专利名称：鲤春病毒血症抗原表位的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
我国是水产养殖大国，水产养殖总量世界第一，水产品出口量占世界第一。鲤春病毒血症(SVC)是鱼类最主要的疾病之一，以发病急、死亡率高为特征。鲤春病毒血症病毒的宿主范围很广，能感染四大家鱼和其他几种鲤科鱼，包括鲤鱼和锦鲤、鳙鱼、草鱼、鲢鱼、黑鲫、鲫鱼、丁鳜和欧鲇等，鲤鱼是其中主要的、最易感的宿主。近几年来该病在我国大部分地区均有发生，，已成为我国淡水养殖鱼类的主要病害。鲤春病毒血症是水产动物一类传染病，是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。目前，在我国对SVC病毒的检测方法主要是病毒分离后用RT-PCR。PCR技术虽然具有高灵敏度的优越性，但缺点是
1、结果判断上常常会出现假阳性的情况；
2、需要专业人员和昂贵的仪器试剂；
3、不符合国际兽疫局(OIE)推荐的检测方法。
发明内容
本发明通过噬菌体展示技术，利用鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体筛选出阳性克隆，找出与SVCV单克隆抗体结合的保守序列，筛到的抗原型表位制备临床诊断试剂， 小分子抗原肽作为疫苗防治鲤春病毒血症。本发明基因序列是SEQ ID NO :1。本发明鲤春病毒血症抗原表位在制备鲤春病毒血症疫苗的应用。本发明利用噬菌体展示技术，通过SVCV单克隆抗体筛选阳性克隆，找出在随机肽库中能与中和SVCV活性的单克隆抗体结合的保守序列。确定该抗原决定簇的位点，分析其序列，结构与功能的关系；研究小肽竞争与SVCV受体结合，针对SVCV而产生抑制作用，对未来小分子抗原肽作为疫苗，将具有巨大的应用价值。
图1是本发明第1、2轮筛选6次洗脱扩增的噬菌体克隆点杂交结果； 图2是本发明第3轮筛选3次洗脱扩增的阳性克隆点杂交结果；
图3是本发明短肤触合蛋白组的设计表达与纯化；
图4是本发明抗原表位在ELISA和Westernblot的结果中，均被免疫血清所识别； 图5是本发明短肽融合蛋白与细胞结合活性测定； 图6是本发明加入抗血清后短肽蛋白与细胞结合活性测定； 图7是本发明阳性杂交瘤细胞染色体形态； 图8是本发明2A3抗体与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图；图9是本发明3H7抗体与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图； 图10是本发明SVXV单克隆抗体正辛酸纯化的SDS-PAGE电泳结果； 图11是本发明2株腹水与抗原的反应结果。
具体实施例方式本发明鲤春病毒血症抗原表位基因序列是SEQ ID NO :1。本发明鲤春病毒血症抗原表位在制备鲤春病毒血症疫苗的应用。一、鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体制备 1材料与方法
1. 1材料 1. 1. 1主要试剂
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和二氨基联苯胺(DAB)以及青霉素G (钠盐)和链霉素(硫酸盐)购自北京鼎国生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术公司；RPMI-1640培养基、100倍HT和100倍HAT、HEPES、二甲基亚砜(DMS0)、 聚乙二醇4000、秋水仙素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵、 PNA, β-巯基乙醇和硝酸纤维素膜购自Sigma公司；抗体亚类鉴定试剂(IgGl、IgG2a, IgG2b、IgG3、IgM、IgA)购自 Pharmacia 公司；低分子量标准蛋白(97. 4,66. 2,43. 0,31. 0、 20. 1和14. 4kD)购自TaKaRa公司；胎牛血清购自HyClone公司；其它试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂。1. 1. 2鲤春病毒血症病毒鲤春病毒血症病毒本实验室保存 1. 1.3实验动物
