专利名称：鸡新城疫活疫苗的生产方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物疫苗的生产方法，尤其涉及鸡新城疫活疫苗的生产方法以及由该生产方法得到的鸡新城疫活疫苗，属于鸡新城疫活疫苗的生产领域。
背景技术：
中国目前生产鸡新城疫低毒力活疫苗所用的是SPF鸡胚。目前国内SPF鸡胚的生产能力和质量状况制约畜禽生物制品的生产。用SPF鸡胚生产鸡新城疫活疫苗成本高，劳动利用率低，且易造成外源病毒污染，批间差异大，给疫苗产量、效力的提高带来困难。此外，疫苗效价的高低是疫苗合格与否的关键指标，现有技术中对鸡新城疫疫苗效价的测定一直沿用SPF鸡胚法(EID5tl),用效价测定方法存在测毒不能准确定量，测毒结果易受鸡胚个体差异和培养条件影响，试验周期长、费时费力等缺陷，急需改进。
发明内容
本发明主要目的是克服现有的鸡新城疫活疫苗生产方法所存在的不足，提供一种利用细胞系生产鸡新城疫活疫苗的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种鸡新城疫活疫苗的生产方法，包括以下步骤(I)鸡胚培养的鸡新城疫弱毒接种传代细胞系，加入病毒生长液进行培养，得到细胞适应疫苗种毒；(2)将细胞适应疫苗种毒接种传代细胞系，加入病毒培养维持液进行培养，收获增殖病毒悬液；(3)测定增殖病毒悬液的毒价，将毒价检测合格的增殖病毒悬液进行配苗、分装及冻干，即得。本发明首先将鸡新城疫弱毒La sota株接种不同传代细胞系，至37°C培养30 40小时，收获病毒液；将收获的病毒液继续传代，直至3 5代内出现细胞病变，筛选病毒可在哪些细胞系中增殖。实验结果显示新城疫弱毒疫苗株可在MDCK细胞系、vero细胞系， marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系或MDBK细胞系上进行增殖。此外，本发明将不同鸡新城疫弱毒分别接种不同的传代细胞系，实验结果发现，能在MDCK细胞系、vero细胞系，marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系或MDBK细胞系上进行增殖的新城疫弱毒有La sota株，ZMlO株、HB92株、CS2株、HBl株和BI株等新城疫弱毒株。步骤(I)中，优选的，将鸡胚培养的鸡新城疫弱毒按感染复数O. 01-0. 5M0I接种单层传代细胞系，加入病毒生长液进行培养；其中，所述的培养包括培养接种至70-100% (优选80-90% )的细胞发生病变时收获病毒液；收获的病毒液以同样的方法接种细胞，如此进行2-4代获得细胞适应疫苗种毒。步骤(I)中所述病毒生长液的组成包括94% -95% MBl液或DiffiM液、5% -6%犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7. 0-7. 2。优选的，步骤(2)中将细胞适应疫苗种毒按感染复数O. 01-0. 5M0I接种单层传代细胞系(更优选的，将细胞适应疫苗毒按感染复数O. 1-0. 5M0I接种单层传代细胞系)，加入病毒生长液，培养32 40小时，收获病毒液。其中，所述病毒培养维持液中的胰酶浓度优选为 I. 5-2. 5ug/ml,更优选为 2. Oug/ml。步骤(2)中所述病毒培养维持液的组成包括含O. 05 3ug/ml胰酶的无血清MEM 液或DMEM液、加适量的抗菌素，pH值调整为7. O 7. 2。步骤(3)中优选采用半数组织感染量(TCID5tl)方法测定增殖病毒悬液的毒价；毒价合格的增殖病毒悬液每Iml含病毒> IO7 0TCID50 ;其中，所述半数组织感染量(TCID5tl)测定方法包括a.准备细胞培养板选取生长良好的上述细胞系，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，调整细胞密度为I. 5 3. 5 X IO5个/ml，以IOOul/孔接入96孔细胞培养板；b.疫苗毒样品的稀释和接种将要滴定的鸡新城疫疫苗病毒悬液用病毒生长液作10倍倍比稀释；将生长3天的96孔细胞培养板甩掉培养液，每孔加入200 μ I PBS,洗2 次。每个细胞培养孔接入100 μ I样本，每个稀释度6 8个重复；c.加入ΙΟΟμ I培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照；在37°〇±1°C， 4 6% CO2培养箱中培养3 5天；d.将96孔细胞培养板中液体每孔吸取25 μ I转移96孔V型血凝板，孔孔对应。 在96孔V型血凝板每孔加25 μ I O. 5%鸡红细胞，室温作用20-25分钟；e.读板，观察每孔的凝集。在记录纸上记录每个稀释度的阳性孔数，并应用 Spearman Karber方法并计算病毒滴度。步骤(3)中所述的配苗、分装及冻干包括将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每羽份含细胞毒液不少于
