重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂的制作方法

专利名称：重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂的制作方法
重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定
制剂本申请要求2009年1月16日提交的美国临时申请第61/145，440号以及2009年 1月16日提交的美国临时专利申请第61/145，436号的权益。美国临时申请第61/145，440 号以及美国临时专利申请第61/145，436号的全文通过引用纳入本文。
背景技术：
白细胞减少症是指循环白细胞计数(WBC)的减少，通常定义为WBC计数< 4000/ mL。白细胞减少症中涉及的主要细胞是嗜中性粒细胞。但是，淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞数量减少可能对总细胞计数减少也有影响(Merck Manual (默克手册)，第17版)。嗜中性白细胞减少症的特征为血液嗜中性粒细胞计数的减少，通常引起对细菌和真菌感染易感性的提高。根据嗜中性粒细胞计数和感染的相对风险将嗜中性白细胞减少症分成轻度(1000-1500/mL)、中度(3级，500-1000/mL)或重度G级，< 500/mL)急性和重度嗜中性白细胞减少症由于使患者易患迅速致死感染而是一种危及生命的病症(默克手册，第17版)。嗜中性白细胞减少症可由骨髓中嗜中性粒细胞生成受损或嗜中性粒细胞加速破坏引起。当嗜中性粒细胞快速使用而其生成严重受损时，急性嗜中性白细胞减少症可能在数天内发作。慢性嗜中性白细胞减少症可能持续数月，并通常由脾脏中嗜中性粒细胞的生成减少或隔离引起。嗜中性白细胞减少症可以根据其是骨髓细胞外源因子的次生结果还是存在于骨髓祖细胞的内在缺陷进行分类(默克手册，第17版)。嗜中性白细胞减少症及其感染性并发症是细胞毒性化疗和其它肿瘤治疗如放疗、 生物治疗、靶向治疗和骨髓移植中最为常见和严重的副作用之一。细胞毒性化疗通过破坏快速生长的细胞来发挥作用，由于嗜中性粒细胞前体的高增殖率和血液嗜中性粒细胞的快速代谢回转而引发嗜中性白细胞减少症(默克手册，第17版)。化疗患者中，嗜中性白细胞减少症的最常见症状包括发热、口疮和耳感染。显著嗜中性白细胞减少症的患者常发生化脓性感染，例如败血症、皮肤蜂窝组织炎、肝脓肿、疔疮、肺炎、口腔炎、牙龈炎、围直肠炎、结肠炎、鼻窦炎和中耳炎。化疗可能被迫延迟直至身体能产生更多的嗜中性粒细胞，可能必须采用较低的剂量，导致治疗效果较低。发明概述本文所述方法和组合物有助于治疗、缓解或预防以白细胞计数低于正常值为特征的症状。这些症状包括但不限于白细胞减少症和嗜中性白细胞减少症。在第一种实施方式中，描述了在人对象中治疗或预防嗜中性白细胞减少症的方法，包括对显示嗜中性白细胞减少症或有产生嗜中性白细胞减少症风险的人对象施用有效量的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子以治疗对象。在示范性实施方式中，所述人对象可能患有非骨髓恶性肿瘤并正接受至少一种骨髓抑制型抗癌药，该药物与发热性嗜中性白细胞减少症的临床显著发病率相关。
在第二种实施方式中，描述了在人对象中治疗或预防白细胞减少症的方法，包括对显示白细胞减少症或有产生白细胞减少症风险的人对象施用有效量的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子以治疗对象。在第三种实施方式中，描述了在患有非骨髓性恶性肿瘤并在接受至少一种骨髓抑制型抗癌药的人对象中降低表现为发热性嗜中性白细胞减少症的感染发病率的方法，该抗癌药物与发热性嗜中性白细胞减少症的临床显著发病率相关，该方法包括给予对象有效剂量的人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子以治疗对象。在一些方法中，本文所述的复合物有助于降低感染的发病率，例如表现为发热性嗜中性白细胞减少症的感染。在一些实施方式中，所述组合物和方法包括由人血清白蛋白 (“HSA”)和人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。所述融合多肽长度为759 个氨基酸；融合体中的1-585位氨基酸对应于成熟形式HSA的氨基酸，而融合体的586-759 位氨基酸对应于成熟形式人G-CSF的氨基酸。

图1显示了融合蛋白的氨基酸序列。将名为NeUgraninTM( “NEUG”)的融合多肽给予显示有白细胞减少症或嗜中性白细胞减少症风险的患者。例如，在一些实施方式中，方法包括在人对象中通过给予有效剂量的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子治疗对象的白细胞减少症或嗜中性白细胞减少症。在一些实施方式中，嗜中性白细胞减少症是原发性嗜中性白细胞减少症、急性嗜中性白细胞减少症、重度慢性嗜中性白细胞减少症(SCN)、重度先天性嗜中性白细胞减少症 (Kostmann综合征)、重度婴儿遗传性粒细胞缺乏症、良性嗜中性白细胞减少症、周期性嗜中性白细胞减少症、慢性特发性嗜中性白细胞减少症、继发性嗜中性白细胞减少症、嗜中性白细胞减少症相关综合征或免疫介导的嗜中性白细胞减少症。在其它实施方式中，嗜中性白细胞减少症由以下原因造成或与之相关辐射、酗酒、药物、过敏性疾病、再生障碍性贫血、自体免疫疾病、T-Y淋巴增生性疾病(T-YLPD)、 脊髓发育不良、骨髓纤维化、丙种球蛋白异常血症、阵发性夜间血红蛋白尿、癌症、维生素B12 缺乏、叶酸缺乏、病毒感染、细菌感染、脾脏疾病、血液透析、移植、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、 浸润并置换骨髓的转移性实体瘤、毒素、骨髓衰竭、Schwachman-Diamond综合征、软骨-毛发发育不全、先天性角化不良、IB型糖原贮积病、各种原因导致的脾肿大、和骨髓细胞或其前体的内在缺陷。在一些实施方式中，嗜中性白细胞减少症由细胞毒性化疗造成或与之相关。在一些实施方式中，所述人对象患有非骨髓恶性肿瘤如乳腺癌，并在接受细胞毒性化疗。例如，在一些实施方式中，患者接受至少一种与发热性嗜中性白细胞减少症的临床显著发病率有关的骨髓抑制抗癌药。在一些实施方式中，所述骨髓抑制抗癌药是多柔比星或多西他赛。在进一步的实施方式中，对至少一个疗程，通过静脉输液在同一天依次给予约 50mg/m2多柔比星和约75mg/m2多西他赛。在其它实施方式中，对至少一个疗程，通过静脉输液在同一天依次给予约60mg/m2多柔比星和约75mg/m2多西他赛。在其它实施方式中，方法包括降低人对象感染的发病率，其表现为发热性嗜中性白细胞减少症。在一些实施方式中，所述人对象患有非骨髓恶性肿瘤并正接受至少一种骨髓抑制型抗癌药，该药物与发热性嗜中性白细胞减少症的临床显著发病率相关。在一些实施方式中，给予对象有效量的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子以治疗患者的嗜中性白细胞减少症。
在一些实施方式中，降低对象中嗜中性白细胞减少症的持续时间或严重程度或消除嗜中性白细胞减少症。例如，在一些实施方式中，消除对象的4级或3级嗜中性白细胞减少症。在其它实施方式中，缩短4级或3级嗜中性白细胞减少症的持续时间。例如，在一些实施方式中，对象的4级嗜中性白细胞减少症持续时间少于5天；在一些实施方式中，对象的4级嗜中性白细胞减少症持续时间少于4天、少于3天或少于2天。在其它实施方式中， 对象的3级嗜中性白细胞减少症持续得到消除，和/或对象的3级嗜中性白细胞减少症持续时间比未接受人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子治疗的对象缩短。在一些实施方式中，给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起对象的血液白细胞计数(“WBC”)增加或降低WBC损失。例如，在一些实施方式中，对象的嗜中性粒细胞数量升高；对象的嗜中性粒细胞数量降低受到抑制，对象的最低嗜中性粒细胞绝对计数 (“ANC”)增加，对象的ANC恢复提高，和/或对象的ANC恢复时间缩短。在一些实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量从约 40μ g/kg到约500μ g/kg ；在其它实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量从约50 μ g/kg到约450 μ g/kg。在另一些实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量为约50 μ g/kg、约100 μ g/kg、约150 μ g/kg、约200 μ g/kg 或约250 μ g/kg。在进一步的实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量为约300 μ g/kg、约350 μ g/kg或约400 μ g/kg。在另外的实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量为约450 μ g/kg。在其它实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量为约20-100mg。在进一步实施方式中， 给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量为约30-60mg。在进一步实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量为约30mg、约40mg、约50mg或约 60mg。在一些实施方式中，重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子在化疗(例如，给予骨髓抑制抗癌药)后给药。