过HPLC的方法实现，这是现代色谱领域的常用方法。研究结果显示， 精氨酸脱亚胺酶的串联体比原型分子具有更长久的维持血清低精氨酸状态作用，说明串联体具有更长的活性衰减周期，具体见实施例。更进一步地，本发明还设计了证明串联体分子能够减少过敏反应的研究内容。可以通过过敏反应试验方法检测串联体与单体对动物过敏反应的强弱来检测串联体的优势。 研究通过豚鼠全身主动过敏试验反应来实现，具体步骤参见2005年版药物研究技术指导原则(国家食品药品监督管理局组织编写)127 131页。
为了更好地说明本发明的现实可行性和效果，我们列举了一些实施例。这些实施例虽然没有能够把自然界常见的活性蛋白和多肽一一列举，但实施例提供的方法和产物足以延伸到任意有生物活性的蛋白质和多肽分子，同业人员可以方便地依据本发明的描述制备出具有更优化功能的蛋白质和多肽分子的串联体，这些串联体同样在本发明的保护范围内。


图1.重组人干扰素等蛋白和多肽分子串联体的电泳结果Lanel 分子量Marker ;Lane2 :PEG连接的重组人干扰素α加串联体；Lane3 PEG连接的重组人干扰素0让串联体；1^1^4 :PEG连接的重组人干扰素α 2b串联体； Lane5 :PEG连接的重组人干扰素γ串联体；Lanee :PEG连接的重组人复合α干扰素串联体；Lane7 :PEG连接的重组人粒细胞集落刺激因子串联体；LaneS =PEG连接的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子串联体；图2.重组人肿瘤坏死因子α等蛋白和多肽分子串联体的电泳结果Lanel 分子量Marker ；Lane2 :PEG连接的重组人肿瘤坏死因子α串联体；Lane3 PEG连接的大肠杆菌门冬酰胺酶串联体；Lane4 :PEG连接的重组人白细胞介素2串联体； Lane5 :PEG连接的重组人白细胞介素11串联体；Lane6 :PEG连接的人胸腺素α 1串联体； Lane7 =PEG连接的重组人胸腺素α 2串联体；图3.重组鲑鱼降钙素等蛋白和多肽分子串联体的电泳结果Lanel 分子量Marker ；Lane2 =PEG连接的鲑鱼降钙素串联体；Lane3 =PEG连接的人胰高血糖素串联体；Lane4 :PEG连接的艾塞那肽串联体；Lane5 :PEG连接的重组人精氨酸酶串联体；Lanee =PEG连接的重组精氨酸脱亚胺酶串联体；Lane7 :PEG连接的重组人生长激素串联体；
图4.复合分子结构示意图 A为连接功能团，B为生物活性功能团
具体实施例方式实施例1.聚乙二醇连接的重组人干扰素α -2a等蛋白或多肽串联体的制备反应采用平均分子量为10000道尔顿、双端基均为醛基的自制线型同端基遥爪聚乙二醇，重组人干扰素α- 来自沈阳三生生物制药公司。将重组人干扰素α- 浓缩为 5mg/ml，缓冲液为20mM PB, pH7. 0。用冰醋酸调节缓冲液pH值为5. 0，加入20mMNaCNBH3， 充分溶解后，再加入自制的活化PEG干粉，PEG与蛋白质的质量比为5 1。在4°C条件下搅拌反应15h，然后加入2g甘氨酸以终止反应。层析分离将反应混合物上样于S-100层析柱中，用缓冲液以20ml/min的流速洗脱，Pharmacia UV_U80nm检测，REC-101记录出峰图谱。分段收集样品。SDS-PAGE电泳分析。此步骤旨在分离PEG修饰物、未修饰物和部分多修饰物，以及除去游离的PEG和过量的甘氨酸。将第一次kphacryl-SlOO层析分离后SDS-PAGE电泳纯度大于90%的样品合并，浓缩至浓度lmg/ml以上。上样于S-100层析柱中，用缓冲液以20ml/min的流速洗脱。 PharmaciaControl Unit UV-I在^Onm检测吸收，REC-IOl记录洗脱峰谱。手动分段收集样品峰，获得PEG连接的重组人干扰素α-Μ纯品。同法制备了重组人干扰素α Ib串联体、重组人干扰素α 2b串联体、重组人干扰素 Y串联体、重组人复合α干扰素串联体、重组人粒细胞集落刺激因子串联体、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子串联体、重组人肿瘤坏死因子α串联体、大肠杆菌门冬酰胺酶串联体、重组人白细胞介素2串联体、重组人白细胞介素11串联体、人胸腺素α 1串联体、 重组人胸腺素α 2串联体、鲑鱼降钙素串联体、人胰高血糖素串联体、艾塞那肽串联体、重组人精氨酸酶串联体、重组精氨酸脱亚胺酶串联体和重组人生长激素串联体。制备过程中采用的反应缓冲体系的酸碱度适当调整，保持在酸性条件下，尽量避开目标分子的等电点。 不同的蛋白或多肽分子使用的修饰剂大小见前文所述。实施例2.聚乙二醇连接的重组人干扰素α -2a串联体等分子的电泳检测方法采用SDS-PAGE电泳，步骤参见中国药典2005年版附录IVC。浓缩胶浓度5%; 分离胶浓度12% ；上样量约10 μ g。电泳后在凝胶成像系统上进行扫描。电泳扫描结果提示，本发明制备的上述蛋白和多肽串联体的分子量测定结果比理论分子量稍大(具体数据省略)，见附图1、附图2和附图3。实施例3.重组精氨酸脱亚胺酶串联体药代初步分析采用健康、成年、雄性昆明种小鼠。单剂量单次给药后，血清中精氨酸浓度的降低和瓜氨酸浓度的升高作为检测指标。小鼠给药后，不同时间尾静脉取血，常规方法制备血清，用HPLC分析测定精氨酸和瓜氨酸的含量。结果表明，重组精氨酸脱亚胺酶串联体比非串联体具有更长久的降低血液精氨酸的特点。数据见下表1 表1.血浆精氨酸、瓜氨酸浓度(μ Μ)法推测药物体内代谢情况
