专利名称：一种禽减蛋综合征病毒毒株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物病毒领域，涉及病毒新毒种，具体涉及一种禽减蛋综合征病毒 毒株及其应用。
背景技术：
河南某鸡场饲养的罗曼父母代种鸡，31周龄，该鸡群未接种减蛋综合征灭活疫苗。 2002年2月12日，鸡群饲料消耗正常，产蛋量大幅度下降。发病前日产蛋率为86. 7%，发病 后产蛋量呈直线下降，第9日下降到最低点，为45.6%。此后，产蛋量出现缓慢回升，第30日 日产蛋率达到52.7%，仍不能恢复到发病前的水平。在发病期间，平均日产蛋率为50. 1%, 比发病前下降了 36. 5%，同时观察到产软壳蛋、薄壳蛋和粗壳蛋的现象，这些畸形蛋占总产 蛋数的11.5%。患病鸡群精神状况多无异常表现，仅少数鸡只发生腹泻，在发病期间共死鸡6只， 死亡率为0.6%。。剖杀病死鸡内脏器官无明显肉眼变化，取心血、肝、脾细菌学检查亦为阴性 结果。采集发病后12日的鸡血清样本19份，检测EDSre血凝抑制抗体，阳性率为100%，效 价为25 28。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽减蛋综合征病毒毒株，分类命名禽减蛋综合征病毒， 拉丁文学名Adenoviridae，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏单位简称CGMCC，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期2009年12 月17日，保藏编号3527。本发明的技术方案是一种禽减蛋综合征病毒毒株，禽减蛋综合征病毒 (Adenoviridae)，CGMCC NO :3527。所述的禽减蛋综合征病毒毒株具有下述特点(1)所述毒株在电镜下显示呈六角形、球形、无囊膜、直径大小75 SOnm的病毒粒 子，符合腺病毒粒子的形态特征；(2)所述毒株对氯仿和乙醚不敏感，在pH为3.0 10.0的条件下有抵抗力，在 37 70°C的条件下有抵抗力；(3)所述毒株的核酸类型是DNA病毒；(4)所述毒株只与EDS76抗血清发生特异性反应，而与H5、H7、H9和ND阳性血清 的HI反应均为0 ； (5)所述毒株在鸭胚中和试验中，只有EDS76抗血清能够抑制所述毒株病毒在鸭胚 尿囊腔的增殖，而其它阳性血清均不能抑制所述毒株病毒的增殖；(6)所述毒株与国际标准毒株AV127的亲缘值R为95%，属于同一血清型；(7)使用所述毒株制备的减蛋综合征灭活油乳剂能够刺激鸡只产生EDS76抗体。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。
本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒诊断EDS76抗原试剂中 的应用。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒诊断阳性血清试剂中 的应用。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒治疗用EDSre抗血清试 剂中的应用。本发明的有益效果是本发明是一株新的减蛋综合征病毒分离株，与国际标准株 AV127株的血清型相同；病毒免疫原性好，能够抵抗减蛋综合征病毒多个地方分离株和标 准株的攻击；本发明的减蛋综合征病毒油乳剂免疫蛋鸡群，可以给鸡群的产蛋率提供有效 的的保护，是一株比较理想的制苗候选毒株；可以用来制备特异性的EDS76病毒抗原和阳性 血清，用于病毒的快速鉴定和流行病学的调查。
图1为目的基因PCR扩增，其中，l.lkbDNA ladder marker (8000，7000，6000，5000，4000，3000，2000，1500， 1000，517，396and 230bp) ；2.目的基因 PCR 产物。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株，保藏日期2009年12月17日，保藏单位中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏编号3527。
具体实施例方式实施例2002年2月，河南某种鸡场蛋鸡群产蛋下降，采集病料，经鸭胚接种后分离到一株 减蛋综合征病毒毒株。鸡群190日龄开始发病，以产蛋量下降和产浅色蛋、软壳蛋、薄壳蛋 等畸形蛋为主要特征，发病鸡精神、食欲等其它方面基本正常，上述临诊表现与近年来国内 报道的其他地区发病后的鸡减蛋综合征的症状大致相似。所述毒株初次分离时，鸭胚尿囊液血凝滴度为0，但到第3代时即达到29，经连续 传代至第5代时HA效价已稳定且可达到215 17，并且其只凝集鸡的红细胞，而不凝集哺乳 动物的红细胞。所述毒株的凝集鸡红细胞的作用不被NDV和AIV抗血清抑制，但能被EDS76阳性血 清抑制。所述毒株在感染产蛋鸡后，试验鸡产蛋量下降和异常蛋增多。电镜观察可见到典型的腺病毒粒子。理化特性试验表明所述毒株对脂溶剂不敏感，对酸碱和热都有一定的抵抗力。病毒能在鸭胚成纤维细胞上增殖且出现细胞病变；病毒的核酸类型是DNA病毒； PCR结果也表明所述毒株病毒是一株减蛋综合征病毒。所述毒株具有良好的特异性和免疫原性。病毒液与等量EDS76阳性血清混合37°C 作用1小时后，接种鸭胚成纤维细胞，无细胞病变出现，HA效价为0。而ND、AIV阳性血清不 能抑制病毒的增殖，说明所述毒株特异性强。中和试验的结果表明，所述毒株的血清型与国际标准株AV127的血清学关系密切，属于同一血清型。用病毒液感染雏鸡和油乳剂免疫试验鸡，试验鸡均产生了特异性 EDS76HI抗体，从血清学角度证明分离到的鸡减蛋综合征病毒毒株具有良好的免疫原性。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒诊断EDS76抗原试剂中 的应用。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒诊断阳性血清试剂中 的应用。本发明的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒治疗用EDSre抗血清试 剂中的应用。本发明中，毒株定名为Chicken/China/Henan/02/2002 株，简称 HE02 株。(1)流行病学调查调查鸡群的发病年龄，日产蛋率，蛋壳质量，临床表现及死亡 等情况。河南某鸡场饲养的罗曼父母代种鸡，31周龄，该鸡群未接种减蛋综合征灭活疫苗。 2002年2月12日，鸡群饲料消耗正常，产蛋量大幅度下降。发病前日产蛋率为86. 7%，发病 后产蛋量呈直线下降，第9日下降到最低点，为45.6%。此后，产蛋量出现缓慢回升，第30日 日产蛋率达到52.7%，仍不能恢复到发病前的水平。在发病期间，平均日产蛋率为50. 1%, 比发病前下降了 36. 5%，同时观察到产软壳蛋、薄壳蛋和粗壳蛋的现象，这些畸形蛋占总产 蛋数的11.5%。患病鸡群精神状况多无异常表现，仅少数鸡只发生腹泻，在发病期间共死鸡6只， 死亡率为0.6%。。剖杀病死鸡内脏器官无明显肉眼变化，取心血、肝、脾细菌学检查亦为阴性 结果。采集发病后12日的鸡血清样本19份，检测EDSre血凝抑制抗体，阳性率为100%，效 价为25 28。(2)病毒分离取病死鸡输卵管和子宫分别加10倍生理盐水研磨勻浆；另取软壳 蛋蛋清加适量生理盐水制备蛋清稀释液。在上述3份病料中加入等量的氯仿，振摇30分 钟，然后，以3500rpm离心10分钟，取上清液经双抗处理，4°C过夜。第二日，对病料作无菌 检查，取无菌的材料作为病毒分离样本，置一 30°C冰箱冻结备用。将3份样本分别接种10 11日龄的鸭胚和10日龄SPF鸡胚，鸭胚来自EDS76血 凝抑制抗体阴性的鸭群，经尿囊腔途径接种，每胚0. anl，于37°C连续孵化96 120小时， 每6 8小时照蛋一次，及时挑出死胚；弃去48小时前的死胚，直至120小时后不论死亡或 存活，取出所有胚，气室向上直立，置2 8°C冰箱冷却8 16小时，收获胚液，观察各个代 次鸭胚和鸡胚的死亡率，所致病变和测定尿囊液的血凝效价。并进行盲传，每1代均设2枚 不接种的鸭胚作为对照。结果表明，将病死鸡输卵管和子宫两份样本接种鸭胚并盲传3代，均不能致死鸭 胚和产生病变，测定收获的尿囊液亦无血凝效价。将软壳蛋蛋清样本接种鸭胚并进行盲传，至第3代时，3/10的鸭胚头颈部观察到 少量点状出血，收获的尿囊液中出现24 7的血凝价。在传代至第4代和第5代时，分别在 接种后118小时和115小时致死1枚鸭胚，死亡率为20% (2/10)；死亡胚与存活胚病变显 著，胚胎发育阻滞，胚体头颈部、背部、大腿、翅膀及腹部出血明显，严重者呈弥漫性出血；收 获尿囊液的血凝价从27 211上升到213 217。在5次传代过程中，对照鸭胚健康存活，尿 囊液未测定出血凝价。病毒分离获得的鸡胚和鸭胚尿囊液的HA和HI试验结果见表1、2。
表1病料分离物使用鸡红细胞的试验结果
权利要求
1.一种禽减蛋综合征病毒毒株，其特征在于禽减蛋综合征病毒(Adenoviridae)， CGMCC NO :3527ο
2.根据权利要求1所述的禽减蛋综合征病毒毒株，其特征在于它具有下述特点(1)所述毒株在电镜下显示呈六角形、球形、无囊膜、直径大小75 SOnm的病毒粒子， 符合腺病毒粒子的形态特征；(2)所述毒株对氯仿和乙醚不敏感，在ρΗ为3.O 10. O的条件下有抵抗力，在37 70°C的条件下有抵抗力；(3)所述毒株的核酸类型是DNA病毒；(4)所述毒株只与EDS76抗血清发生特异性反应，而与H5、H7、H9和ND阳性血清的HI 反应均为O ；(5)所述毒株在鸭胚中和试验中，只有EDS76抗血清能够抑制所述毒株病毒在鸭胚尿囊 腔的增殖，而其它阳性血清均不能抑制所述毒株病毒的增殖；(6)所述毒株与国际标准毒株AV127的亲缘值R为95%，属于同一血清型；(7)使用所述毒株制备的减蛋综合征灭活油乳剂能够刺激鸡只产生EDS76抗体。
3.如权利要求1所述的禽减蛋综合征病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。
4.如权利要求1所述的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒诊断EDS76抗 原试剂中的应用。
5.如权利要求1所述的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒诊断阳性血 清试剂中的应用。
6.如权利要求1所述的禽减蛋综合征病毒毒株在制备禽减蛋综合征病毒治疗用EDS76 抗血清试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种禽减蛋综合征病毒毒株，禽减蛋综合征病毒(Adenoviridae)，CGMCC NO3527。本发明是一株新的减蛋综合征病毒分离株，与国际标准株AV127株的血清型相同；病毒免疫原性好，能够抵抗减蛋综合征病毒多个地方分离株和标准株的攻击；本发明的减蛋综合征病毒油乳剂免疫蛋鸡群，可以给鸡群的产蛋率提供有效的保护，是一株比较理想的制苗候选毒株；可以用来制备特异性的EDS76病毒抗原和阳性血清，用于病毒的快速鉴定和流行病学的调查。
文档编号A61P15/08GK102086446SQ201010128150
公开日2011年6月8日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者崔保安, 崔沛, 李双亮, 李新生, 陈红英, 高文明, 黄宗梅 申请人:河南农业大学