例如，在一些实施方式中，重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子在化疗期间给药、或在化疗施用2小时内、4小时内、6小时内、12小时内、18小时内、M小时内或48小时内给药。在本发明的另一实施方式中，重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子可在给予骨髓抑制抗癌药后给药。例如，重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的给药时间可选自下组(a)给予骨髓抑制抗癌药后至少2小时；(b)给予骨髓抑制抗癌药后至少4小时；(c)给予骨髓抑制抗癌药后至少6小时；(d)给予骨髓抑制抗癌药后至少12小时；(e)给予骨髓抑制抗癌药后至少18小时；(f)给予骨髓抑制抗癌药后至少M小时；(g)给予骨髓抑制抗癌药后至少48小时；或(h)在骨髓抑制抗癌药给药期间或基本与之同时。在一些实施方式中，在化疗治疗期间或之后给予的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起WBC升高和/或引起ANC升高。例如，在一些实施方式中，ANC和WBC在化疗后10天内回复正常。在其它实施方式中，ANC和WBC在化疗后11天、12天、13天、14天或 15天内回复正常。在一些实施方式中，化疗施用后14天，用重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子治疗的患者中ANC的升高低于用等剂量聚乙二醇化非格司亭治疗的患者中ANC的升高。在一些实施方式中，给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞升高。例如，在一些实施方式中，对象中淋巴细胞、 单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞的数量增加。在其它实施方式中，对象中淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞的数量减少被抑制。在一些实施方式中，特别是对于治疗或预防嗜中性白细胞减少症的方法，所得结果可选自下组(a)对象的4级嗜中性白细胞减少症被消除；(b)对象的4级嗜中性白细胞减少症得以减轻；(c)对象的重度嗜中性白细胞减少症持续时间缩短；(d)对象的3级嗜中性白细胞减少症的持续被消除；(e)对象的3级嗜中性白细胞减少症持续时间缩短；或(f) 其任意组合。在一些实施方式中，特别是对于治疗或预防嗜中性白细胞减少症的方法，给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起血液白细胞计数(WBC)的升高。在另一些实施方式中，特别是对于治疗或预防嗜中性白细胞减少症的方法，所得结果选自下组(a)对象的嗜中性粒细胞数量增加；(b)对象的嗜中性粒细胞数量减少被抑制；(c)对象的最低嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)增加；(d)对象的ANC恢复提高；(e)对象的ANC恢复时间缩短；或 (f)其任意组合。在一些实施方式中，给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量选自下组(a)从约 50 μ g/kg 至约 450 μ g/kg ； (b)约 50 μ g/kg ； (C)约 150 μ g/kg ； (d)约 300 μ g/kg ； (e)约 450 μ g/kg ； (f)从约 30mg 至约 60mg ； (g)约 30mg ； (h)约 40mg ；⑴约 50mg ； (j)约60mg ；或(k)其任意组合。在一些实施方式中，要治疗或预防的嗜中性白细胞减少症选自原发性嗜中性白细胞减少症、急性嗜中性白细胞减少症、重度慢性嗜中性白细胞减少症(SCN)、重度先天性嗜中性白细胞减少症(Kostmarm综合征)、重度婴儿遗传性粒细胞缺乏症、良性嗜中性白细胞减少症、周期性嗜中性白细胞减少症、慢性特发性嗜中性白细胞减少症、继发性嗜中性白细胞减少症、嗜中性白细胞减少症相关综合征和免疫介导的嗜中性白细胞减少症。此外，嗜中性白细胞减少症可能由以下原因造成或与之相关，例如，辐射、酗酒、药物、过敏性疾病、再生障碍性贫血、自体免疫疾病、T-Y淋巴增生性疾病(Τ-γ LPD)、脊髓发育不良、骨髓纤维化、丙种球蛋白异常血症、阵发性夜间血红蛋白尿、癌症、维生素B12缺乏、叶酸缺乏、病毒感染、细菌感染、脾脏疾病、血液透析、移植、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、浸润并置换骨髓的转移性实体瘤、毒素、骨髓衰竭、Schwachman-Diamond综合征、软骨-毛发发育不全、先天性角化不良、IB型糖原贮积病、各种原因导致的脾肿大、和骨髓细胞或其前体的内在缺陷。在本发明的实施方式中，当人对象患有非骨髓恶性肿瘤时，所述非骨髓恶性肿瘤可包括乳腺癌。在本发明的实施方式中，当给予骨髓抑制抗癌药时，所述骨髓抑制抗癌药可包括多柔比星和多西他赛。例如，对至少一个疗程，可通过静脉输液在同一天依次给予约50mg/ m2多柔比星和约75mg/m2多西他赛。或者，对至少一个疗程，可通过静脉输液在同一天依次给予约60mg/m2多柔比星和约75mg/m2多西他赛。在本发明的一些实施方式中，ANC和WBC在治疗后选自下组的时间段内回复正常 (a)化疗后10天；(b)化疗后11天；(c)化疗后12天；(d)化疗后13天；(e)化疗后14天； 或(f)化疗后15天。在另一实施方式中，化疗施用后14天，用重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子治疗的患者中ANC的升高低于用等剂量聚乙二醇化非格司亭治疗的患者中ANC的升高。在本发明的一些实施方式中，给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞或其任意组合的升高。在其它实施方式中，对象中淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或其任意组合的数量增加。在本发明的其它实施方式中，对象中淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞的数量减少被抑制。上述总体说明和以下的附图简要说明与详细说明都是示范性和说明性的，并旨在为本发明要求保护的范围提供进一步说明。通过本发明的以下详细描述，本发明的其它目的、优势和新特征对于本领域技术人员将是显而易见的。附图简要说明图1A-1C 图IA显示名为"Neugranin " ( ‘‘NEUG”)的所述重组人白蛋白-粒细胞集落刺激因子(“rHA-G-CSF”)融合蛋白的核酸序列和氨基酸序列；图IB显示人G-CSF 的氨基酸序列；图IC显示人血清白蛋白的氨基酸序列。图2显示I期对象的嗜中性粒细胞绝对计数(“ANC”)图。对象在研究化疗后的第 1 疗程中接受 300μ g/kg NEUG (η = 19),450μ g/kg NEUG (η = 20)或 6mg 聚乙二醇化非格司亭(Neulasta ) (η = 9)。图3显示I期研究中人对象内NEUG的药代动力学。在没有化疗的乳腺癌患病对象中，测量指定剂量NEUG 050 μ g/kg、300 μ g/kg或150 μ g/kg)皮下给药的血清NEUG浓度。 正方形450 μ g/kg疗程0 ；三角形300 μ g/kg疗程0 ；圆形150 μ g/kg疗程0。图4显示NEUG在化疗第1疗程中的药代动力学/药效学(“H(/PD”)(I期研究)。 在第1疗程给药多柔比星/多西他赛后1天，患者接受450 μ g/kgNEUG。ANC显示为空心菱形；NEUG浓度显示为实心正方形。3级和4级嗜中性白细胞减少症的临界值用虚线显示。 NEUG的定量下限(“LL0Q”)显示为6ng/ml处的点线。图5显示在化疗第1疗程开始后一天接受30mg NEUG或6mg聚乙二醇化非格司亭 (Neulasta )的患者的ANC曲线(II期研究)。3级和4级嗜中性白细胞减少症的临界值用虚线显示。图6显示I期研究化疗疗程。图7A和7B显示对象在I期研究中的ANC和血液白细胞计数(“WBC”)计数。图 8 显示用 NEUG (Albugranin)或 Neupogen ⑧的 NSF-60 细胞增殖图。图9显示用NEUG或Neulasta的NSF-60细胞增殖图。图10显示BDF-I小鼠在NEUG (Albugranin)和Neupogen单次SC给药后的外周血嗜中性粒细胞(Gr. 1+)水平图(时间过程)。Gr. 1+细胞总数表示为组平均值+/-SEM。图11显示在NEUG(Albugranin)和Neupogen单次SC给药后，外周血造血祖细胞 (c-kit+)的水平图(时间过程)。c-kit+细胞总数表示为组平均值+/-SEM。图 12A和 12B显示BDF-I 小鼠中 NEUG(Albugranin)或Neulasta 单次皮下(“SC”) 给药后外周血粒细胞(Gr. 1+)水平。12A显示单剂量Neulasta或NEUG后应答的时间过程， 12B显示了 NEUG或Neulasta的相对效力。图13列表显示I期所用NEUG药物产品的组成。图14列表显示11期所用NEUG药物产品的组成。