BALB/c小鼠购自长春生物制品研究所实验动物中心。1.1.4 细胞株
SP2/0骨髓瘤细胞为军事医学科学院十一所细菌室保存。EPC购自中科院上海细胞所 1. 1. 5主要培养液及缓冲液
青、链霉素(双抗)溶液取青霉素G (钠盐)100万U和链霉素(硫酸盐)lg，溶于IOOml 去离子水中，过滤除菌，分装小瓶，-20°C保存备用。50%聚乙二醇取PEG 0. 5g于0. 5ml去离子水中，121°C高压灭菌15min备用。RPMI-1640培养液取商品化RPMI-1640培养基粉剂按说明书配制，充分溶解后每 IOOOml加HEPES 2g，青、链霉素(双抗)溶液1ml，用HCl或NaOH调pH值为7. 2，过滤除菌， 分装后_20°C保存备用。20%胎牛血清RPMI-1640培养液RPMI_1640培养液80ml加胎牛血清20ml。HAT选择培养液RPMI-1640培养液80ml，加100倍HAT 1. 0ml，胎牛血清20ml。HT选择培养液RPMI-1640培养液80ml，加100倍HT 1. 0ml，胎牛血清20ml。细胞冻存液90ml胎牛血清加IOml 二甲基亚砜，_20°C保存备用。0. 2%台盼蓝溶液0. 2g台盼蓝溶于100ml PBS中。抗原包被液(pH7.6) =NaCO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，溶于 1000ml 蒸馏水中。PBS (pH7. 4) =NaCl 8. 0g, Na2HPO4 12H20 2. 9g, KCl 0. 2g，溶于 1000ml 蒸馏水。
封闭液3%BSA，用 pH7. 4 的 PBS 配制。抗体稀释液0. 3% BSA，用pH7. 4的PBS配制。洗涤液100ml PBS 中力口 0. Iml Tween—20。底物溶液(OPD-H2A溶液):4mg OPD溶于IOml pH5. 0的磷酸盐一柠檬酸缓冲液中， 力口 30% H2O2 15 μ 1。1. 1. 6主要仪器
二氧化碳培养箱、-70 V超低温冰箱(SANYO公司产品)，倒置显微镜()(DS-1B，重庆光电仪器总公司产品)，96孔酶标板、96孔及M孔细胞培养板(NUNC公司产品)，超净工作台(苏净集团安泰公司产品)，酶联免疫检测仪(ELX800，Bio-TEK公司产品)，垂直板电泳仪(槽) (BI0-RAD公司产品)，转移电泳槽(北京六一仪器厂产品)，其它仪器为国产普通小型仪器。1. 2 方法 1.2. 1动物免疫
培养鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)，传代M 48 h之后接种SVCV。当细胞产生90%病变之后反复冻融3次，收集病毒液。将病毒液以4°C 8 000 r/min离心1 h，取上清以 12°C 35000 r/min超速离心3 h,取沉淀溶于适量PBS中，将部分样品加于浓度为30% 蔗糖界面上，45 000 r/min离心5 h,收获沉淀溶于PBS中，以40 000 r/min离心
3 h去除蔗糖，沉淀溶于少量PBS中。按同样的方法处理正常的EPC作为对照。用纯化的SVCV抗原免疫8周龄BALB/c小鼠，免疫3次，每次间隔2周。初次免疫时抗原加等量弗氏完全佐剂，后2次加等量弗氏不完全佐剂，免疫剂量均为100 Lg/只，免疫途径为颈背部多点皮下注射；融合前3天做加强免疫，用不加佐剂抗原腹腔注射，100 Lg/只。1.2.2小鼠腹腔巨噬细胞制备饲养细胞
取一只没有免疫的健康BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入75%的酒精中消毒lOmin，移入超净台，用无菌手术剪剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用玻璃注射器注入腹腔IOml RPMI-1640培养液，按摩腹部，用注射器吸取培养液，然后用5mlRPMI-1640培养液重复一次，合并两次吸出的液体，滴入3块96孔培养板，每孔50 μ 1，37°C 5%C02培养箱培养12 24h备用。1. 2. 3骨髓瘤细胞悬液的制备
