专利名称：Serpine2基因的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种与胃癌转移相关的SERPINE2基因 的用途。
背景技术：
胃癌是世界上高发的恶性肿瘤之一，在1990-1992年的中国恶性肿瘤死亡抽样 调查显示，胃癌的死亡率接近25. 2/10万人(男性32. 8/10万人，女性17. 0/10万人)，占 1990-1992年死亡的肿瘤病人的23. 2%，居各类恶性肿瘤之首。虽然近年来胃癌的死亡率 有明显下降，但是依然很高，多数胃癌患者是发现了临床症状如腹部不适、隐痛、泛酸、暧气 或消瘦、黑便等症状后进行胃镜和活检确诊，一经确诊，多为晚期，错过了治疗的最佳时期。胃癌的筛查手段包括影像学检查、胃镜加活检、血清学检测如胃蛋白酶元、CEA、 CA系列抗原等。传统的影像学检测能够有效检出大的淋巴结转移，但是至少有25%的转移 淋巴结小于5mm且MRI、PET等影像学手段无法检出。血清学检测普遍存在灵敏度低、特异 性差，尤其是对早期胃癌的检出率、有效性都很低。目前最有效的手段就是胃镜加活检，胃 镜检查和病理学诊断均基于形态学的判断，对于操作人员的经验技术有较高的要求，这种 非客观、非标准化的检测存在较大的误诊/漏诊率，而且对有不典型增生、早期胃癌、胃癌 进展期等组织学特征进行的区分，目前尚难以有明确的界限。丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)是最大且分布最广泛的蛋白酶抑制剂超家族，通 过构象变化抑制酶的活性，它们控制许多重要的蛋白级联水解，部分丝氨酸蛋白酶抑制剂 的突变会导致蛋白错误折叠或者产生致病的失活蛋白多聚物。SERPINE2是分子量为44kDa的分泌蛋白，是胰蛋白酶(trypsin)、凝血酶 (thrombin)、纤溶酶(plasmin)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)和前列腺蛋白(prostasin)的抑制剂，能增强肿瘤的侵袭能力，SERPINE2在脑组 织、神经胶质细胞和神经元中高表达，但是在正常胰腺以及慢性胰腺炎组织中几乎不表达。 SERPINE2在肿瘤中的研究很少，目前尚无关于SERPINE2与胃癌转移相关的研究或产品应 用报道。
发明内容
本发明要解决缺乏客观准确的肿瘤转移早期诊断方法的技术问题，提供一种与胃 癌转移相关的SERPINE2基因的用途，可作为肿瘤转移的早期分子诊断标志物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种SERPINE2基因的用途，用于制备早期诊断肿瘤 转移的产品。优选的，所述早期诊断肿瘤转移的产品包括用实时定量PCR、基因芯片检测、或 免疫检测诊断肿瘤转移的产品。所述用实时定量PCR诊断肿瘤转移的产品至少包括一对特异扩增SERPINE2基因的引物。所述用基因芯片检测诊断肿瘤转移的产品包括至少一个与SERPINE2基因的核酸序列杂交的探针，该探针序列与SERPINE2基因序列的任意连续9个核苷酸序列相同或互 补。所述用免疫检测诊断肿瘤转移的产品包括与SERPINE2蛋白特异性结合的抗体。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对SERPINE2蛋白特 异的抗体。例如，将提纯的人SERPINE2基因产物或它的抗原片段或人工合成的含有与 SERPINE2蛋白有连续5个相同的氨基酸的多肽片段注射入动物体内以产生多抗体。同样， 表达人SERPINE2蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据 本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述 探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可 以。在本发明的另一方面，还提供了一种用于早期诊断肿瘤转移的试剂盒，所述试剂 盒包含特异性针对SERPINE2基因的引物或探针，或包含特异性结合SERPINE2蛋白的抗体。利用本发明的试剂盒，可以检测肿瘤病人SERPINE2基因的表达情况，从而判断肿 瘤病人是否会发生肿瘤转移，进而制定个性化的治疗方案。在本发明的另一方面，还提供了一种SERPINE2基因的用途，用于制备治疗肿瘤转 移的药物。优选的，所述治疗肿瘤转移的药物包括抑制SERPINE2基因表达或抑制SERPINE2 蛋白活性的物质。