图15显示在NEUG(Albugranin)或Neulasta 单次皮下给药后，外周造血祖细胞 (c-kit+)的水平(时间过程)。c-kit+的总数表示为各组计算所得的平均值和标准差。采用异方差t-检验分析治疗组间的差异。图 16 显示在 5-FU (150 μ g/kg) IP 注射后 1 天，NEUG (Albugranin)或 Neulasta 单次皮下给药后的外周血嗜中性粒细胞(Gr. 1+)的水平(时间过程)。每天计算GR. 1+细胞的总数，表示为各组计算所得的平均值和标准差。用方差不等的双样本t-检验评估治疗组间的差异。与载剂对照相比，用任一种药剂在所有剂量水平下的治疗都引起嗜中性粒细胞数量在统计学上显著增加。图17显示NEUG(Albugranin)对外周血嗜中性粒细胞相对百分比的影响。各研究日的嗜中性粒细胞的相对百分比表示为组平均值+/-SEM。NEUG 100 μ g/kg Q7的第8、9天的数据分别表示为第9、10天以便于和其它组作比较。对照为每四天一次共4次SC给予盐水或者每天一次共14次SC给予Neupogen 。第1_14天视为治疗期，第15- 天为恢复期。图 18 显示 NEUG(Albugranin) SC、NEUG IV、或 Neulasta SC 重复剂量给药对猴的嗜中性粒细胞移动影响的比较。直至第22天的各研究日的嗜中性粒细胞数(K/μΙ)表示为组平均值+/-SEM。箭头标明剂量给药。NEUG以1. Omg/kg/剂量通过SC(n = 6)或IV(η =6)给药，Neulasta 以 0. 22mg/kg/ 剂量(1. Omg/kg NEUG 的等摩尔剂量)通过 SC (n = 6) 给药。NEUG载剂通过SC给药作为对照(n = 2)。图19Α和19Β列表显示体内药代动力学研究的小结。图20列表显示提供安全性数据的体内非临床研究的小结。图21是NEUG发酵和纯化的示范性概况的流程图。图22显示I期A部分中(疗程0或化疗前)对象从治疗到第14天的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的中位数。在第4天，图中线条由高到低分别是300 μ g/kg、450 μ g/kg、 150 μ g/kg 禾口 50 μ g/kg ο图23A和2 显示I期B部分中各治疗对象的曲线下面积(AUC)，基于第0_15天的ANC数值。图23A为图表；图23A中的数据总结于表23B中。图M显示II期治疗对象的曲线下面积(AUC)，基于第1疗程第0-15天所得ANC 值(固定剂量组)。对所有II期对象，计算AUCanc(第0-15天)。用Neugranin治疗的患者接受0. 3-lmg/kg(根据剂量除以基线体重计算)的剂量。体重调整的剂量范围分成四组并对AUCaic作图(左图)。对所有用聚乙二醇化非格司亭治疗的对象(N = 112)，也计算并比较了 Neugranin 30mg (N = 10)、40mg(N= 105)或 50mg(N= 105)的 AUCanc。数据显示为平均值士 SEM。发明详述本文公开了用于治疗、预防和减轻以白细胞计数减低为特征的症状和疾病的组合物和方法。本文所述的方法和组合物包括由人血清白蛋白(“HSA”)和人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。在一个优选实施方式中，所述融合多肽长度为约759个氨基酸；融合体中的1-585位氨基酸对应于成熟形式HSA的氨基酸，而融合体的586-759位氨基酸对应于成熟形式人G-CSF的氨基酸。图1显示了融合蛋白的氨基酸序列。本发明还包括含G-CSF变体或片段的融合蛋白，和含白蛋白或白蛋白的片段或变体的融合蛋白。本发明还包括编码本发明的治疗性白蛋白融合蛋白的多核苷酸、治疗性白蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂和试剂盒。本发明也包括转化有治疗性白蛋白融合蛋白的编码多核苷酸的宿主细胞，和采用这些多核苷酸和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。在一个实施方式中，本发明所述的白蛋白融合蛋白具有延长的保存期限。在第二个实施方式中，本发明所述的白蛋白融合蛋白比相应未融合的G-CSF分子
更稳定。本发明还包括经修饰包含本发明所述核酸分子的转基因生物，优选修饰成表达本发明的白蛋白融合蛋白。本发明一般涉及编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸；白蛋白融合蛋白；和采用白蛋白融合蛋白或编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防或改善疾病或失调。如本文所用， “白蛋白融合蛋白”指通过将至少一分子白蛋白(或其片段或变体)与至少一分子G-CSF(或其片段或变体)融合形成的蛋白质。本发明的白蛋白融合蛋白包含G-CSF的至少一个片段或变体和人血清白蛋白的至少一个片段或变体，两者通过基因融合(即，所述白蛋白融合蛋白通过核酸的翻译产生，该核酸中编码全部或部分G-CSF的多核苷酸与编码全部或部分白蛋白的多核苷酸在读框内连接)彼此结合。G-CSF和白蛋白一旦成为白蛋白融合蛋白的部分，就可各自称作白蛋白融合蛋白的“部分”、“区段”或“组成”(例如，“G-CSF蛋白部分” 或“白蛋白蛋白部分”)。在一个高度优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白包含至少一分子的G-CSF或其片段或变体(包括但不限于，G-CSF蛋白质的成熟形式)和至少一分子的白蛋白或其片段或变体(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在进一步优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白通过宿主细胞加工并分泌到周围的培养基中。在表达用宿主的分泌途径中发生的初生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于，信号肽切割；二硫键形成；适当折叠；碳水化合物的添加和加工(例如，N-和 0-连接糖基化)；特异性蛋白水解切割；和装配成多聚体蛋白。本发明的白蛋白融合蛋白优选为已加工形式。在最优选的实施方式中，所述“白蛋白融合蛋白的加工形式，，是指经过N 末端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，本文也称为“成熟的白蛋白融合蛋白”。在一个实施方式中，本发明提供了编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含G-CSF和血清白蛋白或由其组成。在进一步实施方式中，本发明提供了包含G-CSF 和血清白蛋白或由其组成的白蛋白融合蛋白。在其它实施方式中，本发明提供了包含G-CSF 的生物活性和/或治疗活性片段和血清白蛋白，或由其组成的白蛋白融合蛋白。在其它实施方式中，本发明提供了包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性变体和血清白蛋白，或由其组成的白蛋白融合蛋白。在优选的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的血清白蛋白组成是血清白蛋白的成熟部分。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。在进一步实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片段，或由其组成。在进一步的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性变体，或由其组成。 在优选的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的成熟部分。在进一步优选的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的胞外可溶结构域。在替代的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的活性部分。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。
在进一步实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性片段或变体和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片段或变体，或由其组成。在优选的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的成熟形式和血清白蛋白的成熟形式，或由其组成。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。I.定义如本文所用，“多核苷酸”是具有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，包含在读框内连接的至少一分子白蛋白(或其片段或变体)与至少一分子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(或其片段或变体)，或由其组成。如本文所用，“白蛋白融合构建物”指包含在读框内连接的编码至少一分子白蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸与编码至少一分子G-CSF (或其片段或变体)的至少一个多核苷酸、或由其组成的核酸分子；以及还包含，例如一种或一种以上下列元件(1)功能性自我复制载体(包括但不限于，穿梭载体、表达载体、整合载体和/或复制系统)，( 转录起始区(例如，启动子区如可调节或可诱导的启动子、组成型启动子)，C3)转录终止区，(4)前导序列，和(5)选择性标记。编码G-CSF和白蛋白的多核苷酸一旦成为白蛋白融合构建物的部分，可各自称作白蛋白融合构建物的“部分”、“区域”或“组成”。所述显示“治疗活性”的G-CSF多肽或具有“治疗活性”的G-CSF蛋白质是指具有一种或多种已知的G-CSF蛋白相关生物学和/或治疗活性的G-CSF多肽。作为非限制性示例，“G-CSF治疗蛋白”是可用于治疗、预防或改善疾病、症状或紊乱的G-CSF蛋白质。作为非限制性示例，“G-CSF治疗蛋白”可以与特定细胞类型(正常(如淋巴细胞)或非正常(如癌细胞))特异性结合并因此可用于将化合物(药物或细胞毒剂)特异性靶向到该细胞类型。II.粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激嗜中性粒细胞生成的造血生长因子。