专利名称：一种减毒活疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗，尤其涉及一种减毒活疫苗及其应用。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌(enterohermorrhangicE. coli，EHEC)0 157:H7 (EHEC0157)是 一种重要的人畜共患传染病病原，其感染已成为全球性的公共卫生问题。自1982年该菌首 次被确认为严重致病菌以来，全球很多国家和地区包括中国都多次爆发流行。EHEC 0157感 染宿主可导致腹泻、出血性肠炎、溶血尿毒综合症等疾病和严重并发症。由于抗生素治疗可 加剧感染病情的危险，目前尚无有效的预防和控制措施。EHEC 0157菌培养容易、感染力强、 传播途径多样，使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂，EHEC 0157菌 的烈性致病因子还有可能用于基因武器的构建。美国疾病控制中心已将其列为B类生物恐 怖病原体严加防范。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发，研制EHEC 0157疫苗， 加强其防控研究具有重大的战略意义。EHEC 0157引起宿主严重的感染性疾病主要通过三个方面来实现的。1)志贺毒 素(Shiga toxin, Stx)志贺毒素在细胞表面受体结合介导下进入细胞，抑制细胞蛋白质的 合成，最终导致组织严重病理损伤，引发感染性疾病；2)EHEC0157通过表面抗原和炎症刺 激因子(OmpA、intimin等)的作用，诱导肠道感染部位剧烈炎症反应，导致电解质平衡紊 乱；3)粘附与擦拭损伤(Attaching andeffacing lesions, A/E lesions):细菌紧密粘附 于肠上皮细胞表面，通过一系列信号转导蛋白的相互作用(intimin-Tir，Tir-Cortactin, TCCP-N-WASP等)，引起细菌粘附部位肌动蛋白的聚集，导致微绒毛破坏、刷状缘损伤等肠 上皮细胞特征性病例改变，细胞屏障功能破坏，引发感染性疾病。OmpA、htimin和Stx2B为肠出血性大肠杆菌0157:H7的重要致病因子，同时 也是细菌的保护性抗原，目前已经有证据表明体内的抗OmpACTorres AG, Kaper JB et al.Infect Immun 2003 Sep ；71 (9) :4985-95.)、抗intimin(Gu,J. , Y. Liu,etal. _Microbes Infect 2009 11(10-11) :835-841)禾口 抗 Stx2B(Ma，Y.，X. Mao，et al. Immunol Lett 2008121(2) :110-115.)的抗体能够保护致死剂量的肠出血性大肠杆菌0157:H7的感染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种减毒活疫苗，其保藏号为CCTCC M 2010185。所述减毒活疫苗，包含肠出血性大肠杆菌0157:H7的抗原。所述抗原具有抗原OmpA、Intimin和Mx2B。减毒活疫苗在制备预防肠出血性大肠杆菌0157:H7感染的制剂中的应用。所述应用中的减毒活疫苗诱导产生保护性的抗OmpA、Intimin和Mx2B的抗体。EHEC 0157菌本身培养方便，经济。在经保藏号为CCTCC M 2010185的减毒活疫苗 免疫的小鼠血清中检测到明显的抗肠出血性大肠杆菌0157:H7菌株的抗体，且小鼠经过强 毒株攻毒时具有一定的保护性。
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本发明所述的减毒活疫苗菌株制备方便，本身带有肠出血性大肠杆菌0157:H7的 全部抗原，能够刺激系统性抗肠出血性大肠杆菌0157:H7免疫反应，具有较好的保护性效果。本发明所述的减毒活疫苗已于2010年7月23日保藏，其保藏号为CCTCCN0 M2010185 ；保藏单位中国典型培养物保藏中心；地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大 学；分类命名肠出血性大肠杆菌 EHEC0157:H700B015 (Enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC 0157:H700B015)
具体实施例方式下面提供的实施例用于进一步阐明本发明，而不构成对本发明范围的限制。实施例1肠出血性大肠杆菌0157:H7菌株00B015(保藏号为CCTCC M 2010185) 刺激的免疫反应1实验方法1)肠出血性大肠杆菌0157:H7菌株00B015的分离鉴定肠出血性大肠杆菌0157:H7菌株00B015分离自江苏疾控中心普通腹泻病人，其分 离和鉴定的方法参照《全国肠出血性大肠杆菌0157:H7区监测方案(试行)》执行，菌种保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010185。2)将20只6周龄Balb/c小鼠平均分为2组，每组10只，各组小鼠在口服接种前， 禁食一夜，禁水4h。先给予3%碳酸氢钠溶液300ul灌胃，中和胃酸，防止胃酸对菌株的破 坏，20min后，取300ul上述制备好的菌液喂饲各组小鼠(约1 X IO9CFU/只)，30min后给小 鼠恢复进食。0、14、28d各喂饲一次，共3次。分别在喂饲前，喂饲2次和喂饲3此后7天从 尾静脉采取小鼠血清，保存-80°C备用。3)ELISA检测喂饲后小鼠血清中抗肠出血性大肠杆菌主要免疫原OmpA、Intimin 和Mx2B的抗原特异性IgG水平按照文献的方法制备纯化的免疫原OmpA、Intimin和Stx2B (Torres AG, Kaper JB et al. Infect Immun 2003 Sep ；71 (9) :4985-95, Gu, J. , Y.Liu, et al. _MicrobesInfect 2009 11(10-11) :835-841)。从小鼠尾静脉采集静脉血，1 100开始以生理盐水倍比稀释 待检血清，按100 μ 1/孔加入相应抗原蛋白包被的ELISA板，37°C放置lh，PBS-Tween20洗4 次，100 μ 1/孔加入HR标记的羊抗鼠IgG(l 20000)，37°C放置lh, PBS_Tween20洗4次， 加入OPD底物显色液，室温避光反应15min，2mol/L H2SO4终止反应，以PBS孔作空白对照， 492nm测定各孔OD值。OD样品与OD _之比彡2. 1者为阳性。2实验结果三次口服后小鼠血清抗OmpA抗体的变化
权利要求
1.一种减毒活疫苗，其保藏号为CCTCC M 2010185。
2.根据权利要求1所述的减毒活疫苗，其特征在于，包含肠出血性大肠杆菌0157:H7的 抗原。
3.根据权利要求2所述的减毒活疫苗，其特征在于，所述抗原具有抗原OmpA、Intimin 和 Stx2B0
4.权利要求1所述的减毒活疫苗在制备预防肠出血性大肠杆菌0157:H7感染的制剂中 的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的减毒活疫苗诱导产生保护性的抗 OmpA、Intimin 禾口 Stx2B 的抗体。
全文摘要
本发明提供一种减毒活疫苗及其应用。该减毒活疫苗的保藏号为CCTCC M2010185。其为无毒的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株，含有肠出血性大肠杆菌O157:H7的抗原。本发明所述的减毒活疫苗菌株可以用于制备预防肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的制剂。本发明所述的减毒活疫苗菌株制备方便，本身带有肠出血性大肠杆菌O157:H7的全部抗原，能够刺激系统性抗肠出血性大肠杆菌O157:H7免疫反应，具有良好的保护性效果。
文档编号A61K39/02GK102114241SQ20101029214
公开日2011年7月6日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者朱凤才, 毛旭虎, 邹全明, 顾江 申请人:中国人民解放军第三军医大学