专利名称：一种肿瘤靶向双载药递释系统及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术和药物制剂领域，涉及载药递释系统，具体涉及一种肿瘤靶向双载药递释系统，尤其涉及一种肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统及其制备方法。
背景技术：
临床肿瘤治疗研究显示，单一药物用于肿瘤治疗已不能彻底治疗肿瘤。分析其原因在于，由于肿瘤细胞具有一定的调节性，临床长期给予单一的药物，致使肿瘤细胞产生耐受性，导致药物失去肿瘤治疗作用，特别是单纯的化学疗法中，普遍存在多药耐药的弱点。 因此，临床尝试采用联合药物治疗解决这一难题。化疗药物联合用药可以有效防止肿瘤细胞出现耐受性，提高药物的治疗作用。疗效的提高可以降低所需药物剂量，进而降低对人体正常组织的毒副作用。目前，本领域对于基因药物和化疗药物联合用药已经显现出越来越浓厚的兴趣。 联合药物治疗主要包括不同化疗药物的联合以及基因药物与化疗药物的联合。然而，联合用药的发展却受制于多次给药和繁琐的药物系统构建，特别是基因药物和化疗药物联合用药，需要分别构建系统来进行运载药物。因此，肿瘤联合用药成功的一个关键手段就是设计简单高效、高载药量的基因药物联合递释系统，在提高肿瘤治疗效果的同时，逆转耐药性并且降低毒副作用。目前，有研究利用胶束，脂质体和纳米粒等，将基因药物和化疗药物递送至发挥作用的位点，发挥作用，并且相互促进得到联合治疗效果，如；将抗肿瘤化疗药物阿霉素、肉红霉素或5—氟尿嘧啶插入到基因的碱基对形成复合物，该复合物可在血液中保持相对完整，阿霉素不会泄露。但较成功的一个载体可以同时递送基因药物和化疗药物的递送系统仍然很少。有文献报道将高分子材料作为基因药物载体，树枝状高分子材料如聚酰胺一胺树状分枝物(polyamidoamine dendrimer,简称 PAMAM)和聚赖氨酸(dendri-graft polylysines,简称DGL)是近年来出现的纳米级的合成高分子，高度分枝，呈单分散性，其末端氨基丰富，并易于经过适当的修饰连接靶向头基等生物活性物质，有望成为良好的药物载体，而由于这些树枝状高分子载体表面的氨基在生理条件下质子化，带正电荷，因此可考虑作为非病毒载体材料携载基因药物。主动靶向是构建靶向递释系统的一个主要策略，利用特定的头基修饰系统，特异性结合特定细胞表面过度表达的受体以达到靶向输送的作用。研究显示，肿瘤细胞表面过度表达一系列受体，其中转铁蛋白受体被用作靶点已有较长的研究历史。但是，内源性转铁蛋白(transferrin，简称为Tf)浓度很高，约为25 mM，可与以转铁蛋白作为靶向头基的给药系统竞争肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体，从而影响肿瘤靶向效率。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术中的不足，提供一种肿瘤靶向双载药递释系统，尤其涉及一种多肽修饰的肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统及其制备方法。本发明中，选用通过噬菌体展示技术筛选出的多肽修饰高分子材料，以多肽为靶向头基，高分子材料为基础高分子载体，通过静电作用与基因化疗药物复合物形成纳米递释系统。该递释系统以内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对载药递释系统的摄取，并且安全。具体而言，本发明的一种肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，其由高分子材料、聚乙二醇、多肽、治疗基因和化疗药物制成。本发明中，所述高分子材料与聚乙二醇的分子比为1 :2 1 :10 ；高分子材料与多肽的分子比为1 :1 1 :5 ；高分子材料与治疗基因的质量比为3 :1 10 1 ；治疗基因与化疗药物的分子比为0. 025 3000 8 :3000o本发明中，高分子材料为树枝状，其内部有空腔；本发明的一个实施例选用的高分子材料为聚酰胺一胺型树状分枝物和聚赖氨酸。本发明中，治疗基因包括编码人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白的基因(pORF-hTRAIL)以及其它所有具有抗肿瘤效果的基因；所述化疗药物包括阿霉素，柔红霉素和5—氟尿嘧啶等可以插入到基因碱基对的抗肿瘤化疗药物。所述的TRAIL蛋白能介导恶性肿瘤细胞的凋亡，其介导凋亡的机制是通过细胞表面凋亡受体调节的主动的外部的途径，这些凋亡受体在与凋亡配体结合后传导凋亡信号， 另一方面，化疗药物介导的凋亡是典型的内部途径，如基因严重损坏，低氧，或者其他的细胞应激，因此，本发明通过联合化疗药物和编码TRAIL蛋白的基因能得到协同的杀肿瘤细胞效果。本发明中，所述的载体系统采用多肽修饰树枝状高分子材料形成纳米粒，所述的多肽(T7)其氨基酸序列为HAIYPRH，该多肽为可特异性结合转铁蛋白受体的多肽，通过噬菌体展示技术筛选得到。本发明所述的多肽(T7)为小分子多肽，可化学合成，稳定性好，作为靶向头基空间位阻小；对转铁蛋白受体的亲和力和转铁蛋白相当，Kd值大约IOnM左右；多肽(T7)与转铁蛋白受体的结合位点与转铁蛋白不同，不与转铁蛋白竞争抑制且不影响转铁蛋白本身的生理功能，相反转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合会促进多肽(T7)的入胞效率。本发明中，所述聚乙二醇选自马来酰亚胺一聚乙二醇3 500—琥珀酰亚胺 (MAL-PEG3500-NHS)。本发明肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统适用于靶向人体来源和动物来源的肿瘤细胞及其它肿瘤细胞。本发明提供了多肽修饰的肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统的制备方法，其特征在于，其包括步骤