当有要刺激的存活前体细胞时，给予G-CSF可快速诱导嗜中性粒细胞白细胞增多。G-CSF的另一重要体内活性是移动造血祖细胞进入外周血液(Duhrsen等，1988，Molineux等，1999 ；Roberts等，1994)。该效应不但包括嗜中性粒细胞谱系，还扩展到其它单谱系与多谱系祖细胞和多能造血干细胞(Molineux等，1999)。G-CSF通过激发嗜中性粒细胞来增强作为抗感染的防御机制部分的细胞事件，从而增强其针对经调理金黄色葡萄球菌(Maphylococcusaureus)的吞噬和抗菌活性。G-CSF还引起嗜中性粒细胞与单核细胞的趋化性和嗜中性粒细胞的附着(You等，1989 ；Wang等，1988)。目前已批准重组G-CSF产品用于多种临床症状以刺激嗜中性粒细胞的增殖和分化。在临床试验中，非格司亭(filgrastim，重组甲硫氨酰基人G-CSF ；Neupogen Amgen，Thousand Oaks, CA)提高了外周嗜中性粒细胞数量，从而缩短了骨髓抑制化疗后嗜中性白细胞减少症的持续时间。重组G-CSF(非格司亭)通过每日皮下(SC)注射给药。G-CSF的另一重组形式是聚乙二醇化非格司亭，一种聚乙二醇偶联的rG-CSF (Neulasta )，用其每疗程一次来替代每日一次rG-CSF疗法以降低接受骨髓抑制行抗癌药患者的发热性嗜中性白细胞减少症发病率已被证明是安全有效的(Holmes，0' Shaughnessy 等，2002 ；Green 等，2003 ；Neulasta SmPC2007)。在基于年龄、医疗记录、疾病特征和化疗方案的骨髓毒性确定的高风险患者中，为预防发热性嗜中性白细胞减少症推荐用G-CSF进行初步预防。美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology)和欧洲癌症研究和治疗组织(EuropeanOrganization for Research and Treatment of Cancer)推荐当发热性嗜中性白细胞减少症风险达约20%时采用G-CSF。美国国家综合性癌症中心网络(U. S. NationalComprehensive Cancer Center Network)推荐的G-CSF预防的可选指标为发热性嗜中性白细胞减少症风险为10-20%，G-CSF预防的确定性指标为发热性嗜中性白细胞减少症风险至少为 20%。(Smith 等，2006 ；Vogel 等，2005 ；Timmer-Bonte 等，2006，NCCN 指南)。推荐用集落刺激因子预防以缓解某些化疗方案的毒性。然而，这些治疗的附加成本在美国和特别是欧洲部分地区是重要考虑因素，可能引起预防性G-CSF治疗的应用不足，也可能限制患者进行强剂量化疗方案的资格(Timmer-Bonte等，2006 ；Adams等，2006，NCCN指南)。G-CSF蛋白可以用野生型多核苷酸序列编码(例如，全长或成熟的)，或在某些情况下所述序列可以是野生型多核苷酸序列的变体(例如编码野生型G-CSF蛋白的多核苷酸，其中该多核苷酸的DNA序列为了例如在特定种类中表达而优化；或者编码野生型G-CSF蛋白的变体的多核苷酸(即定点突变；等位基因变体))。III.人血清白蛋白人血清白蛋白(HSA或HA)是人循环系统中自然产生的最常见血液蛋白，测得为约40克白蛋白/升并在循环中保持逾20天。白蛋白是载体蛋白，在生理浓度下具有最小活性。尽管HSA缺乏酶或免疫功能，它在体内广泛分布，并已知是血液中各种物质的载体(例如，激素、脂肪酸、未偶联胆红素等(Yeh等，199幻。HSA和重组HA(rHA)在人体中都具有同样的长循环半衰期。研究显示，与人白蛋白遗传融合的治疗蛋白能具有白蛋白的循环半衰期特征(Syed等，1997)。例如，在兔中，与白蛋白融合的⑶4半衰期是未融合⑶4的140倍(Yeh等，1992)。人血清白蛋白负责血清渗透压的显著部分以及作为内源和外源配体载体起作用，其成熟形式是有585个氨基酸的蛋白质(如美国专利第7，592，010号中图1所示)。目前，临床使用的HA通过从人血中提取制得。在EP 330 451和EP 361 991中公开了微生物中重组HA(rHA)的生产。IV.多肽和多核苷酸的片段和变体A.片段本发明还涉及本发明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的片段。本发明还涉及本发明中编码G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白片段的多核苷酸。尽管从蛋白的N末端删除一个或多个氨基酸会引起本发明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧失，其它治疗活性和/或功能活性(例如，生物活性、多聚体化的能力、结合配体的能力)仍可以保持。例如，当从N末端去除的残基少于完整多肽的主要残基时，N末端缺失多肽对识别所述多肽完整或成熟形式的抗体的诱导和/或结合能力一般仍被保留。通过本文所述的以及本领域已知晓的常规方法，可容易地确定缺少完整多肽的N末端残基的特定多肽是否保留该免疫活性。缺失大量N末端氨基酸残基的突变蛋白保留某些生物或免疫活性并非不可能。事实上，由少至6个氨基酸残基组成的肽常能引起免疫反应。因此，对应于本发明白蛋白融合蛋白中G-CSF蛋白部分的G-CSF片段包括全长蛋白和从参比多肽(即，G-CSF蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。具体地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸残基总数的整数，m限定为从2到q减6范围内的任何整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，对应于本发明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的血清白蛋白多肽片段包括全长蛋白和从参比多肽(即，血清白蛋白、或白蛋白融合蛋白的血清白蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。在优选的实施方式中，可以用通式m至585描述N末端缺失，其中585是成熟人血清白蛋白的氨基酸残基总数的整数，m限定为2到579范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。在另外的实施方式中，可以用通式m至609描述N末端缺失，其中609是表示全长人血清白蛋白的氨基酸残基总数的整数，m限定为2到603范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，本发明的白蛋白融合蛋白片段包括全长白蛋白融合蛋白和在所述白蛋白融合蛋白的氨基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示白蛋白融合蛋白氨基酸残基总数的整数，m限定为2到q减6范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。如上所述，尽管从参比多肽(例如，G-CSF蛋白；血清白蛋白；或本发明的白蛋白融合蛋白)的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸会引起该蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧失，但其它治疗活性和/或功能活性(例如，生物活性、多聚体化的能力、结合配体的能力)仍可以保持。例如，当从C末端去除的残基少于完整或成熟多肽的主要残基时，C末端缺失多肽对识别所述多肽完整或成熟形式的抗体的诱导和/或结合能力一般仍被保留。通过本文所述的和/或本领域已知晓的常规方法，可容易确定缺少参比多肽的N末端残基和/或C末端残基的特定多肽是否保留治疗活性。本发明还提供了在对应于本发明白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的G-CSF蛋白氨基酸序列的羧基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可以用通式1至η描述C末端缺失，其中η是从6到q减1范围内的任何整数，而其中q是表示参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸残基总数的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，本发明提供了在对应于本发明的白蛋白融合蛋白中白蛋白部分的白蛋白氨基酸序列的羧基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是从6到584范围内的任意整数，其中584表示成熟人血清白蛋白的氨基酸残基总数减1的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。具体地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是从6到608范围内的任意整数，其中608是表示人血清白蛋白的氨基酸残基总数减1的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，本发明提供了在本发明的白蛋白融合蛋白羧基末端有一个或一个以上残基缺失的多肽。具体地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是从6到q减1范围内的任意整数，其中q是表示本发明白蛋白融合蛋白的氨基酸残基总数的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。另外，上述的任何N或C末端缺失可以组合产生N和C末端缺失的参比多肽。