0.001ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。每羽份疫苗含病毒≥IO6TCID500与现有技术相比，本发明鸡新城疫活疫苗的生产方法主要具有以下有益效果(I)本发明鸡新城疫活疫苗的生产方法用细胞系代替SPF鸡胚制造鸡新城疫低毒力活疫苗，可解决禽源外源病原污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。(2)本发明生产方法用细胞系代替SPF鸡胚制造鸡新城疫低毒力活疫苗，可摆脱使用SPF鸡胚产量低的限制，有效的提高疫苗的产量，大大降低生产成本。采用细胞系生产的鸡新城疫低毒力活疫苗，经免疫攻毒试验结果显示，对鸡新城疫强毒攻击可100%保护。(3)本发明用细胞系生产的鸡新城疫低毒力活疫苗各批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、易操作、产量大、成本低等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。本发明鸡新城疫活疫苗的生产方法具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高， 批间差异小，质量易控，能够快速、准确的测定疫苗效价等优点，本发明生产方法可显著提高疫苗产量和质量，所生产的鸡新城疫弱毒活疫苗安全性好、免疫效力高，对鸡新城疫强毒攻击具有完全的免疫保护作用。
图I鸡新城疫弱毒疫苗细胞病变结果a :鸡新城疫弱毒疫苗样品；b :阴性对照。图2试验动物免疫后NDV HI抗体变化曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。病毒生长液的组成94% -95% MEM液或DMEM液、5% _6%犊牛血清、加适量的抗菌素(青霉素100单位/ml，链霉素为100yg/ml)，pH值调整为7. 0-7.2。病毒培养维持液的组成含2. Oug/ml胰酶的无血清MEM液或DMEM液、加适量的抗菌素(青霉素100单位/ml，链霉素为100yg/ml)，pH值调整为7. O 7. 2。实施例IMDCK细胞系作为制苗用细胞生产新城疫弱毒活疫苗(I)选择MDCK细胞系(购自美国ATCC公司)作为制苗用细胞；(2)制苗用细胞的传代与培养上述MDCK细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，37°C，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；(3)细胞毒种的繁殖生长良好的上述MDCK细胞系单层用细胞维持液或PBS洗2 次，将细胞种毒(新城疫弱毒La sota株；购自中国兽医药品监察所)接种上述细胞系单层，37°C感作I小时；加入病毒培养维持液37°C继续培养，32-40小时细胞80%脱落时收获病毒培养维持液作为细胞适应疫苗种毒；细胞适应疫苗种毒鉴定结果毒种鉴定完全符合新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程毒种标准，对鸡安全无副作用，细胞毒种每Iml含病毒> IO8-2TCID50 ；(4)制苗毒液的繁殖取已形成良好单层的MDCK细胞系培养瓶，弃去细胞生长液， 用细胞维持液或PBS洗2次，将上述细胞适应疫苗种毒接种MDCK细胞系单层，37°C感作I 小时；加入细胞维持液继续培养，30 40小时细胞80%脱落时收细胞培养毒液；收获的毒液置-15°C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对鸡安全无副作用，每Iml含病毒> IO8-2TCID50 ；(5)配苗、分装及冻干半数组织感染量(TCID5tl)方法测定增殖病毒悬液的毒价
a.准备细胞培养板选取生长良好的上述细胞系，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，调整细胞密度为I. 5 3. 5X IO5个/ml，以IOOul/孔接入96孔细胞培养板。
b.疫苗毒样品的稀释和接种将要滴定的鸡新城疫疫苗病毒悬液用病毒生长液作10倍倍比稀释；将生长3天的96孔细胞培养板甩掉培养液，每孔加入200 μ I PBS，洗2次。每个细胞培养孔接入100 μ I样本，每个稀释度6 8个重复。加入100 μ I培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照；在37°C ± 1°C，4 6% CO2培养箱中培养3 5天；d.将 96孔细胞培养板中液体每孔吸取25 μ I转移96孔V型血凝板，孔孔对应。在96孔ν型血凝板每孔加25 μ I O. 5%鸡红细胞，室温作用20-25分钟。读板，观察每孔的凝集。在记录纸上记录每个稀释度的阳性孔数，并应用Spearman Karber方法并计算病毒滴度。增殖病毒悬液的毒价测定结果本实施例所制备的增殖病毒悬液每Iml含病毒≥ IO8-2TCID50 ；将毒价检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每羽份含细胞毒液不少于O. 001ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。成品检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，均符合“鸡新城疫活疫苗”规定，对鸡安全无副作用。