将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称取适量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料比例为1 :2 1 :10，一定温度下搅拌反应数小时即可；
将多肽溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，与高分子材料比例1 :1 1 :5，一定温度下反应对h，制得肿瘤靶向纳米载体， 转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)和多肽(T7)，pH值7. 4的磷酸盐缓冲液复溶； 将治疗基因溶解在50 mM硫酸钠溶液中，与化疗药物阿霉素，分子比例为0.025 3000 8 :3000，质量比例为2. 25 :58 720 :58，在pH值7. 4的磷酸盐缓冲液中复合，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物；
将肿瘤靶向载体加入以质量比为3 1,6 1,10 1 (基础载体比基因)到基因阿霉素复合物溶液中，并立即涡旋30 s，即得肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统。本发明的肿瘤靶向双载药递释系统利用肿瘤靶向非病毒载体携载基因的方法，携载基因药物和化疗药物的复合物，并将复合物输送至肿瘤细胞；这些复合物在进入细胞后， 转移至细胞核，并介导肿瘤细胞的凋亡。具有转铁蛋白作为靶向头基的优点，并且有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和治疗效率高、制备简捷，可以较广泛应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。本发明的突出优点及有益效果是，
1)利用阿霉素可以插入到治疗基因双链中，形成基因阿霉素复合物，使得正电性的高分子材料可以通过静电作用同时携载两种药物，发挥协同效果；
2)可特异性结合肿瘤细胞表面转铁蛋白受体的新型多肽(T7)修饰高分子材料，静电结合基因化疗药物复合物制成肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统，使载药递释系统的分布具有了多肽(T7)的肿瘤靶向特征和细胞摄取特征，提高肿瘤细胞的摄取效率和肿瘤的治疗效率。3)制备方法简单，不需要特殊的处理，可直接用于细胞和动物试验；
4)本药物双载药递释系统由于系统中多肽修饰的作用，赋予了载药递释系统进入肿瘤细胞的能力，并且治疗基因和化疗药物不同机制抑制肿瘤细胞生长，提高了载药递释系统对肿瘤的治疗效率。
图1是阿霉素荧光光谱表征阿霉素与基因不同比例复合。图2是凝胶电泳考察载体对基因阿霉素复合物的迁移影响。M 基因标记物；A 裸基因；B 游离阿霉素；C 基因阿霉素复合物；D，E和F 载体与基因质量比分别为3 1,6 :1， 10 1的非靶向系统PAMAM/DNA-D0X。图3是体外考察阿霉素自游离阿霉素、基因阿霉素复合物、非靶向系统PAMAM/ DNA-DOX中的释放行为。图4倒置荧光显微镜观察肝肿瘤细胞Bel-7402对非靶向载体(PAMAM和 PAMAM-PEG)以及靶向载体(PAMAM-PEG-T7)携载的基因阿霉素复合物的摄取；绿色表示荧光探针(Y0Y0-1)标记的基因，红色表示阿霉素。图5是倒置荧光显微镜观察分别给予Bel-7402肿瘤细胞孵育载绿色荧光蛋白报告基因非靶向系统(PAMAM/pEGFP-N2和PAMAM_PEG/pEGFP_N2)，载阿霉素和绿色荧光蛋白报告基因非靶向系统(PAMAM/pEGFP-N2-D0X和PAMAM-PEG/pEGFP-N2_D0X)，载绿色荧光蛋白报告基因靶向系统(PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2)以及载阿霉素和绿色荧光蛋白报告基因靶向系统(PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2-D0X) 2 h后绿色荧光蛋白的表达情况；其中设立共同孵育转铁蛋白(血浆浓度25 μΜ)的对照组，绿色表示绿色荧光蛋白，放大倍数为100倍。
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图6是分别给予Bel-7402肿瘤细胞载阿霉素和对照基因非靶向系统(PAMAM-PEG/ PGL2-D0X )、载阿霉素和对照基因靶向系统(PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X )、载治疗基因非靶向系统(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL)、载治疗基因靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF_hTRAIL)、载阿霉素和治疗基因非靶向系统(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL-DOX)和载阿霉素和治疗基因靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X)孵育2 h，再换成培养基孵育48 h，然后用凋亡检测试剂盒(AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit)标记不同凋亡时期的细胞，倒置荧光显微镜观察细胞凋亡情况，设立共同孵育转铁蛋白(血浆浓度25 μ Μ)的对照组；绿色代表早期凋亡时细胞膜上的磷脂酰丝氨酸；红色代表晚期凋亡或者死细胞中碘化吡啶标记的细胞核。