本发明还提供了在氨基和羧基末端都有一个或一个以上氨基酸缺失的多肽，可通常表示为具有参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本发明白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、或血清白蛋白、或本发明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或白蛋白融合蛋白、或由本发明的多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白)的m至η残基，其中η和m为如上所述的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。本申请还涉及所含多肽与本文提出的参比G-CSF多肽或参比白蛋白多肽或其片段有至少约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的蛋白质。在优选的实施方式中，本申请涉及的蛋白质所含多肽与上述缺失氨基酸N和C末端的参比多肽至少有约80 %、约85 %、约90 %、约91 %、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。本发明的优选多肽片段包含显示G-CSF蛋白或血清白蛋白多肽序列的治疗活性和/或功能活性(例如生物活性)的氨基酸序列，或者由其组成，该氨基酸序列是片段。其它优选的多肽片段是生物活性片段。生物活性片段是那些展示的活性与本发明多肽的活性相似，但未必相同的片段。片段的生物活性可包括所需活性的改善或不良活性的减弱。B.变体“变体”是指与参比核酸或多肽不同但保留其基本性质的多核苷酸或核酸。通常，变体总体上与参比核酸或多肽密切相似并在很多区段与之相同。本文所用“变体”是指在序列上分别与G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白不同，但仍保留其如本文另述或本领域已知的至少一种功能和/或治疗性质的本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或本发明的白蛋白融合蛋白。通常，变体与白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白、白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白、和/或白蛋白融合蛋白的氨基酸序列在整体上非常相似，并在很多区段相同。本发明也包括编码这些变体的核酸。本发明还涉及包含，与例如如本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白、本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白和/或白蛋白融合蛋白至少约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%相同的氨基酸序列，或由其组成的蛋白质。还提供了这些多肽的片段。本发明进一步包括的多肽是由在严谨杂交条件(例如，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中以约45°C杂交从而过滤结合的DNA，然后在0. Ix SSC，0. 2% SDS中以约50_65°C清洗一次或多次)、在高度严谨条件(例如，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中以约45°C杂交从而过滤结合的DNA，然后在0. Ix SSC，0.2% SDS中以约68°C清洗一次或多次)或者在本领域技术人员已知的其它严谨杂交条件(参见，例如，Ausubel, F.M.等编著，1989，Current protocol in Molecular Biology (Mifif，Green publishingassociates, Inc.禾口 John Wiley & Sons Inc. , New York,6. 3. 1-6. 3. 6 禾口 2. 10. 3 各页)下与本发明白蛋白融合蛋白的编码核酸分子的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。所述多肽的氨基酸序列与查询氨基酸序列至少，例如95% “相同”，意味着查询氨基酸序列的每100个氨基酸中对象多肽序列中可包括最多5个氨基酸变化，除此之外对象多肽的氨基酸序列与查询序列相同。换而言之，为得到氨基酸序列与查询氨基酸序列至少95%相同的多肽，对象序列中最多有5%的氨基酸残基可被插入、缺失或用其它氨基酸取代。参比序列的这些变化可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端或这些末端位置之间的任何地方，可以散布于参比序列的各残基间，或者在参比序列内的一个或一个以上相邻基团中。作为实践问题，可以采用已知的计算机程序来常规确定任何特定多肽是否与例如本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列或其片段(例如所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分或所述白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)具有至少约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同。确定查询序列(本发明的某序列)与对象序列之间的最佳总体匹配的优选方法可以采用基于Brutlag等(Comp. App. Biosci. 6 :237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序，该方法也称为整体序列比对。在序列比对中，查询和对象序列或者都是核苷酸序列，或者都是氨基酸序列。整体序列比对的结果表示为相同百分数。FASTDB氨基酸比对中所用的优选参数为矩阵(Matrix) = PAM 0，k_ 元组(k-tuple) = 2，错配罚分(Mismatch Penalty) = 1，连接罚分(Joining Penalty) =20，随机分组长度(Randomization Group Length) =0,临界分值(CutoffScore) = 1，窗口尺寸(Window Size)=序列长度，缺口罚分(Gap Penalty) = 5，缺口尺寸罚分(Gap Size Penalty) = 0. 05，窗口尺寸=取500或对象氨基酸序列长度中较短者ο若对象序列比查询序列短是由于N或C末端缺失而非内部缺失，必须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算整体相同百分数时并不考虑对象序列的N和C末端截断。对于相对查询序列在N和C末端有截断的对象序列，通过计算查询序列中在对象序列N和C末端而不与相应的对象残基匹配/对齐的残基数占查询序列总碱基数的百分比来校正相同百分数。通过FASTDB序列比对的结果确定残基是否匹配/对齐。然后通过上述FASTDB程序采用特定参数计算所得相同百分数中减去该百分值，获得最终的相同百分数得分。该最终相同百分数得分用于本发明的目的。为了人工调整相同百分数得分，仅考虑对象序列N和C末端未与查询序列匹配/对齐的残基。即，只查询对象序列N和C末端残基最远端外侧的残基位置。例如，90个氨基酸残基的对象序列与100个残基的查询序列比对以确定相同百分数。缺失发生在对象序列的N末端，因此FASTDB比对并未显示N末端最初10个残基的匹配/对齐。这10个未配对残基代表序列的10% (N和C末端未匹配残基数/查询序列的总残基数)，因此从FASTDB程序计算得到的相同百分数得分中减去10%。若其余90个残基为理想匹配，那么最终的相同百分数将是90%。在另一示例中，比较90个残基的对象序列与100个残基的查询序列。这次缺失为内部缺失，因此对象序列的N或C末端没有与查询不匹配/对齐的残基。该情况下，FASTDB计算所得相同百分数不用人工校正。再次，只对在FASTDB比对中显示为对象序列N和C末端外侧，未与查询序列匹配/对齐的残基位置进行人工校正。没有为本发明目的进行其它人工校正。
变体通常和与变体具有相同长度的正常HA或G-CSF蛋白长度具有至少约75%(在其它实施方式中，至少约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99% )的序列相同性。通过BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool (基础本地比对搜索工具))分析，采用为序列相似性搜索调整过的blastp、blastn、blastx、tblastn 禾口 tblastx 所用算法(Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87 :2264-2268(1990)和 Altschul，J. Mol. Evol. 36 :290-300 (1993)，通过引用全文纳入)确定核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或相同性。BLAST程序所用方法首先考虑查询序列和数据库序列之间的相似区段，然后评估所有一致匹配的统计学显著性，最后仅总结出那些满足预选的显著性阈值的匹配者。关于序列数据库相似性搜索的基本问题的讨论，参见Altschul等(Nature Genetics 6 119-1^(1994))，其全文通过引用纳入本文。直方图、描述、对齐、预期(即，针对数据库序列报告匹配者的统计学显著性)、临界值、矩阵和筛选的搜索参数采用默认设置。Blastp、blastx、tblastn 和 tblastx 采用的默认计分矩阵是 BL0SUM62 矩阵(Henikoff 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89 10915-10919 (1992)，通过引用全文纳入)。