专利名称：3-Fmoc胺基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及有机合成领域，特别是，涉及一种3-Fmoc胺基_3_(3_硝基_4_氟苯 基)丙酸及其制备方法。
背景技术：
非天然氨基酸是非蛋白基因编码的氨基酸，在基因组学、蛋白质组学等前沿生物 技术研究中有重要的应用。例如，α-非天然氨基酸在蛋白质、核苷和核酸的研究中得到了 广泛应用它们能限制多肽构象的灵活性、提供具有稳定二级结构的脱氧核糖核酸或核糖 核酸分子、增强多肽对酶的稳定性以及提高药代动力学和生物活性；β “非天然氨基酸是 β “内酰胺的前体和很多潜在酶抑制剂的关键成分，具有相当有趣的药理活性。β _非天然 氨基酸在组合化合物库的构建和药物研究中已经成为越来越重要的合成模块。此外，将非 天然氨基酸掺入蛋白序列是合成生物学设计新蛋白的一个策略。这种策略对研究天然蛋白 质的折叠和功能有重要作用。现在已有大约超过30种非天然氨基酸被人工插入到生物体 合成的天然蛋白质中。同时，非天然氨基酸在以重组蛋白质为主的基因工程药物，如重组细胞因子、蛋白 质激素、重组血浆蛋白、重组溶血栓药物、可溶性受体、治疗性抗体、重组药用动植物蛋白等 以及预防或治疗用疫苗、核酸药物、小分子多肽药物等生物药物和疫苗方面有重要的应用。 非天然氨基酸自身可以是重要的药物，它们也是很多市售药物的重要结构单元。目前，世界 上最著名的医药公司，都在研究含有非天然氨基酸骨架的多肽类药物，这些药物多用于抗 菌、消炎、抗惊厥、抑制细胞生长和抗肿瘤等方面。很多药物已经进入临床研究阶段。对于 制药公司而言，在新药的研发过程中，已经没有人敢忽视非天然氨基酸的作用。
发明内容
本发明的目的是提供3-Fmoc胺基_3_ (3_硝基_4_氟苯基)丙酸及其制备方法。本发明提供下述式(I)化合物
NHFmoc
(I)本发明的式(I)化合物3-Fmoc胺基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸的合成路线如
下式所示
O ONH2 NHFmoc
丄 02Ν^^Λη2) ^ O2N J^X^COOH^
4321
其中，1)为浓硫酸，浓硝酸；2)为丙二酸，乙酸铵；3)为FmocCl或Fmoc-Osu，碳酸钠。本发明进一步提供制备上述化合物的方法，包括下述步骤1)使4-氟苯甲醛在浓硫酸和浓硝酸作用下反应生成3-硝基-4-氟苯甲醛；2)将3-硝基-4-氟苯甲醛、丙二酸和 乙酸铵在醇类溶剂中回流6-8小时得到3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸；3)将3-氨 基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸、质量百分比浓度为8-12%的碳酸钠溶液和二氧六环混 合，形成悬浮液后向其中加入FmocCl或Fmoc-Osu和二氧六环的溶液，反应生成3-Fmoc胺 基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸。其中，步骤1)中所加浓硫酸的量为2-4毫升/克4-氟苯甲醛，所加浓硝酸的量为 0. 4-0. 6毫升/克4-氟苯甲醛。步骤2)中所述3-硝基-4-氟苯甲醛、丙二酸和乙酸铵的摩尔比为1 1 2。步骤2)中所述醇类溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。步骤3)中，将c摩尔3-氨基-3-(3_硝基-4-氟苯基)丙酸、(2_2. 5) c升8_12% 的碳酸钠溶液和(1. 0-1. 2) C升的二氧六环混合，剧烈搅拌形成悬浮液；将此悬浮液冷却至 0-5°C，缓慢滴加(1.05-1. 10) c摩尔FmocCl或Fmoc-Osu和(1.5-2. 0)c升二氧六环的溶液； 滴加完毕后，反应体系在0-5°C下搅拌1-2小时后逐渐升至室温，室温下搅拌12-24小时。本发明还提供包含式(I)化合物的药剂。本发明还提供式(I)化合物在用于制备治疗或预防糖尿病、糖尿病并发症、急性 早幼粒细胞白血病(APL)、炎性疾病、器官移植排斥、原虫感染、自身免疫性疾病或肿瘤的药 物中的应用。具体而言，本发明提供制备3-Fmoc胺基_3_ (3_硝基_4_氟苯基)丙酸的方法，包 括下述步骤将a摩尔4-氟苯甲醛(化合物4)于_5°C至0°C下缓慢滴加至浓硫酸(2_4毫升/ 克4-氟苯甲醛)和浓硝酸(0. 4-0. 6毫升/克4-氟苯甲醛)的混合溶液中。滴加速度为
2-4滴4-氟苯甲醛/秒。滴加完毕后，将反应体系逐渐升至室温。室温反应1-3小时后，将 反应体系倒入冰块中(20-25克冰/克4-氟苯甲醛)，生成大量固体。待冰块完全融化成 水后，抽滤反应体系得到固体产物。水相用低极性有机溶剂萃取2-4次，抽滤得到的固体产 物用同样的低极性有机溶剂溶解。合并所有的有机相，先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至PH值 为7-8，再用饱和食盐水洗涤，然后用干燥剂干燥。过滤后，浓缩除去有机溶剂，得到b摩尔