放大倍数为200倍。图7是皮下移植瘤裸鼠模型给予荧光标记的载阿霉素和对照基因的非靶向系统(PMAM-PEG/pGL2-D0X,每张照片中左边动物)和载阿霉素和对照基因的靶向系统 (PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X，每张照片中右边动物)，给药系统静脉注射后1 h，4 h和8 h采用荧光活体成像系统拍照，红色代表荧光标记的对照基因。绿色代表近红外探针标记的基础载体(PAMAM)。图8 (A)是观察各给药系统皮下移植瘤裸鼠模型瘤体积的抑制情况。静脉注射载阿霉素和对照基因非靶向系统(PAMAM-PEG/pGL2-D0X)、载阿霉素和对照基因靶向系统 (PAMAM-PEG-T7/pGL2 -DOX )、载治疗基因非靶向系统(PAMAM-PEG/pORF-hTRAI L )、载治疗基因靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL )、载阿霉素和治疗基因非靶向系统(PAMAM-PEG/ p0RF-hTRAIL-D0X)和载阿霉素和治疗基因靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X)后， 给药系统的剂量是每次4 μ g/鼠，大约0.16 yg/kg，市售组盐酸阿霉素剂量为5 mg/kg; 各给药系统分别给药3次，每隔7天一次，分别是第O天，第7天和第14天；女P < 0.05和 ★★ P < 0.01分别表示市售的盐酸阿霉素、载阿霉素和治疗基因的靶向系统抑制瘤生长对其它组的显著性差异，(B)是在体内肿瘤抑制实验过程中给药系统和市售阿霉素对动物体重的影响，箭头代表了给药的日程。
具体实施例方式实施例1.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1 :2，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，核磁共振氢谱表征载体的合成。实施例2.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1 :2，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1 :1，室温搅拌反应M h，MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的多肽(T7)，核磁共振氢谱表征靶向载体的合成。实施例3.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例4.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成0.05 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为0.025 :3000，质量比为2. 25 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例5.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成0. 1 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为0.05 :3000，质量比为4. 5 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例6.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成0.2 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为0. 1 :3000，质量比为9 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例7.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成0.5 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为0.25 :3000，质量比为22. 5:58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例8.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成1 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为0. 5 :3000，质量比为45 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例9.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成2 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为1 :3000，质量比为90 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光
■；並实施例10.