对于 blastn,计分矩阵用M( S卩，匹配残基配对的奖励计分)与N(S卩，错配残基的罚分)的比值设定，其中M和N的默认值分别为5和-4。四项blastn参数可作如下调整Q-10(缺口产生罚分)；R=10(缺口延伸罚分)；wink= 1(在沿查询序列的各wink. sup. th位置产生字命中)；以及gapw =16(设定产生带缺口对齐的窗口宽度)。Blastp的相应参数设定为Q = 9 ;R = 2 ；wink =1和gapw = 32。在GCG包1. 0版中可在序列间进行Bestfit比较，采用DNA参数GAP =50 (缺口产生罚分)和LEN = 3 (缺口延伸罚分)，蛋白质比较中的相应设定为GAP = 8和LEN = 2。本发明的多核苷酸变体可含有在编码区、非编码区或两者内的变化。特别优选的多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失的变化，但不改变所编码多肽的性质或活性。优选因遗传密码简并性导致的沉默取代所产生的核苷酸变体。此外，也优选多肽变体中低于50个、低于40个、低于30个、低于20个、低于10个、或5-50个、5-25个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸被以任意组合取代、缺失或添加。可以为多种原因产生多核苷酸变体，例如为优化特定宿主中密码子的表达(将人mRNA中的密码子变成细菌宿主如酵母或大肠杆菌中优选的密码子)。在一个优选的实施方式中，本发明中编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在进一步优选的实施方式中，本发明编码白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在更进一步优选的实施方式中，本发明中编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在另一实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白G-CSF蛋白部分的密码子优化多核苷酸不和编码G-CSF蛋白的野生型多核苷酸杂交。在进一步的实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密码子优化多核苷酸不和编码白蛋白的野生型多核苷酸杂交。在另一个实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白的密码子优化多核苷酸不和编码G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的野生型多核苷酸杂交。
在另外的实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸不包含该G-CSF蛋白的天然产生序列，或不由其组成。在进一步的实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包含该白蛋白的天然产生序列，或不由其组成。在另外的实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的天然产生序列，或不由其组成。采用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法，可以产生变体以改善或改变本发明多肽的特性。例如，可以从本发明多肽的N或C末端删除一个或多个氨基酸而不显著损失生物学功能。在优选的实施方式中，本发明的变体具有保守取代。“保守取代”是指在组内交换，例如脂族或疏水氨基酸Ala、Val, Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Tar的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代；碱性残基Lys、Arg和His的取代；芳香族残基Wie、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、kr、Hir、Met和Gly的取代。提供了关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指南，例如，Bowie等，"Deciphering the Message in Protein Sequences :Tolerance to Amino AcidSubstitutions (解码蛋白质序列的信息对氨基酸取代的容差)，，，Science 247 1306-1310(1990)，其中作者表明有两种主要策略研究氨基酸序列对变化的容差。第一种策略通过进化过程中的自然选择探索氨基酸取代的容差。通过比较不同物种间的氨基酸序列鉴别保守氨基酸。这些保守氨基酸可能对于蛋白质功能很重要。相反，其取代为自然选择容忍的氨基酸位置表明这些位置对于蛋白质功能并非关键。因此，容忍氨基酸取代的位置可被改变而仍保持所述蛋白质的生物活性。第二种策略采用遗传工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸变化以鉴别蛋白质功能的关键性区段。例如，可采用定点突变或丙氨酸扫描突变(在分子的各残基处引入单个丙氨酸突变)。参见 Cunningham 和 Wells，Science 244:1081-1085(1989)。然后，可测试所得突变分子的生物学活性。如作者所指出，这两种策略揭示了蛋白质对氨基酸取代的惊人容差。作者进一步指出，在蛋白质的某些氨基酸位置哪些氨基酸变化是可能允许的。例如，大多数被包埋(在蛋白质三级结构中)的氨基酸残基要求非极性侧链，而通常表面侧链的特性极少是保守的。此外，可容忍的保守氨基酸取代涉及脂族或疏水氨基酸Ala、Val、LeU和Ile的取代；羟基残基Ser和Thr的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代；碱性残基Lys、Arg和His的取代；芳香族残基Wie、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、Ser, Thr、Met和Gly的取代。除了保守氨基酸取代，本发明的变体包括(i)含一个或一个以上非保守氨基酸残基取代的多肽，其中被取代的氨基酸残基可以由或不由该遗传密码编码，或者(ii)含有一个或一个以上具有取代基团的氨基酸残基取代的多肽，或(iii)与另一化合物，例如提高多肽稳定性和/或溶解度的化合物(如聚乙二醇)融合或化学偶联的多肽，(iv)包含额外氨基酸，例如IgG Fc融合区肽的多肽。本领域技术人员在本文教导下认为这些多肽变体是在本文范围内的。例如，包含带电氨基酸被其它带电或中性氨基酸取代的多肽变体可产生特性改善的蛋白质，例如较少聚集。药物制剂的聚集减低活性并因聚集体的免疫原活性提高了清除。参见 Pinckard 等，Clin. Exp. Immunol. 2 :331-340 (1967) ；Robbins 等，Diabetes36 :838-845 (1987) ；Cleland 等，Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)。在特定的实施方式中，本发明的多肽包含白蛋白融合蛋白氨基酸序列、G-CSF蛋白和/或人血清白蛋白氨基酸序列的片段或变体，或由其组成，其中所述片段或变体与参比氨基酸序列相比，具有1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150个氨基酸残基的添加、取代和/或缺失。在优选的实施方式中，所述氨基酸取代是保守的。本发明也包括编码这些多肽的核酸。本发明的多肽可以由通过肽键或修饰的肽键，即肽等排物彼此连接的氨基酸组成，并可包含20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。所述多肽可以通过天然过程修饰，例如翻译后加工，或者通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。这些修饰在基础文章和更具体的专著以及大量研究文献中已详尽描述。修饰可发生在多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当了解相同类型的修饰可以在给定多肽的多个位置以相同或不同程度出现。并且，给定多肽也可包含许多类型的修饰。多肽可以是分支的，例如因泛素化造成，它们可以是含有或不含分支的环状。环状、分支和分支环状多肽可以由翻译后的自然过程造成也可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价结合黄素、共价结合血红素部分、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y -羧化、糖基化、GPI锚体形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转移RNA介导的蛋白质氨基酸加成如精氨酰化、以及泛素化。(参见，例如 PROTEINS—STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (蛋白质结合和分子性质)，第 2版，Τ· E. Creighton，W. H. Freeman and Company, New York (1993) ；P0ST-TRANSLATI0NALC0VALENT MODIFICATION OF PROTEINS (蛋白质翻译后的共价修饰)，B. C. Johnson 编著，Academic Press, New York,第 1—12 页(1983) ；Seifter 等，Meth. Enzymol. 182 626-646 (1990) ；Rattan 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663 :4862 (1992))。C.功能活性“具功能活性的多肽”是指能显示与G-CSF蛋白的全长、前蛋白、和/或成熟形式相关的一种或一种以上已知功能活性的多肽。