3-硝基-4-氟苯甲醛(化合物3)。所述的低极性有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚或二氧六环。萃取水 相的低极性有机溶剂的用量为0. 3-0. 5毫升/毫升水相。溶解抽滤得到的固体产物的低极 性有机溶剂的用量为5-10毫升/固体产物。所述的饱和食盐水的用量为0. 2-0. 4毫升/毫升有机相。所述的干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁；用量为0. 5-1克/50毫升有机相。将b摩尔3-硝基-4-氟苯甲醛、b摩尔丙二酸和2b摩尔乙酸铵在醇类溶剂中回 流6-8小时。冷却以后，将反应体系过滤，得到c摩尔3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙 酸(化合物2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。
将c摩尔3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸、(2_2. 5) c升8_12%的碳酸钠溶 液和(1.0-1. 2) C升的二氧六环混合，剧烈搅拌形成悬浮液。将此悬浮液冷却至0-5°C，缓 慢滴加(1. 05-1. 10) c摩尔FmocCl或Fmoc-Osu和(1. 5-2. 0) c升二氧六环的溶液。滴加完 毕后，反应体系在0-5°C下搅拌1-2小时后逐渐升至室温，室温下搅拌12-24小时。将反应 体系倒入(20-30)c升的冰水中。用(8-12) c升的有机溶剂萃取两次。水相用(2.0-2.5) N的稀盐酸调节pH值至1-2。大量固体沉淀出。过滤，将固体真空干燥，得到3-Fmoc胺 基-3- (3-硝基-4-氟苯基)丙酸(化合物1)。所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚或二氧六环。氟化学研究表明在分子中引入氟元素后，分子的生物活性将发生显著的改变。因 此，氟元素的引入将有可能导致新药的诞生。在很多药物分子中，硝基是非常重要的活性基 团。基于上述认识，本发明人设计并合成了一种含氟元素和硝基的非天然氨基酸。初 步的实验研究表明，用此非天然氨基酸合成的多肽化合物具有较好的生理活性。
本发明具有如下有益效果1)本发明提供的3-Fmoc胺基-3-(3_硝基-4-氟苯基)丙酸与其它的氨基酸合成 得到的一系列多肽化合物对组蛋白脱乙酰酶(HDAC)具有一定的抑制活性，可能成为治疗 或预防糖尿病、糖尿病并发症、急性早幼粒细胞白血病(APL)、炎性疾病、器官移植排斥、原 虫感染、自身免疫性疾病或肿瘤等的药用组合物。2)本发明提供的3-Fmoc胺基_3_(3_硝基_4_氟苯基)丙酸的合成方法，能够从 简单易得的原料出发，以44-52%的三步反应总收率得到目标产物。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1将18克4-氟苯甲醛(15. 6毫升，0. 145摩尔，1当量，化合物4)于_5°C至0°C下 缓慢滴加至72毫升浓硫酸(市售浓硫酸，浓度为98%)和10. 8毫升浓硝酸(市售浓硝酸， 浓度为68%)的混合溶液中。滴加速度为2滴4-氟苯甲醛/秒。滴加完毕后，将反应体系 逐渐升至室温。室温反应1小时后，将反应体系倒入450克冰块中，生成大量固体。待冰块 完全融化成水后，抽滤反应体系得到固体产物。水相用250毫升二氯甲烷萃取2次，抽滤得 到的固体产物用100毫升二氯甲烷溶解。合并所有的有机相，先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤 至PH值为7-8，再用140毫升饱和食盐水洗涤，然后用7克无水硫酸钠干燥。过滤后，浓缩 除去二氯甲烷，得到14. 5克3-硝基-4-氟苯甲醛(0. 087摩尔，产率60% )。核磁共振氢谱(1HNMR, 300MHz, CDCl3) δ 10. 04 (s，1H)，8· 60 (dd, J = 7. 0,2. OHz, 1Η)，8. 20(oct, J = 2. OHz, 1Η)，7. 50 (t, J = 9. OHz, 1Η)。质谱(ΕΙ):170(Μ+1，7· 2)，169 (Μ，25)，123(100)。将14. 5克3-硝基-4-氟苯甲醛(0.087摩尔，1当量，化合物3)、9. 0克丙二酸 (0.087摩尔，1当量)和13. 4克乙酸铵(0. 174摩尔，2当量)在乙醇中回流6小时。