在细胞融合前Mh，给预先培养的骨髓瘤细胞换液一次，使其处于对数生长期，融合前从培养瓶移出骨髓瘤细胞于灭菌的离心管，用IOml RPMI-1640培养液洗涤3次(lOOOrpm， 5min),用RPMI-1640培养液重悬细胞，对细胞悬液计数，调整细胞数为1 X IO5飞X IO5个/ ml ο1.2.4免疫脾细胞悬液的制备
在最后一次免疫注射后第3d，取免疫的小鼠，摘除眼球放血，收集血液分离血清，供检测抗体和作实验的阳性对照用。小鼠拉颈处死，用自来水冲洗后浸入75%酒精中消毒 lOmin，随即放入超净台内，用无菌剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏，放入玻璃培皿中的消毒铜网上，滴入2ml无血清RPMI-1640培养液，用5ml注射器针筒芯研磨脾脏，使之成浆状，用镊子夹住铜网，滴加适量无血清RPMI-1640培养液洗涤，将培养皿静置3 5min，待大的组织块沉淀后，小心吸取细胞悬液，移入50ml塑料离心管内，用RPMI-1640培养液洗涤细胞2次 (lOOOrpm, lOmin)，用RPMI-1640培养液重新悬浮细胞并计数，调整细胞数为1 X IO8个/ml。
1. 2. 5细胞融合
将已制备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50ml离心管内，脾细胞与骨髓瘤细胞之比为10:1，用RPMI-1640培养液洗涤细胞2次(1200rpm，lOmin)，同时将50%PEG和IOml RPMI-1640培养液于37°C水浴预热。最后一次洗涤后弃去上清液，用力振动离心管，振散细胞团块，置于37°C水浴中。在Imin内滴加0. 5ml 50%PEG，缓慢振荡，加完后静置90s，在 Imin内滴加細1无血清RPMI-1640培养液，在!Bmin内加Iml无血清RPMI-1640培养液，补加至30ml，静置lOmin，IOOOrpm离心lOmin，弃去上清液，轻轻振散细胞团块，加入15ml含 20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养液，制成细胞悬液。加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0. 1ml，于37°C 5%C02培养箱培养。融合后每天观察细胞生长情况，于第4、6、8、 IOd每孔吸去50 μ 1培养液上清，加入50 μ 1 HAT培养液，第Ild改换同量的HT RPMI-1640 培养液。1.2.6杂交瘤抗体检测
鲤春病毒血症病毒抗原用包被缓冲液50倍稀释，滴加入3块96孔酶标板，每孔 100 μ 1，置4°C冰箱过夜，次日甩干包被液，每孔加入IOOul封闭液，置37°C温箱中孵育4h， 取出后甩干封闭液，洗涤液洗涤3次，每次:3min。将融合细胞培养上清加入封闭过的酶标板中，其中两孔加入SP2/0培养上清作为阴性对照，另外两孔加入抗血清作为阳性对照，置 37°C温箱中孵育lh，取出后洗涤液洗涤3次，每次;3min。洗涤后于酶标板每孔中加入1 5000倍稀释的酶标二抗100 μ 1，置37°C温箱中孵育lh，取出后洗涤液洗涤3次，每次3min。 加入底物溶液，每孔ΙΟΟμ 1，置37°C温箱中孵育20min显色，取出后每孔加入50μ 1终止液，终止显色反应。于酶标仪上测定各孔OD49tlnm值。被测孔OD49tlnm值大于阴性2倍以判定为阳性。1.2.7阳性杂交瘤细胞克隆化
将经ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞吹打成细胞悬液，进行细胞计数，然后按照1个 /孔的稀释度稀释细胞悬液，加入含饲养细胞的96孔细胞培养板培养。对有细胞克隆生长的培养孔，待其生长至一个视野的1/2以上时即可按1. 2. 6杂交瘤抗体检测的方法进行检测。检测获得的阳性孔再次按同样的方法进行克隆、检测，直至所有克隆化的细胞全部都为阳性，挑选生长良好且阳性较强的细胞孔，将细胞吹打下来，移入M孔板扩大培养，培养换液时收集培养液上清，部分冻存，部分备用。1.2.8阳性杂交瘤细胞克隆株的冻存
