专利名称：一种玻璃海鞘多肽及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物科学领域，具体的说是一种玻璃海鞘多肽及其制备。
背景技术：
海洋药物是目前药物研究中的一大热点领域，其中以抗肿瘤药物的研究成果最为引人注目，各国科学家已经从海洋动植物中分离纯化出多种结构新颖且具有特异活性的抗肿瘤化合物，但是活性物质在海洋动植物中的含量低、分离纯化困难是海洋抗肿瘤活性物质的分离纯化面临的一大难题。要分离得到一个高活性的化合物需要大量的原材料、合理的试验路线和先进的分离纯化设备。在迄今为止并未并未见以玻璃海鞘为原料分离纯化多肽类物质并用于预防和治疗肿瘤疾病的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种玻璃海鞘多肽及其制备。 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为一种玻璃海鞘多肽玻璃海鞘多肽N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为 5931Da，等电点为7. 25。所述玻璃海鞘多肽按如下步骤得到1)将新鲜的海鞘通过有机溶剂以4-20°C进行沉淀提取1-3次，沉淀物通过滤膜进行超滤截留大于5KDa物质，待用；2)将上述截留大于5KDa物质，以0. 05-0. 5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE 阴离子交换柱层析，收集0. 15M NaCl缓冲液洗脱组分，待用；3)将上述收集的洗脱组分经SuperdeX75分子筛凝胶层析，用超纯水做洗脱液，流速为0. 8-1. 2ml/min，收集洗脱组分，待用；4)将上述洗脱组分经HPLC C-18反相柱分离纯化，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的90%，B液占总洗脱液体积的10%，B液每分钟
的速率上升，流速为0. 5-0. 8ml/min,当B液占总洗脱液体积的28. 4%时出现活性组分， 即得到N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为5931Da的单一组分玻璃海鞘多肽；其中 A液为A液总体积0. 1 %的TFA和A液总体积99. 9 %的超纯水，B液为B液总体积0. 1 %的 TFA和B液总体积99. 9 %的乙腈。所述步骤1)通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为10% -90%的丙酮水溶液， 并且每次沉淀时间为12小时。所述步骤1)通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为60% -80%的丙酮水溶液。 所述多肽为N-末端序列与其同源性在95%以上的变体或其衍生物。玻璃海鞘多肽的制备方法1)将新鲜的海鞘通过有机溶剂以4-20°C进行沉淀提取1-3次，沉淀物通过滤膜进行超滤截留大于5KDa物质，待用；2)将上述截留大于5KDa物质，以0. 05-0. 5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE阴离子交换柱层析，收集0. 15M NaCl缓冲液洗脱组分，待用；3)将上述收集的洗脱组分经SuperdeX75分子筛凝胶层析，用超纯水做洗脱液，流速为0. 8-1. 2ml/min，收集洗脱组分，待用；4)将上述洗脱组分经HPLC C-18反相柱分离纯化，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的90%，B液占总洗脱液体积的10%，B液每分钟
的速率上升，流速为0. 5-0. 8ml/min,当B液占总洗脱液体积的28. 4%时出现活性组分， 即得到N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为5931Da的单一组分玻璃海鞘多肽；其中 A液为A液总体积0. 1 %的TFA和A液总体积99. 9%的超纯水，B液为B液总体积0. 1 %的 TFA和B液总体积99. 9 %的乙腈。所述步骤1)通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为10% -90%的丙酮水溶液，并且每次沉淀时间为12小时。所述步骤1)通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为 60% -80%的丙酮水溶液。本发明所具有的优点1.本发明中涉及的多肽是一种海洋来源的物质，由于海洋生态环境的特殊性，使得海洋生物具有某些陆上生物所没有的活性物质，这些活性物质往往具有结构新颖、高活性、耐药性低等特点，可以为新药研究和开发提供模式结构和医药前体。2.该多肽在提取过程中经过了 70°C高温加热，加热后仍保持活性不变说明该多肽具有热稳定性，将来制成药后能延长药品的货架寿命。
图1为本发明实施例2提取的多肽PI5931。用ABI公司的Q Trap离子喷雾质谱仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)以增强的方式测定其分子量。质谱仪配以TurbolonSpray source并以阳离子模式操作图2为本发明实施例2提取的多肽PI5931的Tricine-SDS-Page电泳分析图。