这些功能活性包括但不限于，生物学活性、抗原性[与抗多肽抗体结合(或与多肽竞争结合)的能力]、免疫原性(产生结合本发明特定多肽的抗体的能力)、与本发明的多肽形成多聚体的能力、和与多肽的受体或配体结合的能力。“具生物学活性的多肽”是指如特定生物学实验所检测，剂量依赖或不依赖性地显示与本发明的G-CSF蛋白包括其成熟形式相似，但未必相同活性的多肽。在优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白具有未与白蛋白融合的G-CSF蛋白部分(或其片段或变体)相关的至少一种生物学和/或治疗活性。可以采用本领域已知试验或对它们作常规改良以及本文所述试验以试验其本发明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物学活性)。另外，本领域技术人员可以对白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白片段进行常规试验。此外，本领域技术人员可以采用本领域已知试验和/或下文实施例部分所述试验对白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白片段进行常规试验分析活性。例如，在一个实施方式中，试验白蛋白融合蛋白结合或与G-CSF蛋白竞争结合抗G-CSF多肽抗体和/或抗白蛋白抗体的能力，可以采用本领域已知的各种免疫试验，包括但不限于，使用例如放射免疫试验、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫试验、免疫放射试验、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散试验、原位免疫试验(例如，采用胶体金、酶或放射性同位素标记)Jestern印迹、沉淀反应、聚集试验(例如凝胶聚集试验、血凝试验)、补体固定试验、免疫荧光试验、蛋白质A试验和免疫电泳试验等技术的竞争性和非竞争性试验系统。在一种实施方式中，通过检测初次抗体上的标记测得抗体的结合。在另一个实施方式中，通过检测二次抗体或试剂与初次抗体的结合测得初次抗体。在另外一实施方式中，标记所述二次抗体。本领域已知并在本发明范围内有多种方法用于在免疫试验中检测结合。在一个优选实施方式中，识别了 G-CSF蛋白质的结合伴侣(例如，受体或配体)，例如，可以通过本领域熟知的方法如还原和非还原性凝胶层析、蛋白亲和层析及亲和印迹法，分析白蛋白融合蛋白与该结合伴侣的结合，所述融合蛋白包含G-CSF蛋白作为融合体的 G-CSF 蛋白部分。一般参见 Phizicky 等，Microbiol. Rev. 59 :94-123 (1995)。在另一实施方式中，可采用本领域已知技术常规分析白蛋白融合蛋白与融合体G-CSF蛋白部分所对应G-CSF多肽的受体结合的生理关联能力。在另一个实施方式中，评估白蛋白融合蛋白形成多聚体的能力，可以通过本领域熟知的方法，例如还原和非还原性凝胶层析、蛋白亲和层析及亲和印迹分析多聚体与其它组分的结合。通常参见Phizicky等，同上。可用于分析蛋白结合和交叉反应性或鉴定的免疫试验包括但不限于使用诸如Western印迹、放射性免疫实验、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫试验、免疫沉淀试验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体固定实验、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫试验等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这类实验是本领域熟知的常规实验(参见例如，Ausubel等编，1994，Current Protocols in MolecularBiology (新编分子生物学实验)，第1卷，John Wiley & Sons, Inc.，New York，通过引用全文纳入本文)。与白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白结合的抗体也可就其对给定蛋白或抗原的结合亲和力加以描述或限定，优选其特异性结合的抗原。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10_2M、10_2M、5x10_3M、10_3M、5x10_4M、10_%。更优选的结合亲和力包括解离常数或 Kd 低于 5χ1(Γ5Μ、1(Γ5Μ、5χ1(Γ6Μ、1(Γ6Μ、5χ1(Γ7Μ、1(Γ7Μ，5χ1(Γ8Μ 或 1(Γ8Μ。更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10-、、10_9Μ、5x10、、10_1(ιΜ、5Χ10_"Μ、1(Γ"Μ、5χIOl 1(Γ12Μ、5X101 10 Μ、5Χ10 Μ、1(ΓμΜ、5X10、、或 IO-15M0 此外，本文描述的试验和本领域已知的试验可以常规应用于检测白蛋白融合蛋白及其片段、变体、衍生物引起所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分和/或白蛋白部分相关的生物学活性和/或G-CSF活性(体内或体外)的能力。其它方法会是本领域技术人员已知的，并在本发明范围内。V. G-CSF和HSA的融合蛋白重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子(rHA-G-CSF)是G-CSF类似物。rHA-G-CSF的例子见美国专利第5，665，863号以及美国专利第7，041，478号的描述，两者都通过引用纳入本文。rHA-G-CSF的另一例子是美国特华生物药物有限公司(Teva BiopharmaceuticalsUSA LTD.)开发的Neugranin (“NEUG”)。NEUG是分子量约为85kDa的融合多肽。NEUG是759个氨基酸的单链多肽，1-585位残基对应于HSA的成熟形式，586-759位残基对应于人G-CSF的成熟形式。图1显示了 NEUG融合蛋白的氨基酸序列。VI.产牛融合蛋白生产rHA-G-CSF的合成过程的示范性方法见美国专利申请第11/929，828号的描述，其全文通过引用纳入本文。在一些实施方式中，采用遗传工程改造的表达NEUG融合蛋白的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))宿主系统生成NEUG。采用本领域熟知的方法(例如通过一系列层析和过滤步骤，如亲和层析及离子交换层析)从酵母培养的发酵培养基中收集并纯化NEUG。在一种非限制性的示例中，如下开发NEUG融合构建物。从英国牛津大学F. E. Baral 1 e博士实验室的人cDNA文库中分离出全长白蛋白cDNA。该克隆作为质粒PAT153ALB送往英国诺丁汉的Delta Biotechnology Limited。此外，修饰6-氨基酸HSA前肽(RGVFRR)以促进酵母中的更有效加工(RSLDKR)。NEUG的生产质粒，基于PSAC35改良的表达质粒，是基于野生型酿酒酵母中发现的2-μ质粒。基于PSAC35的表达载体(参见例如，专利EP 286424Β、美国专利第5，637，504号)含有来自酿酒酵母的LEU2基因作为选择标记，该基因补充酿酒酵母生产宿主中的亮氨酸缺陷。该生产质粒还包含强酵母启动子PRB1，和来自质粒pUC9的可在大肠杆菌中克隆和增殖的序列。此外，一旦转化到酵母中，所述质粒消除在大肠杆菌中增殖所需的PUC9衍生序列。这通过侧翼FLP识别靶标(FRT)和进入酵母后质粒表达酵母FLP重组酶而实现。因此，用于生产NEUG的生物体中没有细菌DNA。这通过在产生主细胞库后从酵母中取出2μπι质粒并测序得到证实。如上所述，名为CID1643(pSAC35 :HSA. GCSF (T31-P204))的 NEUG 生产质粒是从基于PSAC35的表达载体衍生得到。通过PCR扩增与人G-CSFT31-P204对应的区段，添加适当的5’和3’限制性位点以允许与HSA开放读框3’末端的无缝融合。在马里兰州罗克维尔(Rockville，MD)的Human Genome Sciences 公司用 NEUG种子瓶制备cGMP主细胞库。NEUG主细胞库的测试和鉴定在美国宾夕法尼亚州马尔文的 Charles River Laboratories (Malvern, PA, USA)和美国得克萨斯州休斯敦的 LarkTechnologies (Houston, TX, USA),遵照 ICH 指南 Q5D (Derivation and Characterizationof Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/BiologicalsProducts (用于生产生物技术/生物产品的细胞基质的产生和鉴定))进行。随后在Charles River Laboratories产生并检测从该主细胞库衍生的cGMP工作细胞库。生产NEUG细胞系库的所有培养基成分都是合成、生物合成或植物来源。在细胞系或细胞库制备过程中没有使用动物来源或人源的成分。所述细胞库在< _135°C下保存在预灭菌的1. SmL带内螺口封盖Nunc聚丙烯管内的冻存培养基中。图21显示了分离、纯化和制备药用rHSA-G-CSF融合蛋白的非限制性示范方法。用0.2μπι过滤器将配制的药物物质无菌过滤入已灭菌的特富龙(Teflon)瓶中。装有药物物质的液体在约_80°C (标称值，保存温度的可接受范围为约_65°C )下冷冻保存.为改善制剂在运输和临床地点存放的稳健性，并提供具有预期的长保存期的稳定产品，还可采用本领域已知方法冻干NEUG。VII 白细胞减少症和嗜中件白细胞减少症的示范件原因如上所述，白细胞减少症是循环血液白细胞计数(WBC)的减少，嗜中性白细胞减少症以血嗜中性粒细胞计数的减少为特征，常导致对细菌和真菌感染的易感性提高。下列是能使人对象面临引起白细胞减少症或嗜中性白细胞减少症风险的因素的不全面列举药物(例如，苯妥英、氯霉素、磺胺药物和化疗)；维生素B12或叶酸缺乏；饮酒过量；涉及骨髓的癌症和其它疾病(例如，再生障碍性贫血、丙种球蛋白异常血症、阵发性夜间血红蛋白尿、脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征、骨髓纤维化、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤或浸润并置换骨髓的转移性实体肿瘤)；病毒感染(例如，流感、HIV、早期传染性单核细胞增多症、儿童病毒疾病)；细菌感染(例如，结核)；辐射；毒素(例如，苯和杀虫剂)；骨髓衰竭(例如，ktiwachman-Diamond综合征、软骨毛发发育不良、先天性角化不良、IB型糖原贮积病)；脾脏紊乱、各种原因导致的脾肿大；骨髓细胞或其前体的内在缺陷；过敏性疾病；自体免疫疾病；T-γ淋巴增生性疾病(T-YLPD)；血液透析或移植；毒素。大量药物，例如多种化疗方案(如细胞毒性化疗方案)与发热性嗜中性白细胞减少症的高风险(如风险> 20% )。在一些化疗方案中，没有G-CSF治疗时的发热性嗜中性白细胞减少症发病率约为40% (例如静脉内用多柔比星和多西他赛的化疗方案)。下表1提供了与发热性嗜中性白细胞减少症相关的各种癌症和治疗方案的非限制性例子。在一些实施方式中，图1所示的HSA-G-CSF融合蛋白给予患者以预防、治疗或减轻与这些药物治疗