每羽份疫苗含病毒> IO8-2TCID500本实施例共制备出3批鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，批号分别定为200901、200902、200903，制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。实施例2νθ ·ο细胞系作为制苗用细胞生产新城疫弱毒活疫苗(I)选择veix)细胞系(购自美国ATCC公司)作为制苗用细胞；(2)制苗用细胞的传代与培养上述vero细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，37°C，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；(3)细胞毒种的繁殖生长良好的上述vero细胞系单层用细胞维持液或PBS洗2 次，将接细胞种毒(ZM10株；购自中国兽医药品监察所)接种上述细胞系单层，37°C感作I 小时；加入病毒培养维持液37°C继续培养，30-40小时细胞80%脱落时收病毒培养维持液作为细胞适应疫苗种毒生产用毒种；细胞适应疫苗种毒鉴定细胞毒种鉴定完全符合新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程毒种标准，对鸡安全无副作用，细胞毒种每Iml含病毒> IO7-8TCID50 ；(4)制苗毒液的繁殖取已形成良好单层的上述vero细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，用细胞维持液或PBS洗2次，将上述细胞适应疫苗种毒接种上述细胞系单层，37°C感作I小时；加入细胞维持液继续培养，30 40小时细胞80%脱落时收细胞培养毒液；收获的毒液置-15°C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对鸡安全无副作用，每Iml含病毒> IO7-8TCID50 ；(5)配苗、分装及冻干半数组织感染量(TCID5tl)方法测定增殖病毒悬液的毒价
a.准备细胞培养板选取生长良好的上述细胞系，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，调整细胞密度为I. 5 3. 5X IO5个/ml，以IOOul/孔接入96孔细胞培养板。
b.疫苗毒样品的稀释和接种将要滴定的鸡新城疫疫苗病毒悬液用病毒生长液作10倍倍比稀释；将生长3天的96孔细胞培养板甩掉培养液，每孔加入200 μ I PBS，洗2次。每个细胞培养孔接入ΙΟΟμ I样本，每个稀释度6 8个重复。加入100μ I培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照；在37°C ± 1°C，4 6% CO2培养箱中培养3 5天；d.将 96孔细胞培养板中液体每孔吸取25 μ I转移96孔V型血凝板，孔孔对应。在96孔ν型血凝板每孔加25 μ I 0.5%鸡红细胞，室温作用20-25分钟。读板，观察每孔的凝集。在记录纸上记录每个稀释度的阳性孔数，并应用Spearman Karber方法并计算病毒滴度。增殖病毒悬液的毒价测定结果本实施例所制备的增殖病毒悬液每Iml含病毒彡 IO7.8TCID50 ；将毒价检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每羽份含细胞毒液不少于0. 001ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
成品检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验均符合“鸡新城疫活疫苗”规定，对鸡安全无副作用。每羽份疫苗含病毒> IO7-8TCID500试验例I新城疫传代细胞系的筛选与鉴定一、试验材料I、细胞系MDCK细胞系、vero细胞系，marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系和 MDBK细胞系(购自美国ATCC公司)。2、鸡新城疫弱毒株La sota株，ZMlO株、HB92株、CS2株、HBl株和BI株(购自
中国兽医药品监察所)。将鸡新城疫弱毒La sota株接种不同传代细胞系，至37°C培养30 48小时，收获，将收获病毒继续传代，直至3 5代内出现细胞病变，判定病毒可在所用细胞中增殖，实验结果显示新城疫弱毒可在MDCK细胞系、vero细胞系，marc-145细胞系、ST细胞系、BHK 细胞系、MDBK细胞系上增殖。将不同鸡新城疫弱毒分别接种MDCK细胞系、vero细胞系，至37°C培养30 40小时，收获，将收获病毒继续传代，直至3 5代内出现细胞病变，判定该病毒可在所用细胞中增殖，实验结果显示能在MDCK细胞系、vero细胞系增殖的毒株为La sota株，ZMlO株、HB92 株、CS2株、HBl株和BI株。试验例2新城疫病毒培养条件的优化试验I 方法I. I接毒方式研究I. I. I同步接种选用生长良好的MDCK细胞(购自美国ATCC公司)2转瓶消化，按I : 3进行传代，其中I瓶作为阴性对照，2瓶传代后以MOI值0. I接种鸡新城疫病毒(鸡新城疫弱毒La sota株；购自中国兽医药品监察所)，置37°C转瓶机内进行培养，接种30 40小时后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID5tl)。