冷却 以后，将反应体系过滤，得到17.5克3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸(0.076摩尔， 产率88%，化合物2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。将17. 5克3-氨基-3-(3_硝基-4-氟苯基)丙酸(0.076摩尔，1当量，化合物2) >190毫升12%的碳酸钠溶液和90毫升的二氧六环混合，剧烈搅拌形成悬浮液。将此悬 浮液冷却至0-5°C，缓慢滴力口 20. 6克FmocCl (0. 08摩尔，1. 05当量)和152毫升二氧六环 的溶液。滴加完毕后，反应体系在0-5°C下搅拌1小时后逐渐升至室温，室温下搅拌12小 时。将反应体系倒入2280毫升的冰水中。用912毫升乙酸乙酯萃取两次。水相用2.5N的 稀盐酸调节PH值至1-2。大量固体沉淀出。过滤，将固体真空干燥，得到33.5克3-Fmoc胺 基-3- (3-硝基-4-氟苯基)丙酸(产率98 %，化合物1)核磁共振Si普(1HNMR, 300MHz, DMS0) δ 12. 20 (s, 1H), 8. 16 (s, 1H), 7. 66 (d, J = 7. 5Hz, 1Η)，7. 21-7. 45 (m, 10Η)，4. 92 (m, 1Η)，4. 16-4. 25 (m，3Η)，2. 87 (dd, J = 6. 6，1. 8Ηζ, 1Η)，2. 62 (dd, J = 6. 6，1. 8Hz, 1Η)。质谱(ESI)451 (Μ+Η+，7. 2)，474 (M+Na+，23. 5)，480 (Μ+Κ+，100)。实施例2将62克4-氟苯甲醛(53. 7毫升，0.5摩尔，1当量，化合物4)于_5°C至0°C下缓 慢滴加至186毫升浓硫酸和18. 6毫升浓硝酸的混合溶液中。滴加速度为3滴4-氟苯甲醛 /秒。滴加完毕后，将反应体系逐渐升至室温。室温反应2小时后，将反应体系倒入1395克 冰块中，生成大量固体。待冰块完全融化成水后，抽滤反应体系得到固体产物。水相用480 毫升乙酸乙酯萃取3次，抽滤得到的固体产物用300毫升乙酸乙酯溶解。合并所有的有机 相，先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至PH值为7-8，再用350毫升饱和食盐水洗涤，然后用35克 无水硫酸镁干燥。过滤后，浓缩除去乙酸乙酯，得到55.0克3-硝基-4-氟苯甲醛(0.325 摩尔，产率65% )。核磁共振Si普(1HNMR, 300MHz, CDCl3) δ 10. 02 (s, 1H)，8· 63 (dd, J = 7. 0,2. OHz, 1H)，8· 22(oct, J = 2. OHz, 1H)，7· 53 (t, J = 9. OHz, 1Η)。质谱(ΕΙ):170(Μ+1，6· 8)，169(Μ，27)，123(100)。将55克3-硝基-4-氟苯甲醛(0.325摩尔，1当量，化合物3)、33. 8克丙二酸 (0.325摩尔，1当量)和50克乙酸铵(0.65摩尔，2当量)在甲醇中回流8小时。冷却以 后，将反应体系过滤，得到54.9克3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸(0. 24摩尔，产率 74%，化合物2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。将54. 9克3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸(0. 24摩尔，1当量，化合物2)、 480毫升10%的碳酸钠溶液和240毫升的二氧六环混合，剧烈搅拌形成悬浮液。将此悬浮 液冷却至0-5°C，缓慢滴加68. 3克FmocCl (0. 26摩尔，1. 1当量)和360毫升二氧六环的 溶液。滴加完毕后，反应体系在0-5°C下搅拌2小时后逐渐升至室温，室温下搅拌24小时。 将反应体系倒入4800毫升的冰水中。用1920毫升二氯甲烷萃取两次。水相用2. 5N的稀 盐酸调节PH值至1-2。大量固体沉淀出。过滤，将固体真空干燥，得到103. 8克3-Fmoc胺 基-3- (3-硝基-4-氟苯基)丙酸(产率96 %，化合物1)。核磁共振Si普(1HNMR, 300MHz, DMS0) δ 12. 18(s，lH)，8. 13 (s，1H)，7· 64 (d，J = 7. 5Ηζ，1Η)，7. 19-7. 41(m，10H)，4. 90(m，lH)，4. 13-4. 22 (m, 3H), 2. 85 (dd, J = 6. 6，1.8Hz， 1H)，2. 60 (dd, J = 6. 6，1. 8Hz, 1H)。质谱(ESI)451 (M+H+，8. 5)，474 (M+Na+，29. 