更优选的，所述治疗肿瘤转移的药物包括通过RNA干扰抑制SERPINE2 基因表达的核糖核酸，或用于抑制SERPINE2蛋白活性的蛋白质。在本发明的另一方面，还提供了一种SERPINE2基因的用途，用于筛选治疗肿瘤转 移的药物。在本发明的另一方面，还提供了一种SERPINE2基因编码或表达的蛋白质的用途， 用于筛选治疗肿瘤转移的药物。上述肿瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、口腔鳞 状细胞癌、或白血病肿瘤，优选为胃癌。上述SERPINE2基因编码SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。优选的，该SERPINE2 基因为SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。本发明与胃癌转移相关的SERPINE2基因，可作为早期诊断肿瘤转移的标志物，辅 助医生制定个性化的治疗方案、改善患者预后，同时也可作为控制肿瘤转移的药物治疗靶 标，为设计和筛选抗肿瘤转移药物提供新的靶点。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1胃癌组织样本中提取的总RNA的2100峰图；图2是本发明实施例1的SERPINE2基因在转移和非转移胃癌中差异表达的表达 谱芯片结果图3是本发明实施例2的SERPINE2基因在胃癌样本中差异表达的实时定量PCR 结果图；图4是本发明实施例2的SERPINE2基因在胃癌样本中差异表达的芯片与定量PCR 结果比较图；图5是本发明实施例3的SERPINE2蛋白在胃癌转移和未转移样本中差异表达图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京 科学出版社， 2004)中所述的方法进行。实施例1表达谱芯片实验检测SERPINE2基因在胃癌组织中的表达情况1.临床样品的准备胃癌手术切除标本，经病理学诊断确诊胃癌，配对留取25例胃癌病灶及其5cm以 上的癌旁组织，-80°C冻存，液氮运输。临床病理诊断包含有转移和非转移的信息。胃癌的 诊断标准参照全国胃癌病理协作组拟定的胃粘膜活检病理诊断的统一标准。2.总RNA的提取、质量检测和纯化(1)激光显微切割(Laser capture microdissection, LCM)获取高纯度细胞25对胃癌及其癌旁正常组织冰冻切片连续4 6片8 μ m贴附于显微切割仪专用 膜(瑞士匪I公司)上，固定染色步骤均按Ambion LCM染色试剂盒说明书室温操作。贴 有切片的膜浸入95%乙醇30 40s ；75%乙醇30 40s ；50%乙醇25 30s固定；滴加 150 μ 1甲酚紫染色8 IOs ；50%乙醇25 30s ；75%乙醇25 30s ；95%乙醇30 40s ； 100%乙醇30 40s，2次；二甲苯淋洗3 4次；二甲苯放置5min ；通风橱斜置，晾干5min。 在MMI激光显微切割系统的视野中选取目的细胞约5000个左右进行切割收集。(2)总RNA的提取LCM取得的细胞置入1. 5ml离心管，加入100 μ 1 TRIzol (Invitrogen)，上下颠倒 混勻。加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混勻1分钟左右，室温下静置10分钟。4°C， 13200rpm离心15分钟后小心取出上清，转入新的1. 5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻 轻颠倒混勻，室温静置10分钟。4°C，13200rpm离心15分钟后，小心吸去上清，向沉淀中加 入2/5体积的70%乙醇，轻轻混勻洗涤，4°C，13200rpm离心15分钟。小心吸去上清，打开 管盖室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，采用无RNA酶的DNA酶I处理去除 基因组DNA的污染。(3)总RNA的质量检测用Agilent 210000 bioanalyzer分析提取的RNA，清晰的峰形和最低的背景荧光 显示完整、未降解的RNA(见图1)。(4)总RNA的纯化对通过质量检测的25对总RNA使用QIAGEN RNeasy Kit纯化，详细方法见说明书。3.表达谱芯片实验(1)实验过程采用Affymetrix exon表达谱芯片，实验过程严格按照AfTymetrix表达谱芯片操作手册进行。(2)数据预处理和差异筛选芯片所得到的原始数据经过均一化、背景质量检测，得到基因表达值，利用MeV4. 5的SAM模块结合临床资料的转移分型进行分析。