1.1.2单层接种I. I. I消化传代的细胞中，2瓶待细胞长满单层后以MOI 0. I接种病毒，加入维持液，置37°C转瓶机内进行培养，接种30 40小时后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量 (TCID50)。I. 2M0I 研究选用生长良好的MDCK细胞，按MOI值O. 01，O. 05，O. 1,0. 3和O. 5接入病毒液，每个MOI值接种2个转瓶，同时设一个转瓶为阴性对照。接种30 40小时后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID5tl)。I. 3病毒收获时间的研究选生长良好的MDCK细胞，按MOI值0. I加入新城疫病毒液，分别在接毒后第12小时，16小时，20小时，24小时，28小时，32小时，36小时，40小时，44小时，48小时，52小时，
56小时取上清样品，测定病毒含量(TCID5tl)。I. 4病毒培养维持液中胰酶浓度的优化选择生长良好的MDCK细胞，按按MOI值0. I加入新城疫病毒液，感作一小时后，加入维持液，其中胰酶浓度分别为 0. 5ug/ml, I. Oug/ml, I. 5ug/ml, 2. Oug/ml, 2. 5ug/ml, 3ug/ml，接种30 40小时后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID5tl)。2试验结果2. I接毒方式研究结果表明，单层接毒方式新城疫病毒滴度高于同步接毒方式，详见表I。表I同步与单层接种比较结果
权利要求
1.一种鸡新城疫活疫苗的生产方法，包括以下步骤(I)鸡胚培养的鸡新城疫弱毒接种传代细胞系，加入病毒生长液进行培养，得到细胞适应疫苗种毒；(2)将细胞适应疫苗种毒接种传代细胞系，加入病毒培养维持液进行培养，收获增殖病毒悬液；(3)测定增殖病毒悬液的毒价，将毒价检测合格的增殖病毒悬液进行配苗、分装及冻干，即得。
2.按照权利要求I所述的生产方法，其特征在于步骤(I)中所述的鸡新城疫弱毒包括鸡新城疫弱毒La sota株、鸡新城疫弱毒ZMlO株、鸡新城疫弱毒HB92株、鸡新城疫弱毒 CS2株、鸡新城疫弱毒HBl株或鸡新城疫弱毒BI株。
3.按照权利要求I所述的生产方法，其特征在于步骤(I)中所述的细胞系包括MDCK 细胞系、vero细胞系、marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系或MDBK细胞系。
4.按照权利要求I所述的生产方法，其特征在于步骤(I)中将鸡胚培养的新城疫弱毒按感染复数O. 01-0. 5M0I接种单层传代细胞系，加入病毒生长液进行培养。
5.按照权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤(I)中所述的培养包括鸡胚培养的鸡新城疫弱毒接种传代细胞系，加入病毒生长液进行培养至70-100%的细胞发生病变时收获病毒液；收获的病毒液以同样的方法接种细胞，如此进行2-4代获得细胞适应疫苗种毒。
6.按照权利要求I所述的生产方法，其特征在于步骤(2)中将细胞适应疫苗种毒按感染复数O. 1-0. 5M0I接种单层传代细胞系，加入病毒生长液，培养32 40小时，收获病毒液。
7.按照权利要求I或6所述的生产方法，其特征在于所述病毒培养维持液中的胰酶浓度为 I· 5-2. 5ug/ml,优选为 2. Oug/ml。
8.按照权利要求I或6所述的生产方法，其特征在于步骤(3)中采用半数组织感染量方法测定增殖病毒悬液的毒价；步骤(3)中所述的配苗、分装及冻干包括将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇勻，定量分装；每羽份含细胞毒液不少于O. 001ml，分装后进行冷冻真空干燥后即得成品。
9.权利要求1-8任何一项所述生产方法得到的鸡新城疫活疫苗。
10.权利要求9所述的鸡新城疫活疫苗在制备预防或治疗鸡新城疫生物制剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种鸡新城疫活疫苗的生产方法，包括(1)鸡胚培养的鸡新城疫弱毒接种传代细胞系，加入病毒生长液进行培养，得到细胞适应疫苗种毒；(2)将细胞适应疫苗种毒接种传代细胞系，加入病毒培养维持液进行培养，收获增殖病毒悬液；(3)测定增殖病毒悬液的毒价，将毒价检测合格的增殖病毒悬液进行配苗、分装及冻干，即得。本发明鸡新城疫活疫苗的生产方法具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，能够快速、准确的测定疫苗效价等优点，本发明生产方法可显著提高疫苗产量和质量，所生产的鸡新城疫弱毒活疫苗安全性好、免疫效力高，对鸡新城疫强毒攻击具有完全的免疫保护作用。
文档编号A61K39/17GK102600465SQ20101060961
公开日2012年7月25日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者武华, 王洪林 申请人:华威特(北京)生物科技有限公司, 华威特(江苏)生物制药有限公司