施用相关的嗜中性白细胞减少症。
表1:与发热相t嗜中性白细胞减少症相关的示例性癌症和治疗方案癌症治疗膀胱癌MVAC (甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、顺钼)(新辅助治疗、辅药、转移性)
权利要求
1.一种在人对象中治疗或预防嗜中性白细胞减少症的方法，包括对显示嗜中性白细胞减少症或有产生嗜中性白细胞减少症风险的人对象施用有效量的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子以治疗对象。
2.一种在人对象中治疗或预防白细胞减少症的方法，包括对显示白细胞减少症或有产生白细胞减少症风险的人对象施用有效量的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子以治疗对象。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人对象患有非骨髓恶性肿瘤并正接受至少一种骨髓抑制型抗癌药，所述药物与发热性嗜中性白细胞减少症的临床显著发病率相关。
4.一种在患有非骨髓性恶性肿瘤并在接受至少一种骨髓抑制型抗癌药的人对象中降低感染发病的方法，所述感染表现为发热性嗜中性白细胞减少症，所述抗癌药物与发热性嗜中性白细胞减少症的临床显著发病率相关，所述方法包括给予对象有效剂量的人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子以治疗对象。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，(a)对象中4级嗜中性白细胞减少症消除；(b)对象中4级嗜中性白细胞减少症减轻；(c)对象中重度嗜中性白细胞减少症的持续时间缩短；(d)对象中4级嗜中性白细胞减少症的持续时间低于5天；(e)对象中3级嗜中性白细胞减少症的持续时间消除；(f)对象中3级嗜中性白细胞减少症的持续时间减少；或(g)其任意组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起血液白细胞计数(WBC)升高。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，(a)对象中嗜中性粒细胞的数量增加；(b)对象中嗜中性粒细胞数量的降低被抑制；(c)对象中嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的最低值增加；(d)对象中恢复的ANC增加；(e)对象中ANC恢复的时间缩短；或(f)其任意组合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述给予对象的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的量选自下组(a)从约50 μ g/kg 到约 450 μ g/kg ；(b)约50 μ g/kg ；(C)约 150 μ g/kg ；(d)约300 μ g/kg ；(e)约450 μ g/kg ；(f)从约30mg到约60mg；(g)约30mg ；(h)约 40mg ；⑴约50mg ；(j)约 60mg ；或(k)其任意组合。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述嗜中性白细胞减少症选自原发性嗜中性白细胞减少症、急性嗜中性白细胞减少症、重度慢性嗜中性白细胞减少症 (SCN)、重度先天性嗜中性白细胞减少症(Kostmarm综合征)、重症婴儿遗传性粒细胞缺乏症、良性嗜中性白细胞减少症、周期性嗜中性白细胞减少症、慢性特发性嗜中性白细胞减少症、继发性嗜中性白细胞减少症、嗜中性白细胞减少症相关综合征和免疫介导的嗜中性白细胞减少症。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述嗜中性白细胞减少症是由辐射、酗酒、药物、过敏性疾病、自体免疫疾病、T-Y淋巴增生性疾病(T-YLPD)、脊髓发育不良、骨髓纤维化、丙种球蛋白异常血症、阵发性夜间血红蛋白尿、癌症、维生素B12缺乏、叶酸缺乏、病毒感染、细菌感染、脾脏疾病、血液透析、或移植、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、浸润并置换骨髓的转移性实体瘤、毒素、骨髓衰竭、Schwachman-Diamond综合征、软骨-毛发发育不全、先天性角化不良、IB型糖原贮积病、各种原因导致的脾肿大、骨髓细胞或其前体的内在缺陷造成或与之相关。
11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子给药的时间选自下组(a)骨髓抑制性抗癌药物给药后至少12小时；(b)骨髓抑制性抗癌药物给药后至少18小时；(c)骨髓抑制性抗癌药物给药后至少M小时。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在骨髓抑制性抗癌药物之前给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起WBC升高。
13.如权利要求11-12中任一项所述的方法，其特征在于，在化疗前给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起ANC升高。
14.如权利要求3或11-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述非骨髓恶性肿瘤包括乳腺癌。
15.如权利要求3或11-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述骨髓抑制性抗癌药物包括多柔比星和多西他赛。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，对至少一个疗程，通过静脉输液在同一天依次给予约50mg/m2多柔比星和约75mg/m2多西他赛。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，对至少一个疗程，通过静脉输液在同一天依次给予约60mg/m2多柔比星和约75mg/m2多西他赛。
18.如权利要求3或11-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述ANC和WBC在选自下组的时间段内回复正常(a)截止化疗后的第10天；(b)截止化疗后的第11天；(c)截止化疗后的第12天；(d)截止化疗后的第13天；(e)截止化疗后的第14天；或(f)截止化疗后的第15天。
19.如权利要求3或11-18所述的方法，其特征在于，在化疗给药后第14天用重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子治疗的患者中所述ANC的升高低于用相等剂量聚乙二醇化非格司亭治疗的患者中ANC的升高。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述给予重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子引起淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、或其任意组合的升高。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象中淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞或其任意组合的数量增加。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象中淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞或其任意组合的数量降低受到抑制。
全文摘要
公开了用于治疗、预防和减轻以白细胞计数降低为特征的症状和疾病的组合物和方法。本文所述的方法和组合物包括由人血清白蛋白(“HSA”)和人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。
文档编号A61K47/48GK102378635SQ201080012723
公开日2012年3月14日 申请日期2010年1月15日 优先权日2009年1月16日
发明者A·C·贝尔, J·B·博克, J·赫普斯特 申请人:特瓦制药工业有限公司