2)，480 (M+K+，100)。实施例3将93克4-氟苯甲醛(80. 6毫升，0.75摩尔，1当量，化合物4)于_5°C至0°C下缓慢滴加至186毫升浓硫酸和18. 6毫升浓硝酸的混合溶液中。滴加速度为4滴4-氟苯甲醛 /秒。滴加完毕后，将反应体系逐渐升至室温。室温反应2小时后，将反应体系倒入1860克 冰块中，生成大量固体。待冰块完全融化成水后，抽滤反应体系得到固体产物。水相用826 毫升甲基叔丁基醚萃取2次，抽滤得到的固体产物用400毫升甲基叔丁基醚溶解。合并所 有的有机相，先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至PH值为7-8，再用615毫升饱和食盐水洗涤，然 后用41克无水硫酸镁干燥。过滤后，浓缩除去甲基叔丁基醚，得到83. 7克3-硝基-4-氟 苯甲醛(0. 495摩尔，产率66% )。核磁共振氧谱(1HNMR, 300MHz, CDCl3) δ 10. 06 (s, 1H)，8· 66 (dd, J = 7. 0,2. OHz, 1H)，8· 25(oct, J = 2. OHz, 1H)，7· 55 (t, J = 9. OHz, 1Η)。 质谱(ΕΙ):170(Μ+1，7· 5)，169(Μ，22· 5)，123(100)。将83. 7克3-硝基-4-氟苯甲醛(0.495摩尔，1当量，化合物3)、51. 5克丙二酸 (0.495摩尔，1当量)和76. 2克乙酸铵(0.99摩尔，2当量)在异丙醇中回流8小时。冷却 以后，将反应体系过滤，得到90. 4克3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸(0. 396摩尔， 产率80%，化合物2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。将90. 4克3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸(0. 396摩尔，1当量，化合物2)、 790毫升8%的碳酸钠溶液和396毫升的二氧六环混合，剧烈搅拌形成悬浮液。将此悬浮液 冷却至0-5°C，缓慢滴加140. 2克Fmoc-Osu (0. 42摩尔，1.05当量)和594毫升二氧六环的 溶液。滴加完毕后，反应体系在0-5°C下搅拌2小时后逐渐升至室温，室温下搅拌24小时。 将反应体系倒入7920毫升的冰水中。用3170毫升二氧六环萃取两次。水相用2. 5N的稀 盐酸调节PH值至1-2。大量固体沉淀出。过滤，将固体真空干燥，得到148.0克3-Fmoc胺 基-3- (3-硝基-4-氟苯基)丙酸(产率83 %，化合物1)。核磁共振Si普(1HNMR, 300MHz, DMS0) δ 12. 19(s，lH)，8. 15 (s，1H)，7· 66 (d，J = 7. 5Hz, 1Η)，7. 23-7. 45 (m, 10Η)，4. 93 (m, 1Η)，4. 15-4. 24(m，3H)，2. 88 (dd, J = 6. 6，1. 8Ηζ, 1Η)，2· 64 (dd, J = 6. 6，1. 8Hz, 1Η)。质谱(ESI)451 (Μ+Η+，9. 0)，474 (M+Na+，28. 2)，480 (Μ+Κ+，100)。实验例将本发明得到的3-Fmoc胺基_3_ (3_硝基_4_氟苯基)丙酸与半胱氨酸 (Cysteine)、亮氨酸(Leucine)和苯丙氨酸(Phenylalanine)反应制备得到多肽化合物半 胱氨酸_亮氨酸_苯丙氨酸-3-胺基-3- (3-硝基-4-氟苯基)丙酸(N端到C端)。测定 该多肽化合物对组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制活性。组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制作用的活体外测定法使用 Biomol (cat. No :AK-500-0001)的 HDAC FluorescentActivity Assay/Drug Discovery Kit。所述HDAC荧光活性测定法基于Fluor de Lys (荧光组蛋白脱乙酰基酶 Lvsyl)基质和展开剂的联用。所述Fluor de Lys基质含有乙酰化的赖氨酸侧链。基质的 脱乙酰作用使得基质具有感光性，从而在第二步骤中用Fluor de Lys显像剂进行的处理可 以产生荧光基团。HeLa核提取物(Biomol供应)在60微克/毫升与75微摩尔基质下进行培养。将 Fluor de Lys 基质加入到 pH 值为 7. 4 的含有 25mMTris、137mM NaClUmM MgCl2 · 6H20 的 缓冲液中。30分钟后，将1体积的显像剂加入其中。用355nm光线对荧光基团进行激发并且在荧光板读数器上对激发光线(450nm)进行检测。