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成4 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为2 :3000，质量比为180 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例11
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成8 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为4 :3000，质量比为360 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例12
取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为8 :3000，质量比为720 :58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，采用LS-55荧光分光光谱仪480 nm激发，520-680 nm范围内检测阿霉素的荧光发射光谱。实施例13.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液复溶，制成载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值为 7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为8 :3000，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，涡旋30 s，制成载阿霉素和基因的非靶向系统。
实施例14.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液复溶，制成载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值为 7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为8 :3000，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为3 1,6 1和12 :1，涡旋30 s，制成载阿霉素和基因的非靶向系统PAMAM/DNA-D0X。称取0.14 g琼脂糖于三角烧瓶中，加入电泳液IX TAE，加入10 μ 1 500 ug/ml溴乙啶，微波加热至沸，使琼脂糖完全溶解，室温放置约50度，倒入电泳槽中，置入梳子，冷凝成凝胶。将各组样品加入至凝胶中，开启电源，电压为100 V，约25 min停止，紫外灯下观察载体对基因阿霉素复合物迁移的影响。实施例15.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液复溶，制成载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值为 7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为8 :3000，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为3:1，涡旋30 s，制成载阿霉素和基因的非靶向系统PAMAM/DNA-D0X。采用透析法模拟游离阿霉素和基因阿霉素复合物在体内生理环境的释放行为，基因阿霉素复合物溶液(50 Ug阿霉素/ml，400 μ 1)置于透析袋中(MWC0 ；3500)，并立即扎紧，置于20 ml !1值为7.4 的磷酸盐缓冲液中。不同时间点取样，微板读数仪537 nm激发，584 nm发射测定不同时间阿霉素的释放情况。考察阿霉素自非靶向系统PAMAM/DNA-D0X，将PAMAM/DNA-D0X置于离心管中，37度震荡，不同时间点直接测量。实施例16
人肝癌细胞(Bel-7402)培养在RPMI 1640的培养里，并添加10%热灭活胎牛血清，100 单位/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素，在37度5% 二氧化碳湿度条件下培养。实施例17
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg 聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1 2，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min 去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.10 mg多肽(T7， 2 mg/ml pH 7. 0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1 :1，室温搅拌反应M h，MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽 (PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的多肽(T7)，制成靶向载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4 的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于离心管中。将治疗基因(pORF-hTRAIL)用绿色荧光探针(YOYO-I)标记，并溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为8 :3000，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载阿霉素和治疗基因的靶向系统 PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X 以及非靶向系统(PAMAM/pORF-hTRAIL-DOX 和 PAMAM-PEG/ pORF-hTRAIL-DOX)。将5万个Bel_7402细胞培养在M孔板上，48 h后显微镜下观察融合度，给予上述基因荧光标记的载阿霉素和治疗基因的给药系统孵育30 min，用hanks液替换掉药液，荧光显微镜下观察各组治疗基因和阿霉素的摄取情况。实施例18
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg 聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1 2，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min 去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.10 mg多肽(T7， 2 mg/ml pH 7. 0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1 :1，室温搅拌反应M h，MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽 (PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的多肽(T7)，制成靶向载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值为7. 