将M孔板中扩大培养的细胞株，进一步在5ml、10ml、50ml培养瓶中逐步扩大培养，除一部分用于腹水的制备之外，其余细胞在对数生长期时，收集细胞悬液，离心后倾去上清， 加入含10% 二甲基亚砜的小牛血清，混均后移入细胞冻存管内，-70°C冰箱中过夜，次日放入液氮罐中保存。1. 2. 9腹水的制备
取成年BALB/c雌性小鼠，腹腔注射0. 5ml石蜡油，一周后取处在对数生长期的阳性杂交瘤细胞株，倒掉培养上清，用无血清RPMI-1640培养液悬浮细胞，细胞计数，调整细胞数为6X105/ml。将其注入经石蜡油处理过的小鼠腹腔内，每只注入0.5ml。待小鼠腹腔明显胀大后，采集腹水，Id后再采集一次。收集到的腹水置37°C温箱ai，4000rpm离心lOmin，吸取上清液，56°C水浴灭活30min后，置_20°C冰箱冰存备用。
1. 2. 10阳性杂交瘤细胞染色体测定
取对数生长期杂交瘤细胞用终浓度为0. 25umol/L秋水仙素处理4 h，收集细胞后用低渗KCl溶液处理15min，固定液固定，吸管滴加细胞悬液到4°C预冷的载波片上，载波片室温下自然干燥，吉姆萨染色，显微镜下观察并照相，统计染色体数目。1.2.11杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性测定
将亚克隆阳性率达100%的细胞株体外连续培养2个月，每隔一周取细胞培养上清液检测抗体效价；将冻存6个月后的细胞株复苏，取培养上清液检测抗体效价。1. 2. 12单克隆抗体ELISA最佳反应浓度的测定
采用间接ELISA方阵检测。将鲤春病毒血症病毒抗原倍比稀释纵向包被酶标板，3%牛血清白蛋白封闭lh，洗涤3遍。抗体倍比稀释横向包被酶标板，37°C温箱孵育lh，洗涤3遍。 加入HRP-羊抗鼠IgG酶标二抗，37°C温箱孵育lh，洗涤3遍，显色后测定各孔OD49tlnm值，确定单克隆抗体最佳反应浓度。1. 2. 13单克隆抗体亚类鉴定
采用间接ELISA法。纯化的每株单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板，每孔100 μ 1， 37°C孵育lh，洗涤后每孔加入1000倍稀释的抗体亚类试剂100μ 1，37°C孵育lh，洗涤3遍。 然后加入HRP-羊抗鼠IgG酶标二抗，37°C孵育lh，洗涤后加入底物显色，确定各株单克隆抗体的亚类。1. 2. 14单克隆抗体亲和力测定[139]
采用非竞争酶免疫实验。纯化的每株单克隆抗体，经紫外分光光度计^Onm测定其起始浓度，以不同抗原浓度进行抗体倍比稀释的间接ELISA检测，绘制反应曲线，以曲线上最大OD49tlnm值一半时的抗体浓度计算单克隆抗体的亲和力常数，确定抗体与抗原的结合能力。 抗体亲和力常数以如下公式计算。
权利要求
1.一种鲤春病毒血症抗原表位，其特征在于基因序列是SEQ ID NO :1。
2.权利要求1所述的鲤春病毒血症抗原表位在制备鲤春病毒血症疫苗的应用。
全文摘要
一种鲤春病毒血症抗原表位，属于生物技术领域。本发明通过噬菌体展示技术，利用鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体筛选出阳性克隆，找出与SVCV单克隆抗体结合的保守序列，筛到的抗原型表位制备临床诊断试剂，小分子抗原肽作为疫苗防治鲤春病毒血症。 本发明基因序列是SEQ ID NO1。本发明利用噬菌体展示技术，通过SVCV单克隆抗体筛选阳性克隆，找出在随机肽库中能与中和SVCV活性的单克隆抗体结合的保守序列。确定该抗原决定簇的位点，分析其序列，结构与功能的关系；研究小肽竞争与SVCV受体结合，针对SVCV而产生抑制作用，对未来小分子抗原肽作为疫苗，将具有巨大的应用价值。
文档编号A61P31/14GK102399263SQ20101028019
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者张培军, 张林波, 李月红 申请人:李月红