对于各次实验，对照实验(含有HeLa核提取物和缓冲液)、空白培养(含有缓冲 液，但不含有HeLa核提取物)和样品(含有溶于DMSO中的上述多肽化合物并且进一步在缓 冲液中进行稀释，和含有HeLa核提取物)平行进行。在第一种情形中，多肽化合物在ICT5M 的浓度下进行实验。当多肽化合物在IiT5M显示活性时，构造浓度-反应曲线，其中多肽化 合物在ICT5M ICT9M的浓度下进行实验。所有的样品都实验4次。在各次实验中，从对照 实验值和样品值中减去空白值。对照样品表示100%的基质脱乙酰化作用。对于各个样品， 其荧光值由对照平均值的百分比表示。适当时，采用分级数据的概率分析对IC5tl值(使代 谢产物的量降低至对照组的50%时所需要的药物浓度)进行计算。在此将实验化合物的效 果表示为PlC5tl (IC5tl值的负对数值)。实验结果表明上述多肽化合物的PlC5tl值为6. 16，对组蛋白脱乙酰酶(HDAC)具 有抑制活性。
权利要求
下述式(I)化合物FSA00000272451600011.tif
2.制备权利要求1所述的化合物的方法，包括下述步骤1)使4-氟苯甲醛在浓硫酸 和浓硝酸作用下反应生成3-硝基-4-氟苯甲醛；2)将3-硝基-4-氟苯甲醛、丙二酸和乙 酸铵在醇类溶剂中回流6-8小时得到3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸；3)将3-氨 基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸、质量百分比浓度为8-12%的碳酸钠溶液和二氧六环混 合，形成悬浮液后向其中加入FmocCl或Fmoc-Osu和二氧六环的溶液，反应生成3-Fmoc胺 基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所加浓硫酸的量为2-4毫 升/克4-氟苯甲醛，所加浓硝酸的量为0. 4-0. 6毫升/克4-氟苯甲醛。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述3-硝基-4-氟苯甲 醛、丙二酸和乙酸铵的摩尔比为1 1 2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述醇类溶剂为甲醇、乙醇 或异丙醇。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将c摩尔3-氨 基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸、(2-2. 5)c升8-12%的碳酸钠溶液和(1.0-1.2)c升的二 氧六环混合，剧烈搅拌形成悬浮液；将此悬浮液冷却至0-5°C，缓慢滴加(1.05-1. 10) c摩尔 FmocCl或Fmoc-Osu和(1. 5-2. 0) c升二氧六环的溶液；滴加完毕后，反应体系在0_5 V下搅 拌1-2小时后逐渐升至室温，室温下搅拌12-24小时。
7.包含权利要求1所述化合物的药剂。
8.权利要求2的化合物在用于制备治疗或预防糖尿病、糖尿病并发症、急性早幼粒细 胞白血病(APL)、炎性疾病、器官移植排斥、原虫感染、自身免疫性疾病或肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及下述式(I)化合物及其制备方法，所述方法包括下述步骤1)使4-氟苯甲醛在浓硫酸和浓硝酸作用下反应生成3-硝基-4-氟苯甲醛；2)将3-硝基-4-氟苯甲醛、丙二酸和乙酸铵在醇类溶剂中回流6-8小时得到3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸；3)将3-氨基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸、质量百分比浓度为8-12％的碳酸钠溶液和二氧六环混合，形成悬浮液后向其中加入FmocCl或Fmoc-Osu和二氧六环的溶液，反应生成3-Fmoc胺基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸；本发明的3-Fmoc胺基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸与其它的氨基酸合成得到的一系列多肽化合物对组蛋白脱乙酰酶(HDAC)具有一定的抑制活性，制备方法简单，原料易得，收率高。
文档编号A61P35/02GK101985432SQ20101028352
公开日2011年3月16日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者许峰, 高源 申请人:北京欧凯纳斯科技有限公司