4 的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于离心管中。将绿色荧光蛋白报告基因(PEGFP-N2)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成43. 2 μ g/ml，将载体溶液加入到基因溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载报告基因的靶向系统 (PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2)以及非靶向系统(PAMAM_PEG/pEGFP_N2)。将绿色荧光蛋白报告基因(PEGFP-N2)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成43. 2 yg/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素质量比为720:58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载阿霉素和报告基因的靶向系统(PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2-D0X)以及非靶向系统(PAMAM-PEG/pEGFP-N2-D0X)。将5万个Bel_7402细胞培养在M孔板上，48 h后显微镜下观察融合度，给予上述载阿霉素和报告基因以及单纯载报告基因的给药系统孵育2 h，用培养基替换掉药液，继续孵育，48 h后荧光显微镜下观察各组基因表达出的绿色荧光蛋白的情况。实施例19
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1 :2，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1 :1，室温搅拌反应M h，MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的多肽(T7)，制成靶向载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于离心管中。将对照基因(pGL2)溶解在50 mM 硫酸钠溶液中，稀释成43. 2 yg/ml，取0.5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素质量比为720:58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载阿霉素和对照基因的靶向系统PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X以及非靶向系统(PAMAM-PEG/pGL2_D0X)。 将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，将载体溶液加入到基因溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载治疗基因的靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL)以及非靶向系统(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL)。将治疗基因 (pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为8 :3000，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为 3 1,涡旋30 s，制成载阿霉素和治疗基因的靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X) 以及非靶向系统(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL-DOX)。将5万个Bel_7402细胞培养在M孔板上，48 h后显微镜下观察融合度，给予上述载阿霉素和对照基因、载治疗基因以及载阿霉素和治疗基因的给药系统孵育2 h，用培养基替换掉药液，继续孵育，48 h后给予凋亡检测试剂盒进行检测(Apoptosis Detection Kit)，荧光显微镜下观察各组细胞的死亡情况，初步评价治疗基因(pORF-hTRAIL)和阿霉素之间是否存在协同抑瘤效果。实施例20
构建皮下移植瘤裸鼠模型，采用4周大的雄性裸鼠，体重在16 18 g，培养与SPF级环境，将300万的Bel-7402人肝癌细胞接种于裸鼠皮下股骨近端区域，并采用肿瘤体积，动物体重等评价构建的模型。实施例21
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入近红外荧光探针NIP783(MW 900,0. 31 mg)，使基础载体与荧光探针的分子比为1 :5，在0. 1 M pH值为 8. 3的HEPES缓冲液中室温反应1 h，透析法纯化制得荧光标记的基础载体；加入0. 73 mg 聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1 :2， 于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PE(^2)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1 :1，室温搅拌反应M h，MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7) 复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的多肽(T7)，制成靶向载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于离心管中。将对照基因(pGL2)预先用荧光探针单叠氮化溴化乙锭标记，在紫外灯下活化1 h，使荧光探针插入到基因内部，并形成共价连接，然后采用70%乙醇沉淀法收集荧光标记的基因；将荧光标记的对照基因溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成43. 2 μ g/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素质量比为720:29，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载
11体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载阿霉素和对照基因的靶向系统(PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X)以及非靶向系统(PAMAM-PEG/ PGL2-D0X)。观察已构建的裸鼠皮下移植瘤模型，待瘤半径不小于0.5 cm时，尾静脉注射荧光标记的载阿霉素和对照基因的给药系统，观察阿霉素、基因和载体在体内的分布情况。实施例22