具体实施例方式实施例1玻璃海鞘多肽的制备方法1)丙酮沉淀制备粗提物取新鲜海鞘洗净、粉碎、分散勻浆机勻浆，在70°C下加热 30min,而后以lOOOOrpm，离心20min，得上清，上清液中加入上清液体积三倍的丙酮，得到体积百分含量为70%丙酮溶液。在4°C静置过夜；静置过夜后以IOOOOrpm离心20min，取沉淀，沉淀重新溶解后通过5KDa的滤膜进行超滤截留，保留大于5KDa的部分，待用。2)DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析首先，将粗提物装入分子截留量为3. 5kD的透析袋，采用纯水进行初步透析，而后将其对起始缓冲溶液充分透析；将透析好的样品取出，IOOOOrpm离心去除不溶物，准备上柱；起始缓冲溶液为0. 02M Tris-Cl, ρΗ8· 0。其次，取适量的DEAE Sepharose Fast Flow填料 (GE公司生产)，加入超纯水中， 用玻璃棒轻微搅拌均勻后，玻璃棒引流，装入16X26规格的层析柱，用起始缓冲溶液平衡 3-4个柱体积，基线稳定后方可使用。再次，将样品上柱后，用起始缓冲溶液冲洗，待不挂柱蛋白完全穿透后，开始洗脱，洗脱液为Tris-Cl, NaCl溶液，即在起始缓冲液的基础上，分别配制0. 05Μ、0. 1Μ、0· 15Μ、 0. 2Μ、0. 3Μ和0. 5MNaCl溶液，而后进行分步洗脱，流速为5ml/分钟，整个层析过程采用 280nm检测蛋白质洗脱峰。最后，将由六个不同浓度浓度NaCl洗脱所得到的组分用纯水充分透析后冻干，用纯水溶解；每个组分质量浓度为200ug/ml，MTT试验检测各组份活性，0. 15M NaCl洗脱组分为活性组分，将活性组份置于-20°C保存，待用。3) superdex 75分子筛凝胶层析 首先，取适量的superdex 75分子筛凝胶填料(GE公司生产)，清水浸泡24小时， 用玻璃棒轻微搅拌均勻后，玻璃棒引流，装入1. 6 X 80cm规格的层析柱，用纯水平衡3-4个柱体积，基线稳定后方可使用。其次，将上述0. 15M NaCl洗脱组分上柱，用清水以lml/min的速度冲洗层析柱，整个层析过程采用280nm检测蛋白质洗脱峰，共得四个洗脱峰，每个洗脱峰为一个组分，将各个组分冷冻干燥，采用BCA法测定蛋白浓度后，MTT试验检测各组份活性，第四个洗脱组分为活性组分，即截取1小时40分钟至1小时55分钟的洗脱液。将活性组份置于-20°C保存。4)将上述洗脱组分经HPLC C-18反相柱(4. 6 X 250mm规格的层析柱)分离纯化， 洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的90%，B液占总洗脱液体积的10%，B液每分钟的速率上升，流速为0. 5ml/min,当B液占总洗脱液体积的28. 4%时出现活性组分，经质谱鉴定即得到N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为 5931Da的单一组分玻璃海鞘多肽(参见图1)；活性组分由等电聚焦电泳测定等电点为PI =7. 25。其中A液为A液总体积0. 1 %的TFA和A液总体积99. 9%的超纯水，B液为B液总体积0. 1 %的TFA和B液总体积99. 9 %的乙腈。5)海鞘多肽的Tricine-SDS-Page电泳分析鉴定配置4 %的浓缩胶和 16. 5%的分离胶。取过C-18反相柱组分点样，用低分子量蛋白Marker为对照，进行 Tricine-SDS-Page蛋白电泳，浓缩胶采用50V电压，分离胶采用60V电压进行电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色液进行染色，在样品泳道能够发现6KD左右大小的一条亮带，说明该多肽的分子量在6KD左右(参见图2)。实施例2抗瘤谱的测定细胞人宫颈癌上皮细胞(Hela)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人结肠癌细胞 (HCT-116)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞(A549)、人神经胶质瘤细胞(U8T)。以上细胞均为中科院海洋所海洋药物实验室提供。药品及试剂玻璃海鞘多肽中科院海洋所海洋药物实验室提供；5-氟脲嘧啶 (5-FU)江苏南通精华制药有限公司产品，批号为100402 ；MTT(SIGMA, USA) ；DMSO(SIGMA, USA)；胰蛋白酶(SIGMA, USA) ；RPMI1640(GIBCO, Invitragen Co.，USA) ；DMEM(GIBC0, Invitragen Co. ,USA)；优级胎牛血清(GIBCO, Invitragen Co. ,USA)；特级胎牛血清 Fetal BovineSerum(Hyclone)。仪器超低温冰箱(Nature，USA)，细胞培养箱(SANYO，Japan)，倒置显微镜 (NIKON, Japan)，示ft (Bio-Tek Instruments, Inooski, VT,USA)，PH if (Thermo orion, USA)，超净工作台(FLC-哈尔滨东联仪器厂)。