权利要求
1.一类人工的复合分子，其主要特征是该类复合分子由一个连接功能团A和两个结构相同的生物活性功能团B组成，其中连接功能团A通过化学键把两个活性功能团B连接起来。其结构如附图4所示。
2.如权利要求1所述的复合分子，其中的连接功能团A是分支型或者线型高分子聚合物，选自聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、二乙烯基醚与马来酸酐共聚物、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、氧化乙烯和甲醛共聚物、聚环氧化物、乙二酸和丙二酸共聚物以及上述这些物质的衍生物中的一种。
3.如权利要求1 2所述的复合分子，其中的连接功能团A是聚醚类化合物时选自具有H0((CH2)x0)nH结构通式的化合物、聚丙二醇、聚氧化乙烯HO ((CH2) 20) nH、聚乙烯醇 (CH2CH0H) η或这些物质的衍生物中的一种。
4.如权利要求1 2所述的复合分子，其中的连接功能团A是聚烯醇类化合物时选自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或其它烯醇化合物及它们的衍生物中的一种。
5.如权利要求4所述的复合分子，其中的功能团A是具有两个活性端基的聚乙二醇及其衍生物，所述活性端基选自醛基、羧基、氨基、对甲苯磺酸酯基、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯基、琥珀酰亚胺基碳酸酯基、马来酰亚胺顺丁烯二酰亚胺、硝基苯基碳酸酯、3-(2-吡啶二巯基)丙酸η-羟基琥珀酰亚胺酯、异氰酸、酰胼、琥珀酸、对甲苯磺酸。
6.如权利要求5所述的复合分子，其中的连接功能团A是两个活性端基为醛基的同端基遥爪聚乙二醇。
7.如权利要求1所述的复合分子，其中的生物活性功能团B是蛋白质或多肽分子。
8.如权利要求7所述的蛋白质或多肽分子，特别是指选自人干扰素家族各种分子、人粒细胞集落刺激因子、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人促红细胞生成素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-11、人肿瘤坏死因子、微生物来源的天冬酰胺酶、人血管内皮抑素、人角化细胞生长因子、人胸腺素α 、人胸腺素α 2、组织型人纤溶酶原激活剂、人血小板生成素、人脑利钠肽、水蛭素、人干细胞因子、肠降血糖素及其类似物、胰高血糖素、鲑鱼降钙素、 支原体精氨酸脱亚胺酶、人精氨酸酶、酸性或碱性成纤维细胞生长因子、腺苷脱胺酶、人表皮生长因子、神经生长因子、血小板源性生长因子、超氧化物歧化酶、人生长激素以及上述这些蛋白质或多肽的活性突变体中的任意一种。
9.如权利要求1 8所述的复合分子，其中的连接功能团A的两个活性端基分别连接在两个生物活性功能团B的碳末端α羧基、氮端的α氨基以及赖氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、 精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等9种氨基酸的侧链上。
10.如权利要求9所述的复合分子，连接功能团A与生物活性功能团B进行连接的方式是连接功能团A的两个活性醛基末端分别与两个B功能团的氮末端氨基酸的α氨基发生还原氨化反应而连接。
11.含有如权利要求1 10所述的复合分子的制剂在制备用于延长B功能团的药物代谢半衰期、增加B功能团水溶性以及减少B功能团过敏性的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，提供了一类药物分子，其特点是通过高分子聚合物把活性蛋白质或多肽连接在一起，形成活性蛋白多肽的双分子串联体，从而得以实现制备延长蛋白质多肽分子的药物代谢半衰期、增加水溶性以及减少这些分子应用在人体时可能产生的过敏反应的目的。这类复合分子在生物医药领域将有广阔的应用前景。
文档编号A61K47/34GK102188715SQ20101011732
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者吴彦卓, 张鹏, 徐明波, 杨仲璠, 梁果义, 王俊玲, 王喜鹤, 赵晶晶, 连治国 申请人:北京双鹭药业股份有限公司