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1 :2，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1 :1，室温搅拌反应M h，MAL基团与多肽(T7)半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的多肽(T7)，制成靶向载体溶液。取适量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于离心管中。将对照基因(pGL2)溶解在50 mM 硫酸钠溶液中，稀释成43. 2 yg/ml，取0.5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素质量比为720:58，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载阿霉素和对照基因的靶向系统PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X以及非靶向系统(PAMAM-PEG/pGL2_D0X)。 将治疗基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，将载体溶液加入到基因溶液中，使基础载体与基因质量比为3 :1，涡旋30 s，制成载治疗基因的靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL)以及非靶向系统(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL)。将治疗基因 (pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸钠溶液中，稀释成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使与阿霉素的摩尔比为8 :3000，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素复合物，将载体溶液加入到基因阿霉素复合物溶液中，使基础载体与基因质量比为 3 :1，涡旋30 s，制成载阿霉素和治疗基因的靶向系统(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X) 以及非靶向系统(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL-DOX)。观察已构建的裸鼠皮下移植瘤模型，待瘤体积约为150 mm3时，尾静脉注射各组载药的靶向系统和非靶向系统，观察阿霉素和治疗基因之间是否存在协同抑瘤效果。设立阴性对照组，并市售的临床药物盐酸阿霉素作为阳性对照，剂量约是给药系统的30倍左右。本发明实验结果显示，
本发明利用阿霉素可以插入到治疗基因双链中，形成基因阿霉素复合物，使得正电性的高分子材料可以通过静电作用同时携载两种药物，发挥协同效果；所制得的肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统，使载药递释系统的分布具有了多肽(T7)的肿瘤靶向特征和细胞摄取特征，提高肿瘤细胞的摄取效率和肿瘤的治疗效率；载药递释系统具有进入肿瘤细胞的能力，由于治疗基因和化疗药物不同机制抑制肿瘤细胞生长，提高了载药递释系统对肿瘤的治疗效率。
权利要求
1.一种肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，其由高分子材料、聚乙二醇、多肽、治疗基因和化疗药物制成；所述高分子材料与聚乙二醇的分子比为1 :2 1 :10 ；高分子材料与多肽的分子比为 1 :1 1 :5 ；高分子材料与治疗基因的质量比为3 :1 10 1 ；治疗基因与化疗药物的分子比为 0. 025 3000 8 :3000ο
2.按权利要求1所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的高分子材料为聚酰胺一胺型树状分枝物和聚赖氨酸。
3.按权利要求1或2所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的高分子材料为树枝状，其内部有空腔。
4.按权利要求1所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的治疗基因选自编码人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的基因或其它所有具有抗肿瘤效果的基因。
5.按权利要求1所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的化疗药物选自阿霉素，柔红霉素或5—氟尿嘧啶或其他可以插入到基因碱基对的抗肿瘤化疗药物。
6.按权利要求2所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的载体系统采用多肽修饰树枝状高分子材料形成纳米粒。
7.按权利要求1所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的多肽其氨基酸序列为HAIYPRH。
8.按权利要求7所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的多肽特异性结合转铁蛋白受体。
9.按权利要求1所述的肿瘤靶向双载药递释系统，其特征在于，所述的聚乙二醇选自马来酰亚胺一聚乙二醇3500—琥珀酰亚胺。
10.权利要求1所述的肿瘤靶向双载药递释系统在用于摄取人体来源和动物来源的肿瘤细胞及其它癌细胞中的用途。
11.权利要求1的肿瘤靶向双载药递释系统的制备方法，其特征在于，其包括步骤将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称取适量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料比例为1 :2 1 10，一定温度下搅拌反应数小时；将多肽溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，与高分子材料比例1 :1 1 :5，一定温度下反应对h，制得肿瘤靶向纳米载体， 转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的聚乙二醇和多肽， PH值7. 4的磷酸盐缓冲液复溶；将治疗基因溶解在50 mM硫酸钠溶液中，与化疗药物，分子比例为0. 025 3000 8 3000，质量比例为2. 25 58 720 :58，在pH值7. 4的磷酸盐缓冲液中复合，室温条件下涡旋1 min，孵育30 min，制成基因化疗药物复合物；将肿瘤靶向载体加入基础载体与基因质量比为3 :1，6 1,10 :1到基因化疗药物复合物溶液中，涡旋30 s，制得肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向双载药递释系统及其制备方法。本发明采用高分子材料、聚乙二醇、多肽、治疗基因和化疗药物，以多肽为靶向头基，高分子材料为基础高分子载体，将化疗药物阿霉素等插入到治疗基因双链中形成基因化疗药物复合物，然后与高分子载体通过静电作用，制成肿瘤靶向治疗基因与化疗药物双载药递释系统。本发明选用通过噬菌体展示技术筛选出的新型多肽修饰高分子材料，以内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对基因和化疗药物的摄取，并且具有安全性高的特点。本发明使用的靶向头基多肽(T7)具有转铁蛋白的优点，并且可有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和治疗效率高、制备简捷，可以进一步开发应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。
文档编号A61K47/42GK102397554SQ201010286479
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者蒋晨, 韩亮, 黄容琴 申请人:复旦大学