而后通过MTT法进行检测抗肿瘤效果，取各种人的肿瘤细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期细胞，调节细胞悬液浓度5 X IO4个/ml左右。将细胞悬液加入96孔培养板中，每个孔加入180μ 1。置于37°C恒温培养箱中培养24h后，实验组加入各浓度上述实施例所得多肽提取物20 μ 1/孔，并以5-FU作为阳性对照组，每组各设4个平行孔，并分别设清水对照以调零。在培养箱37°C，培养48h后，用移液枪将96孔板中液体洗净后每孔加入MTT(lmg/ml)30l·! 1，置CO2培养箱37°C培养4h，弃去上清，每孔加入DMSO 150 μ 1， 置摇床摇勻30min，用酶标仪在492nm下检测，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取 IC5 (参见表1)0。
实验结果表明，经SPSS软件统计，玻璃海鞘多肽对用于试验的6种肿瘤细胞，均有不同程度的抑制作用，并且呈一定的剂量依赖关系，不同浓度的玻璃海鞘多肽对各种肿瘤细胞的抑制率、IC50值详见表1。表1不同浓度的玻璃海鞘多肽对5种肿瘤细胞的抑制率
权利要求
1.一种玻璃海鞘多肽，其特征在于玻璃海鞘多肽N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为5931Da，等电点为7. 25。
2.按权利要求1所述的玻璃海鞘多肽，其特征在于所述玻璃海鞘多肽按如下步骤得到1)将新鲜的海鞘通过有机溶剂以4-20°C进行沉淀提取1-3次，沉淀物通过滤膜进行超滤截留大于5KDa物质，待用；2)将上述截留大于5KDa物质，以0.05-0. 5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE阴离子交换柱层析，收集0. 15M NaCl缓冲液洗脱组分，待用；3)将上述收集的洗脱组分经SuperdeX75分子筛凝胶层析，用超纯水做洗脱液，流速为 0. 8-1. 2ml/min，收集洗脱组分，待用；4)将上述洗脱组分经HPLCC-18反相柱分离纯化，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的90 %，B液占总洗脱液体积的10 %，B液每分钟1 % 的速率上升，流速为0. 5-0. 8ml/min,当B液占总洗脱液体积的28. 4%时出现活性组分，即得到N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为5931Da的单一组分玻璃海鞘多肽；其中A 液为A液总体积0. 1 %的TFA和A液总体积99. 9 %的超纯水，B液为B液总体积0. 1 %的 TFA和B液总体积99. 9 %的乙腈。
3.按权利要求2所述的玻璃海鞘多肽，其特征在于所述步骤1)通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为10% -90%的丙酮水溶液，并且每次沉淀时间为12小时。
4.按权利要求3所述的玻璃海鞘多肽，其特征在于所述步骤1)通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为60% -80%的丙酮水溶液。
5.按权利要求1所述的玻璃海鞘多肽，其特征在于所述多肽为N-末端序列与其同源性在95%以上的变体或其衍生物。
6.一种权利要求1所述的玻璃海鞘多肽的制备方法，其特征在于1)将新鲜的海鞘通过有机溶剂以4-20°C进行沉淀提取1-3次，沉淀物通过滤膜进行超滤截留大于5KDa物质， 待用；2)将上述截留大于5KDa物质，以0.05-0. 5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE阴离子交换柱层析，收集0. 15M NaCl缓冲液洗脱组分，待用；3)将上述收集的洗脱组分经SuperdeX75分子筛凝胶层析，用超纯水做洗脱液，流速为 0. 8-1. 2ml/min,收集洗脱组分，待用；4)将上述洗脱组分经HPLCC-18反相柱分离纯化，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的90 %，B液占总洗脱液体积的10 %，B液每分钟1 % 的速率上升，流速为0. 5-0. 8ml/min,当B液占总洗脱液体积的28. 4%时出现活性组分，即得到N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为5931Da的单一组分玻璃海鞘多肽；其中A 液为A液总体积0. 1 %的TFA和A液总体积99. 9 %的超纯水，B液为B液总体积0. 1 %的 TFA和B液总体积99. 9 %的乙腈。
7.按权利要求6所述的玻璃海鞘多肽的制备，其特征在于所述步骤1)通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为10% -90%的丙酮水溶液，并且每次沉淀时间为12小时。
8.按权利要求7所述的玻璃海鞘多肽的制备，其特征在于，其特征在于所述步骤1) 通过有机溶剂沉淀时采用体积百分含量为60% -80%的丙酮水溶液。
全文摘要
本发明涉及药物科学领域，具体的说是一种玻璃海鞘多肽及其制备。玻璃海鞘多肽N-末端序列为YQPDKFMLRGELRNN，分子量为5931Da，等电点为7.25。制备将新鲜玻璃海鞘经10％-90％的丙酮沉淀，活性组份透析除盐后，分别经离子交换层析、凝胶过滤层析，HPLC方法纯化得到了分子量为5931Da的玻璃海鞘蛋白。本发明通过体内外活性实验验证，确定此多肽在恶性肿瘤的预防和治疗方面的用途。
文档编号A61P35/00GK102174096SQ201010620668
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者林秀坤, 王翠翠, 程林友, 郑兰红, 魏建腾 申请人:中国科学院海洋研究所