(3)结果应用SAM软件筛选在25对转移和非转移胃癌中差异表达的基因(取FDR = 0.01)， 找到了 SERPINE2基因(图2)，其中，图2的上方是样本编号，样本编号下面是表达图谱，红 色表示基因上调(相对于该基因的平均数)，绿色表示下调，黑色表示未变化。SERPINE2基 因编码SEQID NO 1所示的氨基酸序列。优选的，该SERPINE2基因为SEQ ID NO 2所示的 核苷酸序列。实施例2 实时定量PCR检测SERPINE2基因表达的改变(1)内参设定及引物设计、合成内参选用β -actin，引物设计采用PrimerExpresS 3. 0软件以序列长 度为19-22bp，且Tm值59 °C 60 V为优化条件，SERPINE2基因的正向引物为 TTCCATCTGCTCCCACTTCAA (SEQ IDNO :3)，反向引物为GTCATGAGGCCTCGACTTCAC (SEQ ID NO: 4)，设计的引物由生工合成。(2) RNA提取和逆转录cDNA合成RNA的提取、质量检测和纯化步骤同实施例1所述。在PCR管中加入总RNA、引物、DEPC水，65°C温浴5分钟，稍微离心，立即放置冰上 5分钟。然后在PCR管中继续添加5 X反应缓冲液、RNase抑制剂、IOmM dNTP混合液、逆转 录酶，42°C温浴60分钟之后70V 5分钟终止反应，保存于-20°C备用。(3)实时定量PCR反应采用ABI 73OO 定量 PCR 仪，试剂采用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo)，逆转录产物1 10稀释，取Iul进行实时PCR反应，反应程序为50°C 2分钟； 再95°C 10分钟；然后95°C 15秒及60°C 1分钟，进行40个循环；最后95°C 15秒，60°C 1分 钟，95°C 15 秒。反应结束，得本发明SERPINE2基因在胃癌和癌旁正常样本中的差异表达。 SERPINE2在11个胃癌样本中表达情况的定量PCR结果见图3，在图3中，横坐标为样本号； MO表示未转移，Ml表示有转移；纵坐标为以β-actin为内参基因的Δ Ct值(Ct中C代表 Cycle, t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经 历的循环数，Ct越小说明其表达量越高；ACt值为同一样本中SERPINE2目的基因的Ct值 与内参基因的Ct值相减所得的值)。图3表明SERPINE2基因在转移胃癌样本中的表达量 高于未转移胃癌样本。SERPINE2在11对胃癌样本中表达情况的芯片与定量PCR结果比较见图4，在图4 中，横坐标为样本号；MO表示未转移，Ml表示有转移；纵坐标为Log Ratio值，即癌(T)和癌 旁(N)比值取Log值；qPCR内参基因为β-actin。由图4可知，外显子芯片实验和实时定量 PCR实验的结果都表明SERPINE2基因在发生转移的胃癌样本中表达明显升高，而在未转移 的胃癌样本中表达正常或下降。因此，可通过实时定量PCR或基因芯片诊断胃癌是否发生转移设计SERPINE2基因的PCR引物或探针，检测胃癌组织中SERPINE2基因的表达量，如 果SERPINE2基因的表达量显著升高，则说明胃癌转移的可能性高，如果SERPINE2基因的表 达量正常，则说明胃癌转移的可能性低。由于有研究表明SERPINE2基因在胰腺癌、结肠癌、 乳腺癌、口腔鳞状细胞癌和睾丸癌中的表达均升高，且对睾丸癌的研究发现，在小鼠皮下注 射SERPINE2过表达细胞的培养基能够促进淋巴结转移，而注射被RNA沉默SERPINE2表达 细胞的培养基能抑制淋巴结转移，因此，可通过实时定量PCR或基因芯片，检测肿瘤组织中 SERPINE2基因的表达量，从而早期诊断肿瘤是否发生转移。
实施例3 Western Blot检测SERPINE2蛋白的表达情况(1)组织中总蛋白的提取视胃癌和癌旁组织样本的多少加入100-200 μ 1 RIPA(中)裂解液，冰上裂解30 分钟后，然后在4°C下13200rpm离心15分钟，取上清分装于0. 5ml离心管中并置于_20°C保存。(2)蛋白含量的测定lowry法测蛋白含量。(3) SDS-PAGE电泳12%胶10孔板，每孔上样40 μ g蛋白，80V恒压电泳浓缩胶 15min，至分离胶时加压至120V电泳至槽底。(4)转膜切去多余的胶，每块胶剪1张PVDF膜和6张滤纸，按照滤纸+PVDF膜+ 胶+滤纸顺序置于电转夹中，胶的一侧靠近电泳电源的负极，恒流200A，2小时，取出PVDF膜。(5)封闭将膜置于适量5%奶粉的TBST，室温下摇床上摇动封闭2小时。(6) 一抗将SERPINE2 —抗用TBST以1 400稀释，将膜室温下孵育2小时后， 用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5分钟。(7) 二抗同上方法准备二抗(抗鼠)稀释液并将膜室温下孵育2小时后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次5分钟。(8)化学发光、显影、定影将A 和 B 两种试剂(ECL Western blotting detection reagents, GE)在保鲜膜 上等体积混合，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，2分钟后，去尽残液，包好，放入X-光 片夹中。在暗室中根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为Imin或5min，多次压片，得图 5。在图5中，“T”指胃癌组织，“N”指癌旁组织。由图5可知，SERPINE2在发生了淋巴结转 移的胃癌组织中高表达，而在没有出现淋巴结转移的胃癌组织中正常表达。实施例4抗肿瘤转移药物的筛选以SERPINE2基因作为靶点，设计和筛选抗肿瘤转移药物。具体方法如下。用候选药物处理高表达SERPINE2基因的肿瘤转移体系，该SERPINE2基因为SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，然后检测上述体系中SERPINE2基因的表达水平或检测上述体 系中表达的SERPINE2蛋白的活性。若候选物质可降低SERPINE2基因的表达或降低过表达 SERPINE2蛋白的活性，则表明该候选药物是能控制肿瘤转移的潜在物质。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
一种SERPINE2基因的用途，其特征在于，用于制备早期诊断肿瘤转移的产品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述早期诊断肿瘤转移的产品包括用实 时定量PCR、基因芯片检测或免疫检测诊断肿瘤转移的产品。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断肿瘤转移的产 品至少包括一对特异扩增SERPINE2基因的引物；所述用基因芯片检测诊断肿瘤转移的产 品包括与SERPINE2基因的核酸序列杂交的探针；所述用免疫检测诊断肿瘤转移的产品包 括与SERPINE2蛋白特异性结合的抗体。
4. 一种用于早期诊断肿瘤转移的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对 SERPINE2基因的引物或探针，或包含特异性结合SERPINE2蛋白的抗体。
5. 一种SERPINE2基因的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤转移的药物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述治疗肿瘤转移的药物包括抑制 SERPINE2基因表达或抑制SERPINE2蛋白活性的物质。
7. —种SERPINE2基因的用途，其特征在于，用于筛选治疗肿瘤转移的药物。
8. —种SERPINE2基因编码或表达的蛋白质的用途，其特征在于，用于筛选治疗肿瘤转 移的药物。
9.根据权利要求1、5、或7所述的用途，其特征在于，所述SERPINE2基因编码SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1、5、或7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌、肝癌、胰腺 癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、口腔鳞状细胞癌、或白血病肿瘤。
全文摘要
本发明公开一种SERPINE2基因的用途，用于制备早期诊断肿瘤转移的产品。本发明还公开了SERPINE2基因在制备或筛选治疗肿瘤的药物中的用途。本发明与胃癌转移相关的SERPINE2基因，可作为早期诊断肿瘤转移的标志物，辅助医生制定个性化的治疗方案，同时可作为控制肿瘤转移的药物治疗靶标。
文档编号A61P35/04GK101798600SQ20101013903
公开日2010年8月11日 申请日期2010年4月2日 优先权日2010年4月2日
发明者张庆华, 张雯, 杨燕青, 阳